Abstract

νέκρωσης όγκου παράγοντα που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL) επάγει απόπτωση σε ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών με λίγη ή καμία επίδραση σε φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο, η επίδρασή της είναι περιορισμένη, όπως ορισμένες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος εμφάνιση καρκίνου de novo αντίσταση στην απόπτωση που επάγεται από TRAIL. Στη μελέτη αυτή αναφέρει ότι η GSK-3 αναστολή χρησιμοποιώντας τον φαρμακολογικό παράγοντα AR-18, αυξημένη ευαισθησία TRAIL σε ένα εύρος του παγκρέατος και του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές. Αυτό ευαισθητοποίηση βρέθηκε να είναι εξαρτώμενη από κασπάση, και οι δύο φαρμακολογικών και γενετικών knock-down της GSK-3 ισομορφές οδήγησε σε αποπτωτικά χαρακτηριστικά, όπως φαίνεται από τη διάσπαση της PARP και κασπάσης-3. Αυξημένα επίπεδα αντιδραστικά ενδιάμεσα οξυγόνου και διαταραχή της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών σημείο σε ένα μιτοχονδριακό βρόχο ενίσχυσης για TRAIL απόπτωση που επάγεται μετά αναστολή GSK-3. Σε συμφωνία με αυτό, η υπερέκφραση των αντι-αποπτωτικών μιτοχονδριακή στόχους όπως Bcl-XL, Mcl-1, και Bcl-2 διασώζονται PANC-1 και PPC-1 κύτταρα από TRAIL ευαισθητοποίηση. Ωστόσο, η υπερέκφραση του αναστολέα κασπάσης-8 CrmA ανέστειλε επίσης τις ευαισθητοποίηση του αναστολέα GSK-3, γεγονός που υποδηλώνει έναν επιπλέον ρόλο για GSK-3 που αναστέλλει σηματοδότηση υποδοχέα θανάτου. Οξεία θεραπεία ποντικών που φέρουν PANC-1 ξενομοσχευμάτων με ένα συνδυασμό AR-18 και TRAIL επίσης είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική αύξηση στην απόπτωση, όπως μετράται με κασπάση-3 διάσπαση. Ευαισθητοποίηση για TRAIL σημειώθηκε παρά την αύξηση της β-κατενίνης λόγω αναστολή GSK-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι η προσέγγιση μπορεί να είναι αποτελεσματική ακόμη και σε καρκίνους με απορρυθμισμένη β-κατενίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς της GSK-3 θα μπορούσε να συνδυαστεί αποτελεσματικά με TRAIL για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Mamaghani S, Simpson CD, Cao ΡΜ, Cheung Μ, Chow S, Bandarchi Β, et al. (2012) Η κινάση συνθετάσης γλυκογόνου-3 κύτταρα Αναστολή ευαισθητοποιεί καρκίνο του παγκρέατος σε TRAIL απόπτωση. PLoS ONE 7 (7): e41102. doi: 10.1371 /journal.pone.0041102

Επιμέλεια: Shawn Β Bratton, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Δεκ 2011? Αποδεκτές: 21 του Ιουνίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιουλίου, 2012

Copyright: © 2012 Mamaghani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από τον Campbell Οικογένεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Apo2L /TRAIL ήταν ένα δώρο από την Genentech, South San Francisco, CA. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η εξωγενής οδός της απόπτωσης αρχίζει με σύνδεση συνδετήρων υποδοχέα θανάτου, όπως Fas συνδετήρα, όγκου νέκρωσης παράγοντα-α (TNF-α), και νέκρωσης όγκου απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται με την επαγωγή συνδέτη (TRAIL) με τους υποδοχείς θανάτου, ενεργοποιώντας μία σειρά σημάτων τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε δύο ξεχωριστά, αλλά αλληλένδετα, τρόποι επαγωγής απόπτωσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ενεργοποίηση του θανάτου του υποδοχέα-4 (DR-4) και του θανάτου του υποδοχέα-5 (DR-5) οδηγεί στην πρόσληψη πρωτεϊνών προσαρμογέα για να σχηματίσει το επάγει θάνατο σύμπλεγμα σηματοδότησης (DISC), και την επακόλουθη ενεργοποίηση του εκκινητή κασπάσες-8 ή -10 είναι επαρκής για την ενεργοποίηση τελεστών κασπασών-3, -6 και -7, και τα αποτελέσματα της απόπτωσης [1]. Ωστόσο, η δέσμευση του TRAIL με DR-4 ή DR-5 και την ενεργοποίηση των κασπασών-8 ή -10 είναι συχνά ανεπαρκής για να επάγει απόπτωση, και απαιτεί την απελευθέρωση των μιτοχονδριακών μεσολαβητών όπως το κυτόχρωμα C για να ενισχυθεί το σήμα θανάτου επαγωγής [2]. Αυτή η διαγώνια συζήτηση μεταξύ εξωγενών και ενδογενών οδών απόπτωσης απαιτεί κασπάσης-8 προκαλούμενη διάσπαση του μέλους της οικογένειας Bcl-2 Bid [2], [3]. Περικομμένο Bid (tBid) ενεργεί ως ένας μηχανισμός μπλοκαρίσματος για την αναστολή της δράσης των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 όπως Bcl-2, Mcl-1, και Bcl-XL, οδηγώντας σε μιτοχόνδρια-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο [3].

