Αφηρημένο

Ets-1 είναι μια μεταγραφή παράγοντας που ρυθμίζει πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου και σε εισβολή όγκου. Είναι ένα φτωχό προγνωστικός δείκτης για καρκίνο του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και των καρκινωμάτων των ωοθηκών. Εδώ, ταυτοποιήσαμε πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (ΡΑΚΡ-1) ως νέου αλληλεπίδραση εταίρος του ETS-1. Δείχνουμε ότι Ets-1 ενεργοποιεί, με άμεση αλληλεπίδραση, την καταλυτική δραστικότητα του ΡΑΚΡ-1 και στη συνέχεια το πολυ (ΑΟΡ-ριβοσυλ) ated σε ένα DNA-ανεξάρτητο τρόπο. Η καταλυτική αναστολή της PARP-1 ενισχυμένη Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας και προκάλεσε μαζική συσσώρευση της σε πυρήνες κυττάρων. Ets-1 έκφραση συσχετίστηκε με μία αύξηση στην βλάβη του DNA όταν PARP-1 αναστάλθηκε, οδηγώντας σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, οι αναστολείς PARP-1 προκάλεσε μόνο Ets-1 κύτταρα που εκφράζουν να συσσωρεύονται βλάβη του DNA. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν νέα εικόνα Ets-1 ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα και η σχέση της με τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA. Επιπλέον, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς PARP-1 θα ήταν χρήσιμο σε μια νέα θεραπευτική στρατηγική που στοχεύει ειδικά Ets-1 που εκφράζουν όγκους

Παράθεση:. Legrand AJ, Choul-Li S, Spriet C, Idziorek T, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) Το επίπεδο του ETS-1 πρωτεΐνης ρυθμίζεται από πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (PARP-1) σε καρκινικά κύτταρα για την πρόληψη ζημιών DNA. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10.1371 /journal.pone.0055883

Επιμέλεια: Rajesh Mohanraj, Πανεπιστήμιο ΗΑΕ, Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα

Ελήφθη: 25 Σεπ 2012? Αποδεκτές: 3 Ιαν. 2013? Δημοσιεύθηκε: 6η Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Legrand et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας της Γαλλίας (CNRS) και με επιχορηγήσεις από la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. Η Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur και το Fondation ARC pour la Recherche sur le καρκίνο παρέχεται ένα διδακτορικό υποτροφία για να Arnaud J. Legrand. Η CNRS και το Conseil Régional du Nord-Pas-de-Calais παρέχεται υποτροφία διδακτορικού (BDI) για να Souhaila Choul-li. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ets-1 είναι το ιδρυτικό μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων που ονομάζεται ETS. Αυτή η οικογένεια χαρακτηρίζεται από μια καλά συντηρημένη περιοχή δέσμευσης DNA (DBD)

5 που αναγνωρίζει συγκεκριμένα στοιχεία DNA, που ονομάζονται θέσεις ETS-δέσμευσης (EBS), που βρέθηκαν στα υποκινητές των γονιδίων στόχων. Ets-1 εκφράζεται κυρίως σε εμβρυϊκούς ιστούς. Είναι εμπλέκονται σε φυσιολογικές διαδικασίες όπως πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, μετανάστευση, εισβολή και την απόπτωση [1] – [6]. Ets-1 έκφραση ρυθμίζεται αυστηρά σε ενήλικες ιστούς και υπερέκφραση του συχνά σχετίζεται με επιθετικές ασθένειες, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, σπειραματονεφρίτιδα και πολλούς καρκίνους [7] – [9]. Η παθολογική έκφραση του ETS-1 είναι εν μέρει υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή ικανότητες των καρκινικών κυττάρων. Αυτό διηθητικότητα οφείλεται σε γονίδια που ελέγχονται από Ets-1 και που κωδικοποιούν πρωτεάσες, συμπεριλαμβανομένης της μήτρας μεταλλοπρωτεϊνασών κολλαγενάσης-1 και στρομελυσίνη-1, ή ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ). Ως εκ τούτου, Ets-1 θεωρείται σήμερα ως ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης σε αρκετούς καρκίνους [10] – [13].

Επιπλέον, παρά το γεγονός ότι όλα τα μέλη της οικογένειας ETS μοιράζονται την ίδια DBD, Ets-1 έχει τις δικές του ιδιότητες δέσμευσης DNA του που ελέγχονται αυστηρά για να εξασφαλιστεί μια συγκεκριμένη βιολογική δράση. Ets-1 αναστέλλει τη δική δέσμευσης DNA του λόγω της παρουσίας δύο ανασταλτικών περιοχών που πλευρίζουν DBD του [14]. Ets-1 πρέπει να αλληλεπιδρά με τους εταίρους για την αντιμετώπιση αυτού αυτόματη αναστολή και δεσμεύονται στους υποκινητές των γονιδίων στόχων του [15]. Σε ορισμένες υποκινητές, όπως αυτές που βρίσκονται στο

ΜΜΡ3

(στρομελυσίνη-1) και

ΤΡ53

γονίδια, δύο μόρια Ets-1 να δεσμεύονται με δύο παλινδρομικές EBS χωρίζονται από 4 bp [16] – [18]. Σε όλες τις περιπτώσεις, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών φαίνεται να είναι ο ακρογωνιαίος λίθος της ρύθμισης Ets-1.

Επιπλέον, Ets-1 είναι επίσης ελέγχεται αυστηρά από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης, τροποποίησή της με SUMO και ουμπικουιτίνωση [7], [19]. Ωστόσο, Ets-1 μοιράζεται την ίδια μονοπάτια σηματοδότησης με πολλούς παράγοντες μεταγραφής. Έτσι, η πρόκληση είναι να προσδιοριστούν τα ειδικά χαρακτηριστικά των οδών που ελέγχουν τη δραστηριότητα του ETS-1 να τα χρησιμοποιούν για θεραπευτικούς στόχευση.

