Αφηρημένο

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) για την απόκτηση προ-φλεγμονώδη φαινότυπο. Ωστόσο, ο ρόλος των MSCs ενεργοποιημένων από μακροφάγα σε γαστρικό καρκίνο παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι MSCs ενεργοποιήθηκαν από τα μακροφάγα να παράγουν αυξημένα επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών. σχηματισμός αποικιών κυττάρων και δοκιμασίες μετανάστευσης transwell αποκάλυψε ότι υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSCs θα μπορούσε να προωθήσει τόσο γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων γαστρικού και τη μετανάστευση. Επιπλέον, η έκφραση του επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης (ΕΜΤ), την αγγειογένεση, και τα γονίδια βλαστική ικανότητα σχετίζονται αυξήθηκε σε ενεργοποιημένα MSC. Οι φωσφορυλιωμένες μορφές του ΝΡ-κΒ, ERK και STAT3 σε γαστρικά κύτταρα αυξήθηκαν κατά ενεργό MSC. Η αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ με PDTC μπλοκάρει την επίδραση των ενεργοποιημένων MSCs στη γαστρική καρκινικά κύτταρα. Συν-έγχυση ενεργού MSCs με γαστρικό καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να επιταχύνει την ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου. Επιπλέον, τα ανθρώπινα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος που προέρχεται μακροφάγα ενεργοποιούνται επίσης MSCs να παρακινήσει γαστρικού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι MSCs που ενεργοποιείται από τα μακροφάγα αποκτούν προφλεγμονώδεις φαινότυπο και έγκαιρη γαστρικό ανάπτυξη καρκίνου σε ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο παρέχει νέα στοιχεία για τη διαμόρφωση των MSCs από μικροπεριβάλλον του όγκου και περαιτέρω διορατικότητα στο ρόλο του στρωματικών κύτταρα σε γαστρική καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου

Παράθεση:. Yang Τ, Ζανγκ Χ, Wang Μ, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) Η ενεργοποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από μακροφάγα Ζητά ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου μέσω Growth ΝΡ-κΒ Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 18 Φεβ 2014? Αποδεκτές: 21 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το μεγάλο σχέδιο Ερευνών του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 91129718), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant αρ. 81302119, 81201660, 81071421), στην επαρχία Jiangsu για τη σημαντική Sci-tech ομάδα καινοτομία στην κολέγια και πανεπιστήμια (Grant όχι. SJK2013-10), του έργου της επαρχίας Jiangsu της Επιστημονικής και Τεχνολογικής Καινοτομίας και Επιτεύγματα Μετασχηματισμού (Grant no.BL2012055), της επαρχίας Jiangsu Εξαιρετική Ιατρική Ακαδημαϊκή Leader και Sci-tech καινοτομία του Προγράμματος ομάδας (Grant no.LJ201117), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), Διδακτορική Ίδρυμα Πρόγραμμα του κράτους Υπουργείο Παιδείας (Grant όχι. 20113227110011), στην επαρχία Jiangsu για το Φυσικό Scicence έρευνα σε κολλέγια και πανεπιστήμια (13KJB320001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μια από τις πιο συχνά εμφανιζόμενες κακοήθειες και διατηρεί μια σημαντική αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Στην Κίνα, υπάρχουν περίπου 360.000 άτομα πεθαίνουν από καρκίνο του στομάχου κάθε χρόνο [3]. Αν και η συχνότητα έχει μειωθεί τα τελευταία χρόνια στη Δύση, η επιβίωση είναι ακόμα χειρότερα [4]. Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, μεγάλη προσπάθεια έχει ασκείται για τη διαλεύκανση της παθογένειας του καρκίνου του στομάχου. Ωστόσο, ο πολύπλοκος μηχανισμός της γαστρικής καρκινογένεσης δεν έχουν ακόμη καλυφθεί. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η μακροπρόθεσμη χρόνια φλεγμονή είναι μία από τις κύριες αιτίες της ογκογένεσης. Απελευθέρωση των προ-φλεγμονωδών μεσολαβητών και αυξημένη τοπική επίπεδα ειδών οξυγόνου και αζώτου μπορούν να συνεισφέρουν σε καρκινογένεση [5]. Η απορρυθμισμένη παραγωγή κυτοκινών σε φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον διεγείρει την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου και τροποποιεί τα δομικά χαρακτηριστικά του μικροπεριβάλλοντος για την επιτάχυνση έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου [6] – [9].

