Αφηρημένο

Στόχος

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Τ24 και πιθανών σχετικών μηχανισμών:. έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, και η ρύθμιση των πρωτεϊνών Bcl-2 και ΒΑΧ

Μέθοδοι

κύτταρα Τ24 λάβει αντίστοιχες θεραπείες συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου του οχήματος, αντίσωμα (20 ng /mL CCR7 αντισώματος και 50 ng /ml CCL21), και 50, 100, και 200 ​​ng /ml CCL21. Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ? κυτταρική μετανάστευση και εισβολή αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο transwell. Κυττάρων απόπτωση που επάγεται από αδριαμυκίνη (ADM). Ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ. Western blot-χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των πρωτεϊνών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και BCL-2 και ΒΑΧ.

Αποτελέσματα

CCL21 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, με αυτή την 200 ng /mL που προκαλείται από τη μεγαλύτερη ποσότητα πολλαπλασιασμού. Σημαντικές διαφορές της κυτταρικής μετανάστευσης βρέθηκαν μεταξύ των ομάδων CCL21treatment και της ομάδας ελέγχου σε μελέτες τόσο η μετανάστευση και εισβολή (Ρ & lt? 0.001 για όλους). Οι εκφράσεις του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 πρωτεΐνες αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία CCL21 (ρ & lt? 0,05 για όλους). Πρωτεΐνη έκφραση του Bcl-21 ακολουθεί μια τάση αύξουσα ενώ η έκφραση του Bax ακολουθεί μια φθίνουσα τάση καθώς η συγκέντρωση των αυξήσεων CCL21. Καμία διαφορά δεν βρέθηκε μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αντισωμάτων για όλες τις εκτιμήσεις.

Συμπέρασμα

CCL21 /CCR7 προωθείται πολλαπλασιασμού Τ24 κυττάρων και αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή της μέσω της αυξημένης έκφρασης της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. CCL21 /CCR7 είχε αντιαποπτωτικού δραστηριότητες σε κύτταρα Τ24 μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax. CCL21 /CCR7 μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και μετάσταση

Παράθεση:. Μο M, Zhou M, L Wang, Qi L, Zhou K, Liu L-F, et al. (2015) CCL21 /CCR7 Ενισχύει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή των Ανθρωπίνων καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0119506. doi: 10.1371 /journal.pone.0119506

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Rajesh Mohanraj, Ιατρική Σχολή & amp? Επιστημών Υγείας, ΗΝΩΜΕΝΑ ΑΡΑΒΙΚΑ ΕΜΙΡΑΤΑ

Ελήφθη: 14η Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 13η Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Μο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου των ενηλίκων. Μόνο το 2008, 386.000 ασθενείς διαγνώστηκαν με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που είχε ως αποτέλεσμα 150.200 θανάτους σε όλο τον κόσμο με βάση την παγκόσμια στατιστικά στοιχεία [1]. Η μετάσταση είναι όχι μόνο ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αλλά επίσης και η αιτία της θνησιμότητας [1]. Ωστόσο, η παθοφυσιολογία της μετάστασης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης παραμένει ασαφής. Οι χημειοκίνες, μία υπερ-οικογένεια μικρών εκκρινόμενων πεπτίδια χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να επάγουν τη μετανάστευση των λευκοκυττάρων, έχουν μαζί με τους υποδοχείς τους έχουν βρεθεί να εμπλέκονται στη μετανάστευση των κυττάρων του λεμφικού συστήματος, του έτσι μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη και την εξέλιξη [2-4] καρκίνου. CCL21, ένα σημαντικό χημειοκίνης της οικογένειας CCL, είναι ένα από τα δύο μόνο συνδέτες (το άλλο είναι CCL19) για CCR7. [5] CCL21 παράγεται από ινοβλαστικά δικτυωτά κύτταρα των πλουσίων περιοχής των Τ-κυττάρων σε ανθρώπινα και υψηλά ενδοθηλιακά φλεβίδια σε ποντικούς. [6] CCR7 εκφράζεται από διάφορους τύπους λεμφοκυττάρων συμπεριλαμβανομένων αφελής Β και Τ κύτταρα, semimature και ώριμα δενδριτικά κύτταρα, και ρυθμιστικά κύτταρα Τ [5]. Επιπλέον, η έκφραση του CCR7 έχει αναφερθεί για την προώθηση της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων να λεμφαδένες μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [7], του καρκίνου του μαστού [8], καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του τραχήλου [9], ορθοκολικό καρκίνο [10] , ο καρκίνος του προστάτη [11], καρκίνο του οισοφάγου πλακωδών κυττάρων [12] και γαστρικού καρκίνου [13]. Ως εκ τούτου, CCR7 και συνδέτη (ες) του μπορούν να συμμετέχουν στον πολλαπλασιασμό, την εξέλιξη και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων διαφόρων προελεύσεων οργάνου [7-13]. Βρήκαμε επίσης ότι CCR7 συμμετείχε στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (μη δημοσιευμένα δεδομένα).

