Αφηρημένο

Vezatin (VEZT), μια διασταυρώσεις adherens διαμεμβρανική πρωτεΐνη, αναγνωρίστηκε ως ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό σε προηγούμενη μελέτη μας. Ωστόσο, ο ρόλος της VEZT στην ογκογένεση παραμένει άπιαστο. Έχουμε ως στόχο να αποσαφηνίσει επιγενετική ρύθμιση της και βιολογικές λειτουργίες σε καρκίνο του στομάχου. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι το επίπεδο έκφρασης της VEZT εμπλέκεται στο λεμφικό μετάσταση, το βάθος της εισβολής του καρκίνου και το στάδιο TNM σε 104 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο. Όξινου θειικού αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αλληλούχισης μεθόδους (BSP) έδειξε ότι VEZT ήταν υπερμεθυλίωση σε ιστούς και αντίστοιχες αίμα ασθενών με γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες.

Helicobacter pylori

(

Η. Pylori

) λοίμωξη προκαλεί την μεθυλίωση και αποσιώπηση των VEZT στα κύτταρα GES-1. Αποκατάσταση έκφραση VEZT σε ΜΚΝ-45 και ΝΟΙ-Ν87 γαστρικών καρκινικών κυττάρων ανέστειλε την ανάπτυξη, την εισβολή και την ογκογένεση

in vitro και in vivo

. Παγκόσμια ανάλυση μικροσυστοιχιών εφαρμόστηκε για την ανάλυση της μοριακής βάσης των βιολογικών λειτουργιών του VEZT μετά VEZT διαμόλυνση σε συνδυασμό με πραγματικού χρόνου PCR και προσδιορισμού της χρωματίνης ανοσοκαθίζησης. Συζευγμένος με G πρωτεΐνη υποδοχέας 56 (GPR56), την κυτταρική ανάπτυξη, τον κύκλο κυτταρικής διαίρεσης 42 (CDC42), η μετανάστευση /την εισβολή και τη μεταγραφή του παράγοντα 19 (TCF19), την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ταυτοποιήθηκαν ως γονίδια-στόχους απευθείας VEZT. TCF19, ένα μυθιστόρημα στόχο της VEZT, ήταν λειτουργικά επικυρωθεί. Η υπερέκφραση του TCF19 σε ΜΚΝ-45 κυττάρων αυξήθηκε πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και την ικανότητα ανάπτυξης. Αυτή η μελέτη παρέχει νέα εικόνα για τη ρύθμιση του γονιδίου VEZT, το οποίο θα μπορούσε να αποτελέσει ένα δυνητικό στόχο για θεραπευτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου

Παράθεση:. Miao R, Guo Χ, Zhi Q, Shi Υ, Λι L, Μάο Χ, et al. (2013) VEZT, ένα μυθιστόρημα Υποθετικές Ογκοκατασταλτικής, καταστέλλει την ανάπτυξη και Ογκογονικότητα του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10.1371 /journal.pone.0074409

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 1 Απρ, 2013? Δεκτές: 1 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Νεανικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (81101858), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong της Κίνας (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key Ερευνητικό Έργο από Shandong Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής (2011GGB14158, 2007H2071), το Νεανικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Shandong της Κίνας (BS2010YY060). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η δεύτερη κύρια αιτία της ανδρικής θανάτου από καρκίνο σχετίζονται και η τρίτη κύρια αιτία για τις γυναίκες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Πρόκειται για ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο [2]. Στην Κίνα, υπάρχουν 400.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου και 300.000 θανάτους ετησίως. Πολλές περιπτώσεις που έπασχαν από καρκίνο του στομάχου έχουν χάσει θεραπευτική ευκαιρία με εξαιρετικά κακή έκβαση [3]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών θεραπευτικών μεθόδων είναι απαραίτητη για τη μείωση της γαστρικής θνησιμότητα από καρκίνο. Είναι γνωστό ότι η παθογένεση των γαστρικών καρκινωμάτων είναι πολυπαραγοντική, το οποίο περιλαμβάνει τη γενετική προδιάθεση και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Υπάρχει ένας αριθμός γενετικών εναλλαγές συμπεριλαμβανομένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ογκογονίδια, μόρια προσκόλλησης κυττάρου και παράγοντες ανάπτυξης [4].

