Αφηρημένο

Κακόηθες μεσοθηλίωμα (ΜΜ) είναι μια επιθετική μορφή όγκου προκαλώντας υψηλή θνησιμότητα. Ένας λόγος γι ‘αυτό το παράδειγμα μπορεί να είναι η ύπαρξη ενός υποπληθυσμού των καρκινικών κυττάρων-κίνηση (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) που προσδίδουν ΜΜ με ανθεκτικότητα στα φάρμακα και στην επανάληψη. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει ένα TIC υποπληθυσμό των κυττάρων ΜΜ, χρησιμοποιώντας καλλιέργειες σφαιροειδές, mesospheres, ως μοντέλο MM τικ. Mesospheres, που χαρακτηρίζεται από τους δείκτες βλαστική ικανότητα CD24, ABCG2 και Oct4, ξεκίνησε όγκων σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια πιο αποτελεσματικά από ό, τι προσκολλημένα κύτταρα. CD24 κύτταρα knock-down χάσει την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και χαρακτήρισε κάτω ογκογενετικότητας. Κατά την σειριακή μεταμόσχευση, mesospheres σταδιακά πιο αποτελεσματικά tumrigenic με αυξημένο επίπεδο των δεικτών των βλαστικών κυττάρων. Μπορούμε επίσης να δείξουν ότι διαθέτουν mesospheres μιτοχονδριακή και μεταβολικές ιδιότητες παρόμοιες με εκείνες των φυσιολογικών και καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Τέλος, δείχνουμε ότι τα κύτταρα μεσοθηλιώματος-κίνηση είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε μιτοχονδριακά στοχευμένες βιταμίνη Ε ηλεκτρικό. Αυτό έγγραφα μελέτη που mesospheres μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα αληθοφανές μοντέλο των κυττάρων μεσοθηλιώματος-κίνηση και ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναζήτηση αποτελεσματικοί παράγοντες εναντίον MM

Παράθεση:. Pasdar EA, Smits Μ, Stapelberg Μ, Bajzikova Μ, Stantic Μ, Goodwin J, et al. (2015) Χαρακτηρισμός του μεσοθηλιώματος-κύτταρα έναρξης και την ευαισθησία τους σε αντικαρκινικά μέσα. PLoS ONE 10 (5): e0119549. doi: 10.1371 /journal.pone.0119549

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 8 Σεπτεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 14 του Γενάρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 1, 2015

Copyright: © 2015 Pasdar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Τα πρωτότυπα των πρώτων δεδομένων που είναι αποθηκευμένα στο σύστημα Πανεπιστήμιο Griffith. https://research-storage.griffith.edu.au/owncloud/index.php/apps/files/?dir=%2Fdocuments%2FPasdar%20et%20al%20PLoS%20One.

Funding: Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Αυστραλιανό Συμβούλιο Έρευνας, του καρκίνου του Συμβουλίου Queensland, και του Ευρωπαϊκού Ταμείου Περιφερειακής Ανάπτυξης (έργου BIOCEV, CZ.1.05 /1.1.00 /02,0109) για να JN. EAP υποστηρίχθηκε από την Υποτροφία Douglas Francis Πράσινο διδακτορικό που παρέχονται από το Queensland αμίαντο ασθένειες που σχετίζονται με την Κοινωνία. LFD υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο Griffith Research Fellowship. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κακόηθες μεσοθηλίωμα (MM), ο κύριος όγκος του υπεζωκότα, είναι εξαιρετικά επιθετική, με πολύ λίγα εάν οποιαδήποτε θεραπευτικές επιλογές. Τυπικά τη διάγνωση 20 έως 40 χρόνια μετά την έκθεση στον αμίαντο, το κύριο καρκινογόνο του MM, αυτό νεοπλασματική νόσος είναι πολύ επιθετική και το ποσοστό θνησιμότητας είναι υπερβολικά υψηλή με ένα επιβίωση λίγους μήνες μετά τη διάγνωση [1, 2], η υποτροπή του όγκου που συμβαίνουν λίγο μετά την έναρξη της θεραπείας [3]. Παρά την ισχύουσα απαγόρευση της χρήσης αμιάντου στις βιομηχανικές χώρες και λόγω της έλλειψης της περιοριστικής νομοθεσίας σχετικά με την επεξεργασία και τη χρήση του αμιάντου στις αναπτυσσόμενες χώρες [4], MM συχνότητα συνεχίζει να αυξάνεται ως αποτέλεσμα της μακράς περιόδου λανθάνουσας κατάστασης.

έχει προταθεί ότι η ετερογένεια του όγκου, ως συνέπεια της γενετικής αστάθειας και εξειδικευμένες παράγοντες εντός του όγκου, είναι μια σημαντική αιτία της αντίστασης στη θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο [5, 6]. Γονιδιωματικής μελέτες όγκων MM υπογραμμίζουν επίσης δια- και ενδο-όγκου ετερογένεια αυτού του τύπου κακοήθειας [7, 8]. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί της ετερογένειας του όγκου είναι ακόμα υπό έντονη συζήτηση και έχουν διαφορετικά μοντέλα έχουν προταθεί για να καθορίσει το φαινόμενο αυτό [9]. Η (CSC) μοντέλο που προτείνεται καρκίνου βλαστικών κυττάρων μπορεί εύλογα να περιγράψει την ετερογένεια και την ιεραρχική οργάνωση των κυττάρων εντός των όγκων [10]. ΚΕΠ (που αναφέρεται επίσης ως ογκογενή κύτταρα, τικ), ένα μικρό υπο-πληθυσμό κυττάρων εντός καρκινώματα, έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και παράγουν διαφοροποιημένα κύτταρα με υψηλή ικανότητα πολλαπλασιασμού ότι (επαν) σχηματίζουν την μάζα του όγκου [11 ], καθώς και την τροφοδότηση όγκων ανθεκτικών στη θεραπεία [12, 13]. Η παρουσία των τικ μπορεί επίσης, εν μέρει, να εξηγήσει υψηλή αντοχή των ΜΜ στη θεραπεία, αν και αυτή η πτυχή της MM παθοφυσιολογία είναι μόνο εν μέρει κατανοητός [14, 15].

