Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες και συνδέονται στενά με την ανάπτυξη του καρκίνου. Στην πραγματικότητα, παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs έχει ενοχοποιηθεί σε πολλές μορφές καρκίνου. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, τα επίπεδα miR-203 μειώθηκε, αν και η αιτία αυτού του παρεκκλίνουσα έκφραση παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων miR-203. Εντοπίζουμε την θέση έναρξης της μεταγραφής miR-203 από 5 ‘ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA και στη συνέχεια ορίζουν την περιοχή του υποκινητή miR-203. ανάλυση υποστηρικτής αποκάλυψε ότι IRF1, ένας μεταγραφικός παράγοντας, ρυθμίζει miR-203 μεταγραφή με σύνδεση προς τον προαγωγό miR-203. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι το miR-203 στόχους του 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του

BANF1

, ρύθμιση προς τα κάτω έτσι την έκφραση του, ενώ miR-203 έκφρασης οδηγείται από IRF1. MiR-203 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και η υπερέκφραση του miR-203 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας, σχηματισμό αποικιών, τη μετανάστευση και εισβολή. Η ανασταλτική δράση του miR-203 επί των καρκινικών κυττάρων είναι μερικώς προς τα κάτω ρύθμιση διαμεσολαβείται από το στόχο του,

BANF1

, αφού knockdown του

BANF1

επίσης καταστέλλει σχηματισμό αποικιών, τη μετανάστευση και εισβολή.

Παράθεση: Μάο L, Zhang Υ, Μο W, Yu Υ, Lu η (2015)

BANF1

ρυθμίζεται προς τα κάτω από IRF1-Ρυθμιζόμενη microRNA-203 στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας. PLoS ONE 10 (2): e0117035. doi: 10.1371 /journal.pone.0117035

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Junming Yue, Το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Αυγ 2014? Αποδεκτές: 17 Δεκεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Φεβ 2015

Copyright: © 2015 Μάο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και Υποστήριξη αρχείων πληροφοριών του.

Εισαγωγή

εκτιμάται ότι περίπου το 30% των ανθρώπινων γονιδίων ρυθμίζονται από miRNAs. Η απορρύθμιση των miRNAs μπορεί να αλλάξει τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων, με αποτέλεσμα ανώμαλη κυτταρικές διεργασίες. [1] Πρόσφατα, πολλαπλές μελέτες έχουν δείξει ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του microRNAs (miRNAs) εμπλέκεται σε πολυάριθμες νοσηρές καταστάσεις και ότι αυτή η έκφραση είναι στενά συνδεδεμένες με την ανάπτυξη των ανθρώπινων κακοηθειών [2]. Επιπλέον, ορισμένες miRNAs έχουν διερευνηθεί ως πιθανές βιοδείκτες για τη διάγνωση ή την πρόγνωση ασθενειών του ανθρώπου [3-6]. Ως εκ τούτου, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην miRNA απορρύθμιση είναι ένα θέμα επείγον και σημαντικό έρευνα.

Οι μηχανισμοί που οδηγούν σε ανώμαλη έκφραση των miRNAs δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Τα miRNAs συνήθως μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ στην πρωτοβάθμια miRNAs (PRI-miRNAs), τα οποία υποβάλλονται σε επεξεργασία από Drosha να προ-miRNAs και στη συνέχεια διασπώνται περαιτέρω από Dicer με λίγα λόγια, ώριμη miRNAs [7,8]. Θεωρητικά, παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs μπορεί να προκληθεί από διάφορους μηχανισμούς, που περιλαμβάνουν διαγραφές, επιμηκύνσεις και μεταλλάξεις που περιλαμβάνουν miRNA loci, επιγενετικές τροποποιήσεις και την απορύθμιση των παραγόντων μεταγραφής που στοχεύουν συγκεκριμένα miRNAs. Στο επίπεδο του γονιδιώματος, χρωμοσωμικές ανωμαλίες και επιγενετικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένων μεταλλάξεις, CpG νησί μεθυλίωση και κατασταλτικών τροποποιήσεις των ιστονών, είναι υπεύθυνοι για miRNA φίμωση στον καρκίνο. Στο μεταγραφικό επίπεδο, miRNAs αλληλεπιδρούν με μεταγραφικούς παράγοντες και αναστολείς της μεταγραφής για να δημιουργήσετε μια δυναμική ισορροπία που ρυθμίζει την έκφραση τους [1].

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι ένα από τα πιο συχνά διαγιγνώσκονται καρκίνοι και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στην θηλυκά σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας το 9% των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 8% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο μεταξύ των γυναικών [9]. Η ανώμαλη έκφραση miRNA έχει βρεθεί σε καρκίνο του τραχήλου [10-12], και ένας μεγάλος αριθμός των μη-φυσιολογικών λειτουργιών miRNA έχουν αναφερθεί παγκοσμίως [13]. Ωστόσο, οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανώμαλη έκφραση του miRNA, ενώ οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην miRNA απορρύθμιση λιγότερα αναφερθεί.

