Αφηρημένο

καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχει υψηλή συχνότητα με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Εξασθενημένος έκφραση της πρωτεΐνης ανταπόκρισης βλάβη του DNA Pigmentosum ξηροδερμίας ομάδα συμπληρωματικότητας C (XPC) έχει περιγραφεί στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. XPC διαδραματίζει σημαντικό ρόλο ως το κύριο εκκινητή και ζημιές ανιχνευτής στην παγκόσμια επισκευή εκτομή γονιδίωμα νουκλεοτιδίων (NER) υν-επαγόμενης αλλοιώσεις, ογκώδη προϊόντα προσθήκης DNA και ενδοκλωνικά διασταυρωμένες συνδέσεις, όπως αυτές που γίνονται από τον χημειοθεραπευτικό παράγοντα Cisplatin. Ως εκ τούτου, XPC πρωτεΐνη θα μπορούσε να είναι ένα πληροφοριακό βιοδείκτη για να καθοδηγήσει εξατομικευμένες στρατηγικές θεραπείας σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ως εκ τούτου, μετρήθηκε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης XPC και λειτουργική δραστηριότητα NER 36 όγκους της ουροδόχου κύστης σε ένα τυποποιημένο τρόπο. Έχουμε βελτιστοποιημένες συνθήκες για διαχωρισμό και

in vitro

καλλιέργεια πρωτογενούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα και επιβεβαίωσε εξασθενημένα έκφραση XPC σε περίπου 40% των όγκων. Ωστόσο, η δραστηριότητα NER ήταν παρόμοια με συν-καλλιεργήθηκαν κύτταρα άγριου τύπου σε όλα εκτός από ένα από 36 όγκους της ουροδόχου κύστης. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα, ότι (i) λειτουργική ανεπάρκεια NER είναι ένα σχετικά σπάνιο φαινόμενο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και (ii) τα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC δεν είναι χρήσιμα ως βιοδείκτη για τη δραστηριότητα NER σε αυτούς τους όγκους

Παράθεση:. Naipal ΚΑΤ, Raams Α , Bruens ST, Brandsma Ι, Verkaik NS, Jaspers NGJ, et al. (2015) Έκφραση εξασθενημένα XPC Είναι που δεν συνδέονται με Επισκευή απομειωμένων DNA σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 10 (4): e0126029. doi: 10.1371 /journal.pone.0126029

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 5 Ιανουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 27 του Μάρτη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2015

Copyright: © 2015 Naipal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. Η έρευνα που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα έχει λάβει χρηματοδότηση από το έβδομο πρόγραμμα πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Κοινότητας (FP7 /2007-2013) στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης Νο ΥΓΕΙΑ-F. 2- 2010-259893 (DDResponse) να JH, RK και DVG, URL: https://cordis.europa.eu/fp7/home_en.html? Ολλανδικά Αντικαρκινική Εταιρεία (KWF) nr επιχορήγησης. 2011-5030 σε JH, URL: https://www.kwf.nl/Pages/default.aspx? και Vereniging Trustfonds Πανεπιστήμιο Εράσμους στο JB, URL: https://www.eur.nl/eur/fondsen/trustfonds/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η πέμπτη πιο συχνή κακοήθεια στην Ευρώπη με συχνότητα πάνω από 150.000 περιπτώσεις με αποτέλεσμα πάνω από 50.000 θανάτους ετησίως [1]. όγκοι της ουροδόχου κύστης παρούσα είτε ως μη-διηθητικό (NMIBC) (70%) ή ως διηθητικό καρκίνο ουροδόχου κύστης (MIBC) (30%) [2]. MIBC είναι μια δυνητικά θανατηφόρα ασθένεια με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 50-60% [3]. Θεραπεία του MIBC αφορά κυρίως τη χειρουργική επέμβαση και συστημικές χημειοθεραπευτικές αγωγές, με το τελευταίο κυρίως για επαναλαμβανόμενες και μεταστατική νόσο.

Υπάρχει σαφής κλινική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών συστημικής θεραπείας για MIBC, καθώς η επιβίωση των ασθενών MIBC έχει δεν βελτιώθηκε τις τελευταίες δεκαετίες. Θεραπείες στόχευσης οδούς ογκοειδικό έχουν δείξει να είναι αποτελεσματικές σε διάφορους καρκίνους, όπως του μαστού, των ωοθηκών και νεφρικό καρκίνο, αλλά για την BC τέτοιες θεραπείες δεν είναι διαθέσιμες. Θεραπείες που στοχεύουν απάντηση βλάβες στο DNA (DDR) μηχανισμοί είναι ελπιδοφόρες προσεγγίσεις σε αντικαρκινική θεραπεία [4]. μηχανισμοί DDR είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της σταθερότητας μέσω γενωμικού επιδιόρθωση του DNA, τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η λειτουργικότητα των συγκεκριμένων οδών DDR είναι μία σημαντική παράμετρος που συμβάλλει στην ευαισθησία των κακοήθων κυττάρων σε DNA επιζήμια χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Επιπλέον, στόχευση συγκεκριμένων ελαττωμάτων οδούς DDR θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια πιο αποτελεσματική θεραπεία. Για παράδειγμα, το ελάττωμα DDR προκαλείται από

BRCA1

ή

BRCA2

μεταλλάξεις σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών ευαισθητοποιεί αυτά τα καρκινώματα σε αναστολείς πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) [5,6] . Έτσι, τον καθορισμό του καθεστώτος DDR των επιμέρους όγκων μπορεί να είναι πολύτιμη για την επιλογή της θεραπείας κατά του καρκίνου.

