Αφηρημένο

ξενομόσχευμα ασθενούς που προέρχονται από τα (PDX) μοντέλα που δημιουργούνται από χειρουργικά δείγματα κερδίζουν τη δημοτικότητα ως προκλινικά μοντέλα καρκίνου. Ωστόσο, η δημιουργία PDX γραμμών από μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) ασθενείς είναι δύσκολη λόγω των πολύ περιορισμένη ποσότητα διαθέσιμου υλικού βιοψίας. Ρωτήσαμε αν SCLC κύτταρα που λαμβάνονται από ενδοβρογχικούς υπερηχογραφικό έλεγχο διαβρογχική παρακέντηση (EBUS-TBNA) θα μπορούσε να δημιουργήσει PDX γραμμές που διατήρησε την φαινοτυπικά και γενετικά χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου. Μετά την επιτυχή δειγματοληψίας EBUS-TBNA για διαγνωστικούς σκοπούς, λάβαμε ένα επιπλέον δείγμα για ανάλυση κυτταρολογικά και την εμφύτευση στα πλευρά των ποντικών με ανοσοανεπάρκεια. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν για εμφύτευση για έως 6 μήνες. Η ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση, και στοχευμένη επόμενης γενιάς εκ νέου προσδιορισμό αλληλουχίας, διεξήχθησαν στη συνέχεια τόσο στην πρωτογενή δείγματος και του παραγώγου γραμμή PDX. Συνολικά 12 ασθενείς εντάχθηκαν στη μελέτη. EBUS-TBNA αναρροφήσεις απέδωσε μεγάλο αριθμό των βιώσιμων κυττάρων όγκου αρκεί να εισφέρει μεταξύ 18.750 και 1.487.000 κύτταρα ανά πλευρά, και να αποδώσει ποσότητες μικρογραμμαρίων της υψηλής ποιότητας του DNA. Από αυτά, τα δείγματα από 10 ασθενείς που δημιουργούνται ξενομοσχεύματα (ποσοστό μεταμόσχευσης 83%) με μέση λανθάνουσα κατάσταση από 104 ημέρες (εύρος 63-188). Όλοι εκτός από έναν διατήρησε ένα τυπικό SCLC φαινότυπο που συνδυάζεται στενά το αρχικό δείγμα. Ταυτόσημα μεταλλάξεις που είναι χαρακτηριστικές του SCLC ταυτοποιήθηκαν τόσο στην πρωτογενή δείγμα και γραμμή ξενομοσχεύματος. EBUS-ΤΒΝΑ έχει τη δυνατότητα να είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών στόχευσης για μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς με την παροχή μεγάλου αριθμού βιώσιμων κυττάρων του όγκου κατάλληλο τόσο για ξενομεταμόσχευση και σύνθετη γονιδιωματικής ανάλυσης

Παράθεση:. Leong TL, Marini KD, Rossello FJ, Jayasekara SN, Russell PA, Prodanovic Ζ, et al. (2014) Γονιδιωματική Χαρακτηρισμός του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα που λαμβάνονται από ασθενή Ξενομοσχεύματα που παράγεται από Ενδοβρογχική υπερήχων-Καθοδηγούμενη διαβρογχική παρακέντηση δείγματα. PLoS ONE 9 (9): e106862. doi: 10.1371 /journal.pone.0106862

Επιμέλεια: Prasad Σ Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 2 Αυγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπ 2014

Copyright: © 2014 Leong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα δεδομένα και τα μεταδεδομένα που είναι διαθέσιμα στο ΝΙΗ Σύντομη Διαβάζει Αρχείο, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), αριθμός SRP044662

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από τη βικτοριανή Οργανισμού Καρκίνου (www .victoriancanceragency.org.au), το Εθνικό Συμβούλιο Υγείας και Ιατρικής Έρευνας της Αυστραλίας (www.nhmrc.gov.au), και η κυβέρνηση της Βικτόριας Επιχειρησιακό Πρόγραμμα υποστήριξης Υποδομών (www.business.vic.gov.au/grants-and-assistance/programs/medical-research-operational-infrastructure-program). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 15% όλων των κακοηθειών του θώρακα [1]. Οι ασθενείς με νόσο του περιορίζεται στο στήθος αντιμετωπίζονται με χημειο-ακτινοθεραπεία, ενώ οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία [2]. Στην προχωρημένη νόσο, με βάση την πλατίνα διπλή χημειοθεραπεία επάγει πλήρεις αποκρίσεις σε ποσοστό έως 20%, ενώ σε συνδυασμό χημειο-ακτινοθεραπεία στη νόσο περιορίζεται στο στήθος παράγει πλήρεις αποκρίσεις σε ποσοστό έως 50% των ασθενών [3]. Ωστόσο, θανατηφόρος υποτροπές εντός 12 μηνών να συμβεί σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις. Επιπλέον, μελέτες πολλαπλών κυτταροτοξικών παραγόντων, η εντατικοποίηση της δόσης, ή νέες στοχευμένες θεραπείες έχουν αποτύχει να βελτιώσει την έκβαση κατά τις τρεις τελευταίες δεκαετίες [3].