Στην ανακοίνωση αυτή, αναφέρουμε την ύπαρξη του TICs το μεσοθηλίωμα χαρακτηρίζοντας σφαίρες προέρχονται από διαφορετικές μεσοθηλίωμα κυτταρικές σειρές όπως προηγουμένως καθιερωμένο μοντέλο για την καλλιέργεια βλαστικών κυττάρων και TICs [16-18]. Είμαστε επίσης παρόντες ο χαρακτηρισμός των ΜΜ τικ και την ευαισθησία τους σε παράγοντες αντι-καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι καθιερωμένες ανθρώπινη ΜΜ κυτταρικές σειρές Ist-Mes-2 (επιθηλιοειδής histotype), μεσο-2 (sarcomatoid histotype), ΜΜ-ΒΙ (διφασική histotype) [19], και το AE17 κυτταρική σειρά ποντικού (επιθηλιοειδής histotype) [20] καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και τον αντιμυκητιασικό /αντιβιοτικών (Invitrogen). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Για τον σχηματισμό σφαίρας, προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 10

4 έως 2×10

4 κύτταρα /ml του μέσου χωρίς ορό (SFM) η οποία περιλαμβάνει μέσο DMEM-F12 (Invitrogen) συμπληρωμένου με συμπλήρωμα ποντίκι NeuroCult Πολλαπλασιασμός (StemCell Technologies), 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF και 20 ng /ml FGF2 (R &? D Systems) στους 37 ° C και 5% CO

2. Υπό αυτές τις συνθήκες τα κύτταρα αναπτύσσονται σε μη-προσκολλημένα σφαιρικά σμήνη (mesospheres). ανιχνεύσεις πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο κρυσταλλικό ιώδες.

περιορισμένης αραίωσης

δοκιμασία

Τα προσκολλημένα κύτταρα και mesospheres διαχωρίστηκαν και διαφορετικό αριθμό κυττάρου από 100 να 0,25 κύτταρα ανά φρεάτιο τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων κύτταρο πλάκες καλλιέργειας που περιέχει 200 ​​μΙ SFM. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 για 7 ημέρες και η ικανότητά τους να σχηματίζουν τουλάχιστον ένα σφαίρα αξιολογήθηκε με βάση μια δημοσιευμένη μέθοδο [21, 22].

εμφύτευση όγκου κύτταρο

Ist-Mes-2 προσκολλημένα κύτταρα και mesospheres συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και αιωρήθηκαν σε 125 μΙ ελεύθερο ορού-ϋΜΕΜ /Matrigel μίγμα (BD Bioscience) (1: 1, ν /ν), ακολουθούμενη από υποδόρια ένεση στη δεξιά ή προς τα αριστερά μέσα κοιλιακή περιοχή του Balb-c /nude ή NOD ποντικοί /SCID χρησιμοποιώντας μια βελόνα 23-gauge. σχηματισμό όγκων και την εξέλιξη παρακολουθήθηκε και ποσοτικά με τη χρήση της συσκευής Vevo770 USI είναι εξοπλισμένα με το RMV708 σάρωση κεφαλής (VisualSonics) που λειτουργούν στη συχνότητα των 80 MHz και με το ψήφισμα της 30 μm. Οι μελέτες σε ζώα έγιναν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Αυστραλίας και της Νέας Ζηλανδίας Συμβουλίου για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων στην έρευνα και τη διδασκαλία και εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων Griffith (αριθμός άδειας MSC /13/10 /AEC). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Η ανοσοϊστοχημεία, συνεστιακή μικροσκοπία και TEM

Ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι τους απομακρύνθηκαν αμέσως, που καθορίζεται στο 4% ρυθμισμένο με φωσφορικό φορμαλδεΰδη και εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη. Οι όγκοι κόπηκαν σε πάχος 7 μm σε ένα Leica RM2265 Μικροτ (Leica Microsystems), τοποθετήθηκαν σε υάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες Supersoft Plus (Lomb Scientific), στέγνωσε όλη νύκτα στους 37 ° C, απο-parafinised σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σύμφωνα με τη ρουτίνα ιστοπαθολογική διαδικασία, και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Για συνεστιακή μικροσκοπία, τα επεξεργασμένα πλακίδια επωάστηκαν για μία νύχτα με αντι-mesothelin IgG (Abcam) ακολουθούμενη από ΗΚΡ-συζευγμένο δευτερεύον IgG και απεικονίζονται χρησιμοποιώντας το Olympus FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. ΤΕΜ κυττάρων σφαίρας εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (σηματοδότηση κυττάρου). Τα δείγματα αναλύθηκαν επί πηκτωμάτων SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, οι οποίες δεσμεύτηκαν με 5% BSA, και επωάζονται με το πρωτογενές και συζευγμένο με HRP δευτερογενούς IgGs, ακολουθούμενη από οπτικοποίηση χρησιμοποιώντας τις XRS ChemiDoc

+ System (Biorad). Πρωτογενή αντισώματα ήταν ως εξής: αντι-CD24 IgG, αντι-ΕρΟΑΜ IgG (Abcam), αντι-CD47 IgG (Santa Cruz), αντι-Oct3 /4 IgG (Stem τεχνολογίες κυψελών), αντι-ABCG2 IgG, αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (pERK1 /2) (Thr202 /Thr204) IgG, αντι-ρ44 /ρ42 (ERK1 /2) IgG, αντι-Ρ38 ΜΑΡΚ IgG, αντι-φωσφο-P38 ΜΑΡΚ (ρρ38) (Thr180 /Thr182) IgG, αντι -EGFR IgG, αντι-φωσφο-EGFR (pEGFR) (Tyr1068) IgG (όλα Cell Signaling). Αντι-ακτίνη IgG (Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR)