Για τον εντοπισμό νέων οδών, έχουμε προηγουμένως καθαριστεί εταίρους αλληλεπίδραση του ETS-1 χρησιμοποιώντας το στρεπταβιδίνη pull-down ανάλυση. Με αυτή τη στρατηγική, έχουμε αποδείξει την λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ Ets-1 και η επισκευή του DNA σύμπλοκο DNA-PK [20].

Εδώ, εντοπίσαμε πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (ΡΑΚΡ-1) ως νέο αλληλεπίδραση συνεργάτη του ETS-1. ΡΑΚΡ-1 είναι μια άφθονη και πανταχού παρούσα πυρηνική πρωτεΐνη που καταλύει πολυ (ΑΟΡ-ριβοσυλ) ίωση (PARylation) χρησιμοποιώντας NAD + ως υπόστρωμα για τη σύνθεση διακλαδισμένη πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμερή επί πρωτεϊνών στόχων. ΡΑΚΡ-1 παίζει διάφορους ρόλους σε πολλές μοριακές και κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανίχνευσης βλάβης του DNA και την επισκευή και χρωματίνης τροποποίηση [21]. Αν και ΡΑΚΡ-1 αρχικά χαρακτηρίστηκε ως πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA, πολλές πρόσφατες μελέτες έχουν τονίσει το ρόλο της στην μεταγραφική ρύθμιση. ΡΑΚΡ-1 εμπλέκεται στη ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής όπως ΝΡ-κΒ, ΑΡ-2, ρ53 και πολλοί άλλοι [22] – [24]. Επιπλέον, PARP-1 αναστολή έχει αναδειχθεί ως μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο [25]. Είναι ενδιαφέρον ότι, PARP-1 αναστολή φαίνεται να είναι αποτελεσματική σε καρκίνους που συχνά δείχνουν υπερεκφράζεται πρωτεΐνες ETS, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του προστάτη και του μαστού [25]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια λειτουργική σύνδεση μεταξύ PARP-1 και τα μέλη της οικογένειας ETS, όπως Ese-1, Fli1, Erg και Elk-1 [26] – [28]. Ομοίως, Ets-1 μπορεί να είναι ένα βασικό ρυθμιστή της

parp1

γονιδίου από τον έλεγχο υποκινητή της [29]. Πολύ πρόσφατα, το ενδιαφέρον σε αυτή την λειτουργική διασύνδεση έχει αυξημένη σε βαθμό που να θεωρείται σήμερα ως ένα ολοκαίνουργιο θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο. Πρόσφατες εκθέσεις απέδειξαν ότι πρωτεΐνες σύντηξης ETS, τα οποία εμπλέκονται σε πολλούς καρκίνους, είναι βιοδείκτες ναρκωτικά ευαισθησία ΡΑΚΡ-1 αναστολή [26], [30], [31]. Υψηλή έκφραση του TMPRSS2: Erg σε καρκίνους του προστάτη ή EWS-Fli1 σε σάρκωμα Ewing προκαλεί βλάβες του DNA που ενισχύεται από ΡΑΚΡ-1 και αναστολή ακολουθούνται από ισχυρή αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου. Παρ ‘όλα αυτά, όσο γνωρίζουμε, δεν έχουν υπάρξει αναφορές για τυχόν λειτουργικών δεσμών μεταξύ Ets-1 έκφρασης και την ευαισθησία της σε αναστολείς PARP-1.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η PARP-1 ελέγχει αρνητικά η επίπεδο των πρωτεϊνών Ets-1 σε καρκινικά κύτταρα μέσω PARylation. Υπό αναστολή PARylation, Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας ενισχύεται η οποία συσχετίζεται με Ets-1 πρωτεΐνες συσσώρευση στους πυρήνες των κυττάρων και την αύξηση της βλάβης του DNA που οδηγεί σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αναστολή της PARylation θα μπορούσε να είναι μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τον περιορισμό της εξέλιξης του καρκίνου σε Ets-1 που εκφράζουν καρκινώματα

Αποτελέσματα

PARP-1: α. Τα νέα Ets-1 εταίρος αλληλεπίδρασης σε καρκινικά κύτταρα

Για να βρείτε νέες εταίρους Ets-1, πραγματοποιήσαμε ένα

in vitro

στρατηγική καθαρισμού συγγένειας χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία pull-down στρεπταβιδίνη. Η προσέγγιση αυτή εξασφαλίζει αναγνώριση μεγάλης κλίμακας των εταίρων χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο ανασυνδυασμένου Ets-1 ακινητοποιημένη επί σφαιριδίων στρεπταβιδίνης να διατηρήσει δεσμευτικές πρωτεΐνες του βρίσκονται σε πυρηνικά εκχυλίσματα [20], [32]. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε MDA-MB-231, ένα διηθητικό καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή, για να παράγει πυρηνικά εκχυλίσματα? Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν ενδογενώς την ογκοπρωτεΐνη Ets-1, προσφέροντας έτσι κατάλληλη κυτταρική έννοια. Μετά το διαχωρισμό των δεσμευμένων πρωτεϊνών με SDS-PAGE, μια ιδιαίτερα ορατή ζώνη πρωτεΐνης με μοριακό βάρος 113 kDa παρατηρήθηκε μετά από κολλοειδή χρώση (Εικ. 1Α, λωρίδα 3, σημειώνονται με αστερίσκο (*)), αλλά απουσιάζει σε συνθήκες ελέγχου (Εικ. 1Α, διαδρομές 1 και 2). Αυτή η πρωτεΐνη αναγνωρίστηκε με φασματομετρία μάζας ως το PARP-1 ένζυμο (Σχ. 1Β και S1) και την αποκλειστική παρουσία της στην Ets-1-δεσμευμένες πρωτεΐνες επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 1 C, κανάλι 3). Λόγω της ισχυρής συγγένειας του ΡΑΚΡ-1 για nicked DNA, πυρηνικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι πριν από την επώαση να απομακρυνθούν όλα τα ίχνη των νουκλεϊκών οξέων. Αυτή η θεραπεία δεν διαταράσσουν την αλληλεπίδραση μεταξύ Ets-1 και PARP-1 (Σχ. 1 D, λωρίδα 4). Αυτό επιβεβαιώθηκε με φασματομετρία μάζας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εκτελούνται πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας ένα προϊόν σύζευξης αντι-Ets-1 αντίσωμα-αγαρόζη σε MDA-MD-231 και σε μια κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος, MG63, η οποία εκφράζει επίσης Ets-1. Μετά από διαχωρισμό με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση με αντι-ΡΑΚΡ 1-αντίσωμα, PARP-1 συν-καθιζάνει με Ets-1 και από τις δύο MDA-MB-231 και MG63 κύτταρα (Σχ. 1 Ε, διαδρομή 2). Πειράματα ελέγχου με IgG από φυσιολογικό ορό κουνελιού απέτυχε να προσλάβει PARP-1 (Σχ. 1 Ε, λωρίδα 1). Η αμοιβαία πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα-αγαρόζη συζυγούς αντι-ΡΑΚΡ-1 σε MDA-MD-231 και MG63 κύτταρα. Ets-1 συν-καθιζάνει από δύο MDA-MB-231 και MG63 κύτταρα και ήταν απούσα από πειράματα ελέγχου (Εικ. 1 F). Επιπλέον, τα πειράματα ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντι-Ets-1 και αντι-ΡΑΚΡ-1 αντισώματα έδειξαν ότι και οι δύο πρωτεΐνες συν-εντοπίζεται σε MDA-MB-231 κύτταρα πυρήνες (Εικ. S2, λωρίδα 4).