MiR-203 έχει αναφερθεί να απορυθμίζεται και να λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του οισοφάγου, καρκίνο του τραχήλου και [14-18]? Ωστόσο, ο μηχανισμός που οδηγεί στην ανώμαλη έκφραση του miR-203 δεν είναι απολύτως σαφής. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προσδιορίσει την θέση έναρξης της μεταγραφής miR-203 (TSS) με 5 ‘ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (5’ RACE) και εν συνεχεία τον προσδιορισμό της αλληλουχίας προαγωγού miR-203. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-203 στόχους του 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) του

BANF1

, ρύθμιση προς τα κάτω έτσι

BANF1

έκφρασης, και ότι miR-203 έκφρασης οδηγείται από την IRF1 μεταγραφικού παράγοντα . Η μελέτη μας δημιουργεί μια γραμμική σηματοδοτικό μονοπάτι από το

IRF1

να

BANF1

που μπορεί να συμβάλει στην

BANF1

επαγόμενη ογκογένεση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Το έργο αυτό συμβάλλει στην ολοκληρωμένη κατανόηση του μηχανισμού της εξέλιξης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας HPV-μεσολάβηση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Ανθρώπινο τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και παρακείμενο φυσιολογικό του τραχήλου της μήτρας ιστούς συλλέχθηκαν από τη Σαγκάη Changhai Νοσοκομείο (Σαγκάη, Κίνα). Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτής συγκατάθεσης, και η μελέτη εγκρίθηκε από τις δεοντολογικές επιτροπές της Σαγκάης Changhai Νοσοκομείο και το Πανεπιστήμιο Fudan (αριθμός αναφοράς 2011 – 120).

καλλιέργειας κυττάρων, τα μόρια RNA και επιμόλυνση

τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές (CaSki και HeLa) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε ϋυΐββοοο Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA) που περιείχε 10% (ν /ν) ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco) στο 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Συνθετικά μόρια miRNA, συμπεριλαμβανομένου του miR-203 μιμούνται, αναστολέα και αρνητικός έλεγχος, αγοράστηκαν από την Ambion, ΗΠΑ. Τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA κατά

BANF1

και αρνητικού ελέγχου συντέθηκαν από Genepharma (Σαγκάη, Κίνα) [19]. Οι αλληλουχίες ήταν ως εξής: siRNA-BANF1, 5′-CCAGGUGCAUUUAAAGAAATT-3 ‘και αλληλουχία ελέγχου, 5′-UUUCUUUAAAUGCACCUGGTT-3’. Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς και κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Ambion, USA) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Takara, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα S1. Για την ανίχνευση miR-203, το RNA μεταγράφηκε ανάστροφα με ένα συγκεκριμένο εκκινητή ανάστροφης μεταγραφής (RT-miR-203). Για την ανίχνευση του mRNA, RNA μεταγράφηκε ανάστροφα με τυχαία 6 καταναλωτές και Ολίγο dT Primer. SYBR Προμίγματα Ex Taq (Takara, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης ώριμη miR-203 και του mRNA χρησιμοποιώντας το σύστημα Real Time PCR LightCycler 480 II (Roche, Γερμανία). RNU6B και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την έκφραση miR-203 και mRNA, αντιστοίχως. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου προσδιορίστηκαν με τη χρήση της μεθόδου δέλτα Ct [20] και εκφράζεται ως ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± την τυπική απόκλιση.

5 ‘ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (5’ RACE)

το TSS του miR-203 πρωτεύοντος προϊόντος μετεγγραφής (από κύτταρα HeLa) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 5′-Full kit RACE (Takara, Κίνα). Δύο μικρογραμμάρια RNA χρησιμοποιήθηκε σε κάθε αντίδραση, και HL60 ολικού RNA, το οποίο παρέχεται στο κιτ, χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το 5 ‘άκρο του ανθρώπινου

Prohibitin

(ΡΗΒ) γονίδιο (προϊόν PCR 750 bp) , η οποία χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Τα επίπεδα του miR-203 πρωτεύοντος προϊόντος μετεγγραφής προσδιορίστηκαν με ένθετη PCR χρησιμοποιώντας εξωτερικά και εσωτερικά αρχικά τεμάχια (S1 πίνακα). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες παραμέτρους όπως προτείνεται στο εγχειρίδιο. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%, ανιχνεύονται, καθαρίζεται και στη συνέχεια η αλληλουχία τους.