TRAIL μπορεί επίσης να δεσμεύσει δύο σύνολα μη-λειτουργικών υποδοχέων δολώματα, στην οποία περίπτωση, η επαγωγή απόπτωσης είναι αποκλεισμένη [1]. Η ισορροπία μεταξύ του θανάτου που επάγει υποδοχείς και υποδοχείς δολώματα είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της επαγωγής απόπτωσης σε κύτταρα στόχους [4]. Σε αντίθεση με ΤΝΡ-α και Fas, TRAIL φαίνεται να δείχνει μεγαλύτερη ειδικότητα προς επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα όγκου

in vivo

, με αντίστοιχα μικρότερη τοξικότητα για τον ξενιστή [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Αν και ο ακριβής μηχανισμός της ειδικότητας στόχου με TRAIL δεν είναι γνωστή, η έλλειψη τοξικότητας σε φυσιολογικά κύτταρα οφείλεται εν μέρει στο κατώτερο έκφραση των υποδοχέων θανάτου (DR-4 και DR-5) και την αυξημένη έκφραση του δολώματος υποδοχείς στην επιφάνεια των τα φυσιολογικά κύτταρα [4], [7]. Αντίθετα, μια ποικιλία καρκίνων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του DR-4 και -5 υποδοχείς, καθιστώντας τα ευαίσθητα σε απόπτωση που επάγεται ρυμουλκουμένων [3]. Ενώ το ογκοκατασταλτικό αποτέλεσμα του TRAIL είναι πολλά υποσχόμενη, θα έχει περιορισμένες επιπτώσεις και πολλοί όγκοι είναι ανθεκτικοί σε TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].

Προηγούμενη εργασία με μας εργαστήριο και άλλοι προτείνουν ότι ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται θετικά από την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3 (GSK-3) και εμπλέκεται σε χημειο-αντίσταση, την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, την ανάπτυξη, και μετάσταση [12], [13], [14]. GSK-3 επαγόμενη αναστολή επιδράσεις αντι-επιβίωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, που συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ και μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων στόχων όπως ΧΙΑΡ, BCL-XL, και η κυκλίνη D1 [14].

GSK-3 μπορεί επίσης να προστατεύσει τα κύτταρα από ΤΝΡ-α διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα, δεικνύοντας ότι η GSK-3 έχει ένα ρόλο στην παρεμπόδιση των υποδοχέων θανάτου απόπτωση [15], [16], [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα ανασταλτικά αποτελέσματα της GSK-3 έχουν επεκταθεί σε άλλους υποδοχείς θανάτου όπως TRAIL και Fas [18], [19]. Η αναστολή της GSK-3 έχει αποδειχτεί ότι ενισχύει TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα ηπατώματος και του προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές [10], [20]. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων που περιγράφονται στο προηγούμενο έργο μας, παρατηρήθηκε ότι η GSK-3 αναστολή μπλοκάρει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ με TNF-α [14]. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ έχει προηγουμένως προταθεί για να καταστείλει TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [21], το εύρημα αυτό πρότεινε τη δυνατότητα για αναστολή GSK-3 για να ευαισθητοποιήσει τον καρκίνο του παγκρέατος να TRAIL. Στην έκθεση αυτή, ελέγξαμε κατά πόσο η GSK-3 αναστολή είχε μια επίδραση ευαισθητοποίησης για TRAIL επαγόμενη απόπτωση τόσο

in vitro

χρήση του παγκρέατος και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και

in vivo

χρησιμοποιώντας PANC-1 ξενομοσχευμάτων .

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές PANC-1 και BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],14]. PPC-1 κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, στους 37 ° C και 5% CO2 στον αέρα.

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Apo2L /TRAIL ήταν ένα δώρο από την Genentech, South San Francisco CA. Ο αναστολέας γενική κασπάσης z-VAD-fmk ήταν από την Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, ΡΑ.

σταθερές επιμολύνσεις

Για τις μελέτες υπερέκφραση, pcDNA3.1-Myc κατασκευάσματα που περιέχουν αντι -apoptotic δείκτες: Bcl-2, Bcl-XL, CrmA και MCL-1 περιέχει pcDNA3.1-His κατασκεύασμα ετικέτα χρησιμοποιήθηκαν (Sidnet, Τορόντο, Καναδάς)

PANC-1 και η ΔΕΗ-1 κύτταρα. επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) με 0,95 μg /DNA καλά. Οι επιμολύνσεις επιλέχθηκαν με G418 για 14 ημέρες για να δημιουργήσει σταθερούς κλώνους όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Λειτουργικότητα των εκφρασμένων πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε με τη χρήση της δοκιμασίας επαγωγής απόπτωσης σταυροσπορίνη [23].

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Η δοσοεξαρτώμενη επίδραση του AR-A014418 (AR-18) (προσαρμοσμένο συντίθεται, Toronto Research Chemicals Inc., North York, Οντάριο, Καναδάς), TRAIL (rh-TRAIL, R & amp? συστήματα D, Inc., Minneapolis, ΜΝ) και ο συνδυασμός τους σε PANC-1, BxPC-3 και τα κύτταρα PPC-1 και του γενετικά τροποποιημένες ποικιλίες αξιολογήθηκε από την χρωστική σουλφοροδαμίνης Β (SRB) (Invitrogen, Carlsbad, CA) δοκιμασία πρόσδεσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] εις τριπλούν και επαναλήφθηκε έξι φορές.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης

Συνδυασμένη μέτρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η παραγωγή αντιδραστικών ενδιαμέσων προϊόντων οξυγόνου (ROI), και η ακεραιότητα της εξωτερικής μεμβράνης με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. PANC-1, BxPC-3, και τα κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με AR-18 (25 μΜ) για 24 ώρες που ακολουθείται από TRAIL (10 ng /mL) για 24 ώρες, με μονοθεραπεία ή χωρίς θεραπεία ελέγχους. Τα κύτταρα βάφτηκαν με (40 ηΜ) DiIC1 (5) (Invitrogen, Carlsbad, CA) και dichlorodihydrofluorescin διοξεικό (H2-DCFDA) (5 μΜ) (Invitrogen, Carlsbad, CA), και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σε μια τελική συγκέντρωση του 1 mg /mL.

