Αφηρημένο

Ανεξάρτητα από τις επιτεύξιμη υφέσεις με ορμονική θεραπεία πρώτης γραμμής σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (ΚΓΠ), η ασθένεια δεν εμπίπτει στην εξαρτώμενη από ορμόνη στάδιο σε μια πιο επιθετική κατάσταση όπου η χημειοθεραπεία είναι η μόνη αποτελεσματική θεραπεία και δεν αγωγή είναι θεραπευτική. Αυτό καθιστά πολύ σημαντικό για τον εντοπισμό νέων στόχων που μπορούν να βελτιώσουν την έκβαση της θεραπείας. ΑΤΜ και DNA-PK είναι οι δύο κινάσες υπεύθυνη για τη σηματοδότηση και την επισκευή διπλό διαλείμματα σκέλος (ΟΕΔ). Έτσι, και οι δύο κινάσες είναι συναφείς στόχοι σε θεραπεία καπάκι για να ενισχυθεί η δραστικότητα των πολυάριθμων DNA DSB παραγόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία CaP όπως ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) επαγωγή. δοκιμασία σχηματισμού αποικίας χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η ευαισθησία των εξαρτώμενων ορμόνης, ρ53 wt (LNCaP) και ανεξάρτητων ορμόνης μεταλλαγμένο ρ53 (PC3) κυτταρικές γραμμές CaP στην κυτταροτοξική δράση του IR και δοξορουμπικίνη παρουσία ή απουσία Ku55933 και NU7441 τα οποία είναι μικρού μορίου αναστολείς της ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ, αντίστοιχα. Ροής μέθοδοι που βασίζονται κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η επίδραση των δύο αναστολέων επί του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και σχηματισμό εστιών Η2ΑΧ. Ουδέτερη κομήτη δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επαγωγή του DNA DSBs. Ku55933 ή NU7441 μόνον αύξησε την ευαισθησία των κυτταρικών σειρών τάπα με την ϋΝΑ βλαπτικούς παράγοντες, ωστόσο συνδυάζει και τις δύο αναστολείς μαζί οδήγησε σε περαιτέρω ενίσχυση της ευαισθησίας. Το προφίλ του κυτταρικού κύκλου και των δύο κυτταρικών γραμμών επηρεάσθηκε με αυξημένο κυτταρικό θάνατο, το DNA DSBs και σχηματισμού εστιών Η2ΑΧ. Η μελέτη αυτή δικαιολογεί περαιτέρω αξιολόγηση των αναστολέων ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ για κλινική εφαρμογή σε ασθενείς καπάκι. Επιπλέον, η επαυξημένη αποτέλεσμα που προκύπτει από το συνδυασμό των δύο αναστολείς ενδέχεται να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για τη θεραπεία των ασθενών Cap ο οποίος έχει ένα ελάττωμα σε ένα από τα δύο μονοπάτια επιδιόρθωσης DSB

Παράθεση:. Shaheen FS, Znojek P, Fisher A , Webster Μ, Plummer R, Gaughan L, et al. (2011) Στόχευση του DNA διπλό σκέλος Μηχανήματα επισκευής Break στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 6 (5): e20311. doi: 10.1371 /journal.pone.0020311

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 18 του Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 28η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 23 του Μάη 2011

Copyright: © 2011 Shaheen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Αγά Χαν, www.akdn.org/AKF, CRUK, CancerResearchUK.org, MRC, www.mrc.ac.uk και AICR, www.aicr.org.uk. . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Ένας από τους συγγραφείς, Graeme Ο.Μ. Smith, απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία, KuDOS Pharmaceuticals Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, UK. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με τις Η.Π.Α. National Institutes of Health, η προσαρμοσμένη στην ηλικία συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη 2003-2007 ήταν 156,9 ανά 100.000 άνδρες ετησίως. Παρά το γεγονός ότι τα υψηλά ποσοστά ανταπόκρισης μπορεί να επιτευχθεί με θεραπεία πρώτης γραμμής με χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, αντιανδρογόνο ή συνδυασμούς τους? η φυσική εξέλιξη της νόσου είναι προς το ορμονοάντοχο κατάσταση [1] όπου η χημειοθεραπεία είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία, αλλά ακόμα δεν θεραπευτική [2]. Αυτή η αντίσταση τονίζει τη σημασία της αναγνώρισης νέων στόχων που μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων πώματος και ως εκ τούτου τα ποσοστά ανταπόκρισης και τη συνολική επιβίωση των ασθενών. Αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και η καταλυτική υπομονάδα εξαρτώμενη DNA κινάσης πρωτεΐνης (DNA-PKcs) είναι μέλη των κινασών φωσφατιδυλο ινοσιτόλης σχετίζονται 3-κινάσης (Pikk) υπεροικογένεια. Τα μέλη αυτής της οικογένειας χαρακτηρίζεται από υψηλή βάρος και η αλληλουχία τους ομοιότητας μοριακό έως το ρ110 υπομονάδα λιπιδίου κινάσης ΡΙ3-κινάσης [3]. Σε κύτταρα θηλαστικών, ΑΤΜ και DNA-PK παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόκριση του DNA διπλό σπάσιμο σκέλος (ΟΕΔ), μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) και μη ομόλογο λήξης που ενώνει (NHEJ), αντίστοιχα [4], [5]. Ταχεία φωσφορυλίωση τόσο ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ λαμβάνει χώρα σε απόκριση προς DSB εξής ενδογενείς ή εξωγενείς προσβολές. Μόλις ενεργοποιηθεί, ΑΤΜ και το σήμα της ΟΝΑ-ΡΚ σε ένα ευρύ φάσμα των κατάντη στόχων που εμπλέκονται στη διαδικασία επισκευής, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [6]. Η επιλογή των οποίων επισκευές οδού η ΟΕΔ είναι κυτταρικού κύκλου στάδιο εξαρτάται, με ΝΗΕΙ είναι η κυρίαρχη οδός στην G0 και G1, και HR κυριαρχεί σε S και G2 /M φάσεων [7]. ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ διασπώνται από κασπάσης 3 μόλις η απόφαση για την ενεργοποίηση της απόπτωσης γίνεται στο κύτταρο και αυτό το γεγονός διάσπασης πιστεύεται ότι διευκολύνει την απόπτωση, απενεργοποιώντας τον μηχανισμό σηματοδότησης και επιδιόρθωση του DNA [8], [9]. Παραδοσιακά αναστολέας ΡΙ3Κ, γουορτμανίνη με γενικά χαμηλή εκλεκτικότητα έναντι διαφορετικών τάξεων ή /και ισομορφές της Pikk έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη ATM και μονοπάτια σηματοδότησης DNA-PK [10]. Ku55933 ταυτοποιήθηκε ως ένας ισχυρός και ειδική ΑΤΡ ανταγωνιστικός αναστολέας της ΑΤΜ (IC