Dual-λουσιφεράσης δοκιμασίες ρεπόρτερ και παράγοντα μεταγραφής ανάλυση

Το 3’UTR του

BANF1

ενισχύθηκε από ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA των κυττάρων HeLa και κλωνοποιήθηκε στον φορέα psiCHECK-2 αναφοράς (Promega, USA), και η μετάλλαξη και η διαγραφή του

BANF1

3’UTR επιτεύχθηκε με SOE PCR (γονίδιο μάτισμα με επέκταση επικάλυψης PCR). κύτταρα HeLa συν-επιμολύνθηκαν με τους φορείς αναφοράς και είτε miR-203 μιμητικό (30 ηΜ) ή miRNA μιμούνται αρνητικό έλεγχο (NC, 30 ηΜ). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega, USA), και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως κανονικοποιημένη αναλογία Renilla να λουσιφεράση πυγολαμπίδας.

Για την δοκιμασία ρεπόρτερ miR-203 προαγωγό, το 744 -BP γονιδιωματική αλληλουχία ανοδικά του miR-203 ενισχύθηκε με PCR και κλωνοποιήθηκε στον (Promega, USA) φορέα ανταποκριτή pGL3-Basic. Τα κύτταρα HeLa συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα αναφοράς προαγωγέα και είτε pCDNA-IRF1 ή το πλασμίδιο ελέγχου, pcDNA3.1. Ένα πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla, pRL-ΤΚ, χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης. Τα κύτταρα λύθηκαν σε 24 ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega, USA). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η κανονικοποιημένη αναλογία πυγολαμπίδας να λουσιφεράση της Renilla και παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA συν αναστολείς πρωτεάσης ( Millipore, USA). Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, USA), αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα, επωάστηκαν με αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, συμπεριλαμβανομένων των αντι-β-τουμπουλίνης (Abmart, M20005, 1: 2000, Κίνα), αντι-BANF1 (Santa Cruz, sc-33787, 1: 200, USA), HRP αντι-κουνελιού (KPL, 4751 έως 1516, 1: 2000, USA) και HRP αντι-ποντικού (KPL, 0751- 1809, 1: 2000, ΗΠΑ), και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΚΕΣΔ αντιδραστηρίων ανίχνευσης (CWBIO, Κίνα). Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του συστήματος Gene Gnome Bio Imaging (Syngene, UK).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασίες

δοκιμασίες ChIP πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το EZ-Magna ChIP One-Day χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης Kit (Millipore, USA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών. Εν συντομία, περίπου 1×10

7 κύτταρα HeLa ήταν διασυνδεδεμένη και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης II. Χρωματίνης διατμήθηκε με υπερήχους (υψηλή ισχύς, 10 κύκλοι των 30 s ‘στο’ και 30 s ‘off’? Bioruptor UCD-300, ΗΠΑ) σε ένα μέσο μέγεθος από 200 έως 1000 bp, και τα ψαλιδισμένα δείγματα χρωματίνη χωρίστηκαν σε 50 -μl κλάσματα. Κάθε κλάσμα της χρωματίνης (1×10

6 ισοδύναμα κυττάρων χρωματίνης) αραιώθηκε σε 450 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης. Πέντε μικρολίτρα (1%) του υπερκειμένου απομακρύνθηκε ως «Input», και το αντίσωμα ανοσοκαταβύθιση, IRF1 (Abcam, ab26109, 5 μg, UK), και 20 μΙ πρωτεΐνης Α μαγνητικών σφαιριδίων προστέθηκαν στο υπόλοιπο υπερκείμενο. Τέλος, τα ανοσοσύμπλοκα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και εκλούσθηκαν, και οι διασυνδέσεις στη συνέχεια αντιστράφηκε. DNA ανακτήθηκε και αναλύθηκε με qRT-PCR. Ως αρνητικός έλεγχος, η κανονική IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε για ανοσοκαθίζηση.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών δοκιμασίες

Για τους προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού, CaSki και HeLa κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν είτε με 30 ηΜ miR-203 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα και διατηρήθηκαν σε πλήρη μέσα αύξησης για 7 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία. Για αυτή τη δοκιμασία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν με την ίδια αρχική πυκνότητα, και η απορρόφηση στα 490 nm διαβάστηκε σε διαδοχική ημέρα χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός (BioTek, USA). Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, 200 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται στους 37 ° C είτε για 10 ημέρες (κύτταρα HeLa) ή 15 ημέρες (κύτταρα CaSki). Τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν αν η αποικία περιείχε περισσότερα από 50 κύτταρα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vitro

μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

Εισβολή και δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων transwell θαλάμους (8 μm πόρου μεμβράνης μεγέθους πολυανθρακικό, Corning, USA) με ή χωρίς 150 μg Matrigel (BD, ΗΠΑ). Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης, 5 × 10

4 κύτταρα σε μέσο άνευ ορού απλώθηκαν στον άνω θάλαμο. Για τους προσδιορισμούς εισβολής, 1 × 10

5 κύτταρα σε μέσο άνευ ορού απλώθηκαν στον άνω θάλαμο. Medium με 10% FBS προστέθηκε στα φρεάτια πυθμένα των θαλάμων. Μετά από 20 ώρες (κύτταρα HeLa) ή 26 ώρες (κύτταρα CaSki) της επώασης, τα κύτταρα προσκολλώνται στην κατώτερη μεμβράνη σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Οι μετεγκατάσταση ή εισέβαλε κύτταρα μετρήθηκαν και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα IX51 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Ιαπωνία).