Η ακριβής προκλινικά μοντέλα και δείγματα υψηλής ποιότητας ιστού είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη της νέες θεραπείες του καρκίνου. Δεδομένου ότι η χειρουργική εκτομή του SCLC είναι ασυνήθιστο, μελέτες διάγνωση και βιοδεικτών βασίζονται σε μεγάλο βαθμό σε δείγματα που λαμβάνονται από διαδερμική παρακέντηση με λεπτή βελόνα ή βρογχοσκόπηση λαβίδα βιοψίας [1]. Και οι δύο τεχνικές παρέχουν πολύτιμα λίγο υλικό για τους ερευνητές, που οδηγεί σε μια μεγάλη εξάρτηση από τις συμβατικές κυτταρικές σειρές που μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την πολύπλοκη βιολογική και γονιδιωματικών ετερογένεια της ανθρώπινης νόσου [4]. Πιο πρόσφατα, τα μοντέλα PDX έχουν κερδίσει σε δημοτικότητα μεταξύ των ερευνητών του καρκίνου. Εδώ, ιστού που ελήφθη από φρέσκα χειρουργικά δείγματα μπορεί να εμφυτευθεί σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια και διατηρήθηκαν ως απεριόριστο πηγή του υλικού του όγκου που μοιάζει πολύ με τον πρωτογενή όγκο [4] – [7]. Επιπλέον, «συν-κλινικές» δοκιμές είναι πλέον δυνατή, όπου ασθενή και το ποντίκι λαμβάνουν την ίδια θεραπεία [8]. Ωστόσο, η περιορισμένη διαθεσιμότητα υψηλής ποιότητας SCLC ιστών κάνει μια τέτοια προσέγγιση είναι εξαιρετικά δύσκολο [4].

EBUS-TBNA είναι μια νέα εξέλιξη στη διαγνωστική βρογχοσκόπηση που επιτρέπει την εξαιρετικά ακριβή δειγματοληψία φιλοδοξία των όγκων και των λεμφαδένων που γειτνιάζουν με ο αεραγωγός που δεν είναι ορατά με συμβατικές βρογχοσκόπηση [9]. Επειδή SCLC συνήθως συνδέεται με μεσοθωρακίου λεμφαδενοπάθεια [1], EBUS-TBNA είναι ένας ιδανικός τρόπος απόκτησης υλικού για τη διάγνωση και σταδιοποίηση. Ως εκ τούτου, θα δοκιμαστεί η σκοπιμότητα της χρήσης ζωντανών κυττάρων που λαμβάνονται από EBUS-TBNA δειγματοληψίας για τη δημιουργία PDX γραμμές από SCLC ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

Ανθρώπινο πειραματισμό αναλήφθηκε με ενημέρωσε, γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τις πολιτικές του Εθνικού Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας, Monash Υγείας, Μελβούρνη Υγείας και τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Τα κλινικά και ερευνητικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από μια πολυκεντρική Επιτροπή Δεοντολογίας Έρευνας Ανθρωπίνων Αυστραλίας (Πρωτόκολλο # HREC /12 /SHA /8). πειραμάτων σε ζώα εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο Monash Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων (Πρωτόκολλο # 09072A), και έγινε σύμφωνα με το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας και το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας. Ανώδυνη θανάτωση των ποντικών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εισπνεόμενων αναισθησία διοξειδίου του άνθρακα, σύμφωνα με το θεσμικό και εθνικές κατευθυντήριες γραμμές.

Ασθενείς και το σχεδιασμό της μελέτης

Οι ασθενείς με υποψία καρκίνου του πνεύμονα που υποβάλλονται σε EBUS-TBNA ως μέρος της συνήθους κλινικής φροντίδας έδωσαν πληροφορημένη συναίνεση για ένα επιπλέον βιοψία που πρέπει να ληφθούν για ερευνητικούς σκοπούς. Εκείνοι που βρέθηκαν να έχουν SCLC ήταν τότε που περιλαμβάνονται για την ανάλυση παρουσιάζονται παρακάτω.