50 13 nmol /L) σε σχέση με την αναστολή άλλων μελών της οικογένειας Pikk. Ku55933 αύξησε την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε IR, μεταβάλλεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου τους, και ανέστειλε την φωσφορυλίωση ενός πάνελ των στόχων ΑΤΜ. Α-Τ κύτταρα δεν εμφανίζουν αυτά τα αποτελέσματα όταν κατεργάζεται με Ku55933 [11]. NU7441 ταυτοποιήθηκε ως ένας ισχυρός και ειδική ΑΤΡ ανταγωνιστικός αναστολέας της ΟΝΑ-ΡΚ (IC

50 14 nmol /L) με 100-πλάσια εκλεκτικότητα για ΟΝΑ-ΡΚ σε σχέση με άλλα μέλη της οικογένειας PI3KK. NU7441 αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε αναστολείς IR και τοποϊσομεράσης II, και μεταβάλλεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου τους. DNA-ΡΚ κύτταρα με ανεπάρκεια V3 δεν έδειξαν αυτά τα αποτελέσματα όταν κατεργάζεται με NU7441 [12]. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε ως προκλινική αξιολόγηση των δύο αναστολέων ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ να διερευνήσει κατά πόσον αυτοί οι αναστολείς μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των παραγόντων επαγωγής DNA DSB για θεραπεία πώμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Όλα τα συνήθη χημικά ήταν η αγορά από Sigma, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. NU7441 συντέθηκε στο βόρειο Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, Πανεπιστήμιο του Newcastle (Newcastle upon Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο) σε συνεργασία με KuDOS Pharmaceuticals (Cambridge, UK). KU-55933 ήταν ένα είδος δώρο από KuDOS Pharmaceuticals. Και οι δύο αναστολείς διαλύθηκαν σε DMSO σε μία συγκέντρωση αποθέματος από 2.000 × τελικής συγκέντρωση που απαιτείται για το πείραμα. Η δοξορουβικίνη διαλύθηκε σε νερό σε συγκέντρωση παρακαταθήκης 1000 × τελικής συγκέντρωση που απαιτείται για το πείραμα. Όλες οι ενώσεις αποθηκεύτηκαν σε υποπολλαπλάσια στους -20 ° C.

Κυτταροκαλλιέργεια

LNCaP ορμόνη ευαίσθητη (ρ53 άγριου τύπου) και PC3 ορμόνη ευαίσθητος (null p53) κυτταρικές σειρές CaP αγοράστηκαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FCS. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές συνήθως διαλογή για Mycoplasma.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε διαφορετικές πυκνότητες. Αφού αφέθηκε να αποδίδουν, τα κύτταρα επωάστηκαν με Ku55933 (10 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με NU7441 (1 μΜ) για 1 ώρα πριν είτε ακτινοβολία (0-2 Gy), ή θεραπεία δοξορουβικίνη (0-75 ηΜ). 24 ώρες αργότερα, τα φρεάτια πλύθηκαν δύο φορές απαλά με θερμό PBS πριν από την προσθήκη φρέσκου μέσου και επέστρεψαν στον επωαστή για 7-10 ημέρες για τα κύτταρα PC3 και 12-14 ημέρες για τα κύτταρα LNCaP να σχηματίζουν αποικίες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με στερεωτικό Carnoy, ξηραίνεται, χρωματίστηκαν με 0.4% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν με το χέρι. Ο παράγοντας μείωσης επιβίωση υπολογίστηκε ως ο επιζών κλάσμα κυττάρων απουσία των αναστολέων διαιρούμενο με το κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων στην παρουσία αναστολέων για οποιαδήποτε δεδομένη δόση ή συγκέντρωση του κυτταροτοξικού παράγοντα.