μικροπεριβάλλον του όγκου αποτελείται από διάφορα στρωματικά κύτταρα , συμπεριλαμβανομένων διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ινοβλάστες καρκίνωμα που συνδέεται (CAFS), μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs), και το αίμα και του λεμφικού αγγειακών δικτύων. Αυτά τα κύτταρα αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και αποτελούν φλεγμονώδεις μικροπεριβάλλον και να συμβάλλουν στην ογκογένεση [10], [11]. Μεταξύ των στρωματικά κύτταρα, μακροφάγα, ως σημαντικά ανοσοποιητικού ρυθμιστικά κύτταρα, παίζουν κυρίαρχο ρόλο στη διαχείριση της φλεγμονής σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Για παράδειγμα, τα μακροφάγα που απομονώνονται από μικροπεριβάλλον του όγκου των ασθενών με καρκίνο του μαστού μυστικό χημειοτακτικές κυτοκίνες για να αυξήσει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [12]. Τα μακροφάγα έχουν επίσης δειχθεί ότι προάγει φλεγμονώδη απόκριση και ογκογένεση μέσω επιδρούν στην έκφραση φλεγμονωδών κυτοκινών και την αλλαγή των μοριακών ογκογόνο προγραμμάτων εντός των επιθηλιακών κυττάρων [13].

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) είναι ένα άλλο σημαντικό συστατικό του όγκου μικροπεριβάλλον και θεωρούνται ως τα πρόδρομα κύτταρα του καρκίνου που συνδέεται μεσεγχυματικών κυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων [14]. Οι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι MSCs μυστικό διαλυτών παραγόντων για την προαγωγή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [10]. Σε ένα μοντέλο γαστρικού καρκίνου που σχετίζεται με φλεγμονή, MSCs θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί προς CAFS να αυξήσει χρόνια φλεγμονή και την πρόοδο του καρκίνου [15]. Περαιτέρω, MSCs έχουν αναφερθεί για την πρόσληψη των μονοκυττάρων /μακροφάγων για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου σε ένα CCR2 εξαρτώμενου τρόπο [16]. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ μακροφάγων και MSCs παραγωγή ενός ενεργοποιημένου, προ-φλεγμονώδη φαινότυπο με υψηλή CXCL10 και έκκριση IL-6, που μπορούν να επηρεάσουν την φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον [17].

γαστρικό καρκίνο είναι ένα κλασικό μοντέλο χρόνιας φλεγμονής στον καρκίνο. Ωστόσο, ο ρόλος των MSCs ενεργοποιούνται από μακροφάγα σε καρκίνο του στομάχου και του υποκείμενου μηχανισμού είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι MSCs έντονα ενεργοποιείται από τα μακροφάγα υπό φλεγμονώδους κατάστασης, για να παράγουν φλεγμονώδεις κυτοκίνες και παράγοντες προαγωγής όγκων, με αποτέλεσμα την αύξηση της γαστρικής επιθηλιακών κυττάρων και του καρκίνου κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση μέσω της ενεργοποίησης του NF-κΒ οδό. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούνται MSCs προώθηση του γαστρικού καρκίνου ανάπτυξης και εξέλιξης του φλεγμονώδη κατάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή HGC-27, ανθρώπινου γαστρικού επιθηλίου κυτταρική σειρά GES-1, και την ανθρώπινη οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία γραμμή ΤΗΡ-1 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και κυτταρικής Βιολογίας στο κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). GES-1 και ΤΗΡ-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Invitrogen), και τα κύτταρα HGC-27 διατηρήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ (H -DMEM, Invitrogen) με 10% FBS. MSCs προήλθαν από τον ομφάλιο λώρο και καλλιεργήθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ (L-DMEM, Invitrogen) με 10% FBS. Τα κύτταρα όλα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστήρα κυτταρικής καλλιέργειας με 5% CO

2. Τα φρέσκα ιστούς του ομφάλιου λώρου συλλέχθηκαν από υγιείς επιλόχεια μητέρες μετά λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. MSCs απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [18]. Όλα τα πρωτόκολλα πείραμα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Jiangsu. MSCs στο πέρασμα 3 επιλέχθηκαν για τα πειράματα.

Το υπερκείμενο Προετοιμασία

Για την προετοιμασία των συνδεδεμένων μακροφάγων υπερκείμενο MSCs, MSCs (3 × 10

5) σπάρθηκαν να τηρούν. Τα κύτταρα ΤΗΡ-1 (1:01 αναλογία) προστέθηκαν με φρέσκο ​​μέσο παρουσία ή απουσία LPS (1 μg /ml). Μετά την συν-καλλιέργεια για 48 ώρες, το μέσο απορρίφθηκε και τα κύτταρα πλένονται απαλά με PBS για την απομάκρυνση των κυττάρων ΤΗΡ-1. Τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα, διηθείται με ένα 0.22-um φίλτρου και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Όταν χρησιμοποιείται για αναλύσεις κυτταρικής λειτουργίας, τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs αναμίχθηκαν με ίσο όγκο 10% FBS που περιέχει Η-DMEM ή RPMI-1640. Για μονοπάτι σηματοδότησης αναλύσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs για 1 ώρα

Luminex Δοκιμασία

Ανθρώπινο κυτοκίνη & amp.? χημειοκίνης μαγνητικό σφαιρίδιο κιτ πάνελ (# HCYTOMAG-60Κ) (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) σχεδιάστηκε για να ανιχνεύει διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων (G-CSF), προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα-ΒΒ (PDGF-ΒΒ), μονοκυττάρων χημειοελκτική πρωτεΐνης- 1 (MCP-1), παράγοντα νέκρωσης όγκου-α (TNF-α), του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 και IL-8 στο υπερκείμενο από ενεργοποιημένα MSCs. Όλες οι διαδικασίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα σήματα ανιχνεύθηκαν και αναλύθηκαν με τη χρήση Luminex200 System (Millipore).