EBUS-TBNA

Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν οι διαδικασίες στα εξωτερικά ιατρεία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], σύμφωνα με το βρετανικό κατευθυντήριες γραμμές Πνευμονολογικής Εταιρείας [11], υπό συνειδητή νάρκωση σε συνδυασμό με τοπική αναισθησία του αεραγωγού χρησιμοποιώντας lignocaine 2%. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μια ειδική γραμμική συστοιχία βρογχοσκόπιο (BF-UC180F-OL8, η Olympus, Tokyo, Japan). εικόνες υπερήχων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από ένα ειδικό Doppler-mode υπερήχων σαρωτή (ΕΕ-ΜΕ1, η Olympus, Tokyo, Japan).

Το πρώτο δείγμα λήφθηκε σύμφωνα με το πρότυπο κλινικά πρωτόκολλα. Οι αρχικές 3 σταγόνες της αναρρόφησης ανακτήθηκε επί ενός θετικώς φορτισμένη διαφάνεια, ξηραίνεται στον αέρα, και στη συνέχεια ταυτόχρονα σταθερών και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Diff-Quik και αξιολογούνται επί τόπου από ένα κυτταροπαθολόγο. Το υπόλοιπο του δείγματος στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε ένα αποστειρωμένο διάλυμα και μεταφέρθηκαν στο διαγνωστικό εργαστήριο παθολογίας όπου φυγοκεντρείται, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και τεμαχίσθηκαν για τη συνήθη ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Μόλις η διάγνωση επιτόπου επιβεβαιώθηκε, ένα δεύτερο δείγμα στη συνέχεια μεταφέρθηκε για ερευνητικούς σκοπούς.

Επεξεργασία της έρευνας EBUS-TBNA δείγμα

Το συνολικό ερευνητικό δείγμα ανακτήθηκε σε ένα αποστειρωμένο 1,5 ml Eppendorf σωλήνας, τοποθετείται σε υγρό πάγο, και στη συνέχεια μεταφέρονται αμέσως στο εργαστήριο. Ice-κρύο, στείρο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) προστέθηκε στο υπόδειγμα, προκειμένου να καταστεί ο συνολικός όγκος 500 μΙ, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 g για 5 δευτερόλεπτα. Το δείγμα στη συνέχεια αναμίχθηκε ήπια με μία πιπέτα του 1 ml και τοποθετήθηκαν σε πάγο. Το δείγμα στη συνέχεια κατανέμονται ως εξής: (i) 200 μΐ μεταφέρθηκε σε ένα Nunc κρυοσωλήνα και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μετέπειτα καθαρισμό DNA? (Ii) 50 μΐ αλείφεται σε ένα θετικά φορτισμένο διαφάνεια, ξηραίνεται στον αέρα και στη συνέχεια χρωματίζονται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Diff Quik να προσδιοριστεί η καθαρότητα των κυττάρων του όγκου? (Iii) 50 μΐ μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα Eppendorf, και ζωηρά κονιορτοποιήθηκε με πιπέτα 200 μΙ να μη συνυπολογίζουν μηχανικά τα κύτταρα ακολουθούμενη από μέτρηση χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο για να καθορίσει συνολικό αριθμό κυττάρων? (Iv) τα υπόλοιπα 200 μΐ χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το PDX. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων του όγκου εγχύθηκαν εκτιμήθηκε με προσδιορισμό των κυττάρων του όγκου αριθμός φανεί στα Diff-Quick χρώση διαφάνειες ως ποσοστό όλων των εμπύρηνων κυττάρων από το μέσο όρο των μετρήσεων των 10 τυχαίων πεδίων στο 40Χ.

Δημιουργία PDX γραμμές

το δείγμα EBUS-TBNA αναμίχθηκε με ίσο όγκο παγωμένου Matrigel (BD Biosciences), τοποθετήθηκε σε μια αποστειρωμένη σύριγγα 1 ml καλυμμένο με ένα G βελόνα 26 και μεταφέρονται αμέσως στην εγκατάσταση ζώο. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες, το κυτταρικό εναιώρημα εγχύθηκε υποδορίως στην δεξιά πλευρά του NSG ποντικού (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Αυτά τα βαθιά ανοσοκατεσταλμένα ζώα προέρχεται από το στέλεχος NOD /SCID με την προσθήκη ενός ομόζυγου Η ιντερλευκίνη-2 υποδοχέα γ αλυσίδα νοκ-άουτ, και είναι κατά το μέγιστο αποτελεσματικά στην ίδρυση ξενομοσχεύματος όγκους από ένα μικρό αριθμό κυττάρων δότη [12]. Μόλις επιτεύχθηκε πρωτογενές εμφύτευση, PDX γραμμές στη συνέχεια περάστηκαν σε γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4].