μέθοδος κυτταρομετρίας ροής που βασίζεται για τον κυτταρικό κύκλο

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ NU7441 και /ή 10 μΜ Ku55933 πριν IR ή δοξορουβικίνη θεραπεία. 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωλήνες FACS (Becton & amp? Dickinson, Οξφόρδη του Ηνωμένου Βασιλείου) διατηρώντας την αυξητικό μέσο πριν βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα δείγματα αναλύθηκαν απευθείας σε ένα FACScan (Becton & amp? Dickinson)., Ένταση φθορισμού σε αυθαίρετες μονάδες απεικονίστηκε γραφικά σε ιστογράμματα, και οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας WinMDI έκδοση 2.8 (Η Research Institute Scrrips, USA)

ροής μέθοδος κυτταρομετρία βάση για δραστική κασπάση 3

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τους αναστολείς ή /και βλάβης του DNA παράγοντα όπως περιγράφηκε προηγουμένως και συλλέγονται σε σωλήνες FACS διατήρηση του μέσου ανάπτυξης. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με FITC συζευγμένο αντίσωμα δραστικό κασπάσης 3 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Becton Dickinson, Οξφόρδη του Ηνωμένου Βασιλείου) και αναλύθηκαν απευθείας σε ένα FACScan. Η ένταση φθορισμού σε αυθαίρετες μονάδες απεικονίστηκε γραφικά σε διαγράμματα σημείων, και η μέση ένταση φθορισμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας WinMDI version2.8.

ροής μέθοδος κυτταρομετρία βάση για το σχηματισμό εστιών γ-Η2ΑΧ

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 πλάκες καλά, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τους αναστολείς ή /και βλάβης του DNA παράγοντα όπως περιγράφηκε προηγουμένως και συλλέγονται σε σωλήνες FACS. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας FITC συζευγμένο αντίσωμα γH2AX όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Τα δείγματα αναλύθηκαν απευθείας σε ένα FACScan. Η ένταση φθορισμού σε αυθαίρετες μονάδες απεικονίστηκε γραφικά σε ιστογράμματα, και η μέση ένταση φθορισμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας WinMDI version2.8.

κηλίδωση

ολόκληρου εκχυλίσματα Western κυττάρων παρασκευάσθηκαν 6 ώρες μετά από 1 μΜ δοξορουβικίνης και 1 h μετά από 10 Gy IR με την παρουσία και απουσία των αναστολέων. Ισοδύναμες ποσότητες κυτταρολύματος φορτώθηκαν σε 4.5, 6, 12 και 15% πήγματα παράλληλα με ένα δείκτη πρωτεΐνης SeeBlue® προχρωσμενος Πρότυπο (Invitrogen, USA). Οι πηκτές ηλεκτροφορήθηκαν και πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Hybond-C. ECL σύστημα (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση συζευγμένο πρωτεΐνες αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και οπτικοποιήθηκαν με έκθεση σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak, Herts, UK). Αντι DNA-PK, αντι ATM, αντι DNA-PK

Ser2056 και αντι DNA-PK

Thr2906 αγοράστηκαν από (Abcam, Cambridge UK). Αντι ATM

Ser1981, κατά H2AX

Ser139 και αντι p53

Ser15 αγοράστηκαν από (Gene Tex, USA), (Upstate, Ηνωμένο Βασίλειο) και (Cell σηματοδότηση, UK), αντίστοιχα.

Neutral κομήτη

δοκιμασία

PC3 υποβλήθηκαν σε ουδέτερη κομήτη δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, USA). Εφαρμόστηκαν δύο βασικές τροποποιήσεις, τα κύτταρα λύθηκαν επί 1 ώρα και ηλεκτροφορήθηκαν επί 30 λεπτά σε 30 V. Κομήτες έγιναν ορατά με φθορισμό Leica DMR μικροσκόπιο και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Komet 5.5 (κινητική απεικόνισης Ltd, Nottingham, UK).

η στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας version4 λογισμικού πρίσματος (GraphPad Prism, San Diego, USA).

Αποτελέσματα

Ku55933 και NU7441 αναστέλλουν ΑΤΜ και DNA-PK κινάσης δραστηριότητα αντίστοιχα IR και δοξορουβικίνη αντιμετωπίζονται CaP κύτταρα

ATM που εξαρτώνται από ΑΤΜ

Ser1981, p53

Ser15, H2AX

Ser139 και DNA-PK

Thr2609 φωσφορυλίωσης προκλήθηκαν 1 ώρα μετά από 10 Gy και 6 ώρες μετά από 1 μΜ δοξορουβικίνης και ανεστάλησαν με Ku55933. IR που προκαλείται DNA-PK

φωσφορυλίωση Ser2056 (αναφέρεται ως ιστοσελίδα αυτοφωσφορυλίωση DNA-PK) ανεστάλη από NU7441 (όπως αναμενόταν) και εκπληκτικά δοξορουβικίνη που προκαλείται DNA-PK

φωσφορυλίωση Ser2056 επίσης αναστέλλεται από Ku55933. NU7441 δεν ανέστειλε ATM

Ser1981, ρ53

Ser15, Η2ΑΧ

Ser139 και DNA-ΡΚ

Thr2609 φωσφορυλίωση (Σχήμα 1).

