Abstract

Ιστορικό

15-Hydroxyprostaglandin αφυδρογονάση (15-PGDH) είναι ένα μεταβολικό ανταγωνιστής του COX-2, καταλύοντας την αποικοδόμηση της φλεγμονής μεσολαβητή προσταγλανδίνης Ε2 (PGE

2) και άλλα προστανοειδή. Πρόσφατες μελέτες έχουν καθιερώσει το γονίδιο 15 PGDH ως καταστολέας του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Εκτιμήσαμε 15 PDGH ως ένα τόπο επιδεκτικότητα καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα σχέδιο τριών σταδίων. Εμείς γονότυπος πρώτα 102 πολυμορφισμούς μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) στο γονίδιο 15-PGDH, που εκτείνονται -50 kb πάνω και κάτω ροή της κωδικοποιητικής περιοχής, σε 464 περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και 393 μάρτυρες πληθυσμού. Στη συνέχεια ο γονότυπος τους ίδιους SNPs, και επίσης προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του 15-PGDH σε ιστούς κόλου από 69 ανεξάρτητους ασθενείς στους οποίους ιστό του παχέος εντέρου και ζευγαρωμένα δείγματα DNA βλαστικής σειράς ήταν διαθέσιμα. Στο τελικό στάδιο 3, μπορούμε γονότυπος τα 9 πιο ελπιδοφόρα SNPs από τα στάδια 1 και 2 σε ένα ανεξάρτητο δείγμα 525 περιπτώσεις και 816 έλεγχοι (στάδιο 3).

Αποτελέσματα

Στις δύο πρώτες στάδια, τρεις SNPs (rs1365611, rs6844282 και rs2332897) ήταν στατιστικά σημαντική (p & lt? 0,05) στην συνδυασμένη ανάλυση της σύνδεσης με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου και του συνεταιρίζεσθαι με την έκφραση 15-PGDH, μετά την προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές. Για ένα επιπλέον SNP, rs2555639, ο Τ αλληλόμορφο έδειξε αυξημένο κίνδυνο καρκίνου και μειωμένη έκφραση 15-PGDH, αλλά μόλις έχασε στατιστική σημαντικότητα (ρ-ρυθμίζεται = 0,063). Στο στάδιο 3, rs2555639 και μόνο έδειξε στοιχεία σύνδεσης με αναλογία πιθανοτήτων (ΤΤ σε σύγκριση με CC) 1,50 (95% CI = 01.05 έως 02.15, p = 0,026).

Συμπεράσματα

μας τα δεδομένα δείχνουν ότι το αλληλόμορφο rs2555639 Τ σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου, και ότι οι μεταφορείς αυτού του αλληλόμορφου κινδύνου εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του 15-PGDH στο παχύ έντερο

Παράθεση:. Thompson CL, Fink SP, Lutterbaugh JD , Elston RC, Veigl ML, Markowitz SD, et al. (2013) γενετική παραλλαγή στο 15-Hydroxyprostaglandin αφυδρογονάση και καρκίνου του παχέος εντέρου Ευαισθησία. PLoS ONE 8 (5): e64122. doi: 10.1371 /journal.pone.0064122

Επιμέλεια: Xiao-Ping Miao, MOE Βασικά Εργαστήριο Περιβάλλοντος και Υγείας, τη Σχολή Δημόσιας Υγείας, Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, η Κίνα

Ελήφθη: 16 Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 10η του Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2013

Copyright: © 2013 Thompson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Cancer Institute (επιχορηγήσεις Κ07 CA136758 να CLT, R01 CA136726 να LL) και την υπόθεση Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (P30 CA043703). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι το τελικό αποτέλεσμα μιας διαδικασίας πολλών σταδίων γενετικών και επιγενετικών αλλαγών με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ογκογόνων οδών καθώς και απενεργοποίηση των οδών καταστολέα όγκου [1]. Ένα βασικό συμβάν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι η αυξητική ρύθμιση του ογκογονιδίου κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) [2], [3], [4], [5]. COX-2 καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε PGH

2, η οποία είναι ένα ενδιάμεσο υπόστρωμα για μια ποικιλία βιοδραστικών προσταγλανδινών, συμπεριλαμβανομένων των PGE

2 [6], [7], το κυρίαρχο προσταγλανδίνης βρίσκεται στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς [8]. Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η αυξημένη παραγωγή της PGE

2 μεσολαβεί στην ογκογόνο δράση του COX-2 [7], [9], [10], [11].