Φυσιολογικά, CCL21 /CCR7 παίζει σημαντικούς ρόλους σε παλιννόστησης των ανοσοκυττάρων, των λεμφαδένων παλιννόστησης και την τοποθέτηση, ανοσίας και περιφερική ανοχή, ανάπτυξη και λειτουργία των ρυθμιστικών κυττάρων Τ, και αυτοανοσία και λεμφοειδών neogensis [5]. Διάφορες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει τους ρόλους των CCL21 /CCR7 στην ανάπτυξη και την εξέλιξη [14-17] όγκου. Για παράδειγμα, CCL21 /CCR7 προωθεί G2 /M εξέλιξη φάση και αποτρέπει την απόπτωση μέσω της οδού ERK σε ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [15, 16], διευκολύνει την εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος μέσω επαγωγή αγγειογένεσης και λεμφαγγειογένεσης [14], ρυθμίζει μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) σε ανθρώπινο μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου [18], και ρυθμίζει προς τα άνω την ΜΜΡ-9 σε Β-κυττάρων χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας μετανάστευση κυττάρων και εισβολή [17]. Επιπλέον, CCL21 /CCR7 βρέθηκε επίσης να προωθήσει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε microlymphatic σκάφη στον καρκίνο του μαστού [19], παγκρεατικού όγκου [20], αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [21], και οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [22]. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος του CCL21 /CCR7 στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης παραμένει ασαφής. Τα κύτταρα Τ24 που προέρχεται από το μεταβατικό κυτταρικό καρκίνωμα της ανθρώπινης ουροδόχου κύστης και έχουν εκτεταμένα χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη καρκίνου της ουροδόχου κύστης [23].

Οι σκοποί της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν οι επιδράσεις του CCL21 /CCR7 για την πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Τ24 και πιθανών σχετικών μηχανισμών:. έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, και η ρύθμιση των πρωτεϊνών Bcl-2 και ΒΑΧ

Υλικά και Μέθοδοι

η μελέτη αυτή λαμβάνεται έγκριση ηθικής από την επιτροπή δεοντολογίας σε Xiangya Νοσοκομείο, Κεντρική Νότια Πανεπιστήμιο, Changsha, επαρχία Χουνάν, Κίνα.

Αντιδραστήρια και κυτταρική σειρά

CCL21 ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη αγοράστηκε από Perprotech (Rocky Hill, NJ, USA) και αντι-ανθρώπινη CCR7 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αγοράστηκε από την Wuhan Boster Biological Engineering Co, Ltd (Wuhan, Κίνα). αναστολέα πρωτεάσης φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) αγοράστηκε από την Roche Diagnostics (Indianapolis, ΙΝ, USA). ΜΤΤ και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκε από Hufeng Chemical Co, Ltd (Σαγκάη, Κίνα). κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC αγοράστηκε από Beyotime Βιοτεχνολογίας (Σαγκάη, Κίνα).

Το ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από τα Ινστιτούτα Σαγκάη Βιολογικών Επιστημών, η Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2, σε μέσο ϋΜΕΜ (GIBCO, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 U /mL στρεπτομυκίνη.

