Αφηρημένο

Η μετάσταση είναι υπεύθυνος για το 90% των θανάτων από καρκίνο. Κατά τη διάρκεια μετάσταση, τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από τον πρωτοπαθή όγκο, εισέρχονται στο αίμα και τα λεμφαγγεία, και τα χρησιμοποιούν ως αυτοκινητοδρόμων να ταξιδέψουν σε μακρινές περιοχές του σώματος για να σχηματίσουν δευτερογενείς όγκους. κυτταρική μετανάστευση καρκίνου μέσω του ενδοθηλίου και στην βασική μεμβράνη αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο στάδιο στη μεταστατική καταρράκτη, ακόμη δεν είναι πλήρως κατανοητή. Η διαδικασία αυτή χαρακτηρίζεται καλά για τα κύτταρα του ανοσοποιητικού που συνήθως μεταναστεύσουν μέσω του ενδοθηλίου σε θέσεις μόλυνσης, φλεγμονής ή τραυματισμού. Προηγούμενες μελέτες με λευκοκύτταρα έχουν αποδείξει ότι αυτό το βήμα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου και υποενδοθηλιακή ακαμψία του υποστρώματος. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα προηγουμένως συσταθεί

in vitro

μοντέλο του ενδοθηλίου και απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, με σκοπό την παρατήρηση μετενσάρκωση καρκινικό κύτταρο και να συγκρίνει αυτή τη διαδικασία σε λευκοκύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, καρκινικού κυττάρου μετανάστευση περιλαμβάνει ένα επιπλέον βήμα, το οποίο όρος «ενσωμάτωση», εντός του μονοστοιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων (EC). Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, τα καρκινικά κύτταρα σωματικά εκτοπίσει ECs, που οδηγεί στην εξάρθρωση του ΕΚ VE-καντερίνη μακριά από κόμβους ΕΚ συνορεύουν καρκινικά κύτταρα, και να εξαπλωθεί σε μονοστιβάδα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ECs αποκολληθούν εντελώς από τη μήτρα. Επιπλέον, η ενσωμάτωση των καρκινικών κυττάρων λαμβάνει χώρα ανεξάρτητα από την κατάσταση ενεργοποίησης και υποενδοθηλιακό ακαμψία υπόστρωμα για τον καρκίνο του μαστού και κύτταρα μελανώματος, μια αξιοσημείωτη διαφορά από τη διαδικασία με την οποία τα λευκοκύτταρα μετεμψυχούμαι. Εν τω μεταξύ, η ενσωμάτωση του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων εξηρτάτο από την κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου και άλλαξε σε πολύ σκληρό υποενδοθηλιακό υποστρώματα. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας παρέχουν μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με την εξαγγείωση των καρκινικών κυττάρων και να αποδείξει ότι η ενσωμάτωση είναι ένα από τα πρώτα βήματα

Παράθεση:. Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza Η (2014) VE-καδερίνη-Ανεξάρτητη Cancer Cell ενσωμάτωση στο αγγειακό ενδοθήλιο Προηγείται Μετενσάρκωσης. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10.1371 /journal.pone.0109748

Συντάκτης: Claudia Daniela andl, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2014? Αποδεκτές: 10, Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 2 Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Hamilla et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Εθνική Υπηρεσία Έρευνας Βραβείο F31NS068028 (KMS) και Human Frontier Science Βραβείο Έργου RGP0058 /2011 ( HAE). Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του Εθνικού Ινστιτούτου Νευρολογικών Διαταραχών και Εγκεφαλικού Επεισοδίου ή το National Institutes of Health. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετάσταση του καρκίνου προκύπτει όταν τα καρκινικά κύτταρα κομμάτι από την πρωτογενή θέση όγκου, εισάγετε τα αιμοφόρα αγγεία και της λέμφου, και εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα όργανα του σώματος. Αυτή η διαδικασία είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που συμβάλλουν στην deadliness του καρκίνου [1], [2]. Μόλις μεταστατικά καρκινικά κύτταρα έχουν εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος, πρέπει να διασχίσει το φράγμα των ενδοθηλιακών κυττάρων (ΕΚ), πριν την εισβολή του ιστού κάτω από σε ένα στάδιο γνωστό ως εξαγγείωση. Τα περισσότερα κύτταρα όγκου σύλληψης από μη ειδική δέσμευση των παραγόντων πήξης και με περιορισμό του μεγέθους σε τριχοειδείς κλίνες [3]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, έχουν ειδικοί συνδετήρες επί κυττάρων όγκου έχουν συσχετιστεί με αυξημένο μεταστατικό δυναμικό [4] – [6]. Μέχρι στιγμής, σημαντική έρευνα έχει αφιερωθεί στην ανάλυση των βιοχημικών και μοριακών δυνατότητες των καρκινικών κυττάρων [7] – [9], αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός του καρκινικού κυττάρου εξαγγείωσης μέσω του ενδοθηλίου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν παρατηρηθεί να μεταναστεύσουν μέσω του σώματος κύτταρο ΕΚ [10], καθώς και μέσω κόμβων ενδοθηλιακών κυττάρων-κυττάρων χωρίς να καταστρέφει τη στιβάδα του ΕΚ [11]. Ωστόσο, αντικρουόμενες έρευνες έχουν επίσης δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα δεν αφήνουν το ενδοθήλιο άθικτο μετά από εξαγγείωση [10], [12] – [14]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι μελέτες αυτές χρησιμοποίησαν διαφορετικές κυτταρικές γραμμές όγκων, καθώς και των διαφόρων γραμμών ΕΚ και