15-Hydroxyprostaglandin αφυδρογονάσης ( 15-PGDH) είναι το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην αποδόμηση των προσταγλανδινών, συμπεριλαμβανομένων των PGE

2, και άμεσα ανταγωνίζεται την COX-2 ογκογόνο οδό της παραγωγής προσταγλανδίνης [12]. 15-PGDH εκφράζεται έντονα σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, ρυθμίζεται μέσω της ΤΟΡ-β ογκοκατασταλτικό μονοπάτι, και υφίσταται απώλεια της έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [13], [14]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως τη λειτουργία καταστολής όγκου των 15-PGDH, διαπιστώνοντας ότι επανέκφραση του 15-PGDH σε ένα μπλοκ κυτταρική γραμμή ανάπτυξης όγκου καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από ένεση σε αθυμικά ποντίκια, και ότι χτυπήσει έξω ποντικού αποτελέσματα 15-PGDH σε αυξημένη ανάπτυξη του παχέος εντέρου όγκων [13], [15]. Επιπλέον, σε μελέτες σε ανθρώπους βρήκαμε μια ουσιαστική 12-πλάσια διαφορά στα επίπεδα του ορθού 15 PGDH μεταξύ των ατόμων με το χαμηλότερο στο υψηλότερο επίπεδο μεταγραφής 15-PGDH, και ότι τα χαμηλά επίπεδα του ορθού 15 PGDH συσχετίστηκαν με αυξημένη ορθοκολικού αδενώματος (ένας πρόδρομος για καρκίνο του παχέος εντέρου) υποτροπές [16].

Αυτά τα ευρήματα μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον κληρονομική γενετική παραλλαγή στο τόπο 15 PGDH θα μπορούσε να εξηγήσει τη μεγάλη διακύμανση του πληθυσμού στα επίπεδα του παχέος εντέρου 15 PGDH, και θα πρέπει επίσης να συνδέεται με κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου. Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου των δεικτών SNP που εκτείνονται σε περίπου 50 kB ανάντη σε ~ 40 kB κατάντη του γονιδίου 15-PGDH περιοχή κωδικοποίησης σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων με βάση τον πληθυσμό σε δύο στάδια. Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα ίδια SNPs για τις ενώσεις τους με τα επίπεδα έκφρασης της 15-PGDH στους ιστούς του παχέος εντέρου σε ένα ξεχωριστό πληθυσμό ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

Μελέτη

Εμείς που απασχολούνται ένα σχέδιο μελέτης 3 στάδιο για το έργο αυτό. Στο πρώτο στάδιο, ερευνήσαμε όλα τα γνωστά SNPs στο γονίδιο 15-PGDH, που εκτείνονται 50 kb ανοδικά έως 40 kb κατάντη, για συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε μία μελέτη ελέγχου βάσει πληθυσμού. Στο δεύτερο στάδιο, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση αυτών των ίδιων SNPs με έκφραση 15-PGDH σε κολικό επιθηλιακών ιστών από ανεξάρτητο δείγμα των ασθενών. Χρησιμοποιήσαμε τότε μια προσέγγιση μετα-ανάλυση για να συνδυάσει τα αποτελέσματα από τα στάδια 1 και 2, προκειμένου να εντοπίσει τα πιο ελπιδοφόρα SNPs να προχωρήσουμε προς τα εμπρός για το στάδιο 3. Στο στάδιο 3, έχουμε γονότυπος αυτά κορυφή SNPs σε ένα δεύτερο δείγμα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου και του πληθυσμού ελέγχει για επικύρωση.