Αν και οι μοριακοί μηχανισμοί της γαστρικής καρκινογένεσης παραμένουν ασαφή, επιγενετική αποσιώπηση γονιδίων όγκων που σχετίζονται με υπερμεθυλίωση προαγωγού έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως ένα σημαντικό μηχανισμό της ογκογένεσης. Το προφίλ υπερμεθυλίωση προαγωγού διαφέρει σε κάθε τύπο του καρκίνου και σε κάθε γονίδιο, παρέχοντας τύπου του όγκου και του γονιδίου-ειδικό προφίλ υπερμεθυλίωση που μπορεί να περιλαμβάνει στο αντίστοιχο μοριακό μηχανισμό της ογκογένεσης. Η ταυτοποίηση ενός νέου γονιδίου στοχεύονται από υπερμεθυλίωση προαγωγέα μπορεί να παρέχει γνώσεις για τους μηχανισμούς για την απενεργοποίηση των ογκο-κατασταλτική οδούς και είναι σημαντική για τον εντοπισμό των καρκινικών δεικτών σε γαστρικό καρκίνο [5,6].

Πρόσφατα , έχουμε εντοπίσει, ένα ενώσεις προσφύσεως διαμεμβρανική πρωτεΐνη, VEZT ως υποψήφιο γονίδιο καταστολής όγκων. Έχουμε ως στόχο να αποσαφηνίσει την επιγενετική ρύθμιση και βιολογικές λειτουργίες των VEZT σε γαστρικό καρκίνο. VEZT, μία πανταχού παρούσα αναπόσπαστο πρωτεΐνη, έμμεσα συνδέεται με σύμπλεγμα Ε-καδερίνης-κατενίνης και ακτίνης του κυτταροσκελετού [7,8]. λειτουργίες του έχουν κατά κύριο λόγο έχουν διερευνηθεί σε επιθηλιακά κύτταρα. Απώλεια VEZT είναι προοδευτικά επιζήμια για εμβρυϊκή ανάπτυξη [9,10], και VEZT είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση της ακεραιότητας των κυτταρικών συνδέσεων κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας μηχανική πίεση που συμβαίνουν στο επίπεδο των τριχωτών κυττάρων έσω ωτός σε απόκριση προς ήχο. Επιπλέον, το εσωτερικό του αυτιού-ειδικό VEZT όρους ακύρωση οδηγεί σε προοδευτική κώφωση [7]. VEZT εκφράζεται έντονα στον εγκέφαλο [8,11]. VEZT είναι εμπλουτισμένο σε δενδριτικά σπονδυλικές στήλες σε νευρώνες ιππόκαμπου ποντικού. Χρησιμοποιώντας VEZT knock-down και τα νοκ άουτ όρους πριν (D6cre) ή μετά (CamKIIαcre) γέννησης, VEZT ρυθμίζει τη μορφολογία της σπονδυλικής στήλης. Μορφολογικές αλλαγές δεν συνδέονται με μειωμένη συναπτικές επαφές, αλλά μετασυναπτικών VEZT διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μορφο-λειτουργική ωρίμανση του διεγερτικό μετασυναπτικό στοιχείων [12].

Η απενεργοποίηση του γονιδίου VEZT έχει ταυτοποιηθεί σε γαστρικό καρκίνο, και η μεθυλίωση των νησιών CpG μέσα στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου VEZT συμβάλουν στην αδρανοποίηση του, όπως καθορίζεται από μια προηγούμενη μελέτη που διεξήχθη από το εργαστήριο μας [13]. Ο μηχανισμός της μεθυλίωσης και ο ακριβής ρόλος του VEZT στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου είναι προς το παρόν άγνωστη. Τα γονίδια-στόχους και σχετικές οδούς του VEZT δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε συστηματικά το μηχανισμό της μεθυλίωσης και μεθυλίωσης κατάσταση του υποκινητή του γονιδίου VEZT. Αναλύσαμε επίσης λειτουργικά χαρακτηριστικά του μετά την ανασύσταση της έκφρασης VEZT

in vitro και in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και δείγματα ιστών

ΜΚΝ -45, ΜΚΝ-28, ΓΓΕ-7901, η απαθανάτισε ανθρώπινου γαστρικού βλεννογόνου κυτταρική σειρά GES-1 (παρέχεται από το Ινστιτούτο πεπτικό χειρουργική επέμβαση Ruijin νοσοκομείο συνδεδεμένες με Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] και τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) διατηρήθηκαν σε ινστιτούτο μας. Κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SNU-1 και NCI-Ν87 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 2 mM L-γλουταμίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό την παρουσία 5% CO

2.