γενετική Knockdown της GSK-3

GSK-3 ισομορφές γενετικά χτυπηθεί κάτω σε PANC-1 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA κατά της GSK-3 α και β ισομορφές χρησιμοποιώντας μια αντίστροφη πρωτόκολλο επιμόλυνση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

καρκίνο του παγκρέατος μοντέλο ξενομοσχεύματος

τα πειράματα έγιναν σύμφωνα με τους κανονισμούς του καναδικού Συμβουλίου Φροντίδας ζώων και θεσμικών κατευθυντήρια γραμμή για την καλή διαβίωση των ζώων. PANC-1 ξενομοσχευμάτων καθιερώθηκαν υποδορίως στα πλευρά του 6-εβδομάδων αρσενικών σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε περίπου 10 mm σε μεγαλύτερης διαμέτρου. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: μήκος Χ πλάτος

2 × 0.5 [25]. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες (η = 5) για να λάβουν AR-18 20 mg /kg (5 mg /mL απόθεμα σε DMSO) δύο φορές την ημέρα για δύο ημέρες, που ακολουθείται από μια περίοδο ανάπαυσης 24 ώρες πριν από την i.p. έγχυση TRAIL 25 mg /kg, ή ομάδες μονοθεραπεία ή ελέγχου του οχήματος. Τα ζώα ζυγίστηκαν και αξιολογήθηκαν για σημάδια τοξικότητας καθημερινά, και θυσιάστηκαν την ημέρα 5. Οι όγκοι αποκόπηκαν, τεμάχια καταψύχθηκαν, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ή λύονται όπως περιγράφεται παρακάτω.

ανοσοαποτύπωσης

διαδικασία Western blotting ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι διασπασμένης κασπάσης-3, β-κατενίνης, διασπασμένη PARP, Bcl-2, Bcl-XL, (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι της GSK-3 α /β (Biosource Inc., Camarillo, Καναδάς).

η ανοσοϊστοχημεία και Εικόνα Capture

οι ιστοί του ήπατος, των νεφρών και του όγκου μονιμοποιήθηκαν φορμόλη, ενσωματωμένα σε παραφίνη, και τα επεξεργασμένα ως 4 μm τομές. Διαδοχικές τομές ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας Η &? Ε και διασπασμένη κασπάση 3 όπως περιγράφεται προηγουμένως [26] και οπτικοποιούνται υπό ένα μικροσκόπιο Olympus BX41 χρησιμοποιώντας 4Χ και 40Χ αντικειμενικοί φακοί

Ποσοτικοποίηση της διασπασμένης κασπάσης-3

Παρουσιάσεις βάφτηκαν για διασπασμένης κασπάσης-3 αναλύθηκαν με τυφλό τρόπο για να ληφθεί ένα Η-βαθμολογία. Η ένταση χρώσης για κάθε δείγμα κρίθηκε σε σχέση με την ένταση μιας διαφάνειας ελέγχου από ποντικούς που λαμβάνουν θεραπεία οχήματος. Ένα σκορ 1+ αναφέρεται ασθενή χρώση σε σχέση με το φόντο, 2+ = μέτρια χρώση, και 3+ = ισχυρή χρώση. Χρώση ένταση αναφέρθηκε στο υψηλότερο επίπεδο της έντασης που παρατηρείται σε όλα τα στοιχεία του ιστού. Για σύγκριση της χρώσης μεταξύ ιστών, τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν με υπολογισμό ενός πλήρους H-βαθμολογία που θεωρεί τόσο ένταση χρώσης και το ποσοστό των κυττάρων που βάφονται σε ένα συγκεκριμένο φάσμα εντάσεων. Μια πλήρης H-score υπολογίζεται πολλαπλασιάζοντας την ένταση σε ποσοστό θετικά χρωματισμένων κυττάρων (H = P × Ι) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Στατιστική Ανάλυση

Για να διερευνηθεί η πιθανή συνεργιστική επίδραση του συνδυασμού AR18 με TRAIL, η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο θεραπειών φαρμάκου ελέγχθηκε με την τοποθέτησή της σε ένα μοντέλο που λαμβάνει υπόψη το γεγονός ότι ορισμένα πειράματα δεν πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα. Οι τιμές οπτικής πυκνότητας (για SRB) ήταν μετασχηματισμένα λογαριθμικά για να σταθεροποιηθεί η διακύμανση των υπολοίπων. Οι προκύπτουσες τιμές αναλύθηκαν με σύγκριση μεταξύ των διαφορετικών συγκεντρώσεων του κάθε φαρμάκου που χρησιμοποιούν γραμμικά μοντέλα παλινδρόμησης. Μια αλληλεπίδραση φάρμακο θεωρήθηκε συνεργική όταν το αποτέλεσμα του συνδυασμού φαρμάκου ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από το άθροισμα των αποτελεσμάτων των δύο φαρμάκων, και υπο-προσθέτου όταν ήταν λιγότερο από αυτό. Τα αποτελέσματα της αγωγής συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student και οι διαφορές μεταξύ των μέσων θεωρήθηκαν σημαντικές όταν p ≤ 0,05. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού «R» όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SE.