Ανοσοϊστοχημεία

Η χρώση διεξήχθη επί 5 μm φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη τομές όπως περιγράφεται [13 ], χρησιμοποιώντας το Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories? PK-6101) και το ποντίκι σε ποντίκι Basic Kit (Vector Laboratories? BMK-2202). Αντισώματα και αραιώσεις ήταν ως εξής: πολυκλωνικά κουνελιού αντι-NCAM (CD56) ένα νευρικό και νευροενδοκρινείς δείκτη, (Η-300) (Santa Cruz Biotechnology? Sc-10735), 1:200? μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-TTF1 (EP1584Y, Novus Biologicals? NB100-8006), 1:400? μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Synaptophysin (Ventana Κλώνος SP11, προ-αραιωμένο).

Targeted εκ νέου προσδιορισμό αλληλουχίας

καταψύχθηκαν EBUS και τα δείγματα PDX χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν καθαρισμένο DNA χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen DNeasy (# 69504) με την επιλογή Qiagen RNAse Α θεραπεία (# 19101) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNA αναλύθηκε και η ποιότητα ελέγχεται με τη χρήση του qubit 2.0 Fluorimeter (Invitrogen # Q32866) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στοχευμένες εκ νέου αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ολοκληρωμένο v2 πίνακα καρκίνο Ion AmpliSeq (Life Technologies # 4477685), η οποία στοχεύει εξόνια των γονιδίων καταστολέα 409 όγκων και ογκογονίδια. κατασκευή βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ιόν AmpliSeq Βιβλιοθήκη Kit 2.0 (Life Technologies, # 4478379) και τα πρότυπα βιβλιοθήκη παρασκευάστηκε και γραμμικό κώδικα για προσδιορισμό αλληλουχίας με τη χρήση του Συστήματος OneTouch Ion σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις γραμμοκώδικα δείγματα πολυπλέκονται ανά Ion PI Chip (Life Technologies) και προσδιορίστηκε η αλληλουχία στο Ion Proton Sequencer System (Life Technologies). Αλληλουχίας διαβάζει υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Ion Torrent σουίτα λογισμικού v 4.0.2 (Life Technologies). De-πολυπλεξίας δείγματα αξιολογήθηκαν ως προς την ποιότητα της αλληλουχίας και αλληλουχίας υψηλής ποιότητας διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στην πλήρη hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (UCSC έκδοση, Φεβρουάριος 2009). Παραλλαγή ανακάλυψη έγινε χρησιμοποιώντας Torrent παραλλαγή καλούντος κατά 4.0 (Life Technologies), ένα plug λογισμικού για το λογισμικό Ion Torrent Suite. παραλλαγές δείγμα ταυτοποιείται συνενώθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας VcfTools [14] και SnpSift [15]. Παραλλαγή λειτουργική σχολιασμό έγινε χρησιμοποιώντας SnpEff [15], και SnpSift με dbNSFP [16], μια βάση δεδομένων για τη λειτουργική σχολιασμό των μη-συνώνυμη παραλλαγές. Όλα τα δεδομένα και τα μεταδεδομένα που είναι διαθέσιμα στο ΝΙΗ Σύντομη Διαβάζει Αρχείο, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), αριθμός ένταξης SRP044662.

Αποτελέσματα

ασθενών και τα χαρακτηριστικά δείγματος

ένα σύνολο από 12 ασθενείς με επιβεβαιωμένη διάγνωση της SCLC εισήχθησαν στη μελέτη, και συνοψίζονται στον πίνακα 1. τα δείγματα EBUS ελήφθησαν από καθορισμένες κομβικές σταθμούς, είτε από μεγάλες μάζες στην παρατραχειακών, πυλαία ή μεσοθωρακίου περιοχές. Όλα τα δείγματα αξιολογήθηκαν με τη χρήση κριτηρίων ρουτίνας κυτταροπαθολογία ως συνεπής με τη διάγνωση του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Όπου υπάρχουν, μπλοκ κυττάρων κόπηκαν και H & amp? Ε τομές επιβεβαίωσε τη διάγνωση. Ανοσοϊστοχημική χρώση τομών μπλοκ των κυττάρων πραγματοποιήθηκε για Synaptophysin, CD56 και Θυρεοειδής Μεταγραφή παράγοντας 1 (TTF1) σε 8, 2 και 1 υποθέσεις, αντίστοιχα.