Οι νουκλεοτιδικές επισκευή εκτομής (NER) είναι υπεύθυνη για την επισκευή του ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών τύπων βλάβες του DNA που παράγεται από τις περιβαλλοντικές μεταλλαξιογόνες και καρκινογόνες ουσίες. Άσχετα δομικά αλλοιώσεις επισκευαστεί από NER περιλαμβάνουν προκαλούμενη UV στρεβλώσεις έλικα, ογκώδη προϊόντα προσθήκης DNA και ενδοκλωνικά σταυρωτές συνδέσεις (π.χ. που προκαλείται από φάρμακα όπως σισπλατίνη) [7]. Δύο σημαντικές subpathways του NER περιλαμβάνουν παγκόσμια NER γονιδιώματος (ΦΕΚ-NER) και μεταγραφή σε συνδυασμό NER (TC-NER). Pigmentosum ξηροδερμίας ομάδα συμπληρωματικότητας C (XPC) εμπλέκεται ειδικά σε GG-NER και χρησιμεύει ως πρωτεΐνη αναγνώριση ζημιές σε συγκρότημα με HR23B. Μόνο μετά την αναγνώριση ζημιών από XPC-HR23B οι βασικές πρωτεΐνες NER προσληφθεί στην αλλοίωση και NER πραγματοποιείται [8]. Αυτό υποδηλώνει ότι XPC είναι το ποσοστό περιοριστικός παράγοντας στην GG-NER

Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι γονίδια NER παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της BC.? πολυμορφισμούς σε ορισμένα γονίδια που αυξάνουν τον κίνδυνο NER π.Χ., ιδιαίτερα στους καπνιστές [9-12]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι εξασθενημένη έκφραση της πρωτεΐνης NER XPC είναι παρούσα σε ~ 40% όλων των όγκων της ουροδόχου κύστης και ένας παράγοντας που συμβάλλει στην πρόοδο του όγκου [13]. Επίσης, υπερμεθυλίωση ο

XPC

γονίδιο υποκινητής είναι σημαντικά υψηλότερη σε π.Χ. σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο και συνδέεται με υψηλότερα παθολογική φάση, παρουσία της μετάστασης και ρ53 μεταλλάξεων [14]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η συγκεκριμένη

XPC

ελαττώματα π.Χ. προκαλέσει ελαττωματική NER και κακή έκβαση σε μια υποομάδα των όγκων. Από την άλλη πλευρά,

XPC

ελαττώματα ίσως να αξιοποιηθεί για εξατομικευμένη στοχευμένη χημειοθεραπεία. Με την επιλεκτική στόχευση του ελαττώματος NER χρησιμοποιώντας ενώσεις που προκαλούν συγκεκριμένες βλάβες στο DNA των οποίων επισκευή απαιτεί NER, π.χ. Σισπλατίνη, αυξημένη κυτταροτοξικότητα θα μπορούσε να επιτευχθεί στα ελλειμματικά κύτταρα του όγκου NER.

Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης XPC στα επιμέρους κλινικά δείγματα π.Χ. μαζί με την λειτουργική δραστηριότητα NER, ως σημείο εκκίνησης για την εξατομικευμένη θεραπεία . Ιδρύσαμε μια επαναλήψιμη μέθοδο για να αποκτήσετε μια βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια μόνο κύτταρο στρώμα από φρέσκα δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης να εκτελέσει δοκιμασίες μας και να συμπεράνουμε ότι η χαμηλή έκφραση XPC δεν οδηγεί απαραίτητα σε ελαττωματικό NER

Υλικά & amp.? Μέθοδοι

Η συλλογή των δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης

δείγματα

π.Χ. (n = 105) συλλέχθηκαν στο Erasmus MC Ρότερνταμ. Εννέα δείγματα όγκου λήφθηκαν από ριζική κυστεκτομή και το υπόλοιπο από Trans ουρήθρας εκτομή (TUR). Μετά τη συγκομιδή, τα δείγματα όγκου απευθείας μεταφέρονται στο εργαστήριο σε μέσο μεταφοράς (RPMI-1640, 10% ορό εμβρύου μόσχου και αντιβιοτικά). Όλα τα δείγματα στη συνέχεια δίνεται ένα μοναδικό κωδικό και οι ερευνητές τυφλώθηκαν για τα δεδομένα του ασθενούς. Όλα τα δείγματα όγκων αξιολογήθηκαν μετά από τυπική HE χρώση και το στάδιο του όγκου και του βαθμού αξιολογήθηκαν από τον παθολόγο σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ το 1973 και το 2009.

δείγματα της ουροδόχου κύστης συλλέχθηκαν ως χειρουργικό υπολειμματικό υλικό. Σύμφωνα με τις πολιτικές του νοσοκομείου οι ασθενείς γνωρίζουν ότι υπολειμματικό υλικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ερευνητικούς σκοπούς, εκτός αν οι ασθενείς επιλέγουν να μην συμμετέχουν. Όλα τα υλικά κωδικοποιήθηκαν με τέτοιο τρόπο που οι ερευνητές δεν μπορούσαν να ανιχνεύσει πληροφορίες για τον κάθε ασθενή. Ως εκ τούτου, δεν ελήφθη ρητή γραπτή /προφορική συγκατάθεση και η ανάγκη για γραπτή /προφορική συγκατάθεση είχε παραιτηθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Erasmus MC και αυτό το συγκεκριμένο ερευνητικό έργο και τη διαδικασία εγκρίθηκε από το IRB (metC-2012-113).