Σύνολο mRNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy κιτ (Qiagen) και cDNA συντίθεται μέσω της RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) και iCycler iQ Real-Time Σύστημα ανίχνευσης PCR. qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας την Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Γενικώς, 200 ng του εκμαγείου συνολικού RNA και 0.2 μΜ του γονιδίου-ειδικών εκκινητών PCR χρησιμοποιήθηκαν ανά αντίδραση, και το όργανο Eco PCR Πραγματικού χρόνου System (Illumina) για ενίσχυση. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση, τα σχετικά επίπεδα των γονιδίων στόχων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt. Μεμονωμένα εκκινητές είναι ως ακολούθως. CD24: προς τα εμπρός, AGC GGT TCT CCA AGC ACC CA, αντίστροφη-TAG GAG CAG TGC CAG CAG CA? Oct4: εμπρός-CCC CAG Γ.Ο.Σ. GGA ΟΤΟ GGG CT, αντίστροφη-GGA GGC CCC ATC GGA Γ.Ο.Σ. GC? ABCG2: εμπρός-ACG AAC GGA ΤΤΑ ACA GGG TCA, αντίστροφη-CTC CAG ACA CAC CAC GGA T? SOX4: διαβιβάσει GAT TCC GCC CAC AGA GAG TC, αντίστροφη-GGT AGC TCA GGA AAG CGA CA? KLF4: CTG GGT CTT GAG GAA ΟΤΟ CT, αντίστροφη-GGC ATG AGC TCT ΤΟΟ ΤΑΑ TGG? c-Myc: εμπρός-GGA CTT GTT GCG ΟΑΑ ACG AC, αντίστροφη-CTC AGC CAA GGT TGT GAG GT? ABCB5: εμπρός-ACT GAG ΑΑΑ GGA AGC AGT ΤΟΟ Α, αντίστροφη-ΤΑΑ ΑΓΓ ΑΑΟ GCA GGC TCC AT? GAPDH: εμπρός-TGC ACC ACC AAC TGC ΤΤΑ GC, αντίστροφη-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG

Η επιμόλυνση με μικρή φουρκέτα RNA (shRNA)

Ανθρώπινο CD24-ειδικό shRNA κατασκευάζει στο. ραχοκοκαλιά pRS υπό τον έλεγχο του υποκινητή U6 και το σχετικό κενό φορέα ελήφθησαν από ΟηΟεηε Technologies (Rockville). Το αντιδραστήριο διαμόλυνσης FuGENE HD (Promega) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση σταθερώς Ist-Mes-2 κύτταρα με το shRNA CD24 και κενό φορέα (ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι σταθερές και μόνο κλώνοι που προέρχεται από κύτταρα επιλέχθηκαν με την προσθήκη 4 μg /ml πουρομυκίνης στο μέσο καλλιέργειας και παρακολουθείται για επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας qPCR ή κηλίδωση Western.

Αξιολόγηση της δημιουργίας υπεροξειδίου, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, μιτοχονδριακή μάζα , του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και κυτταρική μέγεθος

επίπεδα ανιόντος υπεροξειδίου Ενδοκυτταρικά αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την φθορίζουσα μήλη MitoSOX. 10

5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και σε 70% συρροή, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ MitoSOX για 30 λεπτά, πλύθηκαν εκ νέου εναιώρηση σε PBS, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Fortessa, Becton Dickinson). επίπεδα υπεροξειδίου εκφράστηκαν ως μέση ένταση φθορισμού (MFI). Μιτοχονδριακή μάζα αξιολογήθηκε με αγωγή των κυττάρων με 50 μΜ Mitotracker Πράσινο FM για 30 λεπτά και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Για την αξιολόγηση του κυτταρικού κύκλου, 10

6 βιώσιμα κύτταρα πλύθηκαν και στερεώθηκαν σε 70% EtOH για όλη τη νύχτα και χρωματίστηκαν με 100 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), και αναλύθηκαν με έναν ροής FACS Calibur κυτταρόμετρο (Becton-Dickinson). Σήματα που εκπέμπονται από ένα μόνο πυρήνα και συγκεντρωτικά κύτταρα αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας μια μονάδα διπλού gating. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με την πρότυπη μέθοδο αννεξίνη V /PI. το μέγεθος των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση του μετρητή Σκήπτρο χειρός αυτοματοποιημένο κυττάρων (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

CS, SDH και της δραστηριότητας SQR

δραστηριότητα

CS αξιολογήθηκε από τη μείωση του DTNB [5,5 ‘ -dithiobis- (2-νιτροβενζοϊκό οξύ)] από το ένζυμο και συζευγμένο αντίδραση της με οξαλοξικό και ακετυλο-CoA. Εν συντομία, 10 μg λύματος πρωτείνης προστέθηκε σε ένα μίγμα από 10 mM DTNB και 30 mM ακετυλο συνενζύμου Α Η αλλαγή στην απορρόφηση του DTNB μετρήθηκε στο Tecan άπειρο 200 PRO αναγνώστη για 90 s στα 412 nm μετά την προσθήκη 10 mM οξαλοξικό σε όγκο αντίδρασης 200 μλ. δραστικότητα SDH αξιολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Dong et al., 2011). Για δραστηριότητα SQR, 40 μα λύματος πρωτεΐνης προστέθηκαν σε 1 ml του ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού SQR (10 mM ΚΗ2ΡΟ4, ρΗ 7,8, 2 mM EDTA, 1 mg /ml BSA), 80 μΜ διχλωροφαινολινδοφαινόλη, 0.2 mM ΑΤΡ, 4 μΜ ροτενόνη και 10 mM ηλεκτρικό, και επωάστηκαν στους 30 ° C για 10 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε κάθε λεπτό για 30 λεπτά μετά την έναρξη της αντίδρασης από decylubiquinone (80 μΜ) [23].