(Α) Κολλοειδές μπλε-χρωματισμένο gel για Ets-1 που σχετίζεται με πρωτεΐνες από MDA-MB-231 πυρηνικά εκχυλίσματα. Βιοτινυλιωμένη Ets-1 πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμασία pull-down φορτώθηκαν μόνα ως έλεγχος για τον προσδιορισμό των βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών (κεφαλές βέλους) και πιθανών προϊόντων διάσπασης τους (λωρίδα 1). Pull-down πρωτεΐνες ανιχνεύονται από πυρηνικά εκχυλίσματα (ΝΕ) επωάζονται με άνευ φορτίου σφαιρίδια θεωρούνται μη-ειδικά προϊόντα (γραμμή 2). Η κολλοειδής μπλε χρώση ειδικό ΡΑΚΡ-1 πρωτεΐνη τράβηξε προς τα κάτω με βιοτινυλιωμένο Ets-1 υποδεικνύεται με έναν αστερίσκο (λωρίδα 3). (Β) Προσδιορισμός της PARP-1 με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western επιβεβαιώνει την Ets-1-πρωτεΐνη που συνδέεται ως ΡΑΚΡ-1. Πρωτεΐνες τράβηξε προς τα κάτω από MDA-MB-231 πυρηνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αντισώματα κουνελιού που κατευθύνονται έναντι της PARP-1 (Η-250). (D) Κολλοειδές μπλε χρώση gel για Ets-1 που σχετίζεται με πρωτεΐνες από MDA-MB-231 πυρηνικά εκχυλίσματα είτε χωρίς επεξεργασία (λωρίδες 1 και 2) ή σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι για 40 λεπτά (λωρίδες 3 και 4) και, στη συνέχεια, είτε επωάστηκαν με σφαιρίδια στρεπταβιδίνης φορτώθηκε με βιοτινυλιωμένο πρωτεΐνη Ets-1 (αιχμές βελών) (διαδρομές 2 και 4) ή με άφορτο σφαιρίδια (λωρίδες 1 και 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν την πρωτεΐνη ΡΑΚΡ-1 ανιχνεύεται στο (Α). (Ε) και (F) Συν-ανοσοκαταβύθιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κουνελιού αντι-Ets-1 (C-20) ή ενός αντι-ΡΑΚΡ-1 συζυγούς κουνελιού (Η-250) αντίσωμα-αγαρόζης (λωρίδα 2) ή κανονικό IgG κουνελιού ως ένα έλεγχο (σειρά 1) και πυρηνικά εκχυλίσματα από MDA-MB-231 κύτταρα ή MG-63 κύτταρα. Input (λωρίδα 3) περιέχει 3% των πυρηνικών εκχυλισμάτων που υποβλήθηκε σε συν-ανοσοκαταβύθιση. PARP-1 και Ets-1 αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας αντίστοιχα H-250 και C-4 αντισωμάτων.

Η

Ets-1 αλληλεπιδρά άμεσα με PARP-1 και στη συνέχεια PARylated σε ένα DNA-ανεξάρτητης τρόπο

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το ETS DBD αλληλεπιδρά με PARP-1 [30]? Παρ ‘όλα αυτά, οι αλληλεπιδράσεις με το ΣΕΔΕ-1 DBD περιορίζεται από Ets-1 αυτόματη αναστολή. Επομένως, για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ Ets-1 και PARP-1, χρησιμοποιήσαμε δύο βιοτινυλιωμένο και αυτόματη ανέστειλε ισομορφές του ETS-1: τη μορφή πλήρους μήκους, απλώς ονομάζεται Ets-1 και ένα κυρίαρχο-αρνητικό ισομορφή που προκύπτει από εναλλακτικό μάτισμα , Ets-1 p27. Ets-1 ρ27 ανακαλύφθηκε πρόσφατα από την ομάδα μας και δεν έχει το υπόλειμμα θρεονίνης-38 (Thr38), καθώς και το μυτερό (PNT) και μετενεργοποίησης (TAD) περιοχές (Εικ. 2Α), το σύνολο των οποίων απαιτούνται για την τρανσενεργοποίηση του ETS -1 γονιδίων στόχων. Ωστόσο, Ets-1 ρ27 εξακολουθεί να έχει τις ίδιες ιδιότητες δέσμευσης DNA ως Ets-1 [33]. Μετά την επώαση βιοτινυλιωμένης Ets-1 ισομορφών ακινητοποιήθηκε επί σφαιριδίων στρεπταβιδίνης με ένα ανασυνδυασμένο ένζυμο ΡΑΚΡ-1, PARP-1 συγκεκριμένα και άμεσα αλληλεπίδρασε με Ets-1 ισομορφές (Εικ. 2Β, λωρίδες 2 και 3). Έτσι, η αυτόματη αναστολή της Ets-1 δεν διαταράσσουν την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του DBD και PARP-1. Για να διερευνηθεί εάν Ets-1 είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο από ΡΑΚΡ-1-μεσολαβούμενη PARylation, πραγματοποιήσαμε-out μια