πληθυσμοί Ασθενών

για την ανάλυση ένωση 15 PGDH SNPs με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου, περιπτώσεις περιστατικό εντοπίστηκαν από την κατάσταση του Κεντάκυ επιτήρηση, την επιδημιολογία και τα τελικά αποτελέσματα ( SEER) του μητρώου. Έλεγχοι είχαν προσληφθεί μέσω τυχαίων ψηφίων κλήσης και φίλος παραπομπές. Η πρόσληψη αυτού του πληθυσμού μελέτης περιγράφονται με μεγαλύτερη λεπτομέρεια προηγούμενα [17]. Συνολικά ο πληθυσμός της μελέτης είναι περίπου 94% του Καυκάσου [17]. Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση της στρωματοποίησης του πληθυσμού και για την αύξηση της ομοιογένειας, έχουμε περιορισμένες αναλύσεις μας μόνο σε άτομα που αυτο-αναφοράς όπως Καυκάσιους. Για το σύνολο ανακάλυψη (στάδιο 1), υποκείμενα είχαν προσληφθεί από τον Φεβρουάριο του 2003 έως τον Δεκέμβριο του 2005, και περιελάμβανε 464 περιπτώσεις και 393 έλεγχοι αυτο-αναφορά, όπως Καυκάσου. Το σύνολο αντιγραφής (χρησιμοποιούνται σε στάδιο 3) περιλαμβάνονται 525 Καυκάσου περιπτώσεις και 816 του Καυκάσου ελέγχους που προσλαμβάνονται από τον Ιανουάριο του 2006 έως τον Ιούνιο του 2010. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση, ολοκλήρωσε ένα εκτεταμένο ερωτηματολόγιο παράγοντα κινδύνου και δώρισε ένα δείγμα αίματος. Ολόκληρο το αίμα είχε αποσταλεί στο εργαστήριο έρευνας στο Πανεπιστήμιο Case Western Reserve τη διάρκεια της νύχτας και αμέσως επεξεργασία. DNA απομονώθηκε από φλεγμονώδεις πλακούντες διαχωρίζονται από το πλήρες αίμα συλλέγεται σε πρότυπους σωλήνες ETDA.

Για να μελετηθεί η επίδραση της SNPs επί της γονιδιακής έκφρασης ιστού (στάδιο 2), η κανονική τομές ιστών κόλου συλλέχθηκαν από 69 Καυκάσιους ασθενείς που προσλαμβάνονται στο Πανεπιστήμιο νοσοκομεία υπόθεση Medical Center (UHCMC). Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση. RNA και DNA από τα δείγματα ιστού παρασκευάστηκαν με εκχύλιση με ισοθειοκυανική γουανιδίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Ολικό κυτταρικό RNA και γονιδιωματικό DNA διαχωρίστηκαν με υπερφυγοκέντρηση του εκχυλίσματος μέσω ενός μαξιλαριού καισίου. Και οι δύο μελέτες εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας UHCMC.

Γονοτυπικές

Έχουμε συμπεριλάβει όλες τις γνωστές SNPs από 50 kb ανοδικά έως 40 kb κατάντη των 15 PGDH ότι κατά τη στιγμή της έναρξης της μελέτης μας ήταν που αναφέρονται ως Illumina Golden Gate επικυρωθεί, και για τις οποίες δοκιμασίες TaqMan ΑΒΙ ήταν διαθέσιμα. χημεία ΑΒΙ TaqMan χρησιμοποιήθηκε σε γονοτυπική ανάλυση των δειγμάτων αυτών σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, 2 μΙ κλάσματα, που περιέχουν 5-10 ng του DNA μεταφέρθηκαν από τις πλάκες δεξαμενή 96 φρεατίων σε 384-φρεατίων πλάκες προσδιορισμού για κάθε άτομο που γονότυπου. Πολλαπλές πλάκες 384-φρεατίων δημιουργήθηκαν? το DNA ξηράνθηκε κάτω, οι πλάκες στη συνέχεια σφραγίζεται και καταψύχονται μέχρι την ανάλυση. Ένα δείγμα 5 μl του Master Mix, Probe & amp? Primer ήταν ρομποτικά προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο ενός 384-φρεατίων προηγουμένως με επιχρυσωμένο DNA. PCR [40 Κύκλοι] πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ GeneAmp PCR System 9700 διπλή κεφαλή μέσου και του τελικού σημείου διαβάζει διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ 7900 Sequence Detection System (SDS). Από TaqMan Χημεία είναι μια διαδικασία που βασίζεται στην PCR, όλα τα μείγματα δοκιμασία παρασκευάστηκαν με αμπλικόνιο χωρίς χώρο για να αποφευχθεί η μόλυνση.