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με 30 nM miRNA μιμούνται σε πλάκες 6-καλά, η μέσα αλλάχθηκαν την επόμενη ημέρα, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για άλλες 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης /ΡΙ ΝΡ40 (0.01 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου, 0,1% κιτρικό Na, 0,0564% NaCl, 0,025 mg /ml ριβονουκλεάσης Α, 0,3% ΝΡ-40) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για περιεχόμενο DNA χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD, ΗΠΑ). μοντελοποίηση του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ.

t-test Στατιστική ανάλυση

Student χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων δεδομένων σε όλα τα κατάλληλα πειράματα. Ένα

P

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Αναγνώριση του υποκινητή miR-203

Για να προσδιορίσετε αν το miR-203 έκφρασης είναι. ανώμαλα σε καρκίνο του τραχήλου, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε 20 ζευγαρωμένα δείγματα ασθενών και του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές (HPV 16+ CaSki και HPV 18+ HeLa). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, miR-203 έκφραση ουσιαστικά μειωτικά στην τραχηλική καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις παρακείμενες φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς. Ωστόσο, ο μηχανισμός της παρούσας αρνητική ρύθμιση παραμένει ασαφής. Για να εξερευνήσετε την ρύθμιση της έκφρασης miR-203 στο μεταγραφικό επίπεδο, καθορίζεται για πρώτη φορά το TSS του miR-203, χρησιμοποιώντας ανάλυση 5 ‘RACE. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, υπήρχαν δύο προϊόντα 5 ‘RACE PCR για pri-miR-203, το οποίο πρότεινε ότι το miR-203 θα μπορούσε να έχει τουλάχιστον δύο TSSs. Το TSS κοντά προ-miR-203 ήταν σύμφωνο με αυτό που φαίνεται στο προηγούμενο δημοσίευμα [21] και σημάνθηκε 1.

-203 MiR επίπεδα έκφρασης (Α) σε φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς του ανθρώπου, του τραχήλου της μήτρας και καρκινικούς ιστούς τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (CaSki και HeLa) μετρήθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας RNU6B ως εσωτερικός έλεγχος. αποτελέσματα (B) 5 ‘RACE PCR δείχνουν τις θέσεις εκκίνησης μεταγραφής του ανθρώπου (κύτταρα HeLa) pri-miR-203. (C) Σχηματική των προβλεπόμενων θέσεων πρόσδεσης του IRF1 στο γονίδιο υποκινητή miR-203. Ο αριθμός υποδεικνύει την σχετική απόσταση από το 5 ‘άκρο του πρωτογενούς μεταγραφήματος miR-203 (υποδεικνύεται ως 1). (D) Αποτελέσματα Ευθυγράμμιση δείχνουν την διατήρηση των αλληλουχιών προαγωγού miR-203 μεταξύ των διαφόρων ζώων. ανάλυση δραστηριότητα υποκινητή (Ε) MiR-203 με προσδιορισμούς διπλής λουσιφεράσης. Η προβλεπόμενη προαγωγός miR-203 κλωνοποιήθηκε στο pGL3-βασικό φορέα ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας. δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla και απεικονίζονται σε σχέση με τον μάρτυρα (*

P & lt?

0,05). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια εκτελείται in silico ανάλυση της περιοχής του υποκινητή miR-203 (συμπεριλαμβανομένων των 2 kb ανοδικά του προ-miR-203), χρησιμοποιώντας τα online εργαλεία FirstEF, PromoterScan , softberry-fprom, και υποστηρικτής 2.0 Πρόβλεψη. Αυτά τα εργαλεία προέβλεψε ότι ένα 1-kb, πλούσια σε GC αλληλουχία (περίπου 70%) πλησίον του miR-203 TSS ήταν ο υποκινητής (Εικ. 1 C). Συνήθως, οι αλληλουχίες υποκινητή σε διαφορετικά είδη συντηρημένες. Ως εκ τούτου, μπορούμε να ευθυγραμμίζονται με την προβλεπόμενη ακολουθία ανθρώπινης προαγωγού στην ανοδική περιοχή του προ-miR-203 ποντικού, αρουραίου, σκύλου και αγελάδα και βρήκε ένα εντόνως διατηρημένη περιοχή (Σχ. 1D). Υποθέσαμε ότι αυτό διατηρημένη αλληλουχία ήταν πιθανότατα η αλληλουχία υποκινητή του miR-203. Στη συνέχεια, αναλύσαμε την δραστικότητα αυτού του προαγωγέα χρησιμοποιώντας λουσιφεράση δοκιμασίες ανταποκριτή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου, η προβλεπόμενη αλληλουχία υποκινητή αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης (περίπου 17 φορές), υποδεικνύοντας ότι αυτή η διατηρούμενη αλληλουχία έχει ισχυρή δραστικότητα προαγωγού.