Η στατιστική ανάλυση των πλήρων Η-βαθμολογιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας t-test δύο ουρών Student με μη ζευγαρωμένα δεδομένα της ίσης διακύμανσης. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκαν, όταν η αξία p = & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

GSK-3 Αναστολή ευαισθητοποιεί ρυμουλκουμένων ανθεκτικά κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος σε απόπτωση

Η θεραπεία της PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα με AR-18 (25 και 50 μΜ) ή DMSO για 24 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη του TRAIL (5, 10, 20, 40 ng /mL) για περαιτέρω 24 h αποκάλυψε ότι η θεραπεία με δύο ηλεκτρόδια τα ναρκωτικά να εξαρτάται από τη συγκέντρωση αναστολή της ανάπτυξης, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία SRB, αν και τα κύτταρα PANC-1 ήταν σχετικά ανθεκτικά στην TRAIL (Σχήμα 1). Ουσιαστικά μεγαλύτερη τοξικότητα παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές κατά τον συνδυασμό των δύο παραγόντων, και αυτό το αποτέλεσμα είναι εξαιρετικά συνεργιστική όταν αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] (για BxPC-3, p = 0,0002 με τη χρήση του συνδυασμού του 40 ng /mL TRAIL και 50 μΜ AR-18 και ρ & lt? 0,005 για όλες τις χρονοδιαγράμματα υπόλοιπη δόση? για PANC-1, ρ & lt? 0,005 για όλες τις χρονοδιαγράμματα δόσεων εκτός από 25 μΜ AR-18 σε συνδυασμό με 5 και 10 ng /mL TRAIL που δεν ήταν σημαντική) (Σχήμα 1 και τον πίνακα S1). Η επίδραση ήταν περισσότερο εμφανής μετά από προ-θεραπεία με 50 μΜ AR-18, υποδηλώνοντας ότι η συνεργιστική δράση εξαρτάται από την έκταση της GSK-3 αναστολή αντί συγκέντρωση TRAIL.

PANC-1 (Α) και BxPC- 3 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL μετά από 24 h προ-έκθεση σε AR-18 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία SRB. Κάθε υποδηλώνει ραβδόγραμμα σημαίνει από τρία ξεχωριστά πειράματα με έξι αντίγραφα. Οι ράβδοι σφάλματος = ± SEM.

Η

ανάλυση ανοσοστυπώματος της διάσπασης PARP σε κυτταρολύματα που εξάγεται από PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα σε επεξεργασία με 25 μΜ AR-18, 10 ng /mL TRAIL, ή τον συνδυασμό έδειξε ότι ενώ δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη διάσπαση PARP χρησιμοποιώντας AR-18 μόνο του, η συνδυασμένη θεραπεία με TRAIL σημαντικά ενισχυμένη διάσπαση PARP στις δύο κυτταρικές σειρές. Συνεπής με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με τη δοκιμασία SRB, BxPC-3 κύτταρα έδειξαν ευαισθησία στο TRAIL με βάση την διάσπαση PARP, ενώ τα κύτταρα PANC-1 ήταν ανθεκτικά.

Για να ελέγξετε αν το TRAIL ευαισθητοποίηση του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα από GSK-3 αναστολή είναι κασπάσης-εξαρτώμενη, PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 25 μΜ AR-18 και /ή 10 ng /mL TRAIL στην παρουσία του γενικού αναστολέα κασπάσης z-VAD-fmk. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, αν και η ίδια z-VAD παραγάγει μερικές τοξικές επιδράσεις, ωστόσο διασώθηκε σημαντικά τόσο τις κυτταρικές σειρές από το συνδυασμό AR-18 συν TRAIL. Επιπλέον, TRAIL είχε κασπάσης-εξαρτώμενη επίδραση επί BxPC-3 αλλά όχι PANC-1 κύτταρα, σε συνέπεια με μεγαλύτερη ευαισθησία TRAIL τους δείχνεται με δοκιμασία SRB. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, μερική διάσωση από AR-18 εμφανίστηκε με z-VAD-fmk, υποδεικνύοντας ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα της αναστολής της GSK3 είναι, σε κάποιο βαθμό, της κασπάσης-εξαρτώμενη. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ευαισθητοποίηση TRAIL με αναστολή GSK-3 περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της κασπάσης.

(Α) BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με AR-18, σε συνδυασμό με ή χωρίς TRAIL για 24 ώρες και αναλύθηκε με για διάσπαση PARP. (Β) BxPC-3 (αριστερά) και PANC-1 (δεξιά) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AR-18 (25 μΜ), TRAIL (10 ng /mL), z-VAD-fmk 50 μΜ, ή οι συνδυασμοί που υποδεικνύονται και SRB δοκιμασία μετά από 22 ώρες επώασης. Κάθε υποδηλώνει ραβδόγραμμα σημαίνει από τρία πειράματα με έξι αντίγραφα. γραμμές σφάλματος = ± SEM. * P & lt? 0.005, ** p & lt?. 0.0001

Η

Επιδράσεις των Γενετικών Νοκ ντάουν της GSK-3 σε TRAIL Ευαισθητοποίηση των παγκρεατικών κυττάρων του καρκίνου