Transwell Μετανάστευση Δοκιμασία

Μετά την κατεργασία με τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs για 48 ώρες, GES-1 και HGC-27 κύτταρα ( 1 × 10

5 /φρεάτιο) τέθηκαν σε άνω θάλαμο (8 μm) (Corning, ΝΥ, USA) σε μέσο χωρίς ορό. Το πλήρες μέσο τοποθετήθηκε εντός του κατώτερου θαλάμου. Μετά από επώαση για 12 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στον πυθμένα της μεμβράνης πολυανθρακικού είχαν σκουπιστεί με μπατονέτες. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν προς την κατώτερη επιφάνεια της μεμβράνης κατόπιν σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά. Τα μεταναστεύσει κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά και μετρήθηκαν σε έξι τυχαία πεδία κάτω από το μικροσκόπιο (100 Χ).

Κυττάρου Σχηματισμού Αποικίας Δοκιμασία

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή με τα υπερκείμενα από MSCs για 48 ώρες και σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες. Στο τέλος της περιόδου ανάπτυξης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά. Οι αποικίες κυττάρων φωτογραφήθηκαν και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε για στατιστική ανάλυση.

RNA Εκχύλιση και Real-time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Πέντε μικρογραμμάρια RNA χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Οι αλληλουχίες των ειδικών εκκινητών ήταν όλα παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν και ομογενοποιήθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό συμπληρωμένο με πλήρη αναστολείς πρωτεάσης. Ίση ποσότητα πρωτεϊνών (200 μg) λύθηκε σε 12% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε PVDF μεμβράνες μετά από ηλεκτροφόρηση. Μετά μπλοκαριστεί σε 5% (w /v) μη λιπαρό γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν στους αντίστοιχους κατάλληλα τους αραιώσεις ειδικών πρωτογενών αντισωμάτων επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι πηγές των πρωτογενών αντισωμάτων ήταν: αντι-Oct4, αντι-Sox2, αντι-βιμεντίνης και αντι-φωσφο-STAT3 (Signalway Antibody, USA), αντι-GAPDH (Kangcheng, Σαγκάη, Κίνα), αντι-Ε-καδερίνης, αντι- ERK1 /2, αντι- φωσφο-ERK1 /2 και αντι-Ν-καντερίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντι-ΡΟΝΑ, αντι-STAT3, αντι-ΝΡ-κΒ, αντι-φωσφο-ΝΡ κΒ, αντι-CyclinD1, αντι-VEGF και αντι-C-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, ΜΝ, USA), αντι-C-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, USA).

Animal μοντέλο

Τρεις έως πέντε εβδομάδων ποντικούς BALB /c nude αγοράστηκαν από Slac Εργαστήριο Κέντρο ζώων (Σαγκάη, Κίνα). Τα ζώα συντηρούνται σύμφωνα με τις θεσμικές πολιτικές, καθώς και όλες οι μελέτες έγιναν με την έγκριση του Πανεπιστημίου Επιτροπής Χρήση και φροντίδα των ζώων του Πανεπιστημίου Jiangsu. HGC-27 κύτταρα (1 χ 10

6) και MSCs (5 × 10

5) θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ PBS, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναμείχθηκαν και συν-εγχέεται αριστερό πλευρό γυμνών ποντικών του. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά 20 ημέρες μετά την ένεση, φωτογραφήθηκαν και σταθμίζονται. Το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε με μέτρηση με παχύμετρο και υπολογίστηκαν με βάση το τροποποιημένο ελλειψοειδές τύπου (L Χ W Χ W /2), όπου L παριστάνει το μήκος, και το W αντιπροσωπεύει το πλάτος.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη τομές ιστών όγκου ποντικού σταθερό εγκλεισμένες σε παραφίνη αποπαραφινοποιήθηκαν πρώτα σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αιθανόλης. Οι τομές βρασμένο για 10 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού (ρΗ 6.0, 10 mM) για ανάκτηση αντιγόνου. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης ανεστάλη με την έκθεση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές δεσμεύτηκαν με 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, Κίνα) και επωάζονται με την κατάλληλη αραιωμένο PCNA ή VEGF πρωτογενές αντίσωμα στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά πλύση με PBS, οι τομές επωάστηκαν στη συνέχεια με αραιό δευτερογενές αντίσωμα για 20 λεπτά. Τέλος, τα τμήματα οπτικοποιήθηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) και στη συνέχεια με αιματοξυλίνη για εξέταση με οπτικό μικροσκόπιο (200 Χ).