IRF1 εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση του ΜΙΚ 203

με τη σάρωση του εντοπίστηκαν miR-203 υποκινητή με TRANSFAC (https://www.biobase-international.com/product/transcription-factor-binding-sites), αρκετές πιθανοί παράγοντες μεταγραφής (ΑΡ-1, HSF1, MZF1, IRF1 και SP1) είχαν προβλεφθεί. Για να επικυρώσετε αυτήν την πρόβλεψη, εξετάσαμε τις επιδράσεις των διαφόρων δυνητικών παραγόντων μεταγραφής στο miR-203 δραστηριότητας λουσιφεράσης από υποκινητή. Μεταξύ αυτών των παραγόντων μεταγραφής προβλεφθεί, η υπερέκφραση του IRF1 σε κύτταρα HeLa ενεργοποιημένα σημαντικά miR-203 δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή καθοδηγείται (Εικ. 2Α). Επιπλέον, η επίδραση της υπερέκφρασης IRF1 στην έκφραση miR-203 αναλύθηκε με miRNA qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, IRF1 υπερέκφραση αυξημένη ενδογενή ώριμη miR-203 έκφρασης 8 φορές σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-203 μεταγραφή ρυθμίζεται από IRF1.

(Α) δοκιμασίες διπλής λουσιφεράσης δείχνουν την επίδραση διαφόρων παραγόντων μεταγραφής (IRF1, MZF1, ΑΡ-1, HSF1, και SP1) σε ΜΙΚ 203 δραστηριότητα του υποκινητή. Τα κατασκευάσματα συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα HeLa με φορείς που εκφράζουν παράγοντες μεταγραφής και ο φορέας ρΡΙ_-ΤΚ ως έλεγχος επιμόλυνσης. Η άγριου τύπου πλασμίδιο pCDNA3.1 χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Οι σχετικές δραστηριότητες της λουσιφεράσης φαίνεται ως η αναλογία της δραστικότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας /Renilla. δοκιμασίες (Β) QRT-PCR δείχνουν τις επιδράσεις του IRF1 υπερέκφρασης στην έκφραση miR-203. δοκιμασίες ανοσοκαταβύθισης (C) χρωματίνης δείχνουν το

in vivo

αλληλεπίδραση μεταξύ IRF1 και του υποκινητή του miR-203. θραύσματα HeLa κυττάρων χρωματίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με ένα αντίσωμα για IRF1 ή αρνητικό συγκριτικό αντίσωμα (κανονική IgG). Τα δείγματα DNA από ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για τον υποκινητή miR-203. (D) δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας τα μεταλλαγμένα μορφώματα υποκινητή. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P & lt?

0.05

Η

Η αλληλεπίδραση μεταξύ IRF1 και του υποκινητή του miR-203 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με προσδιορισμούς ChIP qRT-PCR.. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η

in vivo

πρόσδεση του IRF1 με τον προαγωγέα miR-203 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του μάρτυρα. Για τον προσδιορισμό των θέσεων πρόσδεσης IRF1 στην αλληλουχία του υποκινητή miR-203, θα μεταλλαχθεί τις προβλεπόμενες IRF1 θέσεις πρόσδεσης (Εικ. 1Γ). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, η μετάλλαξη της IRF1 θέση πρόσδεσης 2 (pGL3-mut 2) καταργούνται τα αποτελέσματα της IRF1 στον δημοσιογράφο, ενώ μετάλλαξή θέση δέσμευσης 1 δεν είχε καμία επίδραση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, IRF1 ρυθμίζει την έκφραση του miR-203 με σύνδεση στο site 2 (CACTT).

MiR-203 καταστέλλει

BANF1

έκφρασης με στόχο την 3’UTR του

BANF1

η

για να διερευνήσουν τη λειτουργία του miR-203, ψάξαμε για πιθανές miR-203 γονιδίων στόχων χρησιμοποιώντας miRNA βάσεις δεδομένων (TargetScan, Miranda, και miRecords). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η περιοχή σπόρων miR-203 είναι απόλυτα συμπληρωματική με την αλληλουχία στόχο στο 3’UTR του

BANF1

. Να επικυρώσει αυτό το in silico πρόβλεψη, μπορούμε κλωνοποιηθεί το τμήμα του

BANF1

3’UTR που περιέχει την περιοχή-στόχο miR-203 στο λουσιφεράσης πλασμίδιο αναφοράς psiCHECK-2. Στη συνέχεια εκτελείται μία δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή μετά την συν-επιμόλυνση του ρεπόρτερ κατασκευασμάτων με το miR-203 μιμούνται σε κύτταρα HeLa. Με την παρουσία του miR-203 μιμούνται, η λουσιφεράση δραστηριότητα του κατασκευάσματος αναφοράς που περιέχει το

BANF1

3’UTR μειώθηκε σημαντικά, ενώ εκείνη του μη τροποποιημένου κατασκευάσματος δεν άλλαξε (Σχ. 3Β). Επιπλέον, η μετάλλαξη (Mut) και διαγραφή (Del) της αλληλουχίας σπόρων miR-203 και τα δύο ακύρωσε την miR-203 με τη μεσολάβηση μείωση στην ενεργότητα λουσιφεράσης (Σχ. 3Β).