Πρωτογενής γαστρικού όγκου και φυσιολογικών γαστρικού βλεννογόνου ιστοί συλλέχθηκαν είτε από ρουτίνα θεραπευτική χειρουργική επέμβαση ή γαστρεντερική ενδοσκόπηση στο τμήμα μας. Το υπόλοιπο ήταν

H. pylori

καθεστώς μόλυνσης προσδιορίστηκε με βάση την ταχεία δοκιμή ουρεάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση στη μελέτη ελήφθη από όλους τους συμμετέχοντες. 4-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρούνται στο Εργαστήριο Κέντρο Ζώων του επαρχιακού νοσοκομείου Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Shandong (Jinan, Κίνα) για ένα 12/12 ωρών φωτός /σκότους (τα φώτα στις 19: 00) με τροφή και νερό διαθέσιμα adlibitum. Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών ζώων στο Επαρχιακό Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Shandong (Αριθμός Άδειας: SHANS87492). Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Επαρχιακό Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Shandong.

Processing των Laser μικροδιατομής για τους ιστούς και τα κύτταρα

Οι ιστοί απομακρύνονται το συντομότερο δυνατό μετά την εκτομή και καθορίζονται στο φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και κόπηκαν σε 8-μm πάχους τομές για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η 654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor Μέγεθος & lt? 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site της tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth της invasionT22518.35 καρκίνου ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 άπω metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης VEZT σε καρκινικούς ιστούς και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου.

Αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης VEZT σε καρκινικούς ιστούς και κλινικοπαθολογικών παράγοντες γαστρικό καρκίνο δείγματα έναντι παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (n = 104). Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης της VEZT συσχετίστηκε σημαντικά με λεμφικό μετάσταση, το βάθος της εισβολής του καρκίνου και το στάδιο ΤΝΜ (πίνακας 1,

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης VEZT δεν συνδέονται με το φύλο, την ηλικία, το μέγεθος του όγκου, τη διαφοροποίηση των κυττάρων, το ακαθάριστο εμφάνιση, το site του όγκου και μακρινή μετάσταση #:. TNM, όγκου-node-μετάσταση? *

σ

& lt? 0.05. CSV Λήψη CSV

ανάλυση μεθυλίωσης του φυσιολογικού γαστρικού ιστών, πρωτογενή γαστρικού καρκινικούς ιστούς και περιφερικού αίματος από ασθενείς με γαστρικό καρκίνωμα και υγιείς μάρτυρες

Με βάση την προηγούμενη μελέτη από το εργαστήριο μας, η υπόθεση ότι η μεθυλίωση του υποκινητή VEZT ήταν διαφορετική σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνωμα και υγιείς μάρτυρες? χρησιμοποιήσαμε σε απευθείας σύνδεση λογισμικό βιοπληροφορικής για την ανάλυση της κατάστασης περιοχή προαγωγού και μεθυλίωση του γονιδίου VEZT (Σχήμα 1Α). Εξετάσαμε το επίπεδο μεθυλίωσης του υποκινητή VEZT σε 30 δείγματα ιστών DNA από ασθενείς με πρωτοπαθή γαστρικό καρκινικούς ιστούς, αντίστοιχο DNA πλάσματος και τον έλεγχο χρησιμοποιώντας μεθόδους BSP, το οποίο καλύπτει τις περιοχές των -171bp να -428bp (Εικόνα 1Α). Οι μέσες μεθυλιωμένα επίπεδα VEZT σε 30 πρωτογενείς γαστρικό καρκινικούς ιστούς και 30 κανονικό γαστρικό ιστοί ήταν 67,78 ± 25,90% και 42,42 ± 30,30%, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Πρωτογενής γαστρικό καρκινικούς ιστούς έδειξε μεγαλύτερα επίπεδα μεθυλίωσης στην περιοχή προαγωγού VEZT σύγκριση με τις συνήθεις γαστρικό ιστούς (Σχήμα S1A, Σχήμα 1Β, Ρ & lt? 0,05). Η μέση μεθυλιωμένο επίπεδο του DNA στο πλάσμα σε ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου και υγιή περιπτώσεις ελέγχου ήταν 69,00 ± 23,90% και 46,71 ± 26,31%, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Το μεθυλιωμένο επίπεδο του DNA στο πλάσμα σε ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στην περιοχή προαγωγού VEZT σε σύγκριση με υγιή περίπτωση ελέγχου (Σχήμα S1B, Σχήμα 1 C, Ρ & lt? 0,05). Έτσι, σημαντική μεθυλίωση παρατηρήθηκε στο γαστρικό καρκίνο ομάδα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Το επίπεδο των μεθυλιωμένων VEZT σε ιστούς και πλάσμα θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μοριακός δείκτης για καρκίνο του στομάχου.