Για να διασφαλιστεί η ποιότητα των δεδομένων, κάθε αρχείο SDS ήταν μεμονωμένα αναθεωρηθεί πριν από την εξαγωγή των δεδομένων για να διασφαλιστεί η αρχική τιμή έχει ρυθμιστεί σωστά. Στην διάταξη δοκιμασίας 384-φρεατίων, η τελευταία στήλη της πλάκας ήταν αποκλειστικά για κενά νερό για να εξασφαλιστεί καμία μόλυνση κατά τη διάρκεια επιμετάλλωσης. δείγματα DNA, είτε από Coriell ή από το δικό μας βάση δεδομένων, με γνωστούς γονότυπους για την SNPs ανακρίνεται στη μελέτη αυτή περιλήφθηκαν σε κάθε πλάκα προσδιορισμού για να χρησιμεύσουν ως θετικοί μάρτυρες και για τον εντοπισμό των 3 γονότυπους. Τέσσερα πανομοιότυπα δείγματα συμπεριλήφθηκαν στο δείγμα ανακάλυψη (φάση 1) και το δείγμα έκφρασης ιστού του παχέος εντέρου (φάση 2), που γονότυπου ταυτόχρονα, και 29 όμοια δείγματα που συμπεριλήφθηκαν στο δείγμα επικύρωσης (φάση 3) για να επιβεβαιώσετε την ακριβή προσδιορισμό του γονότυπου στην η μελέτη. Γονότυπο αντιστοιχία των επαναλήψεων και δείγματα ελέγχου επιβεβαιώθηκε. Αν δεν παρατηρήθηκε 100% συμφωνία, τα πρωτογενή αρχεία δεδομένων αναθεωρήθηκαν και τυπικά η δοκιμασία επαναλήφθηκε. Το συνολικό ποσοστό κλήση ήταν 94,6% (στοιχεία στον Πίνακα S1).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Μέτρηση 15-PGDH

Η ακεραιότητα του απομονωμένου ολικού RNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent τεχνολογίες, Santa Clara, CA) και οι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ND-1000 Φασματοφωτόμετρο (NanoDrop, Wilmington, DE). Όλα αντίστροφης μεταγραφής ποσοτικούς προσδιορισμούς PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που MIQE [19]. cDNA συντέθηκε από 1 μα RNA εισόδου χρησιμοποιώντας ΑΜν ανάστροφης μεταγραφάσης (Roche, Indianapolis, ΙΝ) ακολουθώντας το συνιστώμενο πρωτόκολλο κατασκευάζει. Σε πραγματικό χρόνο μέτρηση PCR 15-PGDH πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο υδρόλυση ανιχνευτή /εκκινητή που Hs00168359_m1 (HPGD, NM_000860) από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Ένα 25 μΐ μίγματος αντίδρασης περιείχε 1 μΙ (40 ng) του εκμαγείου cDNA και μία αραίωση ενός ατόμου εκκινητών /ανιχνευτών που σε 1Χ Supermix (Bio-Rad, CA) 1:20 και κατά διεξήχθη σε οπτική μονάδα CFX96 (Biorad, Hercules , CA). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας για όλες τις δοκιμασίες ήταν 95 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Cytokeratin 20 (KRT20), ένας δείκτης του κόλου μάζα επιθηλιακών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε ως το γονίδιο αναφοράς για κανονικοποίηση και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το KRT20 (NM_019010) υδρόλυση εκκινητή /σετ ανιχνευτή ανθρώπινου Hs00300643_m1 από την Applied Biosystems ακολουθώντας τις ίδιες συνθήκες αντίδρασης ανωτέρω. επιλέγεται KRT20 έγινε επειδή είναι ένας ειδικός δείκτης για κολικά επιθηλιακά μάζα [7], [15], [16], καθώς επίσης και έχοντας ομοιόμορφη έκφραση με ανάλυση μικροσυστοιχιών σε 16 κανονικές βιοψίες ιστών κόλον και του παχέος κρύπτης επιθηλιακά κύτταρα που απομονώνονται από ένα πρόσθετο 5 φυσιολογικό δείγματα βιοψίας (Markowitz, αδημοσίευτα δεδομένα). Για κάθε αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής, 15-PGDH και KRT20 κύκλος ποσοτικοποίησης (Cq

15-PGDH και Cq

KRT20) τιμές προσδιορίστηκαν ως οι μέσες τιμές που λαμβάνονται από τρεις ανεξάρτητες αντιδράσεις PCR πραγματικού χρόνου. Το συνολικό επίπεδο της έκφρασης RNA 15-PGDH προσδιορίστηκε ως ο λόγος της 15-PGDH: KRT20 = 2 exp (Cq

15-PGDH-Cq

KRT20). RNA που δεν είχαν υποστεί το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφάσης καθώς και ένα δείγμα νερού που πέρασε από το στάδιο της ανάστροφης μεταγραφάσης χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες και ήταν αρνητικά για όλες τις δοκιμασίες που εκτελούνται.