Η

Δημιουργία PDX γραμμές

όγκου κύτταρα ανακτήθηκαν στα ερευνητικά δείγμα σε 12 συνεχόμενες περιπτώσεις, και αναλύθηκαν και εμφυτεύεται στα πλευρά ποντικών NSG όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο αριθμός των κυττάρων του όγκου εγχύθηκαν κυμαίνονταν από μεταξύ 18.750 και 1.487.000 κύτταρα ανά πλευρά. εκχύλιση DNA κατόπιν αναδρομικά πραγματοποιήθηκε στα 10 δείγματα που παράγονται επιτυχώς ξενομοσχεύματα χρησιμοποιώντας κατεψυγμένο κλάσματα του ίδιου αριθμού κυττάρων, όπως χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί η PDX. Αυτό απέδωσε μεταξύ 0.31μg και 11.12 μg υψηλής ποιότητας γονιδιωματικό DNA κατάλληλο για ανάλυση αλληλούχισης επόμενης γενιάς.

Πρώτο πέρασμα PDX όγκοι εμφανίστηκαν μεταξύ 63 και 188 ημέρες μετά την εμφύτευση (μέση 104 ημέρες). Μετά εμφύτευση και την ανάπτυξη σε ένα μέγεθος 800 mm

3, ο παραλήπτης ποντίκι πρώτη δίοδος θυσιάστηκε, του όγκου αποκόπηκαν από τη σχετική δέρματος και των μυών, και μια επίσημη νεκροψία ποντίκι εκτελείται. Δεν μεταστατικές βλάβες αναγνωρίστηκαν σε οποιοδήποτε από τα ζώα. Δείγματα Φρέσκα όγκου (4-5 mm

3) ελήφθησαν και καταψύχθηκαν για μετέπειτα εκχύλιση του DNA, και ένα άλλο δείγμα μονιμοποιήθηκε σε φορμαλίνη και τεμαχίστηκαν για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Το υπόλοιπο του όγκου ήταν τότε μηχανικά αναλυτικά, και 1 × 10

6 κύτταρα εμφυτεύονται εκ νέου στα πλευρά του 5 νέο παραλήπτη γυμνά αθυμικά ποντίκια. Μόλις αυτές οι όγκοι έφτασαν ένα μέγεθος 800 mm

3, ο όγκος του δείγματος στη πανομοιότυπο τρόπο, και 1 × 10

6 κλάσματα έπειτα κρυοσυντηρηθεί.

Από τα 10 επιτυχή μοσχεύματα, 9 διατήρησε ένα τυπικό SCLC φαινότυπο, όπως επίσης και εκφράζοντας τυπικά ανοσοϊστοχημική δείκτες ενός κακοήθους όγκου σε νευροενδοκρινικού πέρασμα 1 και 2. οι αντιπροσωπευτικές εικόνες από ολόκληρο το σύνολο του δείγματος δείχνονται στα Σχήματα 1 και 2, και ένα λεπτομερές παράδειγμα παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. μία PDX γραμμή, LX109, εκτίθενται χαρακτηριστικά συνεπή με ένα μεγάλο κυττάρων νευροενδοκρινικών όγκων, περιλαμβανομένων των μεγαλύτερων πυρήνες με διακριτό πυρήνιο, εξέχουσα ηωσινοφιλική κυτταρόπλασμα, και αποσπασματική χρώση για CD56 (Σχήμα S1). Με περιορισμένη διαγνωστική υλικού που είναι διαθέσιμο για την αναθεώρηση, δεν είμαστε σε θέση να προσδιορίσει εάν αυτή αντιπροσωπεύει απόφυση του έναν υποπληθυσμό των μεγάλων κυττάρων καρκινικών κυττάρων από τα πειραματικά δείγμα. Μια σύνοψη αυτών των στοιχείων παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.

Κλίμακα bar = 30 μm. Η &? Ε = αιματοξυλίνης και ηωσίνης. Κενά τετράγωνα δείχνουν ότι το δείγμα δεν ήταν διαθέσιμο. Μπαρ

Η

Κλίμακα = 30 μm. Κενά τετράγωνα δείχνουν ότι το δείγμα δεν ήταν διαθέσιμο.

Η

Α. Diff-Quick χρωματισμένο κυτταρολογία Παπανικολάου διαγνωστικών δειγμάτων EBUS-TBNA. μπαρ κλίμακας = 15 μm. Β Diff-Quick βάφονται κυτταρολογία επίχρισμα πειραματικό δείγμα EBUS-TBNA. μπαρ κλίμακας = 15 μm. Γ αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του μπλοκ διαγνωστικών κυττάρων. μπαρ κλίμακας = 30 μm. μπλοκ κυττάρων Δ Διαγνωστικό χρώση για CD56. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Ε αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος. Κλίμακα bar = 300 μm. F. αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Γ Τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος χρώση για CD56. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Η ενότητα του παραγώγου ξενομοσχεύματος χρώση για TTF1. μπαρ κλίμακας = 30 μm.