Υψηλής ανάλυσης αναπνευσιομετρίας

Η κατανάλωση οξυγόνου εκτιμήθηκε με τη χρήση του Oxygraph-2k υψηλής ανάλυση respirometer και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Datlab (αμφότερα Oroboros), ουσιαστικά όπως περιγράφεται [24]. Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν στους 37 ° C σε 2 ml θαλάμους. Για την αξιολόγηση της ακέραια κύτταρα, μέσο ϋΜΕΜ ελεύθερο ορού χρησιμοποιήθηκε, ενώ διγιτονίνη-διαπερατά κύτταρα αιωρήθηκαν στο μέσο μιτοχονδριακή αναπνοή MiR05. Για όλα τα πειράματα, 10

6 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ανά θάλαμο. Ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (ροή οξυγόνου) υπολογίστηκε ως η αρνητική κλίση της συγκέντρωσης οξυγόνου. Cellular ροή οξυγόνου διορθώθηκε για το οργανικό υπόβαθρο, η οποία προκύπτει από τη μη ειδική κατανάλωση οξυγόνου του αισθητήρα. Οι συνθήκες για την αναπνοή ήταν ως ακολούθως: GM_L-γλουταμικού (2 mM) /μηλικού (10 mM)? GM_P-όπως προηγουμένως συν ADP (2,5 mM)? GMS_P-όπως προηγουμένως συν ηλεκτρικό (10 mM)? GMS_E-όπως προηγουμένως συν CCCP (5 μΜ)? S (Rot) _E-όπως και πριν συν ροτενόν (0,5 μΜ). Τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν: GM_L διαρροής (κατανάλωση οξυγόνου δεν συνδέεται με την παραγωγή ΑΤΡ)? GM_P-αναπνοή μέσω CI? GMS_P-αναπνοή μέσω CI + CII? GMS_E-αποσυνδεθεί αναπνοή? S (Rot) _E-αποσυνδεθεί αναπνοή μέσω του CII.

Δοκιμασίες

Η πρόσληψη γλυκόζης, ATP επίπεδο και γαλακτικό

Για την πρόσληψη γλυκόζης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε χαμηλά επίπεδα γλυκόζης (1 g /l) DMEM τη διάρκεια της νύχτας σε 5% CO

2 και 37 ° C. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά με 50 μΜ 2-nitrobenzodeoxyglucose (2-NBDG) σε DMEM χαμηλής γλυκόζης. Το επίπεδο φθορίζοντος αναλόγου γλυκόζης στα κύτταρα αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής και εκφράζονται ως MFI. Για την εκτίμηση ΑΤΡ, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 10

4 κυττάρων ανά φρεάτιο και ενδοκυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ λουσιφεράσης-based (φθορισμού Δοκιμασία CellTiter-Glo, Promega). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεΐνη. Για γαλακτικό δοκιμασίας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 10

4 ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώαση, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του γαλακτικού χρησιμοποιώντας ένα κιτ φθορομετρική (Cayman Chemicals). Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε συνολική πρωτεΐνη

Η στατιστική ανάλυση

Το paired t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των πειραματικών αποτελεσμάτων, με διαφορές με

σ

& lt.? 0.05 θεωρούνται ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Σχηματισμός mesospheres από κυτταρικές σειρές ΜΜ με διάφορους φαινότυπους

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των τικ είναι η ικανότητά τους να αυτο-ανανέωση μέσω ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεση. Για να βεβαιωθείτε ότι τα κύτταρα ΜΜ περιλαμβάνει μια υπο-πληθυσμού με χαρακτηριστική ικανότητα αυτο-ανανέωσης, καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές ΜΜ συμπεριλαμβανομένων Ist-Mes-2 (επιθηλιακά histotype), Μεσο-2 (sarcomatoid histotype) και ΜΜ-BI κύτταρα (διφασική histotype), όπως καθώς και κύτταρα ποντικού AE17 ΜΜ καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες που καθορίζονται για τον εμπλουτισμό πληθυσμών κυττάρων σε τικ. Για τον εμπλουτισμό σε τικ, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού (SFM) [25], μια κατάσταση η διατήρηση κυττάρων σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση που έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση διαφόρων τύπων βλαστικών κυττάρων και TICs [26]. Σε SFM, όλα τα κύτταρα του ΠΜ αυξήθηκε το σφαιρικό αποικίες, που αναφέρεται ως mesospheres, με τη διάμετρο 30-100 μm μετά από 3-5 ημέρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 1Α). Για μελετηθεί Όλες οι κυτταρικές σειρές ΠΜ, προσκολλημένα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν λιγότερο αποτελεσματικά από τα αντίστοιχα κύτταρα σφαίρα όταν τοποθετούνται σε πλήρες μέσο, ​​και Ist-Mes-2 κύτταρα ήταν περισσότερο πολλαπλασιαστική από τα κύτταρα Μεσο-2 (Εικόνα 1Β) MM-BI και. Mesospheres διατήρησε την ικανότητα να σχηματίζουν νέα σφαίρες μετά τη μηχανική διάσπαση και την εκ νέου σπορά σε φρέσκο ​​SFM. Η συχνότητα των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας αντιπροσωπεύει TICs αξιολογήθηκε με την δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16, 21, 22]. Μπορεί να υπολογιστεί από τις γραφικές παραστάσεις, με βάση το σημείο τομής στην τιμή 37% με τις κλίσεις των επιμέρους κυτταρικών γραμμών που ο αριθμός των κυττάρων που απαιτείται για το σχηματισμό ενός σφαίρας ήταν 1,81 ± 0,24 για Ist-Mes-2, 4,54 ± 0,39 για το MM-BI και 7,53 ± 0,89 για τα κύτταρα μεσο-2 (Πίνακας 1). Ότι ένα μόνο κύτταρο μπορεί να σχηματίσει μια σφαίρα όταν τοποθετούνται σε SFM τεκμηριώνεται στο σχήμα 1Γ, που δείχνουν εξαρτώμενη από τον χρόνο σχηματισμού σφαίρας που αρχίζει με ένα μόνο Ist-Mes-2 κυττάρων.