BANF1

mRNA επίπεδα μετρήθηκαν με qRT-PCR, η οποία έδειξε μειωμένα επίπεδα

BANF1

mRNA σε παρουσία του miR-203 μιμούνται (Σχ. 3C). Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν ότι

BANF1

είναι ο στόχος του miR-203, εξετάσαμε την ενδογενή

BANF1

επίπεδο πρωτεΐνης μέσω κηλίδωση Western μετά παροδικής επιμόλυνσης το miR-203 μιμούνται και αναστολέα σε κύτταρα HeLa και CaSki . Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, η

BANF1

επίπεδο έκφρασης μειώθηκε καθώς η συγκέντρωση του επιμολυσμένα miR-203 μιμητικό αυξήθηκε, ενώ η

BANF1

επίπεδο έκφρασης αυξήθηκε όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα miR-203. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-203 μπορεί να στοχεύσει άμεσα το

BANF1

3’ΙΙΤΡ και ρυθμίζουν προς τα κάτω

BANF1

έκφρασης.

(Α) Ζευγάρι miR-203 σειρές και θέσεις αναγνώρισης εντός η 3’UTR του

BANF1

. Η ακολουθία των σπόρων του miR-203 είναι υπογραμμισμένο. Η άγριου τύπου (WT), μεταλλαγμένα (Μουτ) και διαγράφεται (Del)

sites BANF1

3’ΙΙΤΡ αναγνώριση εμφανίζονται επίσης. (Β) Η σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης κατασκευασμάτων που περιέχει το

BANF1

WT, της Μουτ ή Del 3’UTRs. Λουσιφεράσης κατασκευάσματα συν-επιμολύνθηκαν με miRNA μιμούνται αρνητικό έλεγχο (NC, 30 ηΜ) ή miR-203 μιμητικό (30 ηΜ) σε κύτταρα HeLa. δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκε 36 ώρες μετά την επώαση και ομαλοποιήθηκε ως προς δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. Ένας αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω προ-miR-203 σε σύγκριση με την έκφραση του WT

BANF1

3’UTR κατασκεύασμα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) QRT-PCR ανάλυση των

BANF1

mRNA από κύτταρα CaSki και HeLa επιμολυσμένα με miRNA μιμούνται NC (30 nM) ή miR-203 μιμούνται (30 nM). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο του GAPDH mRNA, και η αναλογία του

BANF1

/GAPDH στον αρνητικό έλεγχο ορίστηκε στο 1. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) ανάλυση κηλίδας Western των ενδογενών

BANF1

έκφραση σε κύτταρα CaSki και HeLa 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-203 μιμούνται ή αναστολέα. Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε)

BANF1

επίπεδα έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς φυσιολογικό τραχηλικό, του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (CaSki και HeLa) μετρήθηκαν με qRT-PCR, χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος. ανάλυση (F) Western blot των επιπέδων BANF1 σε 20 ζευγαρωμένα ιστούς όγκου (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς (Ν). Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Τα πέντε ζευγαρωμένα δείγματα που έδειξαν καμία διαφορά στην έκφραση BANF1 υποδεικνύεται από κουτιά. *

P & lt?

0.05, **

P & lt?.

0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν μειωθεί η έκφραση του miR-203 συσχετίζεται με το

BANF1

επίπεδα έκφρασης σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αξιολογήσαμε το

BANF1

επίπεδα σε 20 ζευγαρωμένα δείγματα τραχηλικού καρκίνου του ιστού και γειτονικό φυσιολογικό τραχηλικό δείγματα τους, καθώς και σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές (HPV 16+ CaSki και HPV 18+ HeLa) μέσω qRT-PCR.

BANF1

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην τραχηλική καρκινικά κύτταρα και ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 3Ε). Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι οι εκφράσεις του BANF1 ανυψώθηκε σε 15 από τα 20 ζεύγη (75%) ιστούς όγκων (Τ) σε σχέση με την κανονική (Ν) του τραχήλου της μήτρας ιστούς (Σχ. 3F). Τα άλλα 5 ζεύγη δειγμάτων παρουσίασαν οι διαφορές στην έκφραση BANF1 υποδεικνύεται από κουτιά. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μη φυσιολογική μείωση των επιπέδων miR-203 σε καρκίνο του τραχήλου σχετίζεται με την υψηλή έκφραση του

BANF1

.