κυτταρικά εκχυλίσματα ολόκληρου LNCaP παρασκευάστηκαν 1 ώρα μετά 10 Gy και 6 ώρες μετά από 1 μΜ δοξορουβικίνης ± 10 μΜ Ku55933 ή 1 μΜ NU7441. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western και διερευνήθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ku55933 και NU7441 είναι ελάχιστα κυτταροτοξικά για τα κύτταρα CaP

Για να προσδιοριστεί η εγγενής κυτταροτοξικότητα των Ku55933 και NU7441 σε σχέση με χημειο και ραδιοευαισθητοποίηση , τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις Ku55933 ή NU7441 με ελάχιστα κυτταροτοξική συγκέντρωση IR (1 Gy) ή δοξορουβικίνη (10 ηΜ). Τόσο Ku55933 (10 μΜ) και NU7441 (1 μΜ) προκάλεσε ελάχιστο ή καθόλου κυτταροτοξικότητα σε LNCaP (Σχήμα 2Α & amp? Β) και PC3 (Εικόνα 2C & amp? D). Κάθε αναστολέα αυξήθηκαν σημαντικά IR και δοξορουβικίνη κυτταροτοξικότητα στις δύο κυτταρικές σειρές CaP σε έναν αναστολέα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτές οι δύο συγκεντρώσεις (10 μΜ Ku55933 ή 1 μΜ NU7441) χρησιμοποιήθηκαν σε επόμενα πειράματα

LNCaP (Α & amp? Β). Ή PC3 (C & amp? D) κύτταρα σπάρθηκαν σε διαφορετικές πυκνότητες και αφέθηκαν να προσκολληθούν πριν 1 ώρα επώαση με διάφορες συγκεντρώσεις του Ku55933 ή NU7441 πριν από την ακτινοβολία 1 Gy ή 10 ηΜ θεραπεία δοξορουβικίνης για 24 ώρες (

P

& lt? 0.001). LNCaP (Ε & amp? F) ή PC3 (G & amp? Η) κύτταρα σπάρθηκαν σε διαφορετικές πυκνότητες και αφέθηκαν να προσκολληθούν πριν από 1 ώρα επώαση με Ku55933 (10 μΜ) ή NU7441 (1 μΜ) πριν από τη θεραπεία με μεταβαλλόμενες δόσεις IR ή της συγκέντρωσης doxorubicin για 24 h (

P

& lt? 0.001). Όλα τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM.

Η

Ku55933 και NU7441 μειωμένη κυτταρικές σειρές CaP κυτταρική επιβίωση σε απόκριση σε IR ή δοξορουβικίνη

Αφού έδειξε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση και χημειο ραδιοευαισθητοποίηση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, μπορούμε τότε διερευνήθηκε η απόκριση σε μια σταθερή συγκέντρωση του κάθε αναστολέα με αυξημένες συγκεντρώσεις doxorubicin ή δόσης IR. Υπήρξε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην επιβίωση των κυττάρων σε απόκριση σε IR. PC3 κύτταρα που εμφανίζεται αντοχή σε σύγκριση με IR LNCaP, συνδυάζοντας NU7441 ή Ku55933 με IR μείωσε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων για LNCaP (Σχήμα 2Ε) και ουσιαστικά για PC3 (Εικόνα 2G). Ομοίως, η δοξορουβικίνη μειωμένη κυτταρική επιβίωση και στις δύο κυτταρικές σειρές, Περαιτέρω χημειο-ευαισθητοποίηση προέκυψε από το συνδυασμό NU7441 ή Ku55933 σε LNCaP (Σχήμα 2F) και PC3 (Εικόνα 2Η). Συνδυάζοντας τα δύο αναστολείς αύξησε σημαντικά την χημειο-ραδιοευαισθητοποίηση και NU7441 συνδυασμό ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην επαγωγή chemosensitisation σε LNCaP, ενώ Ku55933 συνδυασμός είχε περισσότερη επίδραση στην πρόκληση ραδιοευαισθητοποίησης στα PC3 προτείνοντας ένα προηγμένο ρόλο για ΑΤΜ στο πυρίμαχο μοντέλο ορμόνη

.

Ku55933 και NU7441 αλλαγμένη του κυτταρικού κύκλου και την αυξημένη απόπτωση τους για την αντιμετώπιση της βλάβης του DNA σε κυτταρικές σειρές CaP