πρωτογενή ανθρώπινα μονοκύτταρα Απομόνωση

Ανθρώπινα μονοκύτταρα λήφθηκαν από φλεγμονώδη πλακούντα δειγμάτων περιφερικού αίματος δωρεά από υγιή δότη χρησιμοποιώντας Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Φρέσκα RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS αλλάχθηκαν κάθε 2 ημέρες, και τα μη-προσκολλημένα κύτταρα αφαιρέθηκαν και καθαρίζεται. Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν για 7 ημέρες και 50 ng /ml M-CSF προστέθηκε για να ληφθεί μακροφάγα (Μ). Στη συνέχεια, το υπερκείμενο 24 ώρες εκκρίνεται από τα μακροφάγα συλλέχθηκε και διηθήθηκε. Τα προσκολλημένα MSCs υποβλήθηκαν σε αγωγή με το υπερκείμενο των μακροφάγων απουσία ή παρουσία LPS (1 μg /ml) για 48 ώρες και πλένονται. Τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα και χρησιμοποιήθηκαν για ακόλουθες μελέτες.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS Statistics λογισμικό 16,0. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές στις διαφορετικές ομάδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Οι διαφορές μεταξύ των PDTC θεραπείες ελέγχθηκαν από

t

τεστ. Στατιστική

P

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

Αποτελέσματα

Συγκαλλιέργεια με μακροφάγα Σύμφωνα με φλεγμονώδη κατάσταση Up-ρυθμίζεται η έκφραση φλεγμονωδών κυτταροκινών και βλαστική ικανότητα Γονίδια μέσα. MSCs

για να διερευνηθεί η επίδραση των μακροφάγων επί MSCs κάτω από φλεγμονώδη κατάσταση, έχουμε συν-καλλιεργημένα MSCs με κύτταρα ΤΗΡ-1 σε απουσία ή παρουσία LPS (1 μg /ml) για 48 ώρες. κύτταρα ΤΗΡ-1 απομακρύνθηκαν με PBS έκπλυση και τα προσκολλημένα MSCs καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για επιπλέον 24 ώρες (Σχήμα S1). δοκιμασία Luminex διεξήχθη για να προσδιορίσει τα επίπεδα αρκετών φλεγμονωδών παραγόντων στα υπερκείμενα από MSCs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή της IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF και G-CSF ήταν σημαντικά αυξημένη στο υπερκείμενο από MSCs συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα ΤΗΡ-1 παρουσία του LPS. Χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα αυτών των κυτοκινών παρατηρήθηκαν σε MSCs που δεν ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ-1 κύτταρα (Σχήμα 1Α). Για να επιβεβαιωθεί η αυξημένη έκφραση αυτών των φλεγμονωδών κυτοκινών, εμείς προσχηματισμένο πραγματικού χρόνου PCR για την ανίχνευση των επιπέδων mRNA αυτών των κυτοκινών. Βρήκαμε ότι σε σύμφωνο με τα αποτελέσματα προσδιορισμού Luminex (Εικόνα 1Β), συν-καλλιέργεια με κύτταρα ΤΗΡ-1 ρυθμίζεται προς τα πάνω τα επίπεδα του mRNA της IL-6, IL-8, και ΤΝΡ-α σε MSCs. Για να καθοριστεί εάν συν-καλλιέργεια με κύτταρα ΤΗΡ-1 επηρεάζει την βλαστική ικανότητα των MSC, ανιχνεύσαμε την έκφραση του Oct4 και Sox2 σε MSCs χρησιμοποιώντας Western blot. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο Oct4 και τα επίπεδα πρωτεΐνης Sox2 αυξήθηκαν σε MSCs που ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ-1 κύτταρα (Σχήμα 1 C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το φαινόμενο αυτό, εξετάσαμε επίσης τα επίπεδα mRNA των Oct4 και Sox2 στο MSC. Τα αποτελέσματα της PCR πραγματικού χρόνου έδειξαν ότι συν-καλλιέργεια με κύτταρα ΤΗΡ-1 τα επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του Oct4 και Sox2 γονίδια στα MSCs (Σχήμα 1 D). Σε γενικές γραμμές, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι MSCs σημαντικά ενεργοποιούνται για να παράγουν υψηλότερα επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών από συν-καλλιεργημένα κύτταρα ΤΗΡ-1 κάτω από φλεγμονώδη κατάσταση.

(Α) Luminex δοκιμασία για IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF και G-CSF επίπεδα στα υπερκείμενα από MSCs. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις της IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF και της έκφρασης του mRNA του ΤΟΡ-β σε MSCs. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (C) κηλίδα Western αναλύσεις των επιπέδων της πρωτεΐνης Oct4 και Sox2 σε MSCs. (D) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις της έκφρασης Oct4 και Sox2 mRNA σε στρωματικά κύτταρα μυελού. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

Macrophages- ενεργοποιείται MSCs Ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των γαστρικού επιθηλίου κύτταρα