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

κύτταρα Τ24 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες πριν από την ΜΤΤ δοκιμασία, δοκιμασίες μετανάστευσης και της εισβολής, και ανάλυση στυπώματος Western και 24 ώρες πριν από την μελέτη κυτταρομετρίας ροής. Για κάθε πείραμα, υπήρχαν πέντε ομάδες που αποτελούνται από Ομάδα 1 (ομάδα ελέγχου), η οποία υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μέσο DMEM χωρίς ορό, ομάδα 2 (ομάδα αντίσωμα) το οποίο έλαβε την πρώτη προεπεξεργασία των 20 ng /mL αντι-ανθρώπινα CCR7 αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό για 4 h και στη συνέχεια 50 ng /ml CCL21, Ομάδα 3 η οποία έλαβε 50 ng /ml CCL21, Ομάδα 4, η οποία έλαβε 100 ng /ml CCL21, και η Ομάδα 5, η οποία έλαβε 200 ng /ml CCL21. Τα πειράματα της ανάλυσης ΜΤΤ, κυτταρομετρία ροής, και κηλίδα Western επαναλήφθηκαν τρεις φορές (η = 3), και μετανάστευση κυττάρων και εισβολή επαναλήφθηκαν τέσσερις φορές (η = 4).

ΜΤΤ δοκιμασία για τον πολλαπλασιασμό των Τ24 κύτταρα

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Τ24 αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα κατεργάστηκαν αντίστοιχα σε κάθε ομάδα για 48 ώρες. Μετά την κατεργασία, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 mg /mL διαλύματος ΜΤΤ (20 μΙ). Μετά από επώαση για 4 ώρες στους 37 ° C και 5% CO2, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το σχηματισμό της φορμαζάνης μετρήθηκε στα 490 nm με Gel Τεκμηρίωση & amp? σετ Σύστημα Ανάλυσης (Liuyi Factory, Πεκίνο, Κίνα).

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση κυττάρων και εισβολή αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο φρεατίων (EMD, Millipore, USA). Για τη δοκιμασία εισβολής, ένα θάλαμο transwell τοποθετήθηκε σε ένα πλακίδιο των 24 φρεάτων και επικαλύφθηκε με 30 μΙ Matrigel (Franklin Lakes, USA) και επωάστηκε για μία ώρα στους 37 ° C. Σε αμφότερες τις δοκιμασίες Transwell, κύτταρα, μετά αντίστοιχη θεραπεία 48 ωρών, τρυψινοποιήθηκαν και εμβολιάστηκαν σε θαλάμους στην πυκνότητα 8 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο, και 500 μΙ μέσο ελεύθερο ορού DMEM προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν με 100% Matrigel (BD, Franklin Lakes, USA) μεθανόλη για 30 λεπτά μετά από 24 ώρες, και μη κύτταρα που μετανάστευσαν απομακρύνθηκαν με μπατονέτες. Τέλος, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για 20 λεπτά. Οπτικό μικροσκόπιο (200Χ, Όλυμπος, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει τον αριθμό των κυττάρων σε πέντε τυχαία πεδία του άποψη? μέσος αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε για κάθε ομάδα.

Η κυτταρομετρία ροής για απόπτωση

κυττάρων απόπτωση που επάγεται από Adiamycin (ADM). Ο ρυθμός της απόπτωσης των κυττάρων Τ24 εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ. Εν συντομία, κύτταρα Τ24 επεξεργάστηκαν όπως παραπάνω σε κάθε ομάδα για 24 ώρες? κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ADM (0,1 mg /ml) για επιπλέον 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος μετρήθηκε με διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC και ΡΙ χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνη V-FITC (Beyotime Biotechnology, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά την κηλίδωση. Η απόκτηση δεδομένων και ανάλυση διεξήχθησαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cell Quest.

ανάλυση κηλίδος Western

κύτταρα Τ24 τοποθετήθηκαν σε 75 mL φιαλίδια καλλιέργειας και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες και στη συνέχεια αντιμετωπίζονται αντίστοιχα σε κάθε ομάδα για την επώαση 48h. Τα εναιωρήματα πλύθηκαν με κρύο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό RIPA [1 Μ Tris (ρΗ 7.4), 5 Μ NaCl, 0,5 Μ EDTA (ρΗ 8.0), 10% SDS, 10% DOS, και 10% ΝΡ40] με φρέσκο ​​αναστολέα πρωτεάσης PMSF πάνω σε πάγο για 20 λεπτά. Τα κύτταρα αποξέστηκαν και το λύμα συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα Eppendorff και φυγοκεντρήθηκαν σε 10.000 rpm σε 4 ° C για 10 λεπτά, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C για μελλοντική χρήση.