επόμενο καθοριστεί αν η αυξημένη ευαισθησία των κυτταρικών σειρών καπάκι είναι συνοδεύεται από αυξημένη απόπτωση ή αλλαγές στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου. IR προκαλείται ελάχιστη /καμία αύξηση σε LNCaP (Εικόνα 3Α) σε σύγκριση με μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συσσώρευση G2 σε PC3 (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, ο συνδυασμός και των δύο αναστολέων είχε ένα προσθετικό αποτέλεσμα επί της συσσώρευσης G2 σε χαμηλή δόση (2 Gy), αλλά όχι σε υψηλή δόση (10 Gy). Η δοξορουβικίνη κύτταρα θεραπεία προκάλεσε να συσσωρεύονται σε G2 /M ιδιαίτερα σε υψηλή δόση. Σε γενικές γραμμές, συνδυάζοντας είτε αναστολέα με δοξορουβικίνη χαμηλή δόση (20 ηΜ) αύξησε G2 M συσσώρευση /παρόλο NU7441 είχε μόνο μέτρια επίδραση σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3C). Ότι το ενιαίο συνδυασμός αναστολέα σε υψηλή δοξορουβικίνη δόση (200 ηΜ) είχε ως αποτέλεσμα μια εντυπωσιακή αύξηση στην subG1 σε LNCaP (Σχήμα 3C) σε σύγκριση με μια ενδιαφέρουσα αύξηση της G1 σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 3D). Ένα πρόσθετο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν συνδυάζοντας τις δύο αναστολείς

LNCaP (Α & amp? C). Και PC3 (Β & amp? D) κύτταρα επωάστηκαν με Ku55933 (10 μΜ) και /ή NU7441 (1 μΜ) πριν την έκθεση σε οι υποδεικνυόμενες δόσεις του IR ή δοξορουβικίνη για 48 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν απευθείας στο ΡΑΟδοαη. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. LNCaP (Ε) και PC3 (F) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω και χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι κασπάσης 3 αντίσωμα πριν από την άμεση ανάλυση επί FACScan. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SD.

Η

IR προκάλεσε μία δόση θάνατο κυττάρου που εξαρτάται στις δύο κυτταρικές σειρές. LNCaP απόπτωση ενισχύθηκε όταν συνδυάζεται Ku55933 ή /και NU7441 (Σχήμα 3Ε). Ωστόσο, PC3 κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 3F) αυξήθηκε σε απόκριση προς τους συνδυασμούς αναστολέα σε μόνο χαμηλή δόση. Η αυξημένη απόπτωση που προκαλείται από το συνδυασμό και των δύο αναστολέων είναι συνεπής με τα δεδομένα που δείχνουν την επιβίωση ραδιοευαισθητοποίησης ήταν εντονότερη για δύο κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με δύο αναστολείς μαζί. Επιπλέον, Ku55933 επάγεται μεγαλύτερη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με NU7441 οποίο ήταν ένα παρατηρούνται σταθερά επίδραση του Ku55933 στην επιβίωση των ακτινοβολημένων κυττάρων PC3. Η δοξορουβικίνη προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη δραστικότητα κασπάσης 3 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Συνδυάζοντας Ku55933 ή /και NU7441 με 20 ηΜ δοξορουβικίνη ενίσχυσε την κυτταρικό θάνατο των LNCaP (Σχήμα 3Ε) και κύτταρα PC3 (Εικόνα 3F). Μια μαζική αύξηση των LNCaP απόπτωση προέκυψε από Ku55933 ή /και NU7441 σε συνδυασμό με 200 nM δοξορουβικίνη, 95-99% των κυττάρων ήταν θετικά για την ενεργό caspase3, ενώ καμία αύξηση ανιχνεύθηκε στα PC3 κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

Τέλος, , τα δεδομένα απόπτωση είναι συμβατό με δεδομένα επιβίωσης καθώς η μαζική επαγωγή απόπτωσης συσχετίζεται με σοβαρή μείωση στην κυτταρική επιβίωση σε υψηλές δόσεις της δοξορουβικίνης. Επιπλέον, NU7441 ήταν ανώτερη από τη Ku55933 στην επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα LNCaP. Ότι, Ku55933 είχαν μεγαλύτερη επίδραση στα κύτταρα PC3 η οποία είναι συνεπής με τα δεδομένα επιβίωσης.