Tissue καλλιέργεια

δείγματα όγκων το χέρι σε φέτες σε μικρότερα κομμάτια χρησιμοποιώντας χειρουργικό ψαλίδι και στη συνέχεια υποβάλλεται σε διάσπαση με χρήση Miltenyi Biotec Kit Tumor διαστάσεως σε συνδυασμό με ένα gentleMACS διαστάσεως σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. εναιωρήματα κυττάρων σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων σε μέσο AmnioMax-C100 (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C, 5% CO

2 και το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Αν συνδέθηκαν επαρκείς αριθμούς κυττάρων όγκου, ένας μικρός αριθμός ανθρώπινων ινοβλαστών άγριου τύπου, C5RO, προστέθηκαν στην καλλιέργεια για να χρησιμεύσει ως εσωτερικοί έλεγχοι για προτυποποιημένη δοκιμασία απρογραμμάτιστης σύνθεσης DNA (UDS), η οποία διεξήχθη την επόμενη ημέρα. Για να γίνει διάκριση μεταξύ των κυττάρων C5RO από κύτταρα όγκου, κυτόπλασμα τους ήταν εκ των προτέρων επισημασμένο με σφαιρίδια πολυστυρενίου 2.0 μm [15].

κυτταρικές σειρές ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από την ATCC (ΗΤ-1197 [ATCC CRL-1473] και T24 [ATCC ΗΤΒ-4] και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FCS και αντιβιοτικά.

απρογραμμάτιστης σύνθεσης DNA (UDS) δοκιμασία

δοκιμασία UDS εκτελέστηκε με κύτταρα UV ακτινοβολίας με 16 J /m

2 UVC φως και εν συνεχεία επισήμανση κύτταρα για τρεις ώρες με 20 μΜ 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνης (edu, ένα ανάλογο της θυμιδίνης) σε μέσο καλλιέργειας (Hams F10 χωρίς θυμιδίνη, 10% διαλυμένο FCS, αντιβιοτικά) [16, 17]. στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 10 μΜ θυμιδίνη για 15 λεπτά για να απομακρυνθούν τα μη-ειδικά edu δέσμευσης. τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 3,7% φορμαλδεΰδη σε PBS που περιέχει 0.5% Triton Χ-100. edu ενσωμάτωση οπτικοποιήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας χημεία κλικ αυτό (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και ποσοτικά με ανάλυση εικόνας με τη χρήση Φίτζι (ImageJ).

ανοσοφθορισμού χρώση

για να απεικονίσει XPC-πρωτεΐνης, σταθεροποιημένα κύτταρα επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι XPC (Santa Cruz D-10? sc-74410 αραιωμένο 1/1000) για 90 λεπτά και ένα δευτερεύον Alexa 488 ή 594 συζευγμένο αντίσωμα για 60 λεπτά, πριν από την τοποθέτηση σε ϋΑΡΙ περιέχει μέσο στερέωσης (Vectashield). Ιδιαιτερότητα του αντισώματος δοκιμάστηκε σε XPC άγριου τύπου (C5RO) vs κύτταρα XPC ανεπάρκεια (XP21RO).

Ανάλυση εικόνας

XPC καθώς UDS χρώση τουλάχιστον 50 μεμονωμένους πυρήνες των κυττάρων του όγκου ποσοτικά με τυποποιημένο λογισμικό απεικόνισης (ImageJ) και σε σύγκριση με τουλάχιστον 20 C5RO πυρήνες στην ίδια διαφάνεια. Στη συνέχεια, τα επίπεδα τυποποιημένα XPC και UDS των κυττάρων του όγκου υπολογίστηκαν ως:

Ανοσοϊστοχημεία χρώση

Για να απεικονίσει XPC επί σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) τμήματα των όγκων της ουροδόχου κύστης, τμήματα θερμάνθηκαν στους 95 ° C για 15 λεπτά με ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου (ϋΑΚΟ S1699) και διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 20 λεπτά. Πρωτογενής αντίσωμα (αντι-XPC Santa Cruz D-10? SC-74410 αραιωμένο 1/1000) προστέθηκε, ακολουθούμενο από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Δευτερεύοντα αντισώματα HRP επωάστηκαν για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας χημεία υπεροξειδάσης DAB (DAKO K6438). Τα δείγματα αναλύθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης ανοσοϊστοχημική (S1 Εικ). Αυτό βαθμολόγησης ανοσοαντιδραστικότητα (IRS) σύστημα λαμβάνει υπόψη το ποσοστό των θετικών κυττάρων και την ένταση της παρατηρούμενης χρώσης [18].

ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά κουνελιού αντι-XPC [19 ] και μονοκλωνικά ποντικού αντι-τουμπουλίνης (κλώνος Β-512, Sigma-Aldrich) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα IRDye 800CW γαϊδάρου αντι-ποντικίσια IgG (H + L) (LI-COR) και IRDye 680RD γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG (η + L) (LI-COR) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Οδύσσεια 3.0 (LI-COR).

επιβίωση Colony

150 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε έξι-φρεατίων και κάθε κατάσταση καλλιεργήθηκε εις τριπλούν. Την επόμενη ημέρα, όταν συνδέθηκαν κύτταρα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 2, 4, 6, και 8 J /m

2 UVC. Μετά από 8 ημέρες επώασης, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.1% Coomassie Brilliant Blue για τουλάχιστον 30 λεπτά. Αποικίες μετρήθηκαν με GelCount (Oxford Optronix).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του IBM SPSS Statistics V21 και GraphPad Prism v5.