Η

Στοχευμένες εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας

Για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης και το πέρασμα από την γονιδιωματική ακεραιότητα των μοντέλων μας PDX, χρησιμοποιήσαμε ένα στοχευμένη, επόμενης γενιάς στρατηγική προσδιορισμού αλληλουχίας για τον εντοπισμό εξονικούς μεταλλάξεις στο βασικό δείγμα EBUS και των παράγωγων ξενομόσχευμα της πέρασμα-2. Γονιδιωματικό DNA από τα δύο δείγματα αναλύθηκαν με τη χρήση του ιόντος Ampliseq Comprehensive Cancer Panel αλληλουχία στην πλατφόρμα Ion Torrent (Life Technologies). Το σύστημα αυτό ενισχύει και αλληλουχίες οι κωδικοποίησης εξώνια των 409 γονίδια στα οποία έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις του οδηγού.

Ο αριθμός των χαρτογραφηθεί αλληλουχίας διαβάζει κυμαίνονταν από 16 έως 26000000, τα περισσότερα από αυτά στο στόχο (πάνω από 97% σε όλα τα δείγματα ), με ελάχιστο βάθος ακολουθία της κάλυψης στις στοχευμένες περιοχές του 1000 φορές (Πίνακας S1). Υψηλή ομοιομορφία της κάλυψης παρατηρήθηκε για όλα τα δείγματα, που κυμαίνονται από 85 στο 92% (Πίνακας S1). Ο συνολικός αριθμός των παραλλαγών ανιχνευθεί για κάθε στοιχειώδες δείγμα φαίνεται στον Πίνακα 3, μαζί με τον συνολικό αριθμό των παραλλαγών κωδικοποίησης περιοχής. Ο αριθμός των κωδικοποίησης παραλλαγών περιοχής σε κάθε δείγμα από κοινού με την αντίστοιχη ξενομόσχευμα κυμάνθηκε 55-92% (μέσος όρος 81,4%). Το σύνολο των παραλλαγή απαιτεί κάθε δείγμα περιλαμβάνεται ως ένα υπολογιστικό φύλλο Excel στο S1 αρχείου

Η

Σημαντικές παραλλαγές προσδιορίστηκαν ως εκείνα προβλέπεται να (i) έχουν ως αποτέλεσμα μετατόπιση πλαισίου, ανοησία ή ουσιωδών μεταλλάξεις θέση ματίσματος.? ή (ii) παραλλαγές παρερμηνεύσιμη προβλέπεται να επηρεαστεί αρνητικά η λειτουργία της πρωτεΐνης με SIFT [17] βαθμολογίας ≤0.05. Κοινόχρηστο κωδικοποίησης παραλλαγών περιοχής στη συνέχεια φιλτράρεται χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια αποκλεισμού: (i) γνωστή SNPs βλαστική (ii) πιθανόν τυχαίες μεταλλάξεις (https://mutagenetix.utsouthwestern.edu)? και (iii) παραλλαγών στα γονίδια συνήθως μεταλλάσσεται σε καρκίνο που είναι πιθανό να έχουν καμιά λειτουργική σημασία [18]. Αυτές οι παραλλαγές που απαριθμούνται στον Πίνακα S2. Εμείς αμέσως επόμενο στην κατάταξη των προσβεβλημένων γονιδίων ανάλογα με τη συχνότητα μετάλλαξης τους στην κοσμική βάση δεδομένων (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) με αναφερόμενη συχνότητα εμφάνισης ≥5%. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, όταν κοινών μεταλλάξεων οδηγός ήταν παρόντα στο πρωταρχικό δείγμα, ήταν συντηρημένες στην αντίστοιχη ξενομοσχεύματος. Μεταλλάξεις που υπάρχουν μόνο στην πρωτοβάθμια δείγματος (

IGFR1

,

TET1

,

mTOR

) και μόνο στο ξενομόσχευμα (

RB1 ​​

,

ΝΤΡΚ1

) παρατηρήθηκαν σε επτά πρωτογενή ζεύγη δείγματος ξενομόσχευμα (Σχήμα 4). Μεταλλάξεις στο

KRAS

, πιο χαρακτηριστική του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, δεν είχαν εντοπιστεί.