(Α), το λογισμικό βιοπληροφορικής Συνδεδεμένοι χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η περιοχή προαγωγού και την κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου VEZT. κατάσταση (Β) Μεθυλίωση CpG 34 θέσεις του υποκινητή VEZT από 30 κανονικό γαστρικό ιστούς και 30 πρωτογενή γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Πρωτογενής ιστοί όγκου έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στην περιοχή προαγωγού VEZT σύγκριση με τις συνήθεις γαστρικό ιστούς. κατάσταση (C) Μεθυλίωση CpG 34 θέσεις του υποκινητή VEZT από περιφερικό DNA του 30 ασθενείς με γαστρικό καρκίνωμα και 30 υγιείς ελέγχους πλάσματος αίματος. Περιφερικού αίματος από ασθενείς με γαστρικό καρκίνωμα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε περιοχή προαγωγού VEZT σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Κάθε σειρά από κύκλους αντιπροσωπεύει μια ολοκληρωμένη αναλογία μεθυλίωσης από τρεις κλώνους, και κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει μια απλή θέση CpG. Ανοικτός κύκλος αντιπροσωπεύει μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη, ενώ μαύροι κύκλοι ή μερικώς μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μετουσιωμένο αναλογία των θέσεων CpG.

Η

H. pylori

λοίμωξη προκαλεί την μεθυλίωση και αποσιώπηση της VEZT

Ένας σημαντικός αριθμός μελετών έχουν δημοσιευθεί αποδεικνύουν ότι

H. πυλωρού

λοίμωξη είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για μεθυλίωση [20,21,22]. Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι

H. πυλωρού

προκαλεί VEZT μεθυλίωση και εν συνεχεία καρκινογένεση. Κατά την πρώτη, εξετάσαμε το επίπεδο μεθυλίωσης του υποκινητή VEZT στο DNA από 23 δείγματα ιστών από ασθενείς με

H. pylori

-θετικό χρόνια γαστρίτιδα και οι έλεγχοι με τη χρήση του BSP και MSP μεθόδους, οι οποίες κάλυπταν τις περιοχές των -171bp να -428bp και -342 bp έως -513 bp αντίστοιχα (Εικόνα 1Α). Τα επίπεδα μέσης μεθυλίωση του υποκινητή VEZT σε

H. pylori

-θετικό και ο έλεγχος ήταν 75,74 ± 28,16% και 31,20 ± 25,67%, αντίστοιχα. Έτσι, μια σημαντική διαφορά στην μεθυλίωση παρατηρήθηκε στην

H. pylori

-θετικό χρόνιας ομάδα γαστρίτιδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,01, Σχήμα 2Α). Η περιοχή υποκινητή των VEZT γενικά μεθυλιώθηκε σε ασθενείς με χρόνια γαστρίτιδα σύμφωνα με την ανάλυση MSP (Πίνακας S2)? Ωστόσο, βρήκαμε τέσσερις περιπτώσεις

H. pylori

-θετικό χρόνια γαστρίτιδα που ήταν σχετικά μη μεθυλιωμένα. Παρατηρήσαμε 19 περιπτώσεις