Αποτελέσματα

έκφραση XPC στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Σαράντα επτά από τα 105 δείγματα που συλλέγονται όγκου περιείχε επαρκή όγκο για να δημιουργήσει τομές FFPE. έκφραση πρωτεΐνης XPC διερευνήθηκε σε αυτές τις 47 όγκους με ανοσοϊστοχημεία και παρατηρήθηκε ένα ευρύ φάσμα των επιπέδων XPC. Η πλειοψηφία (58%) των δειγμάτων που εμφανίζονται ισχυρή έκφραση XPC (IRS = 3), ενώ το 38% των δειγμάτων που εμφανίζονται μειωμένα επίπεδα (IRS = 1 ή 2). Στο 4% (2 περιπτώσεις) μόνο ανιχνεύθηκαν επίπεδα υποβάθρου (IRS = 0) (Σχήμα 1Α και S1 σχήμα). επίπεδα XPC δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση με το στάδιο του όγκου (Kruskal-Wallis? p = 0.53), ούτε με το βαθμό του όγκου (Mann-Whitney? p = 0.66). (Εικόνα 1Β και 1C)

Α. κατανομή συχνότητας των XPC IRS ταξινομήσεις σε 47 δείγματα TURB. Β Κατανομή συχνότητας των XPC IRS ταξινομήσεις με βάση το στάδιο του όγκου. Οι διαφορές στην IRS ταξινομήσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντική (δοκιμασία Kruskal-Wallis, p = 0,5266). Γ κατανομή συχνότητας των XPC IRS ταξινομήσεις με βάση την τάξη του όγκου. Οι διαφορές στην IRS ταξινομήσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντική (δοκιμασία Mann-Whitney, p = 0,6612).

Η

Βελτιστοποίηση ex vivo καλλιέργεια διαχωρισμένων κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν οι διαφορές σε πρωτεΐνες XPC έκφραση συσχετίζεται με μεταβολές στην ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA. δραστηριότητα NER μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με μέτρηση της σύνθεσης του DNA επιδιόρθωση που συνδέεται (που ονομάζεται επίσης μη προγραμματισμένη σύνθεση DNA (UDS)). Η δοκιμασία UDS μετρά την ενσωμάτωση ενός επισημασμένου νουκλεοζίτη, 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνης (edu), μετά από έκθεση σε ακτινοβολία UV-C (κατά κύριο λόγο 254nm), και καθορίζεται σε κύτταρα που δεν υποβάλλονται σε DNA S-φάσης που εξαρτώνται σύνθεση [20]. Η δοκιμασία UDS απαιτεί ένα μονό στρώμα κυττάρων των κυττάρων, επειδή η ακτινοβολία UV-C δεν διεισδύει στο παχύ βιοψίες ιστών. Ως εκ τούτου, μια επαναλήψιμη μέθοδος ιδρύθηκε για να αποκτήσετε μια βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια μόνο κύτταρο στρώμα από φρέσκα δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης.

Πρώτα σύγκριση διάφορες μέθοδοι διαχωρισμού για την απόκτηση καλλιέργειες κυττάρων από την BC βιοψίες σε γυάλινες καλυπτρίδες. Ενζυματική αποσυνδέσεις χρησιμοποιώντας διάφορες πρωτεάσες οδήγησε σε χαμηλά ποσοστά επιτυχίας όσον αφορά την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Θεωρήσαμε το συνημμένο επιτυχής όταν καρκινικά κύτταρα συνδέονται με περισσότερο από το 5% της επιφάνειας του τρυβλίου καλλιέργειας. Συνημμένο μεταξύ 5-30% θεωρήθηκε ενδιάμεσο, ενώ πάνω από το 30% ανέφερε κατάλληλο εξάρτημα (Πίνακας 1). Λάβαμε προσκολλημένα κύτταρα όγκου σε μόνο το 35% των όγκων κατά την κατεργασία κολλαγενάσης VII, ενώ δεν συνημμένο επιτεύχθηκε με θρυψίνη ή θεραπείες Dyspase (Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στην περίπτωση των κυττάρων που συνδέεται με την γυάλινη καλυπτρίδα, μικρά συσσωματώματα κυττάρων που συνδέονται πιο αποτελεσματικά από μονά κύτταρα (Εικ S2A). Από την άλλη πλευρά, οι προσδιορισμοί διάσταση χρησιμοποιώντας το κιτ Tumor διαστάσεως Miltenyi Biotec και οι gentleMACS διαστάσεως οδήγησε σε καλλιέργειες μόνο στρώμα κυττάρων σε περίπου 80% των όγκων (Πίνακας 1). Για να γίνει διαχωρισμός των ουροφόρων καρκινικά κύτταρα από ινοβλάστες που συχνά μολύνουν τέτοια πρωτογενείς καλλιέργειες, πραγματοποιήσαμε μια χρώση κατά κυτοκερατίνης 18. Σε περίπτωση κατάλληλης προσάρτησης η πλειονότητα των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά για κυτοκερατίνη 18, ενδεικτικό μιας καθαρής καλλιέργειας ουροθηλιακό κύτταρο όγκου (S2B Εικ) . Από την άλλη πλευρά, βιοψίες όγκου τα οποία εμφανίζονται επιδράσεις καυτηρίαση τη χρώση HE, ενδεικτικό της διαθερμικών αφαίρεση του όγκου, δεν αποδίδουν καλυπτρίδες πιθανώς λόγω (όγκου) θανάτωση κυττάρου από την υπερβολική θέρμανση. Επιπλέον, τα δείγματα βιοψίας όγκου που προέρχεται από δείγματα κυστεκτομή επισυνάπτεται επιτυχώς μόνο σε μία από τις εννέα δείγματα, υποδεικνύοντας ότι επιθετικοί όγκοι της ουροδόχου κύστης είναι δύσκολο να καλλιεργηθούν

ex vivo

σε ένα ενιαίο στρώμα κυττάρων.