οι αραιώσεις του BCL-2 /ΒΑΧ (12%) και ΜΜΡ-2 /ΜΜΡ-9 (7.5%) χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη. Πρωτεΐνες (20μg) φορτώθηκαν σε 5-15% γέλες SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, USA). Οι μεμβράνες μουσκεύτηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% αποβουτυρωμένο γάλα) υπό θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι κηλίδες πλύθηκαν με PBS (με 0,1% BSA). Για να διερευνήσουν για ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, BCL-2, Βαχ, και β-ακτίνης, οι μεμβράνες επωάστηκαν 2 ώρες υπό θερμοκρασία δωματίου με σχετικών αντισωμάτων, που ακολουθείται από κατάλληλη HRP συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα και την ανίχνευση ECL. Τεκμηρίωση Gel & amp? Σύστημα ανάλυσης που (Liuyi Factory, Πεκίνο, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για τη σύλληψη εικόνας και ανάλυσης των τιμών οπτικής πυκνότητας (OD) (490nm).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS 18.0 στατιστικό λογισμικό. Ποσοτικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης με δοκιμή LSD Fishers χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις ομάδας. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p-τιμή μικρότερη από 0.05.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24

Τα αποτελέσματα της CCL21 /CCR7 για τα Τ24 κύτταρα, όπως αντιπροσωπεύονται από OD τιμές που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. OD τιμές ήταν 0,211 ± 0,013 στην ομάδα ελέγχου, 0.216 ± 0.011 στην ομάδα αντίσωμα (ρ & gt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο), 0,248 ± 0,006 σε 50 ng /ml CCRL21 (Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο), 0.290 ± 0.004 για 100 ng /ml CCRL21 (Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο), και 0.341 ± 0.012 για 200 ng /mL του CCRL21 (Ρ & lt? 0.001 ως σε σύγκριση με τον έλεγχο). CCL21 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο με 200 ng /mL προκαλείται από τη μεγαλύτερη ποσότητα του πολλαπλασιασμού.

Η

Επιδράσεις της CCL21 /CCR7 για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Τ24

Τα αποτελέσματα του CCL21 /CCR7 για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Τ24 παρουσιάζεται στο σχήμα. 1. Οι μετρήσεις κυττάρων για τις μελέτες της μετανάστευσης και της εισβολής έχουν ως εξής: 45,5 ± 11,6 και 28,6 ± 15,0 για την ομάδα ελέγχου, 42,5 ± 13,6 και 30,5 ± 15,2 για την ομάδα αντίσωμα, 72,9 ± 22,4 και 55,5 ± 13,6 για CCRL21 100 ng /mL ομάδα, 115,7 ± 18,8 και 102,1 ± 18,0 για CCRL21 150 ng /mL ομάδα, και 178.9 ± 8.4 και 143.7 ± 24.4 για CCRL21 200 ng /mL ομάδα. Σημαντικές διαφορές της κυτταρικής μετανάστευσης βρέθηκαν μεταξύ είτε των τριών ομάδων CCL21treatment και της ομάδας ελέγχου και στις δύο μελέτες η μετανάστευση και εισβολή (Ρ & lt? 0.001 για όλους)? αλλά, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αντίσωμα είτε στην μελέτη μετανάστευση ή την εισβολή μελέτη (Ρ & gt? 0,05 για τα δύο). Το αποτέλεσμα της θεραπείας CCL21 /CCR7 για τη μετανάστευση των κυττάρων T24 είναι εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση με την υψηλότερη συγκέντρωση του CCL21 (200 ng /ml) παρήγαγε το μεγαλύτερο αριθμό των κυττάρων της μετανάστευσης /εισβολής. Σε γενικές γραμμές, μικρότερους αριθμούς κυττάρων Τ24 βρέθηκαν στη μελέτη εισβολή από εκείνο της αντίστοιχης μελέτης μετανάστευση.