Στατιστικές Αναλύσεις

για τον έλεγχο της ποιότητας, κάθε SNP δοκιμάσθηκε για απόκλιση από Hardy-Weinberg ισορροπία (HWE) στον πληθυσμό ελέγχου μέσω chi-square test της διαφοράς από την προσδοκία. SNPs που παρουσίασαν ενδείξεις απόκλισης από HWE (p & lt? 0,05) αποκλείστηκαν από περαιτέρω αναλύσεις

αναλογίες Αποδόσεις (OR) και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) για τον καρκίνο του παχέος εντέρου αξιολογήθηκαν μέσω μιας λογιστικής παλινδρόμησης ως προς την ηλικία. και το φύλο. Στα λογιστικών παλινδρομήσεων, το αλληλόμορφο πιο συχνή στις περιπτώσεις (σε σύγκριση με τους μάρτυρες) θεωρήθηκε το αλληλόμορφο κινδύνου. Για κάθε SNP, τα άτομα αυτά κωδικοποιούνται ως 0, 1 ή 2, που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των αλληλομόρφων κινδύνου σε αυτή τη θέση. Οι αναλογίες πιθανοτήτων υπολογίστηκαν για το γεγονός ότι ένα αλληλόμορφο του κινδύνου και για το γεγονός ότι δύο αλληλόμορφα κίνδυνο, σε σύγκριση με το που δεν έχουν αλληλόμορφα κινδύνου. Η συνολική τιμή p υπολογίζεται για την p-τιμή της τάσης για τον κίνδυνο ανά αριθμό των αλληλομόρφων κινδύνου (προσθετικό μοντέλο)

Η διαφορά στη μέση έκφραση ιστού 15-PGDH για κάθε μία από τις τρεις πιθανές γονότυπους για κάθε SNP αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με δύο βαθμούς ελευθερίας. Δεδομένου ότι ήμασταν έρευνές μας

a priori

υπόθεση ότι το αλληλόμορφο κινδύνου σχετίζεται με μειωμένο 15-PGDH έκφραση, έχουμε αναφερθεί μονόπλευρη p-τιμές. Όταν το αλληλόμορφο κινδύνου αποδειχθεί υψηλότερη έκφραση, μια τιμή p 1 αποδόθηκε.

Για να καθοριστεί ποια SNPs έδειξε την πιο απόδειξη τόσο συσχέτιση με την έκφραση 15-PGDH και τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου, χρησιμοποιήσαμε του Fisher μέθοδο για να συνδυάσει p-τιμές [20] από την ένωση ανακάλυψη SNP και αναλύσεις έκφρασης. μέθοδο Fisher επιτρέπει το συνδυασμό των p-τιμές, ειδικά στην ανάλυση πολλαπλών σταδίων, να συντάξει παρόμοια συμπέρασμα χρησιμοποιώντας διαφορετικά στατιστικά στοιχεία υπολογίζεται από τα ίδια δείγματα. Κάθε ένα από τα στατιστικά στοιχεία σε συνδυασμό δοκιμάζει μια διαφορετική πτυχή του βιολογικού υπόθεση υπό διερεύνηση. Ισχύς μπορεί να βελτιωθεί με συνδυασμό των ρ-τιμές των διαφόρων δοκιμών. Για την αντιμετώπιση των πολλαπλών δοκιμών, τότε να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) της Benjamini και Hochberg [21] για τα συνδυασμένα ρ-τιμές.

Τα κορυφαία 9 SNPs που εντοπίστηκαν στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου στην αντιγραφή που χρησιμοποιώντας τις ίδιες στατιστικές μεθόδους όπως το σετ ανακάλυψη. Συνδυάσαμε τα αποτελέσματα από το πρώτο και το δεύτερο δείγμα ελέγχου περιστατικών χρησιμοποιώντας ένα τυχαίο μοντέλο αποτέλεσμα. Όλα τα στατιστικά εκτός από την μετα-ανάλυση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SAS 9.2 και p-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

SNP-Colon Cancer Discovery Συλλόγου

Θήκες. στη φάση 1 είχαν περισσότερες πιθανότητες να είναι αρσενικό και ήταν, κατά μέσο όρο, ηλικίας άνω των ελέγχων (Πίνακας 1). Από τα 102 SNPs αξιολογήθηκε στον πληθυσμό ανακάλυψη, 25 ήταν είτε μονομορφικής ή είχαν MAF & lt? 5% του πληθυσμού μας. Από τα υπόλοιπα, 2 βρέθηκαν να είναι έξω από HWE, και 1 είχε ποσοστό & lt καλέσει? 80%. Αυτά τα 28 SNPs αποκλείστηκαν από όλες τις περαιτέρω αναλύσεις. Μεταξύ των υπολοίπων 75 SNPs, 8 συσχετίστηκε σημαντικά με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου στο μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης στο p & lt? 0,05 (μη προσαρμοσμένες για πολλαπλές δοκιμές) επίπεδο (Πίνακας S1): rs1365611, σ & lt? 0,0001? rs6844282, σ & lt? 0,0001? rs2332897, σ & lt? 0,0001? rs10520282, p = 0,0035? rs1426936, p = 0,012? rs34299544, p = 0,024? rs2555639, p = 0,038? και rs5007089, ρ = 0,046. Όλα τα αποτελέσματα δίνονται στον Πίνακα S1, και πέντε από αυτές που πληρούσαν τα κριτήρια για την ένταξη στο σύνολο αντιγραφής (με βάση τα αποτελέσματα τόσο στην ένωση του κινδύνου και το πείραμα γονιδιακής έκφρασης ιστού του παχέος εντέρου, βλέπε επίσης παρακάτω) αναλύονται στον Πίνακα 2.