Εικόνες αντίθεση

(Α) Φάση των mesospheres από καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές ΜΜ. (Β) ποσοστό διάδοσης της ενιαίας σφαίρες που προέρχεται από κύτταρα να καλλιεργηθούν εκ νέου σε κανονικό μέσο διαφοροποίησης σε σχέση με τα γονικά κύτταρα μεσοθηλιώματος. Για αυτό το πείραμα, τα κύτταρα σπάρθηκαν στον ίδιο αριθμό σε προσκολλημένα μέσο, ​​και ο πολλαπλασιασμός των αρχικά προσκολλημένα και σφαίρα κυττάρων όπως αξιολογείται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η αναλογία του συντελεστή πολλαπλασιασμού στα προσκολλημένα κύτταρα σφαίρα που προέρχονται επωάζονται για 72 ώρες είναι 3,37 για Ist-Mes-2, 1,72 για μεσο-2 και 4,25 για το MM-BI κύτταρα. (Γ) ένα μόνο κύτταρο Ist-Mes-2 διατηρήθηκε στο σχηματισμό SFM και σφαίρα κατά τις ημέρες 1, 3, 5 και 7 τεκμηριωμένη. Τα δεδομένα στο πάνελ Β είναι μέσες τιμές ± S.D. που προέρχονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Εικόνες σε πίνακες Α και C είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Η κλίμακα μπαρ στο πάνελ Α και C αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

Mesospheres εκφράζουν βλαστικών κυττάρων δείκτες και αποτελεσματικά δημιουργήσει όγκους

Έχουμε πραγματοποιηθεί πρόσφατα ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης παγκόσμιο της σφαίρας και προσκολλημένη Ist-Mes-2 κύτταρα που τεκμηριώνεται μια «υπογραφή βλαστική ικανότητα» των Ist-Mes-2 mesospheres [27]. Να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα των δεδομένων των μικροσυστοιχιών και να καθοριστούν περαιτέρω τα χαρακτηριστικά των κυττάρων σφαίρας, αναλύσαμε τις δύο σφαίρες και προσκολλημένα κύτταρα μονοστοιβάδας για την έκφραση των δεικτών που συνδέουν συχνά με TICs [10] και ότι βρέθηκαν επίσης αυξήθηκαν στην ανάλυση μικροσυστοιχιών της Ist-Mes-2 σφαίρες [27]. Υψηλότερη έκφραση του

CD24

,

Oct4

και

ABCG2

mRNA (1,5 έως 4-πλάσια αύξηση) βρέθηκε σε τομείς σε σύγκριση με το αντίστοιχο προσκολλημένα κύτταρα. Για να ελέγξετε για την πλαστικότητα των κυττάρων ΜΜ, μόνο σφαίρες που προέρχεται από κύτταρα υποβλήθηκαν σε κανονικές συνθήκες προσκολλημένη πολιτισμό μετά το σχηματισμό mesospheres να επιτρέψει εκ νέου την προσήλωσή τους. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι κατά τη διαφοροποίηση, προσκολλημένα κύτταρα που προέρχονται από σφαίρες δείχνουν παρόμοιο επίπεδο έκφρασης δεικτών βλαστικών κυττάρων με εκείνη των αρχικών προσκολλημένα κύτταρα (Σχ 2Α). Mesospheres έδειξε επίσης αυξημένη έκφραση αρκετών άλλων δεικτών βλαστική ικανότητα, δηλαδή

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

και

KLF4

(Σχήμα 2Β) .

(Α) Ist-Mes-2, μεσο-2 και MM-BI κύτταρα αφέθηκαν να σχηματίσουν σφαιρών, μετά την οποία αυτά τοποθετήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο για να προκαλέσει διαφοροποίηση και την εκ νέου προσκόλληση των κυττάρων. Σχετικά επίπεδα

CD24

,

ABCG2

και

Oct4

mRNAs αξιολογήθηκαν στις αρχικές προσκολλημένα κύτταρα (ορίζεται ως 1), οι σφαίρες και οι εκ νέου προσκολλημένα κύτταρα. (Β) Ist-Mes-2, μεσο-2 και MM-BI κύτταρα σφαίρες ελέγχθηκαν για το επίπεδο του

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

και

KLF4

mRNA και το επίπεδό τους εκφράζεται σε σχέση με εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.D. προέρχεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα, το σύμβολο «*» σημαίνει σημαντικά διαφορετικό δεδομένων με

σ

& lt? 0,05, «**» για τα άτομα με

σ

& lt?. 0.005

για να διερευνηθεί αν mesospheres και προσκολλημένα κύτταρα μονοστοιβάδας διαφέρουν στην ικανότητά τους να σχηματίζουν όγκους σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, Ist-Mes-2 μεσόσφαιρα και προσκολλημένα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε Balb-c /γυμνά ποντίκια στα 10

4, 10

5 και 10

6 κύτταρα ανά ποντίκι, και την έναρξη του όγκου και της προόδου παρακολουθήθηκαν με υπερήχους απεικόνισης (USI). κύτταρα Σφαίρα προερχόμενα ήταν πιο αποτελεσματικό στο σχηματισμό όγκων από προσκολλημένα ομολόγους τους, ιδίως για τις κατώτερες αριθμούς κυττάρων (Σχήμα 3Α-3C). Επιθεώρηση των εικόνων όγκου που αποκτήθηκαν από USI αποκάλυψε multilobular φύση των όγκων σφαίρας που προέρχεται, η οποία δεν είναι προφανής στα προσκολλητικά που προέρχεται από κύτταρα καρκινώματα (Σχήμα 3D).