Η δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο transwell επικαλύπτονται με 30 μΐ διαλύματος μίγματος Matrigel με πέντε διαφορετικές ομάδες αποτελούμενες από ελέγχου του οχήματος, CCR7 αντίσωμα 20 ng /ml συν CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml, και CCL21 200 ng /ml. Τα δεδομένα παρούσα Μέση ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επιδράσεις της CCL21 CCR7 στην έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Τ24 παρουσιάζονται /

Αποτελέσματα κηλίδας Western στο Σχ. 2? Οι ποσοτικές μετρήσεις της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Σημαντικές διαφορές βρέθηκαν στην έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 μεταξύ των πέντε ομάδων (ρ & lt? 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, οι εκφράσεις του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 πρωτεΐνες αυξήθηκαν σημαντικά μετά από τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις της θεραπείας CCL21 (ρ & lt? 0,05 για όλους). Ωστόσο, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά σε ΜΜΡ-2 ή ΜΜΡ-9 μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αντίσωμα (ρ & gt? 0,05 για τα δύο)

Διαδρομή 1:. Κύτταρα Τ24 σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος? Διαδρομή 2: κύτταρα Τ24 σε επεξεργασία με αντίσωμα CCR7 20 ng /ml συν CCL21 50 ng /ml? Διαδρομή 3: κύτταρα Τ24 σε επεξεργασία με 50 ng /ml CCL21? Λωρίδα 4: κύτταρα Τ24 σε επεξεργασία με 100 ng /ml CCL21? και Λωρίδα 5: Κύτταρα Τ24 σε επεξεργασία με 200 ng /ml CCL21. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και τρέχουν σε 5-15% γέλες SDS-PAGE ακολουθούμενη από μία ανάλυση Western blot. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επιδράσεις της CCL21 /CCR7 στην απόπτωση σε κύτταρα Τ24

Επιδράσεις της CCL21 /CCR7 στις εκφράσεις του Bcl-2 και Bax με κηλίδα Western παρουσιάζονται στο Σχ. Οι 2 και οι τιμές OD που παρουσιάζονται στο Σχ. 3. Πρωτεΐνη έκφραση του Bcl-21 ακολουθεί μια τάση αύξουσα ενώ η έκφραση του Bax ακολουθεί μια φθίνουσα τάση καθώς η συγκέντρωση των αυξήσεων CCL21. Σημαντικές διαφορές βρέθηκαν στις εκφράσεις του Bcl-2 και Bax μεταξύ CCL21 50 ng ομάδα /ml και CCL21 100 ng /ml ομάδα (ρ & lt? 0,05 για τα δύο) και μεταξύ CCL21 50 ng ομάδα /ml και CCL21 200 ng /ml (ρ & lt ? 0,05 και για τα δύο), αλλά όχι μεταξύ CCL21 100 ng ομάδα /ml και CCL21 200 ng /ml (ρ = 0,545 για Bcl-2 και ρ = 0,191 για Bax). Και πάλι, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αντίσωμα για είτε Bcl-2 ή Βαχ (ρ & gt? 0,05 για τα δύο).