Η

σύνδεσης με την έκφραση 15-PGDH

Το ίδιο πλήρες σύνολο των 102 SNPs αξιολογήθηκε για σύνδεση με τα επίπεδα έκφρασης ιστού της 15-PDGH σε ένα ανεξάρτητο σύνολο 69 ασθενών (πλήρη αποτελέσματα στον πίνακα S2). Από αυτούς τους ασθενείς, 38 (55%) ήταν άνδρες και 31 (45%) ήταν γυναίκες. Η μέση ηλικία ήταν 70,1 (SD = 13.8), και το ηλικιακό εύρος ήταν 18-94. Από τους 102 γονότυπου SNPs, δύο απέτυχαν, QC, και 14 ήταν μονομορφικής. Αυτά εξαιρέθηκαν από περαιτέρω αναλύσεις. Από τις υπόλοιπες 84 SNPs, τέσσερις στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τα επίπεδα έκφρασης στο ρ & lt? 0,05 (Πίνακας S2). Τα λεπτομερή αποτελέσματα της έκφρασης που προβλέπεται για τους ίδιους 9 SNPs που επιλέγονται για την επικύρωση (βλέπε επίσης παρακάτω) στον Πίνακα 3.

Η

Μετά το συνδυασμό των p-τιμές από τους έκφρασης και του συνεταιρίζεσθαι αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του Fisher, το 9 πιο στατιστικά σημαντική SNPs (Πίνακας 2), επιλέχθηκαν για την επικύρωση με δοκιμή σύνδεσης με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα ανεξάρτητο σύνολο αντιγραφή των περιπτώσεων και ελέγχων. Από αυτά τα κορυφαία 9 σημαντικότερες SNPs, 3 (rs1365611, rs6844282 και rs2332897) παρέμεινε σημαντική μετά από προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές (Πίνακας 3) (rs1365611 p = 0,038, rs6844282 p = 0,038 και rs2332897 p = 0.032), και ένα ακόμη είχε μια πολλαπλή δοκιμή προσαρμοστεί p-τιμή λίγο πάνω από 0,05 (rs2555639, p = 0,063).

Σύλλογος επικύρωση

στο δείγμα επικύρωσης φάσης 3, περιπτώσεις ήταν πιο πιθανό να είναι αρσενικό και ήταν μεγαλύτερης ηλικίας, σε Κατά μέσο όρο, από τους ελέγχους, όπως στη φάση 1 (Πίνακας 1). Τα κορυφαία 9 SNPs, με βάση τα συνδυασμένα ρ-τιμές εμφανίζουν ενδείξεις για συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου και /ή έκφραση 15-PGDH στο κόλον, επιλέχθηκαν για την επικύρωση στο ανεξάρτητο σύνολο 525 ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου και 816 ελέγχους. Από αυτά τα SNPs, rs2555639 έδειξε στατιστικά σημαντικές ενδείξεις για συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου κατά το p & lt?. 0.05 επίπεδο (μέσω ανάλυσης λογιστικής παλινδρόμησης) (Πίνακας 4)

Η

Συνδυάζοντας τα δεδομένα από τη νομολογία του ελέγχου ανακάλυψη και την επικύρωση των πληθυσμών, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι έχουν δύο αντίγραφα του Τ αλληλόμορφου του rs2555639 προσδίδει κατ ‘εκτίμηση 58% (95% CI: 19% -109%, p = 0,0015) αύξηση στις αποδόσεις του καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με άτομα με δύο αντίγραφα του αλληλόμορφου C (Πίνακας 5). Επιπλέον, το αλληλόμορφο rs2555639 Τ συνδέεται επίσης με μειωμένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου καταστολής όγκου 15 PGDH (Πίνακας 3, p = 0,012),