in vitro δοκιμασία

PARylation. Για να καταλύουν PARylation, PARP-1 γενικά απαιτεί την παρουσία nicked DNA, όπως φαίνεται στους ελέγχους με την προσθήκη σε υπερήχους δίκλωνου DNA (Σχ. 2C λωρίδες 1 και 2). Μόλις ενεργοποιηθεί, PARP-1 καταλύει της αυτόματης PARylation, οι οποίες μπορούν να παρατηρηθούν χρησιμοποιώντας ένα αντι-PAR αντίσωμα (Σχ. 2C, λωρίδα 2). Με την παρουσία του ETS-1, αυτόματη PARylation ήταν ισχυρότερη και Ets-1 PARylated σε μοριακό βάρος περίπου 51 kDa που αντιστοιχεί σε μονο (ADP-ριβοσυλ) ίωση και PARylation με διαφορετικά μεγέθη πολυμερές (Σχ. 2C, λωρίδα 4, μαύρο βέλος). Επιπλέον, εν απουσία του DNA, όχι μόνο ήταν PARP-1 ακόμη ενεργοποιηθεί, αλλά Ets-1 ήταν ακόμα πιο έντονα PARylated (Σχ. 2C, λωρίδα 5, μαύρο βέλος). Με την ρ27 ισομορφή Ets-1, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε παρουσία nicked DNA, Ets-1 ρ27 δεν PARylated (Σχ. 2C, λωρίδα 7). Παρ ‘όλα αυτά, χωρίς DNA, Ets-1 ρ27 ενεργοποιεί ΡΑΚΡ-1 και στη συνέχεια PARylated, θεωρείται ως μια ζώνη σε ένα μοριακό βάρος περίπου 27 kDa και με διαφορετικού μεγέθους πολυμερή σε μοριακά βάρη μεταξύ 40 και 60 kDa (Εικ. 2C, λωρίδα 8). Ετσι, το C-τερματικό άκρο του ETS-1 μπορεί να ενεργοποιήσει την αυτόματη PARylation της PARP-1 σε ένα DNA-ανεξάρτητο τρόπο από άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και να PARylated σε αντάλλαγμα. Για να επιδειχθεί PARylation σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, δημιουργήσαμε μία κυτταρική γραμμή HeLa, που λαμβάνεται με ρετροϊική μόλυνση, ότι σταθερώς εκφράζει Ets-1 με ετικέτα πεπτίδιο στρεπταβιδίνης δέσμευσης (ΣΑΠ). Μετά τον καθαρισμό του ETS-1 επί σφαιριδίων στρεπταβιδίνης, αναλύσαμε PARylation με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-PAR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα κλάσμα των πρωτεϊνών Ets-1 ήταν ελαφρώς PARylated σε κύτταρα (Σχ. 2D, λωρίδα 2). PARylation είναι μια πολύ βραχύβια μετα-μεταφραστική τροποποίηση η οποία είναι δύσκολο να απεικονίσει σε κύτταρα, ιδιαίτερα λόγω της δράσης της πολυ (ADP-ριβόζη) γλυκοϋδρολάσης (PARG), το οποίο καταλύει την αποικοδόμηση των πολυμερών PAR [21].

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της πλήρους μήκους πρωτεΐνης Ets-1 και κυρίαρχο-αρνητικό ισομορφή του Ets-1 ρ27. Κουτιά αντιστοιχούν σε μεταφρασμένες περιοχές και διακεκομμένες γραμμές σε αμετάφραστες περιοχές. Θρεονίνη-38 (Thr38), μυτερά τομέα (PNT), τομέα διενεργοποίησης (ΣΕΔ), η ανασταλτική περιοχή (Ι), μεταφρασμένη περιοχή που αντιστοιχεί στο εξόνιο VII και δέσμευσης DNA τομέα (DBD) υποδεικνύονται. (Β) Στρεπταβιδίνη pull-down δοκιμασία με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Ets-1 και PARP-1. πρωτεΐνες Βιοτινυλιωμένη Ets-1 (5 μg) ή Ets-1 ρ27 (2,5 μα) φορτώθηκαν σε σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και στη συνέχεια επωάστηκαν με καθαρό ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΡΑΚΡ-1 (1 μg) για 1 h (διαδρομές 2 και 3). σφαιρίδια στρεπταβιδίνης επωάστηκαν με μόνη PARP-1 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (διαδρομή 1). ΡΑΚΡ-1 αναλύθηκε με κηλίδα Western. (Γ) PARylation δοκιμασία με Ets-1 και Ets-1 ρ27. Ets-1 (1 μg) ή Ets-1 ρ27 (500 ng) πρωτεΐνες επωάστηκαν με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη PARP-1 (500 ng) σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης PARylation (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) σε παρουσία (λωρίδες 4 και 7) ή σε περίπτωση απουσίας (διαδρομές 5 και 8) κομμένων DNA επί 20 λεπτά. Ως μάρτυρας, Ets-1 ισομορφών επωάστηκαν μόνα σε ρυθμιστικό αντίδρασης και nicked DNA (λωρίδες 3 και 6) και αυτόματη ενεργοποίηση της PARP-1 μόνη ελέγχθηκε με ή χωρίς DNA (έλεγχος, λωρίδες 1 και 2) (D) PARylation του ETS-1 σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα HeLa, που λαμβάνεται με ρετροϊική μόλυνση. Ets-1 με ετικέτα πεπτίδιο δέσμευσης στρεπταβιδίνης (SBP) καθαρίστηκε σε stretavidin χάντρες από πυρηνικά εκχυλίσματα HeLa κυττάρων (λωρίδα 2). Τα κύτταρα HeLa που εκφράζουν σταθερά μόνο την SBP χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (διαδρομή 1). Στο (C) και (D), την κατάσταση PARylation προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-ΡΑΡ.