Ku55933 και NU7441 αυξήσει την επαγωγή του DNA DSB σε κυτταρικές σειρές CaP

Εμείς διερευνηθεί κατά πόσον η αύξηση στο Cap κυττάρων γραμμές ευαισθησία σε απόκριση σε ATM ή /και αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ είναι αποτέλεσμα της αύξησης του αριθμού των DNA DSBs με άμεσο μέτρο της σήματος Η2ΑΧ και άμεσο μέτρο του DNA DSB (ουδέτερο κομήτη δοκιμασίας). Όπως αναμενόταν γ-Η2ΑΧ σήματος αυξάνονται 0,5 ώρες μετά από IR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και επέστρεψαν στα φυσιολογικά επίπεδα μέσα σε 4 ώρες σε LNCaP κύτταρα (Σχήμα 4Α), ενώ μειώθηκε μόνο κατά 50% σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 4Β) που υποδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα επιδιόρθωσης σε LNCaP σε σύγκριση με PC3. θεραπεία Doxorubicin προκάλεσε εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση των γ-Η2ΑΧ σε LNCaP (Σχήμα 4C) και PC3 (Εικόνα 4D). Συνδυάζοντας είτε Ku55933 ή και τους δύο αναστολείς είτε με IR ή δοξορουβικίνη μείωσε το σήμα γ-Η2ΑΧ στις δύο κυτταρικές σειρές σε όλα τα χρονικά σημεία που εξετάστηκαν το οποίο είναι σύμφωνο με ΑΤΜ να είναι το κύριο κινάση υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση Η2ΑΧ και η αδυναμία των ΟΝΑ-ΡΚ να φωσφορυλιώνει Η2ΑΧ σε η παρουσία του παρεμπόδισε ΑΤΜ. NU7441 ανέστειλε μετρίως τον αρχικό επαγωγή γ-Η2ΑΧ σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές μετά από IR και δοξορουβικίνη. Ωστόσο, σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ οδήγησε σε αυξημένο σήμα γ-Η2ΑΧ αντανακλά αυξημένη DSBs DNA τονίζεται από γ-Η2ΑΧ, συνέπεια της φωσφορυλίωσης από την ενεργή ΑΤΜ. Αξιοσημείωτη, σε πειράματα όπου και οι δύο κινάσες ανεστάλησαν δεν υπήρξε περαιτέρω αύξηση του σήματος Η2ΑΧ. PC3 κύτταρα έδειξαν μικρή αύξηση στην ουρά κομήτη στιγμή 24 ώρες μετά IR ή δοξορουβικίνη αντανακλώντας υψηλή ικανότητα τους να επισκευάσει το DNA βλάβες ζημιές τους. Εντούτοις, ο συνδυασμός είτε αναστολέα είτε με DNA μέσο βλάβης που προκαλείται μέτρια αύξηση στη στιγμή ουρά. Συνδυάζοντας τις δύο αναστολείς είχε μια αύξηση πρόσθετο στην ουρά στιγμή (Σχήμα 4Ε)

LNCaP (Α & amp? C). Και PC3 (Β & amp? D) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 Gy ή 1 μΜ δοξορουβικίνης ακόλουθη επώαση 1 ώρας με Ku55933 (10 μΜ) και /ή NU7441 (1 μΜ) και χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντίσωμα Η2ΑΧ πριν να αναλυθούν απευθείας στο ΡΑΟδοαη. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον 5 ανεξάρτητα πειράματα ± SEM. PC3 κύτταρα (Ε) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως παραπάνω για 24 ώρες και αναλύθηκε με τη χρήση ανιχνεύσεως κομήτη, 50 κύτταρα μετρήθηκαν ανά θεραπεία βραχίονα. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των 3 ανεξάρτητα πειράματα ± SEM

Η

Αξίζει να σημειωθεί, η αύξηση που προκύπτει από την επεξεργασία δοξορουβικίνη ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με εκείνο που προκύπτει από IR.? αυτό θα μπορούσε να είναι εν μέρει σχετίζονται με το γεγονός ότι το IR προκαλεί κυρίως υψηλότερο επίπεδο μόνο διαλείμματα σκέλος.

Συζήτηση

Ku55933 και NU7441 είναι ισχυροί αναστολείς του ΑΤΜ και DNA-PK, αντίστοιχα. Κάθε αναστολέας κατάργησε την αυτοφωσφορυλίωση του δικού στόχου πρωτεΐνες σε δύο κυτταρικές σειρές CaP εξής IR. Τα δεδομένα με τη θεραπεία δοξορουβικίνης ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, αλλά η φωσφορυλίωση ϋΝΑ-ΡΚ

Ser2056 δεν φαίνεται να αναστέλλεται από NU7441. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η φωσφορυλίωση των κατάντη στόχους H2AX

Ser139 και p53

Ser15 που ρυθμίζονται κυρίως από ΑΤΜ καταργήθηκε όταν συνδυάστηκαν οι δύο αναστολείς. Επιπλέον, ένα νέο συμβάν φωσφορυλίωσης αναφέρεται εδώ ως η φωσφορυλίωση των Ser2056 του DNA-PKcs, πιστεύεται ότι είναι ένας αληθινός τοποθεσία αυτοφωσφορυλίωσης για ΟΝΑ-ΡΚ [14], μειώθηκε μετά τη θεραπεία Ku55933 (δεν NU7441) σε απόκριση προς δοξορουβικίνη αλλά όχι IR θεραπείας γεγονός που υποδηλώνει αυτό το site θα μπορούσε να απευθύνονται από ΑΤΜ, ανάλογα με τον παράγοντα που προκαλεί βλάβες στο DNA. Ένα σχετικό ελέγχου θα ήταν να καταστρέφουν μητρική ΑΤΜ και να υποκαταστήσει με ένα ΑΤΜ κινάση-νεκρή.

Ο συνδυασμός είτε αναστολέα με IR ή δοξορουβικίνη είχε ως αποτέλεσμα μια μαζική και σημαντική αύξηση της ευαισθησίας των LNCaP και PC3 κύτταρα στον κυτταροτοξικό επίδραση και των δύο IR και δοξορουβικίνη. Επιπλέον, το συνδυασμό των δύο αναστολέων μαζί με παράγοντες που βλάπτουν το DNA είχε σαν αποτέλεσμα περαιτέρω βελτίωση όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με μόνο συνδυασμό αναστολέα. Αυτό συμφωνεί με αναφερόμενη βιβλιογραφία όπου στόχευσης ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ χρησιμοποιώντας μεθοδολογία siRNA αποκάλυψε αυξημένη ευαισθησία σε IR και στη χημειοθεραπεία με διαφορετικούς CaP κυτταρικές γραμμές [15]. Η αυξημένη ευαισθησία που προκύπτει από το συνδυασμό των δύο αναστολέων μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις για τη θεραπεία της πνευμονίας σε ασθενείς με βλάβη στα μονοπάτια ΥΕ ή ΝΗΕΙ όπως φορείς μετάλλαξη BRCA [16]. Οι ασθενείς με ατέλεια σε μία οδό επιδιόρθωσης θα μπορούσε δυνητικά να αντιμετωπιστεί με τον αναστολέα του άλλου οδού και να επωφελούνται από το μέγιστο αποτέλεσμα της θεραπείας με ελάχιστη τοξικότητα.