IRF1 ρυθμίζει miR-203 και έμμεσα επηρεάζει την έκφραση του

BANF1

η

Για να επικυρώσετε αν ο κανονισμός IRF1 του miR-203 μπορεί να μεσολαβήσει αλλαγές στο

BANF1

έκφρασης, αξιολογήσαμε

BANF1

έκφραση με qRT-PCR και western αποτύπωση υπό IRF1 υπερέκφραση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και Β, IRF1 mRNA και πρωτεΐνη επίπεδα αυξήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα CaSki και HeLa αφού τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-IRF1. Είναι ενδιαφέρον ότι,

BANF1

επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης μειώθηκαν σε κύτταρα CaSki και HeLa παροδικά διαμολυσμένα με pcDNA-IRF1 (Σχ. 4C και 4D), που υποδηλώνει έντονα ότι η IRF1 διεγείρει miR-203 έκφραση, το οποίο στη συνέχεια ρυθμίζει προς τα κάτω

BANF1

έκφραση.

(Α, Β) QRT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western των IRF1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα CaSki και HeLa επιμολυσμένα με ροϋΝΑ-IRF1. IRF1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά αυξημένη όταν επιμολυσμένα με ροϋΝΑ-IRF1. (C) QRT-PCR ανάλυση του

BANF1

έκφραση mRNA σε κύτταρα HeLa παροδικά διαμολυσμένα με φορέα ελέγχου ή ροϋΝΑ-IRF1. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε έκφραση GAPDH. (D) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης BANF1 σε κύτταρα CaSki και HeLa παροδικά διαμολυσμένα με ροϋΝΑ-IRF1. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P & lt?.

0.05

Η

MiR-203 καταστέλλει του τραχήλου της μήτρας τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και το σχηματισμό αποικιών

Έχουμε εξερευνήσει τις κυτταρικές λειτουργίες του miR-203 σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και βρέθηκε ότι miR-203 υπερέκφραση κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των CaSki και HeLa κύτταρα (Εικ. 5Α και Β). Ομοίως, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών μειώθηκε σε κύτταρα CaSki και HeLa όταν miR-203 ήταν πάνω εκφράζεται (Σχ. 5C και D).

(Α, Β) δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων των κυττάρων CaSki και HeLa επιμολυσμένα με ΜΙΚ 203 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα. δοκιμασίες σχηματισμός (C, D) Colony κυττάρων CaSki και HeLa επιμολυσμένα με miR-203 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P & lt?.

0.05

Η

MiR-203 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και καταστέλλει του τραχήλου της μήτρας μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

in vitro

Η

τα κύτταρα επιμολυσμένα με το miR-203 μιμητικό υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρικού κύκλου μέσω κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα υπερεκφράζουν miR-203 είχαν υψηλότερο ποσοστό κυττάρων G1 φάσης και ένα μικρότερο ποσοστό των κυττάρων S φάσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-203 προκαλεί G1 διακοπή. Επιπλέον, transwell δοκιμασίες με ή χωρίς Matrigel έδειξε ότι miR-203 υπερέκφραση σε κύτταρα CaSki και HeLa κατέστειλε την ικανότητα μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα κυττάρων (NC) (Σχ. 6Β, C, D και Ε).

(Α) η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που δείχνει την επίδραση του miR-203 υπερέκφραση επί του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων CaSki και HeLa. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 ηΜ miR-203 μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο (NC) και συλλέγεται, χρωματίστηκαν και αναλύθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. δοκιμασίες μετανάστευσης (B, C) Transwell κυττάρων CaSki και HeLa επιμολυσμένα με miR-203 μιμούνται ή NC. Τα μεταναστεύσει κύτταρα ποσοτικοποιούνται και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες που παρουσιάζονται στο κάτω μέρος. δοκιμασίες εισβολή (D, E) Transwell κυττάρων CaSki και HeLa επιμολυσμένα με miR-203 μιμούνται ή NC. Τα εισέβαλε κύτταρα ποσοτικά και αντιπροσωπευτικές εικόνες. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P & lt?.

0.05

Η

BANF1

νοκ ντάουν καταστέλλει το σχηματισμό αποικιών των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή

Για την περαιτέρω επικύρωση εάν

BANF1

εμπλέκεται σε miR-203 μεσολάβηση αποικία σχηματισμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, siRNA που στοχεύει

BANF1

σχεδιάστηκε και επιμολύνονται σε κύτταρα CaSki και HeLa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι siRNA που στοχεύει

BANF1

μειωθεί σημαντικά

BANF1

mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα CaSki και HeLa (Σχ. 7Α και Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, knockdown του ενδογενούς

BANF1 από

siRNA οδήγησε σε σημαντική μείωση του σχηματισμού αποικιών (Σχ. 7C και D). Ομοίως, οι μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των CaSki κύτταρα HeLa και επίσης μειώθηκε σημαντικά από το

BANF1

siRNA, αλλά όχι με τον αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA (Σχ. 7Ε, F, G και H).