Η

PARP-1 ρυθμίζει Ets-1-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή του στρομελυσίνης-1 προαγωγό

Για να καθοριστεί εάν η αλληλεπίδραση με PARP-1 ρυθμίζει την μεταγραφική δραστικότητα του ETS-1, διεξήχθησαν δοκιμασίες λουσιφεράσης διενεργοποίησης. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιήσαμε τον υποκινητή της μεταλλοπρωτεάσης μήτρας στρομελυσίνη-1, το οποίο είναι ένα καλά μελετηθεί Ets-1 στοχευόμενο γονίδιο εμπλέκεται στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [34]. Αυτός ο προαγωγός, ενεργοποιείται με συνεργασιακή σύνδεση δύο μορίων Ets-1 μέσω ενός παλινδρομική EBS, συντήχθηκε με το γονίδιο λουσιφεράσης (Σχ. 3Α). 3Τ3 κύτταρα ποντικού, είτε με το PARP-1 άγριου τύπου (WT) ή knock-out (ΚΟ), χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας σε παντελή απουσία της πρωτεΐνης ΡΑΚΡ-1. Σε WT κύτταρα, ο υποκινητής στρομελυσίνη-1 ήταν πλήρως ενεργοποιηθεί από Ets-1 διαμόλυνση (Σχ. 3Β, στήλη 3). Σε αντίθεση, PARP-1 KO μείωσε την ικανότητα του ETS-1 για να μετενεργοποιούν τον προαγωγό (Σχ. 3Β, στήλη 4). πειράματα διάσωσης διεξάγεται με τη χρήση ενός φορέα έκφρασης ανθρώπινης ΡΑΚΡ-1 επέτρεψε Ets-1 για να ανακτήσει εν μέρει μεταγραφική δραστηριότητα της (Σχ. 3Β, λωρίδα 5). Έτσι, PARP-1 είναι απαραίτητη για την πλήρη τρανσενεργοποίηση του υποκινητή στρομελυσίνη-1 με Ets-1. Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι συνέπειες της PARP-1-μεσολαβούμενη PARylation επί Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας. Για να γίνει αυτό, πραγματοποιήσαμε τις ίδιες λουσιφεράσης δοκιμασίες μετενεργοποίησης με 3Τ3 κύτταρα χρησιμοποιώντας PJ-34, ένα αναστολέα της καταλυτικής PARP-1. Παραδόξως, PARylation αναστολή, σε αντίθεση με PARP-1 KO, αυξημένη Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας στον υποκινητή στρομελυσίνη-1 όπως δείχνεται στο επιμολυσμένα κύτταρα WT (Σχ. 3C, διαδρομές 3 και 4). Σε κύτταρα ΚΟ, PJ-34 δεν είχε καμία επίδραση και απέτυχε να αυξηθεί τρανσενεργοποίηση του υποκινητή (Εικ. 3C, λωρίδες 7 και 8). Ως εκ τούτου, οι αυξήσεις των Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας δρουν μέσω της ειδικής αναστολής της PARP-1. Ανάλυση με κηλίδα Western αποκάλυψε ότι η αναστολή της PARylation από τους PJ-34 προκάλεσε μια αύξηση στο επίπεδο Ets-1 πρωτεΐνης σε κύτταρα WT (Σχ. 3C, διαδρομές 3 και 4). Για να επιβεβαιωθεί ότι η αναστολή PARylation προκαλεί επίσης μια αύξηση στην Ets-1 μεταγραφικής δραστικότητας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς μετενεργοποίησης λουσιφεράσης σε κύτταρα HeLa με αυξανόμενες δόσεις PJ-34. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο PJ-34 δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην τρανσενεργοποίηση του υποκινητή στρομελυσίνης-1 συσχετίστηκε με αύξηση των επιπέδων Ets-1 πρωτεΐνη (Εικ. 3D, λωρίδες 5-8). Αυτή η αύξηση σε επίπεδα πρωτεΐνης Ets-1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa, όχι μόνο με PJ-34, αλλά και με δύο άλλες καλά μελετηθεί PARP-1 αναστολείς:. 5-AIQ και ΑΒΤ-888 (veliparib) (Εικ 3Ε, λωρίδες 6- 8). Έτσι, αυτή η αύξηση οφείλεται ειδικά σε ΡΑΚΡ-1 αναστολής. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα Ets-1 πρωτεΐνη είναι αρνητικά ρυθμίζονται από ΡΑΚΡ-1-μεσολαβούμενη PARylation.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του γονιδίου λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του στρομελυσίνης-1 ανθρώπινου υποκινητή. Οι παλινδρομικές θέσεις Ets-δέσμευσης (EBS) δεικνύεται δεσμεύεται με δύο μόρια Ets-1. (Β) Επίδραση της PARP-1 νοκ άουτ (ΚΟ) στις Ets-1-μεσολάβηση δράση προαγωγού στρομελυσίνης-1. pGL3 κατασκευάσματα αναφοράς λουσιφεράσης (100 ng) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα 3Τ3 ποντικού άγριου τύπου (WT) (διαδρομές 1 και 3) ή ΚΟ για το γονίδιο PARP-1 (διαδρομές 2, 4 και 5) σε 50-80% συρροή σε απουσία (λωρίδες 1 και 2) ή παρουσία (διαδρομές 3, 4 και 5) του φορέα Ets-1 έκφραση (25 ng) και στα πειράματα διάσωσης με PARP-1 φορέα έκφρασης (100 ng? λωρίδα 5). (C) Επίδραση της PARP-1 καταλυτικός αναστολή στην Ets-1-προκαλούμενη δραστικότητα προαγωγού στρομελυσίνη-1 παρουσία ή απουσία PARP-1. pGL3 κατασκευάσματα αναφοράς λουσιφεράσης (100 ng) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα 3Τ3 ποντικού WT (λωρίδες 1- 4) ή ΚΟ για το γονίδιο PARP-1 (λωρίδα 5-8) σε συρροή 50-80% απουσία (διαδρομές 1, 2 , 5 και 6) ή με την παρουσία (διαδρομές 3, 4, 7 και 8) του-1 Ets φορέα έκφρασης (25 ng) και απουσία (διαδρομές 1, 3, 5 και 7) ή με την παρουσία (διαδρομές 2 , 4, 6 και 8) του PJ-34, ένα καταλυτικό αναστολέα της PARP-1 (10 μΜ). (D) Επίδραση της PARP-1 καταλυτικός αναστολής επί Ets-1-προκαλούμενη δραστικότητα προαγωγού στρομελυσίνης-1 σε ένα μοντέλο καρκινικού κυττάρου. pGL3 κατασκευάσματα αναφοράς λουσιφεράσης (100 ng) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa σε συρροή 50-80% απουσία (διαδρομές 1-4) ή με την παρουσία (διαδρομές 5-8) του ETS-1 φορέα έκφρασης (100 ng) και με αυξανόμενες δόσεις PJ-34 (0-20 μΜ? λωρίδες 1-4 και 5-8). Στο (Β), (Γ) και (Δ), η δραστηριότητα της λουσιφεράσης, μετρούμενη 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και 20 ώρες μετά την επώαση με PJ-34, και εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις εκατό με τη δραστηριότητα που επάγεται από Ets-1 σε ένα ΡΑΚΡ-1 WT πλαίσιο υποδεικνύεται ως 100%. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. (Ε) Επίδραση της PARP-1 καταλυτικός αναστολής στο επίπεδο της πρωτεΐνης Ets-1. κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων μέχρι 70% συρροή, επιμολυσμένα με pcDNA3 (1 μg? αριστερό πλαίσιο) ή ροϋΝΑ3-Ets1 (1 μg? δεξί πάνελ) φορείς για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PJ-34 (1 μΜ) ( λωρίδες 2 και 6), 5-AIQ (1 μΜ) (λωρίδες 3 και 7) ή ΑΒΤ-888 (1 μΜ) (λωρίδες 4 και 8) για 20 ώρες. Σε όλα τα πειράματα, προϊόντα λύσης κυττάρου (30 μg συνολικών πρωτεϊνών) αναλύθηκαν με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Η