Η

στρατηγικές Διαφορετικές επίστρωση καλυπτρίδες, όπως ζελατίνη, ινονεκτίνη ή πολυ-L-λυσίνη δεν οδήγησε σε καλύτερη προσκόλληση των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, εξετάσαμε διάφορα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας για να αυξηθεί η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Media αποτελείται από DMEM ή RPMI-1640 (αμφότερα συμπληρωμένο με 10% FCS και αντιβιοτικά) έδειξαν προσκόλληση των κυττάρων σε λιγότερο από 50% των δειγμάτων, ενώ μέσον AmnioMax-C100 επιτευχθεί προσκόλληση σε περισσότερο από το 80% των δειγμάτων (Πίνακας 2). Ο συνδυασμός της μεθόδου διαχωρισμού Miltenyi Biotec και μεσαίου AmnioMax-C100 χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα επόμενα πειράματα και είχε ως αποτέλεσμα ένα βραχυπρόθεσμο ενιαία στρωματική καλλιέργεια BC κυττάρου όγκου εντός δύο ημερών μετά την αφαίρεση του όγκου.

Η

UDS σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Λειτουργική NER-δραστηριότητα αναλύθηκε στο συνημμένο καρκινικών κυττάρων από 36 διαφορετικούς όγκους της ουροδόχου κύστης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία UDS. Επιπλέον, αξιολογήσαμε τα επίπεδα XPC-πρωτεΐνης στα ίδια κύτταρα με χρώση ανοσοφθορισμού. Η βαθμολογία για την XPC και UDS διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια μέθοδο βαθμολόγησης που συνέκρινε τη μέση ένταση χρώση των καρκινικών κυττάρων με εκείνη των φυσιολογικών ινοβλαστών ανθρώπινης C5RO, το οποίο συν-καλλιεργήθηκαν στο ίδιο κάλυμμα ολίσθησης με τα κύτταρα του όγκου. Οι ινοβλάστες στις μικτές καλλιέργειες σημάνθηκαν με 2 μm σφαιρίδια πολυστυρενίου για να τους διακρίνουν από τα κύτταρα του όγκου (Σχήμα 2). Σχεδόν το 42% (15/36) των όγκων της ουροδόχου κύστης που εκφράζονται τουλάχιστον δύο φορές χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης XPC από συν-καλλιεργημένα ινοβλάστες (0-50%) (Πίνακας 3). Οι περισσότεροι όγκοι εμφανίζονται σχεδόν φυσιολογικά επίπεδα πρωτεΐνης XPC (50-180% των συν-καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες). Δεν παρατηρήσαμε εντάσεις χρώσης XPC μικρότερη από 5%, ένα επίπεδο τυπικό για XPC-ανεπαρκή ινοβλάστες (XP21RO) που λαμβάνεται από έναν ασθενή-XP (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση XPC έδειξε πολύ αδύναμη συσχέτιση με UDS σε αυτούς τους όγκους: R

2 = 0.32 (Σχήμα 3Β). Οι περισσότεροι όγκοι με σχετικά χαμηλά επίπεδα XPC εμφανίζεται φυσιολογικά επίπεδα UDS (Εικόνες 2Β και 3). Κανονική UDS (πάνω από το 50% των συν-καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες) παρατηρήθηκε σε 34 από τα 36 δείγματα όγκων (Πίνακας 3). Δύο όγκοι έδειξαν μειωμένη UDS (λιγότερο από 50% των συν-καλλιεργήθηκαν έλεγχοι ινοβλαστών), όμως σε μία από αυτές ο UDS ήταν κοντά στο 50%, πολύ υψηλότερο από ό, τι παρατηρήθηκε σε XPC

– /- κύτταρα (Σχήματα 2C και 3Α) . Η άλλη όγκου έδειξε XPC και τα επίπεδα UDS παρόμοια με εκείνη της XPC

– /- κύτταρα. Δυστυχώς, λόγω έλλειψης υλικού θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί καμία περαιτέρω γενετική ανάλυση σε αυτόν τον όγκο. Καταλήγοντας, σχετικά χαμηλά επίπεδα έκφρασης XPC μπορεί να υποστηρίξει ακόμα δραστηριότητα NER και μειωμένη έκφραση XPC δεν επηρεάζει κατ ‘ανάγκη δραστηριότητα NER στην ex vivo καλλιεργημένα κύτταρα. Π.Χ.