Ist-Mes-2 προσκολλημένη και σφαίρα κύτταρα ενέθηκαν s.c. σε Balb-c /γυμνά ποντίκια στα 10

4 (Α), 10

5 (Β) και 10

6 κύτταρα ανά ποντικό (C). Ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας USI και εκφράζεται σε σχέση με το αρχικά ανιχνεύεται όγκου (~ 20 mm

3). (Δ) τρία διαφορετικά εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται με τη βοήθεια υπερήχων από sphere- και προσκολλημένη όγκους των κυττάρων που προέρχονται παρουσιάζονται για τους όγκους που προέρχονται από 10

6 κύτταρα ανά ποντίκι. Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει τα περιγράμματα των USI-οπτικοποιείται όγκους. Στη δεξιά πλευρά, μια φωτογραφία ενός αντιπροσωπευτικού όγκου αυξήθηκε από 10

6 σφαίρα (άνω εικόνα) και προσκολλημένα κύτταρα (κάτω εικόνα) εμφανίζεται. Τα δεδομένα σε πίνακες Α-C που προέρχονται από πειράματα που περιλαμβάνουν 4-5 ποντίκια ανά ομάδα και είναι μέσες τιμές ± S.E.M. Το σύμβολο «*» δηλώνει σημαντικά διαφορετικές τιμές με

σ

& lt?. 0.05

Η

Mesospheres διαδίδουν σειριακή όγκους με ολοένα και πιο επιθετική φύση

Για να εξακριβωθεί αν τα κύτταρα μεσόσφαιρα μπορεί μορφή όγκων διαδοχικά, λόγω της ικανότητας αυτο-ανανέωση των τικ, τους υποβλήθηκαν σε σειριακή ξενομεταμόσχευση σε Balb-c /γυμνά ποντίκια. Ist-Mes-2 κύτταρα σφαίρα αφέθηκαν να σχηματίσουν έναν όγκο, και τα κύτταρα του ΠΜ που προέρχονται από τον όγκο στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε καλλιέργεια με αποτέλεσμα μια κυτταρική γραμμή (1

st γενιάς, G1). Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν πάλι για να σχηματίσουν σφαίρες που μεταμοσχεύτηκαν σε γυμνούς ποντικούς για να δώσει δεύτερη γενιά των όγκων από τα οποία 2

ος κυτταρική γενεά γραμμή (G2) προήλθε. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές ακόμη για να ληφθούν γραμμές G3 και G4 κύτταρο. Με κάθε γενεά η χρονική υστέρηση για την έναρξη του όγκου μικρότερη έτσι ώστε να ήταν 52 ημέρες για τα G1, 15 ημέρες για την G2, 7 ημέρες για την G3 και 5 ημέρες για την G4 (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του δείκτη βλαστικών κυττάρων (CD24, ABCG2, Oct4) mRNAs αυξήθηκε σταδιακά στα επιμέρους σφαίρα γενεών (Εικόνα 4Β). Παρατηρήσαμε επίσης γενεά-εξαρτώμενη αύξηση σε CD24, CD47, EpCAM και Oct3 /4 πρωτεΐνη, υποστηρίζοντας περαιτέρω την άποψη ότι βλαστική ικανότητα αυξάνεται με κάθε γενεά (σχήμα 4Γ και 4Δ). Για να δοκιμαστεί η μιτοχονδριακή λειτουργία σε επιμέρους παραγωγή, μελετήσαμε τη δραστικότητα της CS, ένα συστατικό του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) και ένα υποκατάστατο μέτρο της μιτοχονδριακής μάζας. Σχήμα 4Ε δείχνει μια σταδιακή αύξηση στην δραστικότητα του ενζύμου. Για την τεκμηρίωση μορφολογία του καρκίνου των όγκων που προέρχονται από κάθε σφαίρα γενεά, μπορούμε χρωματίστηκαν τομές όγκων για την παρουσία ενός δείκτη του ΜΜ, mesothelin, και με Η &? Ε (Σχήμα 4F)

(Α) Ist-μηνύ-. 2 κύτταρα σφαίρα (γενιά 1, G1) μεταμοσχεύθηκαν υποδόρια σε Balb-c /άτριχων ποντικών σε 10

6 κύτταρα ανά ζώο. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 2.000 mm

3, οι ποντικοί θανατώθηκαν, οι όγκοι αποκόπηκαν και κακοήθη κύτταρα αναπτύχθηκαν

in vitro

ως μία κυτταρική γραμμή. Τα προσκολλημένα κύτταρα μετατράπηκαν σε σφαίρες (G1) και αυτά μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς Balb-c /γυμνούς ποντικούς για να σχηματίσουν όγκους που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή 2 (G2) σφαίρες. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο ακόμη φορές για να αντλήσει G3 και G4 σφαίρες. Το ένθετο στο πάνελ Α δείχνει την καθυστέρηση της εμφάνισης του όγκου ακόλουθες κυτταρικές μόσχευμα για μεμονωμένες γενιές σφαίρα κυττάρων. Κύτταρα μεμονωμένων γενεών αξιολογήθηκαν για βλαστική ικανότητα σημειωτές, όπως φαίνεται με τη χρήση qPCR (Β) και WB (πάνελ Ο δείχνει τα στυπώματα, πάνελ D πυκνομετρική αξιολόγησής τους) και για δραστικότητα CS (Ε). (F) Όγκοι που προέρχονται από προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες των μεμονωμένων γενεών αποκόπηκαν, εγκλεισμένα σε παραφίνη και χρωματίστηκαν για το mesothelin δείκτη MM (άνω εικόνες δείχνουν χρώση με την εξαίρεση του πρωτεύοντος IgG) και με Η &? Ε. Τα δεδομένα δείχνονται στον πίνακα Α που προέρχεται από 5 ζώα και είναι μέσες τιμές ± S.E.M, τα δεδομένα σε πάνελ Β και Ε είναι μέσες τιμές από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. Εικόνες στον πίνακα C είναι αντιπροσωπευτικές των δύο επιμέρους πειράματα και πυκνομετρική αξιολογήσεις τους στον πίνακα D αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές με τις διαφορές χαμηλότερο από το 10%. Εικόνες στον πίνακα ΣΤ ελήφθησαν με τη χρήση ενός όγκου για κάθε συνθήκη (γενιά). Το σύμβολο «*» δηλώνει στατιστικά σημαντικές διαφορές με το

σ

& lt? 0,05. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τριών διαφορετικών όγκων.