κύτταρα Τ24 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος, CCR7 αντίσωμα 20 ng /ml συν CCL21 50 ng /ml, CCL21 50 ng /ml, CCL21 100 ng /ml, και CCL21 200 ng /ml. Οι τιμές (OD) του παρόντος Μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Πρώιμη και καθυστερημένη ποσοστά απόπτωσης και τα συνολικά ποσοστά κυτταρικού θανάτου μετά τις θεραπείες που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Τα ποσοστά της πρόωρης απόπτωσης, αργά απόπτωσης και συνολικά ποσοστά θανάτου των κυττάρων στην ομάδα ελέγχου είναι 26.4 ± 5.0%, 37.5 ± 2.4%, και 63,9 ± 7,1%, αντίστοιχα? ενώ στην ομάδα αντισώματος είναι 25,2 ± 3,8%, 35,6 ± 5,5%, και 60,8 ± 9,3%, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα ποσοστά απόπτωσης βρέθηκε σε κάθε στάδιο μεταξύ των δύο ομάδων (ρ & gt? 0,05 για όλους). Τα ποσοστά της πρόωρης απόπτωσης, αργά την απόπτωση και το συνολικό κυτταρικό θάνατο μειώθηκαν μετά από θεραπείες CCL21 σε 50, 100, και 200 ​​ng /ml. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σημαντικές μειώσεις στη συνολική κυτταρική απόπτωση βρέθηκαν σε ομάδες αγωγής CCL21 (ρ & lt? 0,001 για όλες τις τρεις ομάδες θεραπείας)? Ωστόσο, καμία σημαντική διαφορά δεν βρέθηκε μεταξύ των τριών ομάδων θεραπείας CCL21 συνολικά απόπτωση των κυττάρων (ρ & gt? 0,05 για όλους). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σημαντικές μειώσεις βρέθηκαν επίσης σε πρώιμη απόπτωση των κυττάρων σε ομάδες θεραπείας CCL21 (p = 0.008 για 200 ng /mL, 0.001 για 100 ng /mL, και 0.027 για 50 ng /mL)? Ωστόσο, και πάλι, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων θεραπείας CCL21 στην πρώιμη απόπτωση (p & gt? 0,05 για όλους).

Η

Συζήτηση

Το δυναμικό των καρκινικών κυττάρων να κάνουν μετάσταση εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις του με ομοιοστατική παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των χημειοκινών η οποία όχι μόνο προάγουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση αλλά και τη μετανάστευση και την εισβολή ή μετάσταση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι χημειοκίνες εμπλέκονται στην εξέλιξη και τη μετάσταση διαφόρων καρκίνων [2, 4, 5]. CCR7 εμπλέκεται στη μετάσταση του καρκίνου στους λεμφαδένες σε διάφορες μορφές καρκίνου [7-13]. CCL21 συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό CD4 Τ κύτταρα, κύτταρα νεφρού μεσαγγειακά, και διάφορα καρκινικά κύτταρα [19, 24-27]. Η μελέτη μας απέδειξε για πρώτη ότι CCL21 /CCR7 θα μπορούσε να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24 (Πίνακας 1), τη μετανάστευση και εισβολή (Εικ. 1).

συγκέντρωση χημειοκίνης μπορεί να είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [ ,,,0],19, 26]. Ως αποτέλεσμα, χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του CCL21 στην παρούσα μελέτη και βρήκε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο με τον επιδράσεις CCL21 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24, μετανάστευση, και διείσδυση. CCL21 μπορεί να αυξήσει σε μεγάλο βαθμό τη μετανάστευση Τ24 κυττάρων και εισβολή σε υψηλές συγκεντρώσεις και να διευκολύνει έτσι τη μετάσταση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα ευρήματά μας συνάδουν με αυτά προηγούμενων εκθέσεων.

Η αλληλεπίδραση των χημειοκινών και των υποδοχέων τους χρησιμεύσει ως θεμέλιο για την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και της μετανάστευσης μέσω της ενεργοποίησης του πολυμερισμού της ακτίνης ενδοκυτταρικά για να δημιουργήσετε ψευδοπόδια [28, 29]. Muller et al βρήκαν ότι CCL21 AT100 ηΜ προκάλεσε μια παροδική 1,6-πλάσια αύξηση στην ενδοκυτταρική flamentous ακτίνη (Ρ-ακτίνη) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του μαστού μέσα σε 20 δευτερόλεπτα και παρατηρείται διακριτή σχηματισμός ψευδοπόδια μετά από 20 λεπτά της διέγερσης με CCL21 [19]. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης με τη μετανάστευση Τ24 κυττάρων και εισβολή είναι consistent0020with αυτά προηγούμενων εκθέσεων. Σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων Τ24 παρατηρήθηκε όταν CCR7 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με CCL21 και αυτό δείχνει ότι η επίδρασή του CCL21 εξαρτάται από τη δραστηριότητα του CCR7. Από την άλλη λέξη, CCL21 μπορεί να ενεργοποιεί CCR7 πρώτα και στη συνέχεια να επηρεάσει τη μετανάστευση Τ24 κυττάρων και εισβολή.