Η

Συζήτηση

Εδώ παρουσιάζουμε αποδείξεις της σύνδεσης μεταξύ της Τ αλληλόμορφου του 15-PGDH rs2555639 SNP και τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε μια σταδιακή σχεδιασμό της μελέτης. Αυτό αλληλόμορφο συσχετίστηκε επίσης με μειωμένη έκφραση 15-PGDH στον ιστό του παχέος εντέρου σε ένα ανεξάρτητο πληθυσμό ασθενών. Αυτό SNP χάρτες 17.74 Kb ανοδικά της 5 ‘UTR του γονιδίου 15-PGDH, στην υποτιθέμενη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου (Εικ. 1). Η μελέτη μας υπογραμμίζει έτσι τη σημασία της εξέτασης γενετικής παραλλαγής σε περιοχές υποκινητή κατά την αξιολόγηση της συσχέτισης των κληρονομικών παραλλαγή με προδιάθεση για τη νόσο.

Η

Αν και rs2555639 ήταν το μόνο SNP που συσχετίστηκε σημαντικά με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε κάθε ένα από την ανακάλυψη και την επικύρωση καθορίζει ανεξάρτητα, διάφορα πρόσθετα SNPs είχαν ιδιαίτερα σημαντική συσχέτιση με τον κίνδυνο όταν συνδυάζεται δεδομένα από τα δείγματα ανακάλυψη και επικύρωσης (Πίνακας 5), συμπεριλαμβανομένων των rs1365611 (OR = 1.73, 95% CI: 1,26 – 2,37, p = 0,0008 ), rs6844282 (OR = 1,42, 95% CI: 1,10 – 1,83, p = 0,0078), και rs2332897 (OR = 1,74, 95% CI: 1,27 – 2,38, p = 0,0006). Τα σύνολα ανακάλυψη και την αντιγραφή ωστόσο παρουσιάζουν ενδείξεις ετερογένειας (Πίνακας 5), και αυτά τα 3 SNPs δεν ήταν σημαντικές στο δείγμα επικύρωσης. θα απαιτηθεί περαιτέρω μελέτη με ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος πριν μπορέσει να φτάσει σε οριστικά συμπεράσματα σχετικά με τη σύνδεση των εν λόγω τριών επιπλέον SNPs με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου.

SNP rs2555639 πέφτει σε ένα εξαιρετικά μικρό μπλοκ Ν.Δ., με την κακή συσχετίσεις με τις γειτονικές SNPs. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί δεν υπάρχουν άλλα SNPs στον πίνακα tagging ελέγξαμε συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με τον κίνδυνο της νόσου (Εικ. 2). Για τον ίδιο λόγο, rs2555639 θα ήταν απίθανο να έχουν ανιχνευθεί σε προηγούμενες μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος-ευρεία (GWAS) που επικαλείται επιλογές των πλαισίων των ετικετών SNPs, και δεν βρήκε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση στην περιοχή 15-PGDH [22] , [23], [24].

LD οικόπεδο όλων των SNPs που επιλέγονται για αναπαραγωγή σε όλα τα Καυκάσου δείγματα. Αξιών εντός κουτιά είναι συσχετίσεις (R

2).

Η

Επίσης, προηγούμενες μελέτες υποψήφιο γονίδιο της ένωσης του 15-PGDH SNPs με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου, επίσης, απέτυχε να ανιχνεύσει rs2555639. Αυτές οι προηγούμενες μελέτες εντοπίστηκαν δύο SNPs σε PGDH – rs2612656 και rs8752 – ως ατομικά δείχνουν σημαντική συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου [25]. Ωστόσο, ούτε επαναλήφθηκε σε μια μελέτη επικύρωσης [26]. Αμφότερες αυτές οι δύο προηγούμενες μελέτες περιορισμένη είναι η περιοχή που εξετάστηκαν είτε το σώμα του γονιδίου 15-PGDH ή μόνο 5 kb πλευρικού γονιδιωματικής αλληλουχίας [25], [26]. Έτσι, καμία από αυτές τις μελέτες θα έχουν εντοπιστεί με τη σύνδεση των rs2555639 με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια άλλη προγενέστερη μελέτη αξιολόγησε τη σύνδεση των δύο μόνο μη συνώνυμες κωδικοποίησης SNPs σε 15 PGDH με κίνδυνο αδενώματος του παχέος εντέρου [27]. Εμείς δεν αξιολόγησε τη σύνδεση αυτών των SNPs με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου στη μελέτη μας, λόγω της χαμηλής ανηλίκου συχνότητες αλληλόμορφο τους (3% και 1%, αντίστοιχα).