Η

Από πολιτισμών σφαίρα που προέρχονται από διαφορετικούς όγκους παραγωγής παρουσίασε αύξηση της δραστηριότητας CS, αξιολογήσαμε αυτά τα κύτταρα για την μιτοχονδριακή λειτουργία τους με περισσότερες λεπτομέρειες. Δοκιμάσαμε πρώτα τα μεμονωμένα κύτταρα σφαίρα γενιάς για την αναπνοή. Ανάλυση της αναπνοής του ανέπαφη, καθώς και διαπερατά κύτταρα χρησιμοποιώντας την respirometer Oxygraph υψηλή ανάλυση αποκάλυψε ότι τα κύτταρα γενεά G1 αναπνεομένων περισσότερο (και οι δύο μέσω ρουτίνα αναπνοή, καθώς και μέσω της αναπνοής χρησιμοποιώντας συμπλόκου Ι, CI, και CII) από κύτταρα G0 (σφαίρες παρασκευάστηκε από οι αρχικοί προσκολλημένα Ist-Mes-2 κύτταρα). Η αναπνοή των κυττάρων G2-G4 μειώθηκε ελαφρά, αλλά ήταν ακόμα πολύ υψηλότερο από ό, τι τα πατρικά κύτταρα σφαίρα (Σχήμα 5Α και 5Β). Η τάση αυτή ήταν αρκετά παρόμοια για μιτοχονδριακή μάζας (Σχ 5C), δημιουργία υπεροξειδίου (Σχήμα 5D), η πρόσληψη γλυκόζης (Σχήμα 5Ε) και μιτοχονδριακή δυναμικό (Σχήμα 5G). Από την άλλη πλευρά, το επίπεδο της ΑΤΡ μειώθηκαν στις επιμέρους σφαίρα γενεών (Εικ 5F) και μια παρόμοια τάση αποτελέσματα για παραγωγή γαλακτικού (Εικ 5Η). Δοκιμάσαμε επίσης τις δύο δραστηριότητες του CII, το SDH και ηλεκτρικό κινόνης αναγωγάσης (SQR) δραστηριότητα. Εικ 5Θ καταγράφει καμία μεταβολή στο SDH και σχήμα 5J μια σταγόνα στον G1 κύτταρα δραστηριότητας SQR. Παρατηρήσαμε μια ελαφρά προοδευτική αύξηση του μεγέθους των κυττάρων διαφορετικών γενεών (Εικ 5K). ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (ΤΕΜ) εικόνες αποκάλυψαν μορφολογικές διαφορές στα μιτοχόνδρια των κυττάρων επιμέρους γενιάς (Εικ 5L). κύτταρα πρώτης γενιάς διαθέτουν στρογγυλό ή οβάλ μιτοχόνδρια με ακρολοφίες διατάσσονται παράλληλα μεταξύ τους και μερικές μιτοχόνδρια περιβάλλονται με τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο. G2 κύτταρα έχουν δύο τύπους μιτοχονδρίων με την ίδια συχνότητα: μιτοχόνδρια με χαλαρωμένα μήτρα, και τα μιτοχόνδρια με πυκνή μήτρα και διατατική ακρολοφίες καθώς και μερική εντοπισμός των ακατέργαστων ER στην περιοχή των μιτοχονδρίων, παρόμοια με τα κύτταρα G1. G3 κύτταρα δείχνουν πυκνά μιτοχόνδρια με πεταλοειδή αλλά λιγότερο ευθεία ακρολοφίες, και τα κύτταρα G4 διαθέτουν διακλαδισμένης μιτοχόνδρια με διατατική (φυσαλιδώδους) ακρολοφίες και πυκνή μήτρα.

κύτταρα Σφαίρα αντιπροσωπεύουν μεμονωμένες γενιές αξιολογήθηκαν για την αναπνοή χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο ρουτίνας (Α) και το πρωτόκολλο για την διαπερατά κύτταρα (Β) με τη βοήθεια της υψηλής ανάλυσης respirometer Oxygraph 2k. Τα σύμβολα GM_L, GM_P, GMS_P, GMS_E και S (Rot) _E αντιπροσωπεύουν ρουτίνα αναπνοή, αναπνοή μέσω του συμπλόκου Ι, την αναπνοή μέσω του συμπλόκου Ι + ΙΙ, αποσυνδέεται αναπνοή και αποσυνδεθεί αναπνοή μέσω του CII, αντίστοιχα. (Γ) Μιτοχονδριακή μάζα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Mitotracker Πράσινο όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο τμήμα των Μεθόδων. Υπεροξειδίου αξιολογήθηκε με τη χρήση του φθορίζοντος ανιχνευτή MitoSOX (D), η πρόσληψη γλυκόζης με τη χρήση του φθορίζοντος αναλόγου γλυκόζης 2-NBDG (Ε), τα επίπεδα ΑΤΡ με δοκιμασία λουσιφεράσης-based (F), ΔΨ

m χρησιμοποιώντας τον TMRM φθορίζοντα ανιχνευτή (G ), επίπεδα γαλακτικού χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (H), για SDH (Ι) και δραστηριότητες SQR (J) με τη χρήση ενζυμικών αναλύσεων, και χειρός κύτταρα μετρητή για το μέγεθος των κυττάρων (Κ). (L) ΤΕΜ πραγματοποιήθηκε σε μεμονωμένα κύτταρα σφαίρα γενιάς, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Τα δεδομένα σε πίνακες Α-Κ είναι μέσες τιμές ± Τ.Α., Και προέρχονται από τρία ξεχωριστά πειράματα. Το σύμβολο «*» δηλώνει στατιστικά σημαντικές διαφορές με το

σ

& lt? 0,05. Εικόνες στον πίνακα L είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η λευκή γραμμή στον πίνακα Κ στα ανώτερα εικόνες αντιπροσωπεύει 500 nm, στα χαμηλότερα εικόνες 200 nm.