Τα γονίδια ανάλογα με τη% σύμφωνα με την επικράτηση τους στην κοσμική βάση δεδομένων. Οι μεταλλάξεις που ανιχνεύονται τόσο στην πρωτογενή δείγματος και του ξένου μοσχεύματος φαίνεται

Η

Συζήτηση

μοντέλα PDX έχουν πρόσφατα αναδειχθεί ως ένας τρόπος για μεγαλύτερη ακρίβεια μοντελοποίησης θεραπευτικές απαντήσεις [5] – [7]. έκβαση [12], [19] και ως πηγή υψηλής ποιότητας υλικό για την αλληλούχιση επόμενης γενιάς [20]. Τυπικά, η παραγωγή του καρκίνου του πνεύμονα γραμμών PDX έχει περιοριστεί στην χρήση χειρουργικά υλικό ως πηγή βιώσιμων κυττάρων όγκου [19], [21], [22]. Δεδομένου ότι λιγότερο από το 20% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση, η προσέγγιση αυτή περιορίζει τη δημιουργία γραμμών PDX για καρκίνους του πνεύμονα πρώιμο στάδιο. Επιπλέον, SCLC είναι σχεδόν ποτέ χειρουργικά, όπως τονίζεται από πρόσφατες μελέτες ολόκληρο το γονιδίωμα [23], [24]. Στην αρχική μας περιγραφή των τριών γραμμών SCLC PDX, είμαστε προέρχονται υλικό από βρογχοσκοπικές βιοψίες σε σπάνιες περιπτώσεις κατά τις οποίες θα μπορούσε να εντοπιστεί εύκολα ενδοβρογχικούς βλάβες [4], [20]. Πρόσφατα, Hodgkinson

et al

[25] περιγράφεται η επιτυχής παραγωγή των 4 γραμμών SCLC PDX από κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων από 6 ασθενείς, δίνοντας έμφαση στην επιθετική φύση των όγκων αυτών, καθώς και τη δυνατότητα για τη δημιουργία τιθασεύσει μοντέλα από την ελάχιστα επεμβατική τεχνικές.

για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη περιγραφή των δειγμάτων EBUS-TBNA ως πλατφόρμα για τη δημιουργία γραμμών PDX. Από SCLC παρουσιάζει πολύ πιο συχνά ως ενδο-θώρακα λεμφαδενοπάθεια ή μεσοθωρακίου μάζα, EBUS-TBNA μπορεί δυνητικά να παρέχουν engraftable δείγματα από όλους σχεδόν τους ασθενείς, διευρύνοντας έτσι σημαντικά τις δυνατότητες για προκλινικές μοντελοποίηση σε αυτή την ασθένεια. Οι ανεπάρκειες των μοντέλων PDX, ειδικά η έλλειψη ενός ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, είναι καλά περιγράφεται [5] – [7]. Παρ ‘όλα αυτά, η αύξηση της χρήσης αυτών των μοντέλων οδηγείται από την απόδειξη ότι PDX γραμμές διατηρούν τα βασικά χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου που είναι αμετάκλητα χαθεί στα συμβατικά καλλιέργεια ιστού [4] – [7]. Για παράδειγμα, SCLC PDX γραμμές δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία απλού παράγοντα με την ABT737 ανταγωνιστή BCL2 σε αντίθεση με τα μοντέλα ξενομοσχεύματος προέρχονται από συμβατικές SCLC κυτταρικές γραμμές [26]. Τα στοιχεία μας δείχνουν τώρα ότι SCLC PDX σειρές που προέρχονται από EBUS-TBNA διατηρούν τα χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου.

Μια συνεχιζόμενη ανησυχία σε σχέση με τα μοντέλα PDX είναι η ικανότητά τους να διατηρήσουν το γονότυπο του πρωτοπαθούς όγκου. Δεδομένου του σχετικά μικρού αριθμού των κυττάρων που λαμβάνονται από δείγματα EBUS-TBNA, δεν είμαστε σε θέση να προσδιορίσει αν ο γονότυπος PDX αποτελεί επέκταση ενός πιο επιθετική υποκλώνο με βάση την γενωμική μοντέλο ετερογένεια [27], [28]. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας δείχνουν καθαρά ότι είναι καλά περιγραφεί μεταλλάξεις οδηγού που διατηρούνται σε γραμμές EBUS-TBNA PDX μας για τουλάχιστον 2 περάσματα, ασυμφωνία στην ανίχνευση διαφόρων μεταλλάξεων δείχνει ότι η διαδικασία της ξενομεταμόσχευση μπορεί να επιλέξει για τους γενετικά διακριτή υποκλώνων που προέρχονται από εξαιρετικά ανομοιογενής πρωτογενή δείγματα . Σε άλλη μια περίπτωση (LX105), μια μετάλλαξη στο

RB1 ​​

παρατηρήθηκε μόνο στη γραμμή PDX, υποδεικνύοντας ότι μερικές γραμμές ξενομοσχεύματος μπορεί να είναι πιο χρήσιμη ως αυτόνομα μοντέλα, παρά ως πανομοιότυπα αντίγραφα του αρχικού όγκου του ασθενούς.