Μόρια σαν CCL21 χημοκίνης εμπλέκονται στην μετάσταση των καρκίνων, όχι μόνο μέσω μεσολάβηση της μετανάστευσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων σε ιστούς αλλά παρέχει επίσης τις απαιτούμενες υποστηρικτικές μικροπεριβάλλοντα. In vivo, η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων είναι συχνά επιβραδύνεται με πολλές αντιστάσεις, όπως η βασική μεμβράνη και τις γύρω του συνδετικού ιστού [29, 30]. Ως εκ τούτου, για να μιμηθεί την πραγματική in vivo κατάσταση, χρησιμοποιήσαμε transwell θάλαμο επικαλυμμένο με matrigel ως ένα φυσικό φράγμα για την παρούσα μελέτη. ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι δύο πρωτεΐνες οι οποίες συνδέονται στενά με τη μετάσταση καρκίνου της ουροδόχου κύστης [31-33]. Καρκίνος εισβολή κυττάρων μπορεί να απαιτεί την έκκριση των ΜΜΡ όπως ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 για να υποβαθμίσει το matrigel. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι CCL21 θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και επομένως να βελτιωθεί κυττάρων εισβολής (Εικ. 2 και Πίνακας 2). ΜΜΡ παίζουν σημαντικούς ρόλους σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή? αλλά και άλλοι παράγοντες, όπως ιντερλευκίνες και Ε-καδερίνης μπορεί επίσης να συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου και εισβολή [34-37]. Παρ ‘όλα αυτά, CCL21 /CCR7 μπορεί να διευκολύνει την προσβολή καρκινικών κυττάρων μέσω αύξηση της έκκρισης των ΜΜΡ και ενισχύοντας την κυτταρική κινητικότητα.

Χρησιμοποιώντας ραδιοεπισημασμένου τεχνικές, οι ερευνητές έχουν βρει μόνο ένα πολύ μικρό τμήμα του ραδιοεπισημασμένου καρκινικών κυττάρων σε microcirculations έχει τη δυνατότητα να κάνει μετάσταση [38] . Η επιβίωση των καρκινικών κυττάρων εξαρτάται από την αντιαποπτωτική ικανότητές τους. Όταν τα καρκινικά κύτταρα εγκαταλείψουν την αρχική τους ιστούς του, θα χάσουν κάποια αν όχι όλα τα ομοιοστατική παράγοντες που περιλαμβάνουν χημειοκινών για την προσκόλληση και την υποστήριξη? έτσι τα κύτταρα είναι επιρρεπή σε απόπτωση. Στην παρούσα μελέτη, ο αντιαποπτωτική ικανότητα των κυττάρων CCL21 INT24 διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με χρώση V-FITC /ΡΙ αννεξίνης μέσω επαγόμενων ADM απόπτωσης. Η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) μπορεί να δεσμεύει ειδικά αννεξίνης-ν. PI, ένας πυρηνικός παράγοντας χρώσης, δεν μπορούν να διασχίσουν φυσιολογική κυτταρική μεμβράνη. Στην πρώιμη φάση της απόπτωσης, πυρηνική χρώση ΡΙ δεν μπορεί να ανιχνευθεί ως η κυτταρική μεμβράνη είναι άθικτη. Ωστόσο, όπως κύτταρο υφίσταται απόπτωση στη μέση έως τα τέλη φάσεις, φλύκταινες κυτταρική μεμβράνη και δεν είναι πλέον ανέπαφη? έτσι πυρήνας μπορεί να ανιχνευθεί μέσω χρώσης ΡΙ