Η

CD24 knock-down μειώνει την ικανότητα των κυττάρων μεσοθηλιώματος για να σχηματίσουν σφαίρες και όγκους μορφή

CD24 είναι ένα γλυκοζυλ φωσφατιδυλινοσιτόλης-συνδεδεμένη βλεννίνη σαν πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας με ένα ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση, και εκφράζεται σε διάφορους καρκίνους [28-30]. Αυτός ο δείκτης συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους όγκους και ρύθμιση προς τα κάτω του αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα όγκου [31], ενώ η αυξημένη έκφραση του CD24 προάγει την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [32].

Για την περαιτέρω επαλήθευση ο ρόλος του CD24, εντόνως εκφρασμένο σε Ist-Mes-2 σφαίρες, στο «βλαστική ικανότητα» των κυττάρων ΠΜ, η έκφραση της ήταν σταθερά κάτω ρυθμισμένα με χρήση shRNA. Έχουμε επιλέξει αρκετούς κλώνους των knock-down κύτταρα, από τα οποία κλώνο 2 CD24

– κύτταρα έδειξαν περίπου 80% μείωση των CD24, όπως τεκμηριώνεται τόσο από Western και qPCR (Σχήμα 6Α και 6Β). Στη συνέχεια εκτελούνται όλες πειράματα με τον κλώνο 2 κύτταρα. CD24

– Ist-Mes-2 κύτταρα που αποκτήθηκαν επιθηλιακά-όπως μορφολογία και έδειξε μια απώλεια της τάσης των γονικών κυττάρων »για να σχηματίσει σφαιρίδια (Σχήμα 6C). Πιο συγκεκριμένα, κανένα σημάδι σχηματισμού σφαίρας παρατηρήθηκε μετά τη διατήρηση CD24

– κύτταρα σε SFM για 7 ημέρες, και τα κύτταρα συνέχισαν να επιμένουν στην καλλιέργεια για μερικές ακόμα ημέρες, όπως χαλαρά συσσωματώματα πριν πεθάνει. CD24 knock-down επίσης σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Ist-Mes-2 κύτταρα, όπως τεκμηριώνεται στο σχήμα 6D. Εμείς επόμενη αξιολόγησε τον ρόλο του CD24 στην μιτογόνο μονοπάτι ΜΑΡΚ, που ενεργοποιείται από τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ότι έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε ΜΜ [33]. Τα δεδομένα μας δείχνουν σχετικά υψηλό επίπεδο της φωσφορυλιωμένης EGFR σε mesospheres, ενώ μειωμένες ποσότητες pEGFR παρατηρήθηκαν σε CD24

– κύτταρα. Των κατάντη πρωτεϊνών της οδού ΜΑΡΚ, CD24

– κύτταρα παρουσιάζουν μικρότερη φωσφορυλίωση της Ρ38 αλλά όχι ERK1 /2, ενώ η Ρ38 βρέθηκε φωσφορυλιωμένη σε κύτταρα σφαίρα (Σχήμα 6Ε και 6F). Τέλος, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα ελέγχου για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι η φωσφορυλίωση του EGFR σε σφαίρες οφείλεται στην παρουσία EGF στα μέσα ενημέρωσης. Προσκολλητικά γονική, CD24

– κύτταρα και ψευδο-μορφομετατραπέντα Ist-Mes-2 διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο για 24 ώρες με την παρουσία ή απουσία προστιθέμενου EGF και, μαζί με τα κύτταρα σφαίρα που διατηρήθηκαν στην περιέχουσα EGF SFM , αξιολογούνται από WB για EGFR και pEGFR (Σχήμα 6G και 6Η). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρουσία EGF στο μέσο που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια των προσκολλημένων κυττάρων δεν υποστηρίζει φωσφορυλίωση του EGFR, η οποία είναι ως εκ τούτου μια εγγενής ιδιότητα των κυττάρων σφαίρας.

(Α) Η γονική, ψευδο-επιμολυσμένα, κλώνος 2, clone3 και «μικτές» κύτταρα (Ist-Mes-2 κύτταρα επιμολυσμένα με CD24 shRNA και επιλέγονται για αρκετούς κλώνους) αξιολογήθηκαν για CD24 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western με ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. Σχετικό επίπεδο των CD24 στα κύτταρα φαίνεται βασίζεται σε πυκνομετρική αξιολόγηση στον πίνακα Β, η οποία τεκμηριώνει επίσης το επίπεδο του mRNA CD24 που σχετίζονται με

GAPDH

. (Γ) Η γονική και CD24

– Ist-Mes-2 κύτταρα (κλώνος 2) αναπτύχθηκαν είτε στο μέσο που περιέχει ορό ή το SFM. (Δ) Η γονική, ψευδο-επιμολυσμένα και CD24

– προσκολλημένη και σφαίρα Ist-Mes-2 κύτταρα αξιολογήθηκαν για πολλαπλασιασμό σε 48 ώρες μετά την σπορά στην κουλτούρα, στις ίδιες αριθμό κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού κρυσταλλικό ιώδες. (Ε) Η γονική, ψευδο-επιμολυσμένα και CD24

– προσκολλημένη και σφαίρα Ist-Mes-2 κύτταρα αξιολογήθηκαν για Ρ38, ρρ38 ΜΑΡΚ, ERK1 /2, pERK1 /2, EGRF και pEGRF με κηλίδωση Western με αντι-ακτίνης IgG ως έλεγχος φόρτωσης, με πυκνομετρική αξιολόγηση των κηλίδων στο πάνελ F. (G) η γονική, CD24

– ή ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα καλλιεργούνται είτε σε πλήρες μέσο ή σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με ανασυνδυασμένο EGF, ή κύτταρα που αναπτύσσονται σε σφαίρα η