(Α, Β) QRT-PCR και ανάλυση Western blot

BANF1

επίπεδα στο

BANF1

-knockdown CaSki και HeLa κύτταρα.

BANF1

επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μειωμένες όταν επιμολύνονται με siRNA-BANF1. (C, D) δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι ο μέσος αριθμός σχηματισμού αποικιών μειώθηκε σε

BANF1

-knockdown CaSki και HeLa κύτταρα. (E, F) δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης αποκαλύπτοντας ότι οι μετανάστευσαν κύτταρα μειώθηκαν κατά χτυπήσει κάτω

BANF1

. (G, H) προσδιορισμούς κυττάρων εισβολή αποκαλύπτοντας ότι οι εισέβαλε κύτταρα μειώθηκαν κατά χτυπήσει κάτω

BANF1

. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P & lt?

0.05

Η

Συζήτηση

Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τα miRNAs εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες και συνδέονται με την ανάπτυξη των ασθενειών. μέσω της ικανότητάς τους να ρυθμίζουν γονίδια-στόχους [22,23]. Ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs είναι σημαντική για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης? Εντούτοις, οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων miRNA δεν είναι καλά κατανοητοί [24,25]. Ρύθμιση της έκφρασης στο μεταγραφικό επίπεδο είναι ένα κρίσιμο βήμα στη βιοσύνθεση των miRNAs [26].

Τα γονίδια miRNA μεταγράφονται ως μονάδα ή διασποράς και μπορούν να διαμένουν είτε σε διαγονιδιακές περιοχές ή εντός των εσώνια ή εξώνια της κωδικοποίησης γονιδίων [ ,,,0],27]. Όταν miRNAs κατοικούν στο διαγονιδιακών περιοχών, μπορούν να μεταγραφούν ανεξάρτητα αν έχουν τη δική τους προαγωγούς [27], ή μπορούν να μεταγραφούν μαζί με το γονίδιο ξενιστή εάν δεν διαθέτουν δική τους προαγωγούς. Προσδιορισμός των TSSs και υποστηρικτές είναι κρίσιμη για την κατανόηση των μηχανισμών και των παραγόντων μεταγραφής που διαμεσολαβούν την έκφραση των miRNAs [28]. Το γονίδιο miR-203 είναι εντοπισμένη σε μία διαγονιδιακή περιοχή και μεταγράφεται ανεξάρτητα. Η μελέτη μας προσδιορίζονται miR-203 TSSs από 5 ‘RACE και στη συνέχεια προσδιόρισε την αλληλουχία του υποκινητή miR-203.

Έχοντας πολλαπλές TSSs είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την αύξηση της γονιδιακής πολυπλοκότητα και τη συμβολή στη λειτουργική ποικιλομορφία, ένα φαινόμενο που έχει καλά μελετήθηκαν για τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Στο συγκρότημα του είδους, είναι σύνηθες για τα γονίδια να έχει πολλές διαφορετικές TSSs που μπορεί να είναι ενεργός κάτω από διαφορετικές συνθήκες [29]. Έχει αναφερθεί ότι το σύμπλεγμα ανθρώπινο γονίδιο miRNA miR-23a-miR-27a-miR-24-2 και

Drosophila melanogaster

miRNAs miR-276Α και miR-277 έχουν εναλλακτικές TSSs [30]. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε δύο TSSs για miR-203. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι μεταβλητές μεταγραφές για κάθε miRNA μπορεί να παράγει το ίδιο ώριμο miRNA [31]. Ως εκ τούτου, σχηματίζοντας πολλαπλές μεταγραφές έχει μικρή επίδραση στην λειτουργία ενός miRNA. Ωστόσο, εικάζουν ότι διακριτή TSSs των miRNAs μπορεί να έχουν διαφορετική απόδοση των μεταγραφή και θα μπορούσε να ρυθμίσει το επίπεδο έκφρασης των miRNAs. Περαιτέρω κατανόηση του εναλλακτικού ματίσματος μπορεί να παρέχει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του γονιδίου miRNA.

Η μελέτη μας καθιερώνει ένα γραμμικό μονοπάτι σηματοδότησης (

IRF1

να miR-203 στο

BANF1

) (Εικ . 8).

IRF1

κωδικοποιεί τον ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης 1, ένα μέλος του ρυθμιστικού παράγοντα μεταγραφής (IRF) οικογένεια ιντερφερόνη. IRF1 μειώνεται σε καρκινικούς ιστούς και τις λειτουργίες στην ανοσολογική απόκριση, ρύθμιση της απόπτωσης, την επισκευή βλάβης του DNA και την καταστολή του όγκου [32-34]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επικυρωθεί ότι το miR-203 ρυθμίζει μια σειρά γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των

VEGFA

[18],

ALB1

[35],

PKC

α [16], και

ATM

[36] (Εικ. 8). Αυτά τα γονίδια που εμπλέκονται στον τομέα βιολογικές διαδικασίες παρόμοιες με IRF1.