Στο παρόν, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του PC3 κυτταρικού κύκλου, η έλλειψη λειτουργίας ρ53, οδήγησε σε αυξημένη συσσώρευση στη G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου με την παρουσία του ΑΤΜ, ϋΝΑ-ΡΚ ή δύο αναστολείς ιδιαίτερα όταν συνδυάζεται με θεραπεία IR. Ωστόσο, αναστέλλοντας είτε ATM ή DNA-ΡΚ ή και τα δύο σε συνδυασμό με θεραπεία δοξορουβικίνη υψηλή δόση αύξησε την συσσώρευση G1-φάση, υποδεικνύοντας ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου G1 από άλλες οδούς, όπως η p38MAPK /MK2 [17]. Με την παρουσία του λειτουργικού ρ53 (LNCaP κύτταρα), τα κύτταρα συσσωρεύονται στο G2 /M φάση όταν ATM ανεστάλη ενώ συσσωρεύεται στο G1 όταν το DNA-ΡΚ ανεστάλη. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τα δεδομένα επιβίωσης από τη συσσώρευση σε G2 θα επιτρέψει πιο ΝΗΕΙ μεσολάβηση επιδιόρθωση του DNA. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν προηγούμενες αναφορές που υποδηλώνει ότι η επίδραση της ΟΝΑ-ΡΚ σε p53 συμβάλλει στη διαδικασία της απόπτωσης παρά στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Είναι ενδιαφέρον ότι η αναστολή ATM οδηγεί σε συσσώρευση G2 η οποία μπορεί να εξηγηθεί από την επίδραση της κινάσης δραστικών ATR απουσία δραστικής κινάσης ATM [18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, συνδυάζοντας είτε αναστολέα είτε το διπλό συνδυασμό αναστολέα με υψηλή δοξορουβικίνη δόση (υπερβολική βλάβη του DNA) οδήγησε σε δραματική αύξηση του πληθυσμού subG1, μια ένδειξη της απόπτωσης. Αυτό υποδηλώνει ότι η παρουσία του ρ53 μπορεί να πυροδοτήσει θάνατο κυττάρου, όταν η βλάβη στο DNA είναι πολύ ουσιαστικό να επισκευαστεί. Τα δεδομένα μας είναι συνεπής με ρόλο για ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω της επίδρασής τους επί διαφορετικών πρωτεϊνών [19].

Σε αυτή τη μελέτη, η επίδραση αναστολής ATM ή DNA-PK στην κυτταρικού θανάτου του CaP κυτταρικών σειρών αποκάλυψε ότι, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 ή της εξάρτησης ορμόνη, αυτή η αναστολή αύξησε το προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που επάγεται από χαμηλές δόσεις είτε doxorubicin ή IR. Ωστόσο, η παρουσία του ρ53 (κύτταρα LNCaP) αύξησε σημαντικά την αποπτωτική πληθυσμό με δοξορουβικίνη υψηλή δόση. Ότι, εν απουσία του ρ53 (κύτταρα PC3) υπήρχε είτε καμία ή μια μικρή αύξηση σε κυτταρικό θάνατο με doxorubicin υψηλή δόση η οποία είναι συνεπής με την παρατηρούμενη αύξηση στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η πιο έντονη απόπτωση σε PC3 σε σύγκριση με LNCaP σε χαμηλές δόσεις της βλάβης του DNA θα μπορούσε να εξηγηθεί από την συντομότερη περίοδο θεραπείας (48 ώρες) για LNCaP σε σύγκριση με (96 ώρες) για τα κύτταρα PC3.