Αναστολή της PARylation προκαλεί συσσώρευση του Ets-1 σε καρκινικά κύτταρα

Για τον προσδιορισμό της κινητικής του ETS-1 συσσώρευσης, πραγματοποιήσαμε πειράματα απεικόνισης time-lapse. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα φορέα που εκφράζει μια πρωτεΐνη σύντηξης eGFP (ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) -Ets-1. Υπό συνθήκες ελέγχου, τα επίπεδα της πρωτεΐνης eGFP-Ets-1 ήταν σταθερά κατά τη διάρκεια μιας 12 h time-lapse (Σχ. 4Α, σειρά 1). Κατά την προσθήκη του PJ-34, παρατηρήσαμε μια ισχυρή αύξηση του σήματος eGFP-Ets-1 που αντιστοιχεί στους πυρήνες των κυττάρων HeLa (Σχ. 4Α, σειρά 2). Παρ ‘όλα αυτά, PJ-34 δεν είχε επίδραση επί eGFP μόνο (Σχ. 4Α, σειρά 4) και, πιο ενδιαφέροντα, δεν είχε επίδραση επί eGFP-Ets-1 ρ27 (Σχ. 4Α, σειρά 3). Δεδομένου ότι η πλήρους μήκους Ets-1 είναι ουβικιτινιωμένες και στη συνέχεια αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα, ενώ Ets-1 ρ27 δεν έχει κάποια sites ουβικιτινίωση [19], [33], μπορούμε επόμενο εξετάστηκε κατά πόσον θα μπορούσε να συγκριθεί η κινητική της Ets-1 συσσώρευσης με εκείνα της αναστολής του πρωτεασώματος. Χρησιμοποιώντας MG-132, ένα γνωστό αναστολέα πρωτεασώματος, είχε ως αποτέλεσμα την ίδια κινητική του ETS-1 συσσώρευσης όπως αυτές παρατηρούνται κατά τη διάρκεια PARylation αναστολής (Σχ. 4Α, σειρά 5). Σε αντίθεση, MG-132 δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης Ets-1 ρ27, ενισχύοντας έτσι τη σύνδεση μεταξύ PARylation και της υποβάθμισης του πρωτεασώματος Ets-1 (Σχ. 4Α, σειρά 6). Η στατιστική ανάλυση της μεταβολής στην ένταση φθορισμού σε αυτά τα πειράματα time-lapse έδειξε ότι η σημαντική διακύμανση Ets-1 επίπεδα πρωτεΐνης (αύξηση περίπου 50%) που παρατηρήθηκε κατά την προσθήκη του PJ-34 ή MG-132 ήταν συγκρίσιμο (Σχ. 4Α, κάτω πάνελ, λωρίδες 2 και 5). Για να επιβεβαιωθεί ότι συσσώρευση Ets-1 που προκαλείται από ΡΑΚΡ-1 αναστολής μπορεί επίσης να παρατηρηθεί σε έναν ενδογενή πλαίσιο, αντιμετωπίζεται MDA-MB-231 κυττάρων με PJ-34 και αναλύθηκαν τα επίπεδα πρωτεΐνης Ets-1 με ανοσοφθορισμό. Ets-1 εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα αλλά η παρουσία του παρατηρήθηκε επίσης στην περιπυρηνική κυτταρόπλασμα (Σχ. 4Β, λωρίδα 1, λευκά βέλη) [33]. Με ένα αντι-Ets-1 αντίσωμα, παρατηρήσαμε μια ισχυρή συσσώρευση ενδογενών Ets-1 σε πυρήνες και κυτταρόπλασμα (Σχ. 4Β, λωρίδα 2) κύτταρα ». Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον αυτός ο μηχανισμός ήταν ειδικά για Ets-1. Για να γίνει αυτό, δοκιμάσαμε αρκετές πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι PARylated όπως ρ53, c-Jun, ERK-2 και PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, εκτός από Ets-1, καμία από αυτές τις πρωτεΐνες συσσωρευτεί στα κύτταρα υπό αναστολή PARylation από τους PJ-34 (Εικ. 4C). Παρατηρήσαμε επίσης ότι Ets-1 συσσωρευτεί αποτελεσματικά σε MDA-MB-231 κυττάρων κατά την κατεργασία με άλλους-PARP 1 αναστολείς, 5-AIQ και ΑΒΤ-888, ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 παρέμειναν αμετάβλητες (Εικ. S3). Έτσι, PARP-1-μεσολαβούμενη PARylation εμπλέκεται σε μια συγκεκριμένη ρύθμιση του ETS-1 τα επίπεδα πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα και υποθέτουμε ότι ο μηχανισμός αυτός συνδέεται με την υποβάθμιση του πρωτεασώματος της.