Για να ελέγξετε εάν το TRAIL-δράση ευαισθητοποίησης των AR-18 οφειλόταν σε αναστολή GSK-3, και για τη δοκιμή για λειτουργική πλεονασμό στα GSK-3 ισομορφές, εξετάσαμε έπειτα τα επίπεδα έκφρασης της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση-3 σε προϊόντα λύσης κυττάρου από PANC-1 κύτταρα παροδικώς επιμολυσμένα με siRNA στοχεύουν ενάντια GSK-3α, β, ή και τα δύο, με την παρουσία ή απουσία 10 ng /mL TRAIL. Κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή που δεν έλαβαν θεραπεία χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι, ενώ κύτταρα κατεργασμένα με AR-18 μόνο του ή σε συνδυασμό με TRAIL θεωρήθηκαν ο θετικός έλεγχος. Ανοσοκηλίδωση έδειξαν & gt? Μείωση κατά 80% της συνολικής πρωτεΐνης του κάθε ισομορφής (Σχήμα 3) σε απόκριση σε 3-ημερών επώαση με τα siRNA κατά της GSK-3 ισομορφές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα κύτταρα ως κωδικοποιημένο. Η θεραπεία με TRAIL (10 ng /mL) μόνο είχε μικρή επίδραση στην απόπτωση όπως μετράται με ΡΑΚΡ ή διάσπαση της κασπάσης-3, ενώ παροδική knockdown της GSK-3 α ή β ισομορφές είχε μόνος σημαντικές επιδράσεις. Ο συνδυασμός του TRAIL με GSK-3β γενετική knockdown, σε αντίθεση, η ενισχυμένη ουσιαστικά PARP και διάσπαση της κασπάσης-3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα, και μόνο θεραπείες ή ομελέτα siRNA. GSK-3α knockdown σε συνδυασμό με επαγόμενη TRAIL μικρές επιδράσεις επί PARP και διάσπαση της κασπάσης-3, αλλά ταυτόχρονα knockdown με GSK-3 είχε σημαντική επίδραση η οποία ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του AR-18 (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η GSK-3 αναστολή είναι υπεύθυνη για την TRAIL ευαισθητοποίηση επιπτώσεις της AR-18, και επιπλέον δείχνουν ότι η GSK-3β παίζει πιο σημαντικό ρόλο. Ωστόσο, ο ρόλος της GSK-3α είναι λιγότερο σαφής, επειδή δεν ήμασταν σε θέση να επιτύχει τον ίδιο βαθμό knockdown ως GSK-3β.

PANC-1 κύτταρα προ-κατεργασία χρησιμοποιώντας AR-18 ή siRNA τόσο εναντίον ισομορφές της GSK-3, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε TRAIL. Ανοσοαποτύπωση επιβεβαιώνει την επιτυχή νοκ ντάουν της ΟδΚ3α και β. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη διάσπαση της PARP και κασπάσης-3 μετά από έκθεση σε TRAIL. Scr:. Κωδικοποιημένα μη ειδικό siRNA

Η

TRAIL Ευαισθητοποίηση κατά της GSK-3 Αναστολή Περιλαμβάνει μιτοχόνδρια

σηματοδότησης των υποδοχέων θανάτου ξεκινά έναν καταρράκτη γεγονότων που οδηγεί στην ενεργοποίηση του caspase- τελεστή 3 και η επαγωγή της απόπτωσης [6]. Ωστόσο, σε μερικά κύτταρα της κασπάσης-3 ενεργοποίησης απαιτεί ενίσχυση σήματος μέσω ενεργοποίησης διάσπασης και τα μιτοχόνδρια Bid [2], [6]. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε μη ισορροπημένη φυσιολογικής κατάστασης των μιτοχονδρίων με αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ενδιαμέσων προϊόντων οξυγόνου και διαταραχή της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό [24]. Για να δοκιμαστεί για την εμπλοκή των μιτοχονδρίων κατά την διάρκεια TRAIL ευαισθητοποίηση AR-18, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) και την παραγωγή ROI. Συνδυασμός TRAIL και AR-18 που προκαλείται από το σχηματισμό του ετερογενείς πληθυσμοί PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα που είχαν τα χαρακτηριστικά της αυξημένης παραγωγής ROI, απώλεια ΔΨm, και η πρόσληψη ΡΙ, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο ή μονά αγωγές (Σχήμα 4) . Συνεπής με τα αποτελέσματα από τη διάσπαση δοκιμασία SRB και PARP, AR-18 θεραπεία δεν υποβλήθηκαν αποπτωτικά χαρακτηριστικά σε οποιαδήποτε από τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Η αγωγή με TRAIL μόνο παρήγαγε κάποια απώλεια ΔΨm και αυξημένη ROI σε BxPC-3 αλλά όχι κύτταρα PANC-1, αν και αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο εκτεταμένο όσο τη θεραπεία συνδυασμού. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το TRAIL ευαισθητοποίηση αναστολή GSK-3 περιλαμβάνει τα μιτοχόνδρια.

PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν με AR-18 (25 μΜ), TRAIL (10 ng /mL), ή ο συνδυασμός τους για 24 ώρες, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. οικόπεδα πυκνότητα Dot ιωδιούχου προπιδίου (PI) πρόσληψη vs ΔΨπι δείχνουν ότι η απώλεια ΔΨm προηγείται πρόσληψη ΡΙ. TRAIL επαγόμενη απώλεια ΔΨm σε BxPC-3 αλλά όχι σε PANC-1, σε συνέπεια με μεγαλύτερη ευαισθησία τους δει χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB (Εικόνα 1). Η συνδυασμένη αγωγή με TRAIL και AR18 ευαισθητοποιημένων σαφώς και τις δύο κυτταρικές σειρές σε απώλεια ΔΨm, και αυτό συνοδεύτηκε από αυξημένη παραγωγή ROI και την απώλεια της ακεραιότητας έξω μεμβράνης.