Α. Επάνω αριστερά εμφανίζει την εικόνα όλων των πυρήνων DAPI. Στα δεξιά είναι ένα λαμπρό πεδίο (BF) εικόνα στην οποία το κύτταρο C5RO σημαίνεται με χάντρες κυτταροπλασματική πολυστερίνης. Επόμενο: φθορίζουσα χρώση XPC έκφραση πρωτεΐνης εμφανίζοντας XPC των κυττάρων του όγκου να είναι παρόμοια σε σύγκριση με παρακείμενες άγριου τύπου ινοβλαστών. Επάνω δεξιά εικόνα: edu φθορίζουσα χρώση εμφανίζοντας το σήμα UDS των καρκινικών κυττάρων να είναι παρόμοια σε σύγκριση με γειτονικά άγριου τύπου ινοβλαστών. Β Μέση σειρά από εικόνες αντιπροσωπεύουν ένα δείγμα όγκου της ουροδόχου κύστης που έχει χαμηλότερη έκφραση XPC σε σύγκριση με τα κύτταρα C5RO ωστόσο, τα φυσιολογικά επίπεδα της UDS. Γ Κάτω σειρά από εικόνες που αντιπροσωπεύουν έναν όγκο της ουροδόχου κύστης που έχει χαμηλή έκφραση XPC καθώς και χαμηλά επίπεδα UDS. Λευκό βέλος δείχνει άγριου τύπου κυττάρου C5RO. Άλλες πυρήνες αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένο δείγμα καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Η

Α. Κάθε όγκου αντιπροσωπεύεται με την αντίστοιχη βαθμολογία του για τα επίπεδα XPC και UDS ως ποσοστό του συν-καλλιεργημένα κύτταρα C5RO. Δεν όγκοι εμφανίζονται τα επίπεδα XPC τόσο χαμηλά όσο XP21RO, ένα XPC ελλιπή κυτταρική σειρά. Ένας όγκος έδειξε UDS αποτελέσματα παρόμοια με XP21RO. Β Scatterplot της UDS και βαθμολογίες XPC κάθε όγκου. επίπεδα XPC είναι συχνά χαμηλότερο από 50%. Δύο όγκοι εμφανίζουν επίπεδα UDS του χαμηλότερο από 50%, ωστόσο από ένα από αυτά τα επίπεδα είναι UDS κοντά στο 50%. Ο συντελεστής προσδιορισμού (R

2 = 0,32) δείχνει καθόλου ή πολύ αδύναμη συσχέτιση.

Η

Αυτό το εύρημα είναι απροσδόκητο υπό το φως της προηγούμενης έκδοσης που δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης XPC ποικίλες ανάμεσα σε μια μικρή ομάδα των μεμονωμένων καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές BC και η μία κυτταρική σειρά με χαμηλή στάθμη πρωτεΐνη XPC είχαν μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA. Πήραμε αυτή την κυτταρική σειρά (HT-1197) από την συλλογή ATCC και σε σύγκριση με ένα BC κυτταρική σειρά με φυσιολογική έκφραση XPC (Τ24). Παραδόξως, δεν παρατηρήσαμε μια διαφορά στα επίπεδα πρωτεΐνης XPC ούτε επίπεδα UDS μεταξύ φυσιολογικούς ινοβλάστες, T24 και ΗΤ-1197 κύτταρα, ακόμη και αν οι ινοβλάστες που προέρχονται από ένα XP ασθενή (XP21RO) παρουσίασε σαφώς μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης XPC και μειωμένη UDS (S3A Εικ) . Στη συνέχεια, συγκρίναμε το επίπεδο XPC των ΗΤ-1197 και άλλα γνωστά XPC-καλά και ελλιπή ως κύτταρα με ανοσοαποτύπωση (Εικ S3b). Και πάλι, ΗΤ-1197 δεν εμφανίζουν μειωμένο επίπεδο XPC, ενώ οι γνωστές XPC-ανεπαρκή κύτταρα έδειξαν μια σαφή έλλειψη πρωτεΐνης XPC. Αναλύσαμε επίσης την ευαισθησία των ΗΤ-1197 και Τ24 σε ακτινοβολία UV-C με διεξαγωγή μιας δοκιμασίας επιβίωσης αποικίας και δεν βρήκε καμία διαφορά στην ευαισθησία (S3C Εικ). Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το HT-1197 δεν έχει μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης XPC ούτε μειωμένη ικανότητα NER.

έκφραση XPC και τον κίνδυνο υποτροπής του BC

Τέλος, για να διερευνηθεί κατά πόσο επανεμφάνιση του όγκου έχει καμία επίπτωση σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης XPC συλλέξαμε πρόσθετα κλινικά σχετικών στοιχείων και σύγκριση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC από την πρωτοβάθμια NMIBC με εκείνη των επαναλαμβανόμενων NMIBC. επίπεδα XPC δεν διέφεραν σημαντικά (Mann-Whitney? p = 0.58) μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (Εικ S4A). Επίσης XPC επίπεδα πρωτεΐνης δεν διέφεραν σημαντικά (Mann-Whitney? P = 0.77) μεταξύ όγκων που έδειξαν υποτροπή εντός ενός έτους και όγκους που δεν το έκανε. Αυτά τα δεδομένα παρήχθησαν από την παρακολούθηση των ασθενών, ανεξάρτητα από το αν ένα δείγμα αναλύθηκε π.Χ. ήταν μια πρωτογενής όγκος ή η επανάληψη (S4B Εικ). Αυτό σημαίνει ότι τα επίπεδα έκφρασης XPC κακώς συσχετίζονται με τον κίνδυνο επανάληψης της NMIBC.