Ένας περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι εμείς αξιολογούνται μόνο η ένωση των 15 PGDH τόπου SNPs με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου μεταξύ των ατόμων αυτο-αναφοράς όπως του Καυκάσου, οι οποίοι είναι κατά κύριο λόγο των ευρωπαϊκών καταγωγή. Έτσι δεν είμαστε σε θέση να αξιολογήσει αν η σχέση του rs2555639 τόσο με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου και έκφραση 15-PGDH κατέχει σε άλλες φυλετικές ομάδες. Επιπλέον, αποκλείσαμε SNPs με έναν ελάσσονα συχνότητα αλληλίου κάτω από 5%. Αυτό, σε συνδυασμό με το σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος ανακάλυψή μας, μπορεί να έχουν περιορισμένη ικανότητά μας να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε ένωση είτε σπάνιο 15-PGDH παραλλαγών ή σε πιο κοινές παραλλαγές με πολύ χαμηλά αποτελέσματα. Ένας άλλος πιθανός περιορισμός είναι ότι και οι δύο δείγματα μας το στάδιο 1 και το στάδιο 3 αντλήθηκαν από το κράτος του πληθυσμού Κεντάκι. Επικύρωση των αποτελεσμάτων μας σε άλλες ανεξάρτητες, μη-από το Kentucky πληθυσμοί έτσι δικαιολογημένη.

Ο σημαντικός ρόλος της COX-2 και την οδό του αραχιδονικού οξέος στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι καλά εδραιωμένη, όπως είναι ο ρόλος της 15ης -PGDH ως μεταβολικό καταστολέα του μονοπατιού της COX-2 και ένα γονίδιο καταστολέα καρκίνου του παχέος εντέρου [4], [5]. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε δείξει αποδείξεις για κληρονομικές παραλλαγές στο γονίδιο 15-PGDH σε δυνητικά ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης 15-PGDH στο κόλον, καθώς προσδίδει ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Έχουμε εντοπίσει μια ενιαία SNP, rs2555639, 17.74 kb ανοδικά της 5 ‘UTR του γονιδίου 15-PGDH, η οποία συνδέεται τόσο με χαμηλότερη κολονικής έκφραση 15-PGDH και με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτή η μελέτη δείχνει το πλεονέκτημα να συνδυάζει τις δοκιμές του συνεταιρίζεσθαι SNP με την έκφραση ιστού 15-PGDH και με κίνδυνο της νόσου, όπως αυτή συνδυασμένη προσέγγιση μας επέτρεψε να εντοπίσει το 15-PGDH αλληλόμορφο rs2555639 Τ ως εν δυνάμει λειτουργική και νέα παραλλαγή ευαισθησίας στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε ένα μελέτη 3 σταδίων, παρά τις μέτριες μεγέθη των δειγμάτων και των δύο συνόλων περίπτωση ελέγχου ανακάλυψη και την αντιγραφή. Θα επισημάνω ότι χρησιμοποιήθηκε α = 0.05 ως το cut-off για να δηλώσουν τη σημασία αντιγραφή στη φάση της επικύρωσης, χωρίς περαιτέρω προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές. Παρά το γεγονός ότι επιλέγονται οι SNPs επικύρωσης βασίστηκαν στο συνδυασμένο στοιχεία από τα στάδια 1 και 2 για τη σχέση τους τόσο με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου και της έκφρασης ιστού 15-PGDH, προσοχή πρέπει να λαμβάνεται σε ερμηνεία των αποτελεσμάτων αντιγραφής μας. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας θα πρέπει να ενθαρρύνει περαιτέρω μελέτες για την επικύρωση της παραλλαγής rs25556399 ως προδιαθέτουν σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε άλλους ανεξάρτητους πληθυσμούς, καθώς και για τη διερεύνηση άλλες παραλλαγές SNP στον τόπο 15-PGDH στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

πίνακα S1.

Πλήρης SNP-Colon Αντικαρκινικό Σύνδεσμο Αποτελέσματα στο Discovery πληθυσμού. Διανομής (Ν (%)) της ομόζυγη μεγάλων αλληλόμορφο, ετερόζυγα και ομόζυγα έλασσον αλληλόμορφο, ή από ομόζυγη κινδύνου (που ορίζεται ως πιο συχνή σε περιπτώσεις σε σύγκριση με τους μάρτυρες) εναντίον ομόζυγη αναφορά

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0064122.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

πλήρη αποτελέσματα SNP-έκφραση σε δείγματα ιστών Πληθυσμός

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064122.s002

(DOCX)