Η

Μοριακοί μηχανισμοί TRAIL Ευαισθητοποίηση της GSK-3 Αναστολή

για να διερευνηθούν περαιτέρω οι μηχανισμοί του TRAIL ευαισθητοποίηση αναστολή GSK-3, χρησιμοποιήσαμε PPC-1 προστάτη καρκινικού κυττάρου που υπερεκφράζει Bcl-2, Bcl-XL, και Mcl-1 να αναστέλλουν την μιτοχονδριακή οδό, ή απόκριση κυτοκίνης τροποποιητή Α (CrmA) για την αναστολή της οδού του υποδοχέα θανάτου ενεργοποίηση της κασπάσης. Αξιολόγηση των κυττάρων άγριου τύπου PPC-1 χρησιμοποιώντας το SRB και κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες έδειξαν ότι ο συνδυασμός του φαρμάκου ήταν πιο αποτελεσματικό από τα μονά παράγοντες (Σχήμα S1). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών για ευαισθησία στο TRAIL και AR-18. PPC-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν CrmA, Mcl-1, Bcl-XL, και Bcl-2 έδειξαν αυξημένη σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετά από θεραπεία με το TRAIL + AR-18 συνδυασμού, σε σύγκριση με τα κύτταρα που δεν υπερεκφράζουν οποιαδήποτε αντι-αποπτωτικό δείκτες (Σχήμα 5Α) .

PPC-1 (Α) και PANC-1 (Β) σταθερών κλώνων επιμολυσμένα με Bcl-2, Bcl-XL, CrmA, και MCL-1 που περιέχει κατασκεύασμα pcDNA3.1-His υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συνδυασμός του AR-18 (50 μΜ) και TRAIL (10 ng /mL) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη μέθοδο SRB. Κάθε υποδηλώνει γράφημα σημαίνει από τρία πειράματα με έξι αντίγραφα. γραμμές σφάλματος = ± SEM.

Η

Παρόμοια με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση των PPC-1 κύτταρα, η υπερέκφραση του CrmA και Bcl-2 σε PANC 1-κύτταρα προστατεύονται από την TRAIL + AR-18 συνδυασμού, αν και υπήρχαν διαφορές στις σχετικές επιδράσεις των μελών της οικογένειας Bcl-2 και τα αποτελέσματα της Bcl-XL δεν ήταν στατιστικά σημαντικές σε κύτταρα PANC-1. Η προστατευτική δράση που υπερεκφράζουν CrmA, το οποίο δρα για να καταστείλουν την ενεργοποίηση της κασπάσης υποδοχέα θανάτου, υποδηλώνει την πιθανότητα ότι η GSK-3 η αναστολή μπορεί να ευαισθητοποιήσει μονοπάτι μέσα ενίσχυσης των κασπασών εκκινητή όπως κασπάση-8, καθώς και μέσω αντι-αποπτωτικό μόρια όπως Bcl- 2 και Mcl-1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, θα χρειαστούν περαιτέρω προσπάθειες για τη δημιουργία αυτό.

AR-18 ευαισθητοποιεί PANC-1 κύτταρα με TRAIL

in vivo

Η

Για να εξεταστεί η επίδραση της βραχυπρόθεσμης έκθεσης στο συνδυασμό του AR-18 και TRAIL για επαγωγή απόπτωσης σε PANC-1 όγκων ξενομοσχεύματος, πρώτα διαπιστώνεται ότι η μέγιστη δόση του AR-18 ανεκτή από ποντίκια SCID που χρησιμοποιείται από το εργαστήριο μας ήταν 20 mg /kg, χορηγούμενη δύο φορές ημερησίως με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ip). Αρσενικά SCID ποντίκια που φέρουν PANC-1 ξενομοσχευμάτων χωρίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες θεραπείας και έλαβαν ε.π. ένεση με DMSO ή AR-18 (20 mg /kg? κάθε 12 ώρες για 2 ημέρες) ακολουθούμενο από ε.π. έγχυση TRAIL (25 mg /kg) μέσα σε 24 ώρες μετά την τελευταία AR-18 δόσεων. 24 ώρες μετά τις τελευταίες ποντίκια αγωγή θυσιάστηκαν και οι όγκοι συλλέγονται (Σχήμα 6Α).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της

in vivo

πρωτόκολλο θεραπείας. επίπεδα έκφρασης β-κατενίνης (Β) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πυκνομετρία και οι προκύπτουσες τιμές ομαλοποιήθηκαν έναντι α-τουμπουλίνης. έλεγχος τ έδειξε ότι ο συνδυασμός vs ελέγχου: p = 0,0012, και για AR-18 vs ελέγχου: p & lt? 0,0001. (Γ) Ποσοτικοποίηση της απόπτωσης στα δείγματα όγκου χρησιμοποιώντας Η- σκορ. Διασπασμένη κασπάση-3 χρωματισμένο διαφάνειες (όπως φαίνεται στην Εικόνα S2) βαθμολογήθηκαν για ένταση της χρώσης (Ι) καθώς επίσης και το ποσοστό κυττάρων θετικών για το αντίστοιχο λεκέ (H = I × P). Αποτελέσματα unpaired Student t-test (η = 5 σε κάθε ομάδα θεραπείας) έχουν ως εξής: TRAIL vs ελέγχου (ρ = 0.0002), συνδυασμός vs ελέγχου (ρ = 0.0004), συνδυασμός vs TRAIL (p = 0,0261), συνδυασμός vs AR -18 (p = 0,0035). (D) Αξιολόγηση του βάρους των ζώων κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Η