in vitro

μεθόδους, οπότε είναι πιθανό ότι διάφοροι συνδυασμοί των διαφόρων τύπων των κυττάρων του όγκου και ECs μπορεί να οδηγήσει σε αποκλίνουσες μηχανισμοί εξαγγείωση. Υπάρχουν τρεις προτεινόμενες μεθόδους της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων μέσω του ενδοθηλίου: (α) τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να μεταναστεύσουν μέσω του σώματος ΕΚ [10], (β) τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να επάγουν ΕΚ απόπτωση [10], [13] και (γ) τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μεταναστεύσουν μέσω κόμβων ενδοθηλιακών κυττάρων-κυττάρων χωρίς μόνιμα καταστρέφει τη στιβάδα του ΕΚ [11]. Τα τελευταία χρόνια, η έρευνα έχει δείξει επίσης ότι τα καρκινικά κύτταρα ασκούν επίσης τις δυνάμεις επί ECs που τους ωθούν βαθύτερα στο εξωκυτταρικό πλέγμα κατά τη διάρκεια μετανάστευση [15], [16], και ότι το ενδοθήλιο ενισχύει μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [17]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μετανάστευση του καρκίνου μέσω του ενδοθηλίου είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί περαιτέρω έρευνα για τη διαλεύκανση μηχανιστική πορεία του.

Τα λευκοκύτταρα συνήθως μεταναστεύσουν μέσω του ενδοθηλίου και των υποκείμενων στρωμάτων του αγγειακού συστήματος για να φτάσει θέσεις ιστού φλεγμονής, μόλυνσης, ή τραυματισμό. Αυτό είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο διαδικασία που στηρίζεται στην εντοπισμένη βιοχημικών σημάτων. Σε διακίνηση λευκοκυττάρων, το ενδοθήλιο λειτουργεί ως επιλεκτικός φραγμός που μειώνει σημαντικά το ποσοστό εισβολή [18]. Κατά τη διάρκεια μιας ανοσολογικής απόκρισης, η χημειοκίνη παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα (TNF-α) παράγεται από στρωματικά κύτταρα, και η εντοπισμένη έκθεση της ECS προς ΤΝΡ-α ρυθμίζει προς τα πάνω μόρια προσκόλλησης όπως ενδοκυτταρικού μορίου προσκόλλησης-1 (ICAM-1) επί της επιφανείας του ενδοθηλίου. Επιπλέον, εκτός από μοριακές μεταβολές, ΤΝΡ-α επίσης μεταβάλλει σημαντικά τις δομικές ιδιότητες του ενδοθηλίου, η οποία επάγει μαλάκυνση, ακτίνη επανευθυγράμμιση, και αύξηση της συνολικής διαπερατότητας [19], [20]. Ένας επιπλέον παράγοντας που ενισχύει λευκοκυττάρων μετανάστευση είναι υποενδοθηλιακό ακαμψία υπόστρωμα και μηχανικές ιδιότητες του ενδοθηλίου. Αυτά ποικίλλουν κατά τη διάρκεια της αγγειακής ομοιόστασης και σε παθολογικές καταστάσεις [19]. Τα ουδετερόφιλα είναι σε θέση να mechanosense μικροπεριβάλλον τους [19], [21] – [24], και μετανάστευση των ουδετερόφιλων αυξάνεται καθώς υποενδοθηλιακό υπόστρωμα αυξάνει την ακαμψία που οφείλεται στο φως αλυσίδα μυοσίνης κινάσης ΕΚ (MLCK) μεσολάβηση συσταλτικές δυνάμεις [19]. Όλες αυτές οι αλλαγές στην μονοστιβάδα ΕΚ διευκολυνθεί λευκοκυττάρων μετανάστευση κατά την διάρκεια μίας ανοσολογικής απόκρισης.