Συζήτηση

Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [13,14], βρήκαμε ότι η έκφραση εξασθενημένα πρωτεΐνη XPC είναι ένα κοινό φαινόμενο στην π.Χ., και τα δύο σε διαχωρισμένα κύτταρα όγκου όπως επίσης και σε δείγματα FFPE. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες δεν αναλύουν λειτουργική δραστηριότητα NER π.Χ.. Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει μια

ex vivo

σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας για την εκτέλεση UDS δοκιμασίες, μια λειτουργική δοκιμή για τη δραστηριότητα NER. Εδώ έχουμε επιβεβαιώσει ότι η έκφραση XPC ποικίλλει ευρέως μεταξύ των δειγμάτων πρωτογενούς π.Χ., αλλά αποτελεί έκπληξη, βρήκαμε ότι μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC δεν επηρεάζει γενικά την ικανότητα NER π.Χ.. Το πιο σημαντικό, λειτουργική ανεπάρκεια NER φαίνεται να είναι πολύ λιγότερο συχνές στο BC ό, τι θα αναμενόταν από παλαιότερες μελέτες. Μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC σε αυτούς τους όγκους φάνηκε αρκετή για να υποστηρίξει λειτουργικά NER. Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης XPC και του βαθμού του όγκου ή του σταδίου, ούτε παρατηρούμε μια σχέση με τον κίνδυνο υποτροπής του όγκου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης για την επιλογή όγκους της ουροδόχου κύστης για μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA.

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι σοβαρές λειτουργικές ανωμαλίες NER που προσδίδουν υπερευαισθησία σε χημικές ουσίες που προκαλούν NER-επισκευάσιμα βλάβη, είναι σπάνιες στην BC. Ως εκ τούτου, είναι απίθανο ότι μειωμένη δραστηριότητα NER μπορούν να αξιοποιηθούν θεραπευτικά σε BC. Επιπλέον, η συχνότητα των ελαττωμάτων XPC π.Χ. μπορεί να υπερεκτιμηθεί στη λογοτεχνία, καθώς δεν βρήκαμε μια XPC ούτε NER ελάττωμα στο ΗΤ-1197 κυτταρική γραμμή, από τα οποία στο παρελθόν είχε αναφερθεί στο λιμάνι τέτοια ελαττώματα [13]. Οι διαφορές στη μέθοδο ανίχνευσης των επιπέδων έκφρασης XPC ή την ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA μπορεί να εξηγήσει αυτές τις διαφορές. Παρ ‘όλα αυτά, πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι

XPC

πολυμορφισμοί του γονιδίου μπορεί να επηρεάσει π.Χ. κίνδυνο ή την πρόγνωση [10,12,21]. Είναι ακόμα άγνωστο αν αυτές οι πολυμορφισμοί επηρεάζουν έκφραση XPC, αλλά θα μπορούσε να είναι ότι το μείωσε έκφραση XPC και πολυμορφισμοί έχουν μια λεπτή επίδραση στη δραστηριότητα NER, η οποία θα μπορούσε να συμβάλει στην αύξηση μεταλλαξιγένεση και καρκινογένεση, ειδικά σε περιπτώσεις έκθεσης σε βλαπτικούς παράγοντες ορισμένες DNA π.χ. καπνός τσιγάρου. Η μελέτη μας είναι η πρώτη για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ των λειτουργικών επίπεδα δραστηριότητας NER και πρωτεΐνες XPC μετρηθεί άμεσα σε πρωτοπαθή καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Στην δοκιμασία, NER μας δραστηριότητα άνω του 50% (του συν-καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες) θεωρήθηκε φυσιολογική και ήπια μείωση δεν θα παρθούν. Από την άλλη πλευρά, UDS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε διάφορα ελαττώματα γονιδίου NER, σε ποντικό όπως επίσης και ανθρώπινα κύτταρα, παρουσιάζει σημαντικά μείωσε δραστηριότητες NER (λιγότερο από 50% των συν-καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες). Αυτό καταλήγει στο συμπέρασμα ότι η δοκιμασία UDS είναι κατάλληλη για την ανίχνευση μια ανεπάρκεια NER. Στα κύτταρα XP21Ro εμφανή επίπεδα XPC της τάξης του 5% συσχετίζονται καλά με την υπολειμματική δράση NER 10%. Κανένας από τους όγκους που αναλύθηκαν έδειξαν αυτό το χαμηλό επίπεδο των XPC, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα παρατηρούμενα επίπεδα XPC είναι σε θέση να υποστηρίξουν σχεδόν φυσιολογική NER και ότι XPC είναι πιθανόν να μην αξιολογείτε τον περιορισμό σε αυτούς τους όγκους. Η ex νίνο μοντέλο καλλιέργεια πρωτογενούς όγκου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ιδιαίτερα σχεδιαστεί και βελτιστοποιηθεί προκειμένου να αναλυθούν με ακρίβεια τα χαρακτηριστικά NER μεμονωμένων δειγμάτων όγκων της ουροδόχου κύστης. Ο πρωταρχικός όγκος διίσταται και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί γυάλινο κάλυμμα γλιστρά να διευκολυνθεί τυποποιημένες UDS δοκιμασίες και οι μετρήσεις XPC με απεικόνιση ανοσοφθορισμού. Αυτό το σύστημα καλλιέργειας έδειξε ισχυρή αναπαραγωγιμότητα και επομένως μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαλογή κλινικά δείγματα όγκου χρησιμοποιώντας λειτουργικές

ex vivo

δοκιμασίες. Το υψηλό ποσοστό επιτυχίας αυτής της μεθόδου αποτρέπει την εισαγωγή ενός μεροληψία επιλογής που προκαλείται από έκφυση του μόνο μια υποομάδα των κλινικών δειγμάτων καρκίνου. Ως εκ τούτου, αυτή η μέθοδος καλλιέργειας μπορεί να συμβάλει στην ταυτοποίηση βιοδεικτών που μπορούν να προβλέψουν απόκριση σε θεραπείες κατά του καρκίνου