(Α) Κινητική Ets-1 συσσώρευσης που παρατηρήθηκε με time-lapse εικόνες. κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε πιάτα MatTek και επιμολύνθηκαν με pEGFP-C1-Ets-1 (500 ng? σειρές 1, 2 και 5) ή pEGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng? σειρές 3 και 6) ή άδειο pEGFP-C1 φορείς (500 ng? σειρά 4). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PJ-34 (10 μΜ? Σειρές 2-4) ή MG-132 (5 μΜ? Σειρές 5 και 6) και παρατηρήθηκαν για 12 ώρες κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε μεγέθυνση × 20 με ένα εικόνα που λαμβάνονται κάθε ώρα. Κάτω πίνακας: Στατιστική ανάλυση της μεταβολής της έντασης φθορισμού. Συνθήκες 1 έως 6 που αναγράφεται στον άξονα χ είναι οι ίδιες με εκείνες που περιγράφονται παραπάνω. Οι μέσες εντάσεις φθορισμού από εικόνες time-lapse πείραμα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ και ο λόγος της διακύμανσης μεταξύ της Τ = 12 ώρες και t = 0 εικόνες. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων. (Β) Απεικόνιση των επιπέδων Ets-1 πρωτεΐνης σε MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με PJ-34 με ανοσοφθορισμό. MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με PJ-34 (10 μΜ) για 20 ώρες. Ets-1 απεικονίζεται στο Κόκκινο (Alexa Fluor® 594). Τα κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε × 40 μεγέθυνση. μπαρ κλίμακας = 20 μm. Λευκά βέλη υποδεικνύουν κυτταροπλασματική εντόπιση της Ets-1 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (λωρίδα 1). Κάτω πίνακα: αναπαραστάσεις οικόπεδο επιφάνειας. οικόπεδα επιφάνειας ελήφθησαν από την ανάλυση των εικόνων ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ? ο x και y άξονες υποδεικνύουν τις θέσεις pixel και το Z-άξονα, την ένταση του φθορισμού. (C) Επίδραση της PARP-1 καταλυτικός αναστολής στο επίπεδο των πρωτεϊνών PARylated. MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με PJ-34 (10 μΜ) για 20 ώρες. Τα κυτταρικά λύματα (30 μα συνολικών πρωτεϊνών) αναλύθηκαν με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) έναντι PARP-1, ρ53, c-Jun και ERK-2, τα οποία είναι γνωστό ότι υφίστανται PARylation.

Η

Ets-1 έκφραση οδηγεί στο θάνατο των καρκινικών κυττάρων κάτω από PARylation αναστολή