H. pylori

-θετικό χρόνια γαστρίτιδα που εμφανίζεται υπερμεθυλίωση (Πίνακας S2). Για να καθοριστεί εάν

H. pylori

μόλυνση προκαλεί μεθυλίωση υποκινητή του γονιδίου VEZT

in vitro

, διαπιστώσαμε ότι

H. pylori

μόλυνσης που σχετίζεται με την έκφραση της IL-6, ΑΚΤ, TNF-а, IL-8, ATF3 και IRX5 πρωτεΐνης μετά

H. pylori

μόλυνση και επωάστηκαν για 24 ώρες σε κύτταρα GES-1 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν

H. pylori

μόλυνση προώθησε την έκφραση της IL-6, ΑΚΤ, TNF-а, IL-8, ATF3 και IRX5 πρωτεΐνη και

H. pylori

λοίμωξης ήταν επιτυχής στην GES-1 κύτταρα (Σχήμα 2Β, 2C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι ότι

H. πυλωρού

μόλυνση είναι πράγματι υπεύθυνη για τη μεθυλίωση ή αποσιώπηση της VEZT, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης υποστηρικτής της VEZT στην GES-1 κύτταρα με MSP και BSP. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2D και 2Ε, ο υποκινητής του VEZT ήταν υπερμεθυλίωση σε

H. Παρατηρήθηκε πυλωρού

-μολυσμένα GES-1 κύτταρα, αλλά unmethylation σε κύτταρα μη μολυσμένα με το

H. pylori

(Σχήμα 2D, και Ε). Το επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης της VEZT ήταν επίσης χαμηλότερη στην

H. pylori

-μολυσμένα κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα μη μολυσμένα με το

H. pylori

(Σχήμα 2C).

(Α)

H. pylori

ασθενείς -θετικό γαστρίτιδα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στην περιοχή προαγωγού VEZT σε σύγκριση με το

H. pylori

ασθενείς -αρνητικοί γαστρίτιδα. Κάθε σειρά από κύκλους αντιπροσωπεύει μια ολοκληρωμένη αναλογία μεθυλίωσης από τρεις κλώνους, και κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει μια απλή θέση CpG. Ανοικτός κύκλος αντιπροσωπεύει μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη, ενώ γεμάτους κύκλους ή μερικώς μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μετουσιωμένο αναλογία των CpG θέσεων. (Β) Μετά τη μόλυνση 24 ώρες με

H. pylori

, η σύνδεση του

H. pylori

παρατηρήθηκε με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίων στην επιφάνεια του GES-1 κύτταρα στα πειραματικά κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. (C) VEZT επίπεδο έκφρασης σε κύτταρα GES-1 μειώθηκε μετά από 24 h

H. pylori

λοίμωξη σε σχέση με αρνητικά κύτταρα ελέγχου? Ωστόσο,

H. pylori

λοίμωξη που προκαλείται από την IL-6, ΑΚΤ, TNF-α, IL-8, ATF3 και έκφραση IRX5 με ανάλυση κηλίδος Western. (Δ) Η μεθυλίωση του υποκινητή VEZT ανιχνεύθηκε από MSP μετά από 24 h

H. pylori

μόλυνση σε κύτταρα GES-1 (σημειώνονται ως Μ), ενώ η μεθυλίωση του υποκινητή VEZT σε GES-1 κύτταρα που δεν είχαν μολυνθεί με

H. pylori

δεν παρατηρήθηκε (σημειώνεται ως U). (Ε) Σχηματική σύνοψη των 34 CpG θέσεων στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου VEZT από -171 -428 να με ανάλυση BSP. GES-1 κύτταρα έδειξαν ένα υψηλότερο επίπεδο της μεθυλίωσης μετά από

H. pylori

μόλυνση σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου. Η γραμμή αντιπροσωπεύει 5000 nm.