Η ποσότητα και η ποιότητα των διαθέσιμων από το δείγμα EBUS DNA επιτρέπει τη λεπτομερή, ανάλυση αλληλουχίας μεγάλο βάθος, σε αντίθεση οι πιο περιορισμένη συγκρίσεις που μπορούν να γίνουν μεταξύ των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και γραμμές παράγωγα PDX [25]. Είναι ενδιαφέρον, το δείγμα που παράγεται από τη γραμμή PDX LX109, που μεγάλωσε σαν όγκου αυτήν των άτυπων, δεν είχαν μεταλλάξεις συνήθως εμφανίζονται σε SCLC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μοριακή ανάλυση των δειγμάτων EBUS-TBNA μπορεί να προσθέσει με την ακρίβεια των συμβατικών κριτηρίων παθολογικών και κυτταρολογική. Από δομικές παραλλαγές στα γονίδια, όπως

MYC

,

MYCN

και

SOX2

περιγράφονται καλά στο SCLC [23], [24], η προσέγγισή μας για τη δημιουργία γραμμών PDX από δείγματα EBUS-TBNA μπορούσε επίσης να χρησιμεύσει ως πλατφόρμα για την πιο εντατική ανάκριση με τη χρήση ανάλυσης WGS για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της ξενομεταμόσχευση σε χρωμοσωμική αστάθεια σε SCLC.

τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν επίσης τη δυνατότητα για δείγματα EBUS-TBNA ως πηγή υψηλής ποιότητας DNA για ανάλυση μοριακής παθολογίας. Αρκετές ομάδες έχουν δείξει την αναδρομική ανάλυση των δειγμάτων σταθερής EBUS-TBNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση κλινικά προσβληθεί μεταλλάξεις σε καρκίνο του πνεύμονα [29] – [33], και ότι η υψηλή ποιότητα του DNA, RNA και πρωτεϊνών μπορούν να ληφθούν από αυτά τα δείγματα [34] , [35]. Τα δεδομένα μας επεκτείνουν αυτές τις μελέτες αποδεικνύοντας ότι πρόσφατα απομονωμένα δείγματα EBUS-TBNA μπορεί να παράγει υψηλής ποιότητας DNA κατάλληλο για μαζικά παράλληλη στοχευμένη εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας που αποφεύγει φορμόλη τεχνούργημα, και ότι μπορεί να ελέγχεται προσεκτικά για στρωματικά τεχνούργημα.

έχουν δείξει ότι σε SCLC, EBUS-TBNA είναι ένα πρακτικό και ελάχιστα επεμβατική τεχνική η οποία μπορεί να δημιουργήσει υψηλής ποιότητας DNA για αλληλούχιση επόμενης γενιάς, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πηγή βιώσιμων νεοπλασματικών κυττάρων που εμφυτεύονται σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς με εξαιρετικά υψηλή απόδοση. Επιπλέον, αυτά τα μοσχεύματα διατηρούν σημαντικά χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων που είναι χαρακτηριστικές της SCLC. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η EBUS-TBNA είναι μια τεχνική μέσω της οποίας αναπνευστικού γιατρούς και Θωρακοχειρουργούς μπορεί να παράγει δείγματα που μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για νέες προκλινική έρευνα, και, τελικά, προσφυγής μοριακή διάγνωση σε SCLC και άλλα ενδο-θωρακική κακοήθειες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Χαρακτηριστικά του δείγματος LX109 και των παράγωγων ξενομοσχεύματος του. Α Diff-Quick βάφονται κυτταρολογία επίχρισμα των διαγνωστικών δειγμάτων EBUS-TBNA. μπαρ κλίμακας = 15 μm. Β Diff-Quick βάφονται κυτταρολογία επίχρισμα πειραματικό δείγμα EBUS-TBNA. μπαρ κλίμακας = 15 μm. Γ αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του μπλοκ διαγνωστικών κυττάρων. μπαρ κλίμακας = 30 μm. μπλοκ κυττάρων Δ Διαγνωστικό χρώση για CD56. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Ε αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος. Κλίμακα bar = 300 μm. F. αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Γ Τμήμα του παραγώγου ξενομοσχεύματος χρώση για CD56. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Η ενότητα του παραγώγου ξενομοσχεύματος χρώση για TTF1. μπαρ κλίμακας = 30 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Περίληψη των στατιστικών χαρτογράφηση της NGS πειράματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

Λειτουργικά σημαντικές παραλλαγές μοιράζονται μεταξύ πρωτογενούς δείγματος και ξενομοσχεύματος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s003

(DOC)

αρχείου S1.

Αφιλτράριστο παραλλαγή καλεί σε όλα τα δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s004

(XLS)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω την αυστραλιανή Cancer Research Ίδρυμα Κέντρο για τον Καρκίνο Γονιδιωματική Ιατρική για τη στήριξή του και την τεχνική βοήθεια.