πειραματικό σχεδιασμό μας έχει το πλεονέκτημα ότι άλλα κύτταρα μπορούν να συν-καλλιεργήθηκαν με τα καρκινικά κύτταρα ως εσωτερικοί έλεγχοι, εξαλείφοντας πειραματικά μεταβλητότητα μεταξύ των δειγμάτων. Στην πραγματικότητα, πολλαπλά κύτταρα ελέγχου μπορούν να ενσωματωθούν με τη χρήση πολυστυρενίου χάντρες διαφορετικού μεγέθους ή φθορίζον χρώμα. Με αυτό τον τρόπο έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι ένας όγκος με χαμηλότερο UDS έδειξαν υψηλότερα επίπεδα υπολειπόμενης χωρητικότητας επισκευή από μία XPC

– /-. Κύτταρο, υποδεικνύοντας ότι NER δεν ήταν πλήρως καταργηθεί στο εν λόγω δείγμα

Έτσι, η πρώτο σημαντικό συμπέρασμα από τα αποτελέσματα μας είναι ότι τα επίπεδα XPC δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για να καθοδηγήσει την επιλογή της θεραπείας ή ανταπόκριση στη θεραπεία με παράγοντες που προκαλούν βλάβη στο DNA NER-επισκευάσιμες στην BC. Μπορούμε επίσης να συμπεράνουμε ότι η

ex vivo

σύστημα καλλιέργειας και δοκιμασία UDS είναι καλά προσαρμοσμένα εργαλεία για τον εντοπισμό όγκων (πλην π.Χ.) με μειωμένη δραστηριότητα NER. Επιπλέον, θα μπορούσαν να αναπτυχθούν νέες δοκιμασίες λειτουργική επιδιόρθωση του DNA για την αξιολόγηση της δραστηριότητας των άλλων οδών επιδιόρθωσης DNA σε κύτταρα όγκου και τελικά στην ταυτοποίηση ελαττωμάτων επιδιόρθωσης του DNA που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν θεραπευτικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η μελέτη αυτή υπογραμμίζει τη μεγάλη σημασία των λειτουργικών δοκιμασιών για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των πιο έμμεσες μετρήσεις, όπως τα επίπεδα του RNA και της πρωτεϊνικής έκφρασης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. σύστημα ανοσολογική αντίδραση βαθμολόγησης (IRS).

Α σύστημα βαθμολόγησης IRS. Β Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης XPC σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης για τις διάφορες κατηγορίες των IRS

doi: 10.1371 /journal.pone.0126029.s001

(PDF)

S2 Εικ. Μικρές συστάδες των κυττάρων που συνδέονται με την κάλυψη των εκκαθαριστικών σημειωμάτων.

Α Αντιπροσωπευτικές εικόνες φωτεινού πεδίου δείχνουν διαφορετικές μάζες του ίδιου όγκου που συνδέεται με την καλυπτρίδα και άπλωμα. B. Σε περίπτωση κατάλληλης προσάρτησης η πλειονότητα των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά για κυτοκερατίνη 18, υποδεικνύοντας μία καθαρή καλλιέργεια των κυττάρων όγκου και όχι μολυσματικά ινοβλάστες. Μπλε = DAPI, πράσινο = κυτοκερατίνη 18.

doi: 10.1371 /journal.pone.0126029.s002

(PDF)

S3 Εικ. ΗΤ-1197 εμφανίζει φυσιολογική πρωτεΐνη XPC και τα επίπεδα UDS.

Α Ανοσοφθορισμού εικόνες συγκρίνοντας XPC και τα επίπεδα UDS του XP21RO, T24 και ΗΤ-1197 κύτταρα με εκείνη των κυττάρων C5RO. XP21RO είναι γνωστό ότι είναι ανεπαρκής σε XPC και UDS. Καμία διαφορά παρατηρείται μεταξύ T24 και HT-1197. Μπλε = DAPI, BF = Φωτεινό πεδίο εικόνα που δείχνει C5RO κύτταρα επισημαίνονται με χάντρες 2 μm πολυστερίνης, επίπεδο = έκφραση XPC πράσινο, το επίπεδο Κόκκινο = UDS. Λευκό βέλη δείχνουν τους πυρήνες του αντίστοιχου κυτταρικής γραμμής. Β Ανοσοστύπωμα για XPC σύγκριση HT-1197 με Τ24, ελλιπής και άγρια ​​γνωστό XPC ινοβλάστες τύπου. δοκιμασία επιβίωσης Γ αποικίας που δείχνει την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των ΗΤ-1197 και T24 κυττάρων μετά από την υπεριώδη ακτινοβολία. Δεν παρατηρείται διαφορά μεταξύ ΗΤ-1197 και Τ24. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση με βάση τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0126029.s003

(PDF)

S4 Εικ. τα επίπεδα της πρωτεΐνης XPC και την επανάληψη των όγκων.

Α Οι όγκοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, πρωτογενείς όγκους και επαναλαμβανόμενες όγκους, και τυποποιημένα αποτελέσματα έκφρασης πρωτεΐνης XPC συγκρίθηκαν από αυτές τις ομάδες. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των ομάδων αυτών. Mann-Whitney test, ρ = 0,58. Β Ασθενής δεδομένα παρακολούθησης δείχνουν καμία διαφορά μεταξύ των επιπέδων XPC από όγκους που δεν θα επαναληφθεί εντός ενός έτους από TUR και όγκους που θα επαναληφθεί. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει έναν όγκο. Οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει μέση και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν διατεταρτημοριακό εύρος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0126029.s004

(PDF)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω η κλινική ομάδα του τμήματος Ουρολογίας και το τμήμα Παθολογίας του Erasmus Medical Center του Ρότερνταμ για την υποστήριξη στη συλλογή ερευνητικού υλικού.