τα μακροφάγα και τα MSCs είναι σημαντικά συστατικά της μικροπεριβάλλον του όγκου. Για την απόδειξη των λειτουργικών ρόλων των μακροφάγων που ενεργοποιούνται MSCs, συλλέξαμε τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs και επωάζονται με γαστρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή GES-1 για 48 ώρες. Στη συνέχεια εκτελείται δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των κυττάρων για να αξιολογηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων GES-1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τα κύτταρα επωάζονται με το υπερκείμενο από ενεργοποιημένα MSCs αναπτύχθηκε ταχύτερα και σχηματίζονται όλο και μεγαλύτερες αποικίες από εκείνες τις άλλες ομάδες. Επιπλέον, η επώαση με το υπερκείμενο από ενεργοποιημένα MSCs αύξησε επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης του PCNA και VEGF σε GES-1 κύτταρα (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα του Transwell δοκιμασία μετανάστευσης έδειξε ότι ο αριθμός των μετανάστευσαν GES-1 κύτταρα σε ενεργοποιημένα MSCs συν ομάδα LPS ήταν περισσότερο από ότι σε άλλες ομάδες (Σχήμα 2C). Τα αποτελέσματα της κηλίδας Western αναλύσεις έδειξαν ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούμενη MSCs αύξησε την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων (Ν-καντερίνης και βιμεντίνης) και μείωσε την έκφραση των επιθηλιακών κυττάρων σημειωτή (Ε-καδερίνης) σε GES-1 κύτταρα (Σχήμα 2D). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε την έκφραση του VEGF, ΜΜΡ9 και ΤΟΡ-β με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, επώαση με το υπερκείμενο από activate MSCs συν ομάδα LPS επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του VEGF, ΜΜΡ9 και ΤΟΡ-β σε κύτταρα GES-1. Έτσι, MSCs που ενεργοποιείται από τα μακροφάγα σε φλεγμονώδεις περιβάλλον προώθησε σημαντικά τη γαστρική πολλαπλασιασμό επιθήλια των κυττάρων και τη μετανάστευση.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες της δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας των κυττάρων και ιστόγραμμα του αριθμού των αποικιών. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD από τρία φρεάτια. **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (Β) δοκιμασίες κηλίδος Western για PCNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του δοκιμασία μετανάστευσης transwell και ιστόγραμμα του αριθμού των μετανάστευσαν GES-1 κύτταρα. Μεγέθυνση, × 100, γραμμή κλίμακας = 50 μm. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (D) δοκιμασίες κηλίδος Western για Ε-καδερίνης, Ν-καδερίνης και τα επίπεδα πρωτεΐνης βιμεντίνης. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις VEGF, ΜΜΡ9 και η έκφραση του mRNA του ΤΟΡ-β. **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

Τα μακροφάγα ενεργοποιούνται MSCs Προώθησε την ανάπτυξη και την μετανάστευση των γαστρικά κύτταρα καρκίνου

Δεδομένου ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούνται-MSCs επηρεάζουν γαστρικού επιθηλίου τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, έχουμε την επόμενη προσδιορίζεται η επίδραση των μακροφάγων που ενεργοποιούνται MSCs στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου HGC-27 κύτταρα. Τα αποτελέσματα του ποσοτικού προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας κυττάρων έδειξε ότι HGC-27 κύτταρα επωάζονται με το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs αναπτύχθηκε ταχύτερα και σχηματίζεται μεγαλύτερα κλώνοι από τις άλλες ομάδες (Σχήμα 3Α). αναλύσεις Western μπουλόνι έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης του PCNA και VEGF σε HGC-27 κύτταρα ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs (Σχήμα 3Β). δοκιμασία μετανάστευσης Transwell αποκάλυψε ότι ο αριθμός των μετανάστευσαν HGC-27 κύτταρα ήταν εντυπωσιακά αυξάνεται κατά το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs (Σχήμα 3C). Οι αναλύσεις στυπώματος Western έδειξε ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούμενη MSCs προκάλεσε την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων (Ν-καντερίνης και βιμεντίνης) και ανέστειλε την έκφραση των επιθηλιακών κυττάρων σημειωτή (Ε-καδερίνης) σε HGC-27 κύτταρα (Σχήμα 3D). Τα επίπεδα mRNA του VEGF, ΜΜΡ9 και ΤΟΡ-β ήταν επίσης αυξημένη σε HGC-27 κυττάρων μετά την επεξεργασία με το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs (Σχήμα 3Ε). Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο καρκίνος των κυττάρων βλαστική ικανότητα είναι στενά συνδεδεμένη με τη μετανάστευσή τους, ανιχνεύσαμε την έκφραση των γονιδίων βλαστική ικανότητα σε HGC-27 κύτταρα. Η έκφραση του Oct4 και Sox2 ήταν κυρίως up-ρυθμίζεται από το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs (Σχήμα 3F). Στο σύμφωνο με την πραγματικού χρόνου PCR, τα επίπεδα πρωτεΐνης του Oct4 και Sox2 ήταν επίσης αυξημένη σε HGC-27 κύτταρα με το υπερκείμενο από τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs (Σχήμα 3G). Εν συντομία, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούμενη MSCs προωθείται επίσης γαστρικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση μέσω της επαγωγής ΕΜΤ και κυτταρικών βλαστική ικανότητα υπό φλεγμονώδους κατάστασης.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ποσοτικού προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας κυττάρου και ιστόγραμμα του αριθμός αποικιών. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD από τρία φρεάτια. *