για τον προσδιορισμό των συνεπειών του ETS-1 συσσώρευσης στα καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε εάν η εξωγενής έκφραση Ets-1 επηρεάζει την επιβίωση των κυττάρων HeLa έλαβαν θεραπεία με PJ -34. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με ένα φορέα που εκφράζει Ets-1 ή ένα άδειο φορέα και στη συνέχεια επωάστηκαν για 20 ώρες με PJ-34. πειράματα απεικόνισης Time-lapse έδειξε ότι PJ-34 δεν είχε καμία δραστική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων HeLa επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα ( «Mock»), όπως αποδεικνύεται από την απουσία νεκρωτικής μορφολογία και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) ενσωμάτωση (Εικ. 5Α, αριστερό πάνελ και 5Β). Παρ ‘όλα αυτά, Ets-1 έκφραση ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα να PJ-34 τοξικότητα σε μεγάλο βαθμό (Εικ. 5Α, δεξί πάνελ). πειράματα απεικόνισης time-lapse και στατιστική ανάλυση έδειξε ότι σχεδόν το σύνολο του ΣΕΔΕ-1 που εκφράζουν τα κύτταρα HeLa ενσωματωθεί PI και υποβλήθηκαν σε νέκρωση (Εικ. 5Α, δεξιά πάνελ και 5Β). Ομοίως, ένα ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) απέδειξαν ότι Ets-1 που εκφράζουν τα κύτταρα HeLa ήταν πιο επιρρεπείς σε νέκρωση μετά PJ-34 θεραπεία (Εικ. 5C, δεξιά πάνελ). Όπως PJ-34 είναι γνωστό ότι προκαλεί μιτωτική σύλληψη σε μία ΡΑΚΡ-1-ανεξάρτητο τρόπο [36], εκτελέσαμε επίσης αυτά τα πειράματα με ΑΒΤ-888 (Εικ. S4). Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν, αποδεικνύοντας ότι η νέκρωση του ETS-1 κύτταρα που εκφράζουν HeLa λειτουργεί μέσω ειδικής αναστολής της PARP-1 (Σχ. S4). Με MDA-MB-231 κύτταρα, παρατηρήσαμε ότι το 44% των κυττάρων υποβληθούν σε νέκρωση μετά PJ-34 αγωγή (Σχ. 5D και 5Ε). Η ανάλυση FACS επιβεβαίωσε αυτήν τη χαμηλότερη ευαισθησία σε PJ-34 τοξικότητα (Εικ. 5F). Ο καρκίνος του μαστού κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στην αντικαρκινικά φάρμακα, όπως η δοξορουβικίνη ή πακλιταξέλη, λόγω της υψηλής έκφρασης του MDR1 και Ets-1 [37]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο PJ-34 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως συμπλήρωμα σε μια θεραπεία δοξορουβικίνη. Αυτά τα πειράματα επέτρεψαν επίσης να ερευνήσουμε εάν [ή όχι], η Ets-1 συσσώρευση που προκαλείται από ΡΑΚΡ-1 αναστολή προκαλεί έναν μεγαλύτερο βαθμό αντίστασης στην δοξορουβικίνη σε MDA-MB-231 κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ets-1 ακόμη συσσωρευμένη υπό αναστολή PARylation όταν MDA-MB-231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ηΜ δοξορουβικίνης (Εικ. S5A). Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι MDA-MB-231 κύτταρα ήταν πιο επιρρεπείς σε νέκρωση όταν PJ-34 και δοξορουβικίνη συνενώθηκαν ό, τι όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μόνο μία από αυτές τις δύο φαρμάκων (Σχ. S5B και S5c). Έτσι, ακόμη και αν οι PJ-34 αποτελέσματα είναι μέτρια σε MDA-MB-231 κύτταρα, οι αναστολείς PARP-1 θα μπορούσε να συνδυαστεί αποτελεσματικά με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα για να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας.

(Α) πειράματα απεικόνισης time-lapse των κυττάρων HeLa έλαβαν θεραπεία με PJ-34. κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε πιάτα Hi-Q4 μέχρι 70% συρροή και επιμολύνθηκαν με άδειο pcDNA3 (250 μg? αριστερό πλαίσιο) ή ροϋΝΑ3-Ets1 (250 μg? δεξί πάνελ) Διανύσματα 24 ώρες πριν από την αγωγή με PJ-34 (5 μΜ) ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33242 (μπλε) και ΡΙ (κόκκινο) για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων και παρακολουθούνται για 20 ώρες. Κλίμακα bar = 20 μΜ. (Β) Γραφική απεικόνιση της αναλογίας των νεκρωτικών κυττάρων HeLa (%) σε τρία χρονικά σημεία (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). (Γ) Η κυτταρομετρία ροής ανίχνευση κυτταρικού θανάτου των κυττάρων HeLa σε επεξεργασία με PJ-34. κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων μέχρι 70% συρροή και επιμολυσμένα με pcDNA3 (1 μg? αριστερό πλαίσιο) ή ροϋΝΑ3-Ets1 (1 μg? δεξί πάνελ) φορείς για 24 ώρες και αφεθεί χωρίς θεραπεία (διακεκομμένες γραμμές) ή επεξεργασμένα με PJ -34 (συνεχείς γραμμές) για ένα επιπλέον επώαση 20 h. Νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε στη συνέχεια μέσω κυτταρομετρίας ροής μετά από χρώση ΡΙ. Οι αριθμοί κάτω από την οριζόντια γραμμή δώσει τα ποσοστά των ειδικών PJ-34 που προκαλείται από νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε κάθε κατάσταση. Η κυτταρομετρία ροής προφίλ δείχνονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών επαναλήψεων πειραμάτων. (D) πειράματα απεικόνισης Time-lapse των MDA-MB-231 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PJ-34. MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πιάτα Hi-Q4 μέχρι 80% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PJ-34 (10 μΜ) ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33242 (μπλε) και ΡΙ (κόκκινο) για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων και παρακολουθούνται για 20 ώρες. Κλίμακα bar = 20 μΜ. (Ε) Γραφική αναπαράσταση του ποσοστού των νεκρωτικών κυττάρων MDA-MB-231 (%) σε τρία χρονικά σημεία (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). ΣΤ) Η κυτταρομετρία ροής ανίχνευση κυτταρικού θανάτου των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με PJ-34. MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων μέχρι 80% συρροή και αφεθεί χωρίς θεραπεία (διακεκομμένες γραμμές) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με PJ-34 (συνεχείς γραμμές) για επώαση 20 h. Νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε στη συνέχεια μέσω κυτταρομετρίας ροής μετά από χρώση ΡΙ. Οι αριθμοί κάτω από την οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει τα ποσοστά των ειδικών PJ-34 που προκαλείται από νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε κάθε κατάσταση. Η κυτταρομετρία ροής προφίλ δείχνονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών επαναληπτικών πειραμάτων.

Η

Συσσώρευση Ets-1 που προκαλείται από την αναστολή PARylation αυξάνει βλάβη του DNA

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι κυτταρικής νέκρωσης που προκαλείται από την αναστολή της PARP-1 ταυτόχρονα με Ets-1 συσσώρευσης οφειλόταν στην αύξηση των βλαβών του DNA, όπως παρατηρείται με πρωτεΐνες σύντηξης Ets στον καρκίνο του προστάτη και σάρκωμα Ewing [26], [30]. Για να γίνει αυτό, θα αξιολογηθεί το επίπεδο του σήματος ιστόνης του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα, φωσφορυλιωμένη H2AX (γH2AX) εστίες.