Ως ένδειξη για τις φαρμακοδυναμικές επιδράσεις του AR-18, μετρήθηκε το επίπεδο της β-κατενίνης που ρυθμίζεται από GSK-3 μέσω της οδού Wnt. Υπήρξε μια σημαντική (ρ & lt? 0.0001) αύξηση στα επίπεδα β-κατενίνης σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένα δείγματα μετά από αγωγή με AR18 (Σχήμα 6Β), υποδηλώνοντας ότι η GSK-3 αναστολή επιτεύχθηκε επιτυχώς στα ξενομοσχεύματα PANC-1. Απροσδόκητα, τα επίπεδα της β-κατενίνης ήταν σημαντικά αυξημένα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή TRAIL. Αυτό φαίνεται να είναι ένα νέο εύρημα, η σημασία του οποίου είναι προς το παρόν αβέβαιη. Επιπλέον, ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων αύξησε σημαντικά τα επίπεδα β-κατενίνης σε σύγκριση με τους ελέγχους DMSO, αλλά οι τιμές δεν ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι μόνο AR-18.

Αυξήσεις Θεραπεία Συνδυασμού διασπασμένη κασπάση 3

in vivo

η

Οι μετρήσεις H-score της διασπασμένης κασπάσης-3 έδειξε ότι το TRAIL μόνη που παράγεται σημαντική (p = 0,0002) επαγωγή της απόπτωσης σε PANC-1 όγκων (Σχήμα 6C και Σχήμα S2), ενώ AR-18, όπως ένας μόνο παράγοντας είχε ασήμαντες συνέπειες. Ωστόσο, ο συνδυασμός του AR-18 και TRAIL έδειξε μια μεγαλύτερη επίδραση στην επαγωγή της απόπτωσης σε σύγκριση με ενιαία αγωγές ή DMSO αγωγή έλεγχοι: συνδυασμός έναντι του ελέγχου (ρ = 0.0004), συνδυασμός εναντίον TRAIL (p = 0,0261), συνδυασμός vs. AR-18 (p = 0,0035). Για τη διερεύνηση ενδεχόμενων τοξικές επιδράσεις στα ζώα που έλαβαν 20 mg /kg AR-18 μόνο του ή σε συνδυασμό με TRAIL, το ήπαρ και τα νεφρά ήσαν φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη και τομές χρωματίστηκαν με Η &? Ε και διασπασμένη κασπάση-3. Δεν προφανείς μορφολογικές αλλαγές του τραυματισμού συμπεριλαμβανομένων νέκρωση ή απόπτωση παρατηρήθηκαν. Το σωματικό βάρος των ζώων μετρήθηκαν καθημερινά κατά τη διάρκεια αυτής της οξείας πείραμα δοσολογία δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας, εκτός από το ότι τα ζώα που λαμβάνουν TRAIL μόνος διατηρείται

Συζήτηση ζυγίζει σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO (Σχήμα 6D).

Αυτή η μελέτη προτείνει τη δυνατότητα να ευαισθητοποιήσει παγκρέατος σε TRAIL από GSK-3 αναστολή. Πρώτον, παρατηρήσαμε TRAIL ευαισθητοποίηση μέσω GSK-3 αναστολή τόσο του προστάτη και καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές. Δεύτερον, η διαδικασία του TRAIL ευαισθητοποίηση δείχθηκε να είναι κασπάσης-εξαρτώμενη. Τρίτον, η γενετική knockdown της GSK-3 με τη χρήση ειδικών ισομορφή siRNAs ήταν εξίσου αποτελεσματική στην TRAIL-ευαισθητοποίηση, όπως ήταν το μικρό μόριο αναστολέας AR-18. Τέταρτον, η GSK-3 αναστολέας επαγόμενης ευαισθητοποίηση TRAIL συσχετίστηκε με την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης συνοδεύεται από αυξημένη παραγωγή ROI. Πέμπτον, οι μελέτες υπερέκφραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έδειξαν ότι και οι δύο μιτοχονδριακών πρωτεϊνών κασπάσης-8 (CrmA) και NF-κΒ-εξαρτώμενο (Bcl-2, και Mcl-1) που συμμετέχουν στη διαδικασία του TRAIL ευαισθητοποίησης. Χρήση του TRAIL σε συνδυασμό με αναστολή GSK-3 έχει σχέση με τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, όπως αυτοί οι όγκοι έχουν υψηλή συχνότητα Κ-ras και μεταλλάξεων ρ53 που ενδέχεται να συμβάλουν στην αντοχή τους σε τυπικούς παράγοντες [27], [28], ενώ ευαισθησία TRAIL αναφέρεται ότι είναι ανεξάρτητη της ρ53 και TRAIL είναι αποτελεσματική σε όγκους με αδρανή p53 [29]. Επίσης, έχουν ενεργοποίηση μεταλλάξεων K-ras έχουν αναφερθεί να ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση [30], [31].

Δοκιμάσαμε πρώτα το φαινόμενο TRAIL ευαισθητοποίηση και βελτιστοποιημένη μελέτη μας χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκίνου του προστάτη, λόγω της η προηγούμενη απόδειξη της έννοιας σε αυτούς τους καρκίνους [20]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και υπήρξαν διαφορές στην ευαισθησία TRAIL μεταξύ των δοκιμαζόμενων κυτταρικών σειρών, με PANC-1 είναι το πιο ανθεκτικό TRAIL, ο συνδυασμός με GSK-3 καταστολής παρέχεται μια συνεπής και ιδιαίτερα σημαντική ευαισθητοποίηση σε TRAIL σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Αυτό ευαισθητοποίηση φάνηκε να είναι περισσότερο εξαρτάται από το επίπεδο της GSK-3 αναστολή, και όχι στην συγκέντρωση TRAIL.