P

& lt? 0,05. (Β) δοκιμασίες κηλίδος Western για PCNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του Transwell δοκιμασία μετανάστευσης και ιστόγραμμα του αριθμού των μετανάστευσαν HGC-27 κύτταρα. Μεγέθυνση, × 100? γραμμή κλίμακας = 50 μm. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01. (D) δοκιμασίες κηλίδος Western για Ε-καδερίνης, Ν-καδερίνης και τα επίπεδα πρωτεΐνης βιμεντίνης. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις VEGF, ΜΜΡ9 και η έκφραση του mRNA του ΤΟΡ-β. ***

P

& lt? 0.001, *

P

& lt? 0,05. (F) ανάλυση Western blot για τα επίπεδα της πρωτεΐνης Oct4 και Sox2 σε HGC-27 κύτταρα. (G) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις της έκφρασης Oct4 και Sox2 mRNA. **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

Τα μακροφάγα ενεργοποιούνται MSCs Προωθείται Διάδοσης γαστρική τηλέφωνα και μετανάστευσης μέσω NF-κΒ Pathway

για να διερευνήσουν τον μηχανισμό υπεύθυνο για την προώθηση του ρόλου των μακροφάγων που ενεργοποιούνται MSCs στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, προσδιορίσαμε την έκφραση αρκετών βασικών μετατροπείς σηματοδότησης για τη φλεγμονή και τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των STAT3, ERK και NF-κΒ, σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα και γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Τα αποτελέσματα της κηλίδας Western αναλύσεις έδειξαν ότι τα επίπεδα του p-STAT3, ρ-ERK και ρ-ΝΡ-κΒ ήταν σημαντικά υψηλότερα σε GES-1 κύτταρα επεξεργασμένα με τα υπερκείμενα από ενεργοποιημένα MSCs από εκείνες τις άλλες ομάδες. Το επίπεδο πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ δεν είχε καμία αλλαγή, ενώ εκείνη της ERK και STAT3 μειώθηκε ελαφρά (Εικόνα 4Α). Οι αυξήσεις σε ρ-STAT3, ρ-ERK και τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ΝΡ-κΒ παρατηρήθηκαν επίσης σε HGC-27 κύτταρα μετά από κατεργασία με τα υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSCs (Σχήμα 4Β). Επιβεβαιώσαμε την αυξητική ρύθμιση του π-STAT3, ρ-ERK και τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ΝΡ-κΒ από τα υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSCs σε άλλο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901 (Εικόνα S2). Για να καθοριστεί εάν οι μεταγενέστεροι γονίδια στόχοι ενεργοποιείται επίσης σε HGC-27 κύτταρα, εξετάσαμε την έκφραση της κυκλίνης D1, C-myc και πρωτεϊνών C-Ιούνιος Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 και C-Jun ήταν αυξημένα μετά από αγωγή με τα υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSC.

(Α) GES-1 και (Β) HGC-27 κύτταρα κατεργασμένα με τα υπερκείμενα για ενεργού MSC. Η έκφραση του ρ-STAT3, STAT3, ρ-ΕΚΚ, ERK, ρ-ΝΡ-κΒ, και ΝΡ-κΒ πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν με χρήση στυπώματος Western. (Γ) δοκιμασίες Western blot για την κυκλίνη D1, C-myc, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-Jun σε HGC-27 κύτταρα. (D) δοκιμασίες κηλίδας Western για ρ-ΝΡ-κΒ και τα επίπεδα πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ σε HGC-27 κύτταρα τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSCs σε παρουσία ή απουσία PDTC (100 ηΜ). Ο αριθμός των αποικιών των κυττάρων (Ε) και μετανάστευσαν κύτταρα (F) για HGC-27 κύτταρα κατεργασμένα με διαφορετικά MSCs υπερκείμενα παρουσία ή απουσία PDTC (100 ηΜ). (G) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις VEGF, ΜΜΡ9, και η έκφραση του mRNA του ΤΟΡ-β σε HGC-27 κύτταρα κατεργασμένα με διαφορετικά MSCs υπερκείμενα παρουσία ή απουσία PDTC (100 ηΜ). **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

Για το μέλλον προσδιοριστεί αν NF-κΒ παίζει σημαντικό ρόλο στις λειτουργίες των ενεργοποιημένων MSCs, HGC-27 κύτταρα προ-αγωγή με PDTC να αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του NF-κΒ και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSC. Βρήκαμε ότι η επαγωγή της φωσφορυλίωσης του ΝΡ-κΒ από ενεργοποιημένα MSCs σε HGC-27 κύτταρα ανεστάλη έντονα με PDTC (Εικόνα 4D). Τα αποτελέσματα του σχηματισμού αποικίας κυττάρου και δοκιμασίες μετανάστευσης transwell έδειξαν ότι η ενισχυμένη πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των HGC-27 κύτταρα από τα ενεργοποιημένα MSCs μειώθηκαν σημαντικά σε ομάδες PDTC-αγωγή (Σχήματα 4Ε και 4F). Επιπλέον, PDTC θεραπεία επίσης ανέστειλε την ανιούσα ρύθμιση των VEGF, ΜΜΡ9 και ΤΟΡ-β από ενεργοποιημένα MSCs σε HGC-27 κύτταρα (Σχήμα 4G). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα ενεργοποιημένα MSCs γραμμή γαστρικού επιθηλιακών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων γαστρικού καρκίνου και μετανάστευσης μέσω NF-κΒ.

Τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs που προωθούνται Γαστρικό ανάπτυξη του καρκίνου in vivo

Λόγω του αποδεικτικά στοιχεία ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούνται MSCs θα μπορούσε να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών κυττάρων

in vitro

, αναρωτηθήκαμε εάν αυτά τα MSCs που ασκείται προώθηση ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του γαστρικού

in vivo

. Έτσι, συν-εγχέεται HGC-27 κυττάρων με τα ενεργοποιημένα MSCs σε γυμνά ποντίκια. Είκοσι ημέρες αργότερα, ιστούς όγκων αφαιρέθηκαν, μετρήθηκαν και σταθμίζονται. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α και 5Β, οι όγκοι ξενομοσχεύματος σε ομάδα ενεργοποιημένου MSCs συν-ενέθηκαν ήταν μεγαλύτερες από εκείνες των άλλων ομάδων. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ανάπτυξη και προ-αγγειογόνοι παράγοντες σε ιστούς όγκων. Όσο ισχυρότερη θετική χρώση PCNA και VEGF παρατηρήθηκε στην ομάδα MSCs συν-εγχυθεί ενεργοποιημένα (Σχήμα 5C). Real-time PCR αναλύσεις διεξήχθησαν για την ανίχνευση της έκφρασης του VEGF, ΜΜΡ9 και ΤΟΡ-β σε ιστούς όγκων. Βρήκαμε ότι η έκφραση όλων αυτών των γονιδίων σε συν-εγχυθεί ομάδες ήταν υψηλότερη από ότι σε HGC-27 κύτταρα μόνο ομάδα (Σχήμα 5D). Τα αποτελέσματα της πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις έδειξαν ότι τα επίπεδα του mRNA της Oct4, Sox2 και Sall4 ήταν η υψηλότερη στην ομάδα MSCs συν-ένεση ενεργοποιημένη (Σχήμα 5Ε). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούμενη MSCs έγκαιρη ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου

in vivo

.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των ιστών ξενομοσχεύματος όγκου και (β) ο όγκος και το βάρος του όγκου ιστοί που αφαιρούνται από ποντικούς που ενέθηκαν με HGC-27 κύτταρα μόνο ή μαζί με MSCs. (Γ) ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των επιπέδων PCNA και πρωτεΐνη VEGF σε ιστούς όγκων. Μεγέθυνση, × 200? γραμμή κλίμακας = 50 μm. (D) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις του VEGF, ΜΜΡ9, και η έκφραση του mRNA του ΤΟΡ-β σε ιστούς όγκων. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις της έκφρασης Oct4, Sox2, και Sall4 mRNA σε ιστούς όγκων. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt?. 0.05

Η

Πρωτοβάθμια μονοκύτταρα ενεργοποιείται MSCs σε Ερώτηση του καρκίνου γαστρικό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης μέσω NF-κΒ

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ενεργοποίηση των MSCs από τα μακροφάγα να ζητήσει από τον πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκίνου των κυττάρων και τη μετανάστευση, που απομονώνονται μονοκύτταρα από ανθρώπινο περιφερικό αίμα και συλλέγεται το υπερκείμενο από μονοκύτταρα διαφοροποιούνται μακροφάγα. Μετά την επώαση με το υπερκείμενο από τα μονοκύτταρα διαφοροποιούνται μακροφάγα, MSCs συλλέχθηκαν και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε για πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, η αγωγή με το υπερκείμενο από τα μονοκύτταρα διαφοροποιούνται μακροφάγα πάνω ρυθμισμένα τα επίπεδα mRNA της IL-6, IL-8, MCP-1 και του VEGF σε MSCs. Εμείς στη συνέχεια επωάζονται γαστρικά καρκινικά κύτταρα με το υπερκείμενο από τα ενεργοποιημένα MSC. Τα αποτελέσματα του σχηματισμού αποικίας κυττάρου και δοκιμασίες μετανάστευσης transwell έδειξε ότι το υπερκείμενο από τα ενεργοποιημένα MSCs ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των HGC-27 κύτταρα (Σχήματα 6C και 6D). Δείξαμε επίσης ότι η επώαση με υπερκείμενα από τα ενεργοποιημένα MSCs αύξησε την έκφραση του ρ-STAT3, ρ-ERK και ρ-ΝΡ-κΒ σε HGC-27 κύτταρα (Σχήμα 6Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι σε σύμφωνο με τα κύτταρα ΤΗΡ-1, ανθρώπινα πρωτογενή μακροφάγα ενεργοποιούνται επίσης MSCs να παρακινήσει γαστρικού πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και μετανάστευσης μέσω NF-κΒ.