Παρατηρήσαμε ότι η πρωτογενή επαγωγή Η2ΑΧ εστιών μειώθηκε σημαντικά με το συνδυασμό δύο ή και τα δύο αναστολείς με παράγοντες βλάβης του DNA. Σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, ο σχηματισμός H2AX εστίες εξακολουθούν να αναστέλλονται στα χέρια συνδυασμό αναστολέα ΑΤΜ, ενώ αυξήθηκε στα χέρια αναστολέας της DNA-PK. Αυτό συνεπάγεται ότι η αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ αυξάνει τις DSBs DNA που τονίζονται με αύξηση του αριθμού των εστιών Η2ΑΧ που σχηματίζεται στην θέση βλάβης. Ωστόσο, μειωμένο σχηματισμό εστιών Η2ΑΧ στη όπλων αναστολέα ΑΤΜ δεν είναι συνέπεια του λιγότερο DSBs που παράγεται όπως έχουμε επιδείξει αυξημένο DSBs DNA χρησιμοποιώντας τον ουδέτερο κομήτη δοκιμασίας. Αυτό είναι σύμφωνο με τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΑΤΜ είναι το κύριο κινάση που επάγει H2AX εστίες και ότι το DNA-ΡΚ μπορεί να φωσφορυλιώσει Η2ΑΧ μόνο σε περίπτωση απουσίας του ΑΤΜ αλλά όχι με την παρουσία του χημικώς ανέστειλε ATM [20]. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με μια έκθεση που χρησιμοποιούν άλλες μεθόδους για την ανίχνευση H2AX [21], όπου ο αρχικός σχηματισμός H2AX εστίες (30 λεπτά μετά IR) καταργήθηκε όταν συνδυάζεται ΑΤΜ ή /και αναστολείς DNA-PK. Μια άλλη έκθεση έρχεται σε αντίθεση με τα δεδομένα μας [22], όπου καταδεικνύεται ΟΝΑ-ΡΚ διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στο σχηματισμό εστιών Η2ΑΧ υπό την απουσία της λειτουργίας ΑΤΜ? Ωστόσο η έκθεση αυτή χρησιμοποιούνται κυτταρικές γραμμές που στερούνται είτε ATM ή DNA-PK που δεν συμβαίνει σε κυτταρικές σειρές μας. Επιπρόσθετα, αναστέλλοντας τόσο ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ δεν οδήγησε σε αυξημένο σήμα Η2ΑΧ σε όλα τα χρονικά σημεία. Αυτό υποδηλώνει ότι ATR (η τρίτη κινάσης εμπλέκεται σε φωσφορυλίωση H2AX) δεν είναι σε θέση να πραγματοποιήσει αυτή τη λειτουργία φωσφορυλίωσης με την παρουσία των ΑΤΜ και DNA-PK, ακόμη και όταν αναστέλλεται και τα δύο. Μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση θα ήταν να διερευνηθεί η επίδραση στις εστίες σχηματισμό Rad51 όταν αυτές οι κινάσες αναστέλλεται.

Ο βασικός ρόλος των ΑΤΜ και DNA-PK στην επιδιόρθωση του DNA DSB σε κύτταρα θηλαστικών υποδηλώνει ότι χτυπούν κάτω από τη λειτουργία ενός ή αμφότερες οι πρωτεΐνες θα πρέπει να αυξηθεί ο αριθμός των DNA DSBs μετά από την πρόκληση της θεραπείας. Χρησιμοποιώντας την ουδέτερη κομήτη δοκιμασία δείξαμε ότι η αναστολή της ΑΤΜ ή /και DNA-ΡΚ οδήγησε σε αύξηση του αριθμού των DNA DSBs εξής IR ή θεραπεία δοξορουβικίνη. Μια πρόσθετη επίδραση παρατηρήθηκε στα σκέλη θεραπείας, όπου ανεστάλησαν οι δύο κινάσες. Είναι ενδιαφέρον ότι οι κομήτη ουρές είναι σχεδόν ίσα στα ενιαία αναστολέα βραχίονες αν και θα πρέπει να αναμένεται ότι ο αναστολέας DNA-ΡΚ θα πρέπει να προκαλέσει περισσότερο αυξάνουν σε DSBs ως NHEJ είναι η κύρια οδός για την επισκευή DSBs DNA. Αυτό μπορεί να συμβαίνει επειδή πραγματοποιήσαμε τον κομήτη δοκιμασία σε 24 ώρες, η οποία είναι πιο φυσιολογικά νόημα στα κύτταρα, αλλά δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα την κινητική αποκατάσταση. Οι περισσότεροι DSBs επισκευαστεί γρήγορα με ΝΗΕΙ και στη συνέχεια πιο αργή κινητική από HR για υπολειμματική ειλικρινή ϋδΒδ και ϋδΒδ που προκύπτουν από στασιμότητα διχάλα αντιγραφής. ATM επιπτώσεις στην ΥΕ, ως εκ τούτου KU55933 θα πρέπει να μειώσει αυτή την αργή φάση ακόμη περισσότερο και ως εκ τούτου, ένας μεγαλύτερος αριθμός των διαλειμμάτων στις 24 ώρες σε σύγκριση με όταν HR δεν αναστέλλεται (έλεγχος και ο αναστολέας DNA-PK όπλα).

Εν ολίγοις, αυτό μελέτη αναφέρει μια νέα θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη με τη στόχευση των μηχανημάτων ϋδΒδ επιδιόρθωσης του DNA. Δείχνουμε ότι η στόχευση επισκευή DSB παρέχει μια βελτιωμένη χημειοθεραπεία και ράδιο-ευαισθησία στην ορμόνη ευαίσθητα και μη ευαίσθητα CaP κυτταρικές σειρές που σχετίζονται με αυξημένο προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Περαιτέρω αξιολόγηση των ειδικών αναστολέων θα πρέπει να διεξαχθεί σε ζωικά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένης της εκτίμησης της διαθεσιμότητας του πλάσματος, την τοξικότητα και την αποτελεσματικότητα πριν προχωρήσουμε περαιτέρω προς οποιαδήποτε κλινική δοκιμή.