Η

Λειτουργική ανάλυση μετά την αποκατάσταση της έκφρασης VEZT in vitro

Η συχνή σιγαστήρα ή προς τα κάτω ρύθμιση των VEZT σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου δείχνει ότι είναι πιθανό ένα ογκο-κατασταλτικά γονιδίων σε προηγούμενη μελέτη μας. Για να δοκιμαστεί αυτό το σημείο, μπορούμε διαλογή έκφρασης VEZT σε αρκετές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου με πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδος western. Διαφορετικά επίπεδα έκφρασης VEZT βρέθηκαν στις έξι κυτταρικές γραμμές αναλύθηκαν (Σχήμα 3Α). Κατασκευάσαμε ένα φορέα έκφρασης pEGFP-Ν1-VEZT και επιμολύνθηκαν φορέα pEGFP-N1 εντός του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΚΝ-45 και ΝΟΙ-Ν87, το οποίο έδειξε καθόλου ή χαμηλό επίπεδο έκφρασης VEZT. Μετά την επιμόλυνση, εξετάσαμε την έκφραση του VEZT σε αυτές τις κυτταρικές σειρές με πραγματικού χρόνου PCR, η οποία έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης μεταγράφου του VEZT ήταν ρυθμισμένη 41,99-φορές (Σχήμα 3Β, Ρ & lt? 0,01) σε αυτές τις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με με τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα. Εξετάσαμε επίσης την ικανότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν VEZT να εισβάλει και να μεταναστεύσουν από την εισβολή transwell και προσδιορισμούς μετανάστευσης (Σχήμα 3C). Η επεμβατική ικανότητα του ΜΚΝ-45 κύτταρα στο /Ν1 ομάδα VEZT ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου-επιμολυσμένα (78,32 ± 5,27 έναντι 174,13 ± 2,45,

P

& lt? 0.001). Ο αριθμός των ΜΚΝ-45 κυττάρων στην VEZT επιμολυσμένα δείγμα που μετανάστευσαν μέσω του ενθέτου transwell μειώθηκε επίσης σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου-επιμολυσμένα (48,28 ± 2,16 έναντι 142,13 ± 7,42,

P

& lt? 0.001).

(Α) Τα διάφορα επίπεδα έκφρασης του VEZT σε πέντε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και μία αθανατοποιημένη γαστρικού βλεννογόνου κυτταρική γραμμή. (Β) Έκφραση της VEZT ρυθμίζεται αυξητικά σε ΜΚΝ-45 και NCI-Ν87 κύτταρα κατόπιν VEZT φορέα επιμόλυνσης σε σχέση με Ν1-ελέγχους. (Γ) επεμβατικές, μεταναστευτικών και σωληνοειδή ικανότητες σχηματισμό VEZT-επιμολυσμένα ΜΚΝ-45 και ΝΟΙ-Ν87 κύτταρα καταστέλλονται όπως προσδιορίζεται από την transwell και προσδιορισμούς σχηματισμού σωληνοειδές. (Δ) Η υπερέκφραση του VEZT οδηγεί σε διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία CCK-8. ρυθμοί σχηματισμού (Ε) αποικίας ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ VEZT-επιμολυσμένα κύτταρα και Ν1-ελέγχους ΜΚΝ-45 και NCI-Ν87 κύτταρα. (F) Η υπερέκφραση του VEZT σε ΜΚΝ-45 και ΝΟΙ-Ν87 κύτταρα ανέστειλε την ογκογένεση σε γυμνά ποντίκια. οζίδια όγκου εκτομή από το VEZT επιμολυσμένα ομάδα ήταν μικρότερες από εκείνες από Ν1-ελέγχους. καμπύλες (G) Η ανάπτυξη του όγκου για την ομάδα VEZT /Ν1 και Ν1-ελέγχων δείχνουν ταχεία αύξηση του όγκου των ΜΚΝ-45 ή ΝΟΙ-Ν87 /N1control ομάδες. *

P

& lt? 0.05. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

HUVECs αιωρήθηκαν σε υπερκείμενα που συλλέγονται από τον έλεγχο και VEZT /N1. Μετά από 18-ώρες επώασης, το υπερκείμενο συλλέγεται από κύτταρα VEZT /Ν1 έδειξε ισχυρή ανασταλτική επίδραση επί του σχηματισμού σωληνοειδών δομών με HUVECs σε σχέση με τον αριθμό, το μήκος και τέμνει κόμβους σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3C).