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις IL-6, IL-8, MCP-1, και VEGF mRNA έκφραση σε MSCs. ***

P

& lt? 0.001, **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες των κυττάρων αποικίες και ιστόγραμμα του αριθμού των αποικιών. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD από τρία φρεάτια. **

P

& lt? 0,01, *

P

& lt? 0,05. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του Transwell δοκιμασία μετανάστευσης και ιστόγραμμα του αριθμού των μετανάστευσαν HGC-27 κύτταρα. Μεγέθυνση, × 100? γραμμή κλίμακας = 50 μm. **

P

& lt? 0,01. (D) δοκιμασίες κηλίδος Western για ρ-STAT3, STAT3, ρ-ΕΚΚ, ERK, ρ-ΝΡ-κΒ, και NF-κΒ επίπεδα πρωτεΐνης σε HGC-27 κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, η σύνδεση της φλεγμονής στον καρκίνο έχει προσελκύσει πολλή προσοχή [5], [6]. Μακροχρόνια έκθεση των επιθηλιακών κυττάρων σε φλεγμονώδεις μικροπεριβάλλον οδηγεί σε κακοήθη εξαλλαγή [9], [19]. Τα στρωματικά κύτταρα έχουν δειχθεί να εμπλέκονται κριτικά στην εξέλιξη από φλεγμονή σε καρκίνο με ρύθμιση της φλεγμονώδους μικροπεριβάλλον [7], [8]. Τα μακροφάγα και MSCs είναι δύο βασικά συστατικά του στρώματος του όγκου και να συμμετέχει στη ρύθμιση της έκτασης της φλεγμονώδους αντίδρασης κατά την καρκινογένεση [16]. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση μεταξύ των μακροφάγων και των MSCs σε γαστρικό καρκίνο δεν έχει χαρακτηρισθεί καλά.

καρκίνο του στομάχου έχει εξελιχθεί από τη μακροπρόθεσμη χρόνια γαστρίτιδα και είναι ένα κλασικό μοντέλο του καρκίνου που σχετίζονται με φλεγμονή. Έχουμε απομονωθεί προηγουμένως MSCs κάτοικος από ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και απέδειξε ότι γαστρικό καρκίνο MSCs προέρχονται ιστού που εκκρίνεται πολλά φλεγμονωδών κυτοκινών και προωθείται γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου. Κατά τη διαδικασία της φλεγμονής, τα μονοκύτταρα /μακροφάγα μπορεί να προσληφθεί για να αποκτήσει MSCs με χαρακτηριστικά όγκου-προώθηση [16]. Επιπλέον,

Helicobacter pylori

επάγουν χρόνια φλεγμονή στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα μέσω της απελευθέρωσης των LPS που υπάρχουν στα κυτταρικά τοιχώματα του. Σε αυτή τη μελέτη, προ-επεξεργασμένα με MSCs μακροφάγα παρουσία LPS για να μιμηθεί γαστρικό μικροπεριβάλλον του καρκίνου και να προσδιορισθεί εάν τα μακροφάγα που ενεργοποιείται MSCs συμβάλλουν στην γαστρική εξέλιξης του καρκίνου. Έχουμε αποδείξει ότι MSCs επωάζονται με μακροφάγα και LPS εκκρίνονται υψηλότερα επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η συνεχής διέγερση με μακροφάγων ρυθμισμένο προκαλούμενη μέσο MSCs να αποκτήσει μια προ-φλεγμονώδη φαινότυπο [17]. Σε συνεπής με τη μελέτη τους, διαπιστώσαμε ότι σύντομο χρονικό διάστημα επώασης με μακροφάγα ενεργοποιούνται επίσης MSCs να παράγουν υψηλότερα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτοκινών.

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά-μετάβασης (EMT) είναι μια σημαντική διαδικασία κατά την μετάσταση του καρκίνου [20]. Με τα χρόνια, έχουν ιδιότητες που σχετίζονται με τον επαναπρογραμματισμό EMT έχουν αποδοθεί για την ενίσχυση της κυτταρικής πλαστικότητα σε καρκινικά κύτταρα. Καρκίνος βλαστικών κυττάρων έχει εισαχθεί και αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην ογκογένεση και μετάσταση όγκου [21] – [24]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ένας υποπληθυσμός των βλαστικών-όπως και μεσεγχυματικά κύτταρα που μοιάζουν εμφανίζεται μεγαλύτερη ογκογονικότητα σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα

in vitro και in vivo

[25]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ενεργοποιημένα MSCs, η οποία συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα, παρουσία LPS, θα μπορούσε αξιοσημείωτα να ενισχυθεί η μετανάστευση των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων καθώς και γαστρικά καρκινικά κύτταρα.