Προηγούμενες μελέτες απέδωσε την αντίσταση TRAIL παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων στην υπερέκφραση του αναστολέα φυλοσύνδετη απόπτωσης (ΧΙΑΡ ) [32]. Volger

et al.

Έδειξαν ότι δέσμευση ΧΙΑΡ ευαισθητοποιημένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να TRAIL-επαγώμενη απόπτωση τόσο

in vitro

και

in vivo

[33]. Άλλες μελέτες έχουν τονίσει το ρόλο του ΝΡ-κΒ σε αντίσταση στην TRAIL μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση των αναστολέων της απόπτωσης όπως ΧΙΑΡ, Bcl-2, Bcl-XL, και Mcl-1 [21], [34], [35], [ ,,,0],36], [37]. Η GSK-3 αναστολή ρυθμίζει προς τα κάτω το επίπεδο έκφρασης αυτών των γονιδίων στόχων του ΝΡ-κΒ [14], [38] και μπορεί επίσης να μπλοκάρουν την οδό του υποδοχέα θανάτου [15], υποδηλώνοντας ότι η GSK-3 η αναστολή θα μπορούσε να ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε αγωγή TRAIL μέσω πολλαπλών μηχανισμών .

σύμφωνα με την προηγούμενη διαπίστωση ότι η GSK-3 μπορεί να εμποδίσει ανάντη σηματοδότησης των υποδοχέων θανάτου της κασπάσης-8 [15], ΟπηΑ υπερέκφραση διασώθηκε από τον συνδυασμό TRAIL + AR18. Παρόλο που υποδηλώνουν μία επιπλέον ρόλο της GSK-3 στη σηματοδότηση των υποδοχέων θανάτου, περαιτέρω πειράματα θα χρειαστούν για να επιβεβαιώσουν αυτό. Βρήκαμε επίσης διάσπαση της κασπάσης-3 και ΡΑΚΡ σε κύτταρα ευαισθητοποιημένα σε TRAIL είτε AR-18 ή γενετική knockdown της GSK-3 ισομορφές. Είναι ενδιαφέρον ότι η δράση της GSK-3β σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση ήταν πιο εμφανή από GSK-3α, αν και η ένταση της διπλής knockdown ισομορφής ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με GSK-3β μόνο, και ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρείται με AR-18. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με προηγούμενη αναφορά μας δείχνει ότι η γενετική αποκλεισμός της GSK-3β και διπλό knockdown της GSK-3 ισομορφές είναι σχετικά πιο αποτελεσματική από GSK-3α στην καταστολή δραστικότητας του ΝΡ-κΒ [14]. Ωστόσο, αυτό δεν εξετάστηκε επισήμως σε αυτά τα πειράματα και θα απαιτήσει περαιτέρω έρευνα.

Πολλές από τις πρωτεΐνες-στόχους NF-κΒ αναστέλλει την μιτοχονδριακή οδό, και γι ‘αυτό ρώτησα αν ο συνδυασμός TRAIL AR-18 + διαταράσσει μιτοχονδριακή λειτουργία . Βρήκαμε μια αυξημένη απελευθέρωση ROI σε συνδυασμό με το μειωμένο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα κατεργασμένα με TRAIL + αναστολέα GSK-3, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή των μιτοχονδρίων. Αν και παραγωγή ROI ως μηχανισμός τελεστή κατά τη διάρκεια επαγόμενη από φάρμακα απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα είναι πολύ γνωστή [39], τα αποτελέσματα μας έχουν ενδιαφέρον δεδομένου ότι προτείνουν μια σύνδεση μεταξύ TRAIL ευαισθητοποίηση αναστολή GSK-3 και της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας. Ένα τέτοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε προηγουμένως σε μελέτη από Jung

et al

., χρησιμοποιώντας κουρκουμίνη να ευαισθητοποιήσει νεφρική καρκινικών κυττάρων σε TRAIL [40]. θεραπεία κουρκουμίνη ενισχυμένη γενιά ROI στην TRAIL ευαισθητοποιημένα κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης μια αύξηση στην DR-5 έκφρασης σε ένα ROI-εξαρτώμενο τρόπο [40]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί προηγουμένως σε ανθρώπινα κύτταρα αστρονευρογλοιακά, τονίζοντας ROI εξαρτώμενη ανοδική ρύθμιση των υποδοχέων TRAIL θάνατο [41]. Διάσπαση της κασπάσης-3 που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας μπορεί περαιτέρω την παραγωγή επιρροή ROI, όπως ενεργοποιημένη κασπάση-3 μπορεί να προκαλέσει ένα βρόχο ανάδρασης για την μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα [42]. Είτε αύξηση της παραγωγής ROI σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι η κρίσιμη αιτία του TRAIL ευαισθητοποίηση μετά αναστολή GSK-3, ή δημιουργείται ως φαινόμενο γειτνιάσεως εκτέλεσης απόπτωσης, παραμένει να διερευνηθεί. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η παραγωγή ROI ενδέχεται να περιλαμβάνουν συνδέσμους πάλι ΝΡ-κΒ με τη διαδικασία του TRAIL ευαισθητοποίηση της GSK-3 αναστολείς στον καρκίνο του παγκρέατος.