Το αποτέλεσμα της κυτταρομετρίας ροής μπορεί να διαιρεθεί σε τέσσερα τεταρτημόρια:. το κάτω αριστερό τεταρτημόριο με φυσιολογικά ζωντανά κύτταρα [Annexin-V (-), PI (-)], η άνω δεξιά τεταρτημόριο [Annexin-V (+), ΡΙ (+)] με αργά αποπτωτικά ή νεκρωτικών κυττάρων, η κάτω δεξιά τεταρτημόριο [Annexin-V (+), PI (-)] με πρώιμη αποπτωτικά κύτταρα, και η επάνω αριστερή τεταρτημόριο [Annexin-V (-), ΡΙ (+)] με μικρές μερίδες κυτταρικών θραυσμάτων λόγω μηχανικής ζημίας και την απόπτωση. Έτσι, η ανάλυση της απόπτωσης εξαρτάται κυρίως από πρώιμη απόπτωση (κάτω δεξιά τεταρτημόριο) και το συνολικό κυτταρικό θάνατο (άνω δεξιά + κάτω δεξιά τεταρτημόρια) στην παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματά μας παρουσίασαν σημαντική μείωση της απόπτωσης και κυτταρικού θανάτου με θεραπεία CCL21 σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0,01)? Ωστόσο, καμία διαφορά μεταξύ CCR7 αντίσωμα συν θεραπεία CCL21 και τον έλεγχο βρέθηκε (ρ & gt? 0,05). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αντίσωμα θα μπορούσε να CCR7 ανταγωνίζεται τη δράση της CCL21 στην απόπτωση και κυτταρικό θάνατο και έτσι επιβεβαιώνουν την αντιαποπτωτικό λειτουργία του CCL21 /CCR7. Ωστόσο, καμία διαφορά απόπτωσης ανιχνεύθηκε μεταξύ των τριών ομάδων αγωγής (ρ & gt? 0,05). Η πιθανή αιτία θα μπορούσε να είναι ότι CCL21 στα 50 ng /mL φτάσει κορεσμού κατάσταση έτσι υψηλότερες συγκεντρώσεις δεν θα μπορούσε επιπλέον να αυξήσει το αποτέλεσμα.

οικογένειας Bcl-2 έχει βρεθεί να σχετίζεται στενά με την απόπτωση των κυττάρων [39-41]. Bcl-2 και Bax είναι οι δύο πιο σημαντικές πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 με Bcl-2 αναστέλλουν την απόπτωση ενώ Βαχ προώθηση της απόπτωσης. Αυτές οι δύο πρωτεΐνες είναι παρούσες σε διμερή, όπως Bcl-2 /Bcl-2 και Bax /Bax. Προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Bcl-2 θα οδηγήσει στην επιπλέον Bcl-2 για να συνδυάσει με Βαχ σχηματίζουν Bcl2 /Bax αναστέλλουν έτσι την κυτταρική απόπτωση? ενώ με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των Bcl-2, η ποσότητα του συνδυασμένου μορφή Bcl2 /Bax θα μειωθεί και έτσι να προάγουν την κυτταρική απόπτωση. Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax σε κύτταρα Τ24 σε όλες τις πειραματικές ομάδες, συμπεριλαμβανομένης της έλεγχο. CCL21 θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2, αλλά μειώνουν Bax έκφραση πρωτεΐνης και τα αποτελέσματα εμφάνισαν μια συγκέντρωση CCL21 τρόπο που εξαρτάται από μεταξύ 50 ng /mL και 100 ng /ml. Είναι ενδιαφέρον, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στην Bcl-2 και Bax εκφράσεις μεταξύ CCL21 στα 100 ng /mL και 200 ​​ng /ml CCL21 (Bcl-2: ρ = 0,545? Bax: p = 0,191)? η αιτία μπορεί να είναι ότι CCL21 φτάσει σε μια ορισμένη συγκέντρωση όχι μεγαλύτερη από 100 ng /mL για μέγιστη αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα του (Εικ. 3). Προεπεξεργασία CCR7 αντίσωμα μπορούσε να αντιστρέψει σχεδόν εντελώς την επίδραση των CCL21 στις εκφράσεις του Bcl-2 και Bax και την απόπτωση (Σχ. 3 και Πίνακας 3). Αυτό επιβεβαιώνει περαιτέρω το ζωτικό ρόλο των CCR7 σχετικά με τις επιπτώσεις της CCL21 στα κύτταρα Τ24

Συμπέρασμα

CCL21 /CCR7 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση μοτίβο και να ενισχυθεί η μετανάστευση και την εισβολή του.? Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να σχετίζονται με την αυξημένη έκφραση του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. CCL21 /CCR7 είχε αντιαποπτωτικού δραστηριότητες στα κύτταρα Τ24? Αυτές οι λειτουργίες μπορεί να σχετίζεται με τη ρύθμιση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CCL21 /CCR7 μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και μετάσταση.