Δεδομένου ότι τα λευκοκύτταρα συνήθως μεταναστεύσουν διαμέσου του στρώματος ΕΚ, τεκμαίρεται ότι μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μπορεί να μοιράζονται πολλές από τις ίδιες μηχανισμούς. Ωστόσο, οι μηχανισμοί αυτοί δεν έχουν ακόμα να διερευνηθούν με μεγαλύτερη λεπτομέρεια. Για παράδειγμα, η εμπλοκή των χημειοκινών σε αλληλεπιδράσεις με όγκο ενδοθηλιακά και τα αποτελέσματά τους για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων δεν είναι καλά κατανοητοί [25]. Ακόμη περισσότερο, οι σημαντικές μοριακές και δομικές αλλαγές που λαμβάνουν χώρα στο ενδοθήλιο μετά από θεραπεία TNF-α μπορεί να ενισχύσει μεταστατικό μετενσάρκωση των καρκινικών κυττάρων. Μένει επίσης να δούμε πώς καρκινικών κυττάρων εξαγγείωση ποικίλλει ανάλογα με υπενδοθηλιακό ακαμψία του υποστρώματος. Όπως παρατηρήθηκε με λευκοκύτταρα [19], είναι πιθανό ότι ο καρκίνος των κυττάρων μετανάστευση μπορεί να αυξηθεί με την αύξηση της ακαμψίας του υποστρώματος. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν επίσης παρατηρηθεί να ωθήσει ECs στην εξωκυτταρική μήτρα κατά τη διάρκεια της εξαγγείωσης, υποδεικνύοντας ότι οι μηχανικές ιδιότητες του ECM μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο η κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου και υποενδοθηλιακή ακαμψία του υποστρώματος μπορεί να επηρεάσει καρκινικών κυττάρων εξαγγείωση.

Σε αυτήν την εργασία, ένας

in vitro

μοντέλο του αγγειακού ενδοθηλίου [19 ], [26] – [28] χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει καρκινικού κυττάρου μετανάστευση και πώς αυτή η διαδικασία συγκρίνεται με εξαγγείωσης λευκοκυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα από τα πρώτα βήματα στην εξαγγείωση του μεταστατικού καρκίνου του μαστού κυττάρων είναι ενσωμάτωση της μονοστοιβάδας των EC, η οποία διαταράσσει σημαντικά το φράγμα ΕΚ και σωματικά εκτοπίζει ECs, μερικές φορές οδηγεί σε πλήρη απομάκρυνση του ECS από την μονοστιβάδα. Σε αντίθεση με λευκοκυττάρων μετανάστευση, η ενσωμάτωση των καρκινικών κυττάρων δεν εξαρτάται από την κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου ή υποενδοθηλιακή ακαμψία υπόστρωμα για τα κύτταρα μελανώματος και κύτταρα καρκίνου του μαστού. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ενσωμάτωση του παγκρέατος κύτταρο εξαρτάται από την κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου και υποενδοθηλιακό ακαμψία. Μαζί, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ο καρκίνος του μαστού κύτταρο μεταστατικού εξαγγείωση συνεπάγεται ένα επιπλέον στάδιο της ενσωμάτωσης στο ενδοθήλιο, το οποίο δεν εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εξαγγείωσης λευκοκυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Παρασκευή υποστρωμάτων πηκτή πολυακρυλαμιδίου

πήγματα Thin πολυακρυλαμιδίου παρασκευάστηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Wang και Pelham [29] και περιγράφεται λεπτομερώς σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [19], [23], [30] – [33]. Εν συντομία, 280 kPa (15% ακρυλαμίδιο + 1,2% δις ακρυλαμίδιο) και 0,87 kPa (3% ακρυλαμίδιο + 0,1% δις ακρυλαμίδιο) πηκτώματα δημιουργήθηκαν και επικαλύφθηκαν με 0,1 mg /mL ινωδονεκτίνης (Sigma-Aldrich), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Χαρακτηρισμός μέτρο ελαστικότητας του Young των γελών επιτεύχθηκε με μικροσκοπία ατομικής δύναμης και δυναμική μηχανική ανάλυση, ενώ η ανάλυση των επιφανειακών δεσμευμένη ινονηκτίνη επιτεύχθηκε με ανοσοφθορισμό [23], [32]. Για τα πειράματα σε γυαλί, 22 × 22 mm καλυπτρίδες (Fisher Scientific) επικαλύφθηκαν με 0,1 mg /mL ινονηκτίνη για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (Lifeline Τεχνολογία κυττάρων) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. MDA-MB-231 μεταστατικά κύτταρα καρκίνου του μαστού (ATCC) και κύτταρα μελανώματος Α375 (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε DMEM, 10% FBS και 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. SW1990 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε DMEM, 10% FBS, και 50 μg /mL γενταμυκίνη. HUVECs (περάσματα 2-5, 4 × 10

5 συνολικά) απλώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες ινωδονεκτίνη επικαλυμμένα ή πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου και αναπτύχθηκαν για περίπου 48 ώρες, στο οποίο σημείο ένα μονοστιβάδα που σχηματίζεται. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσα ελέγχου ή 25 ng /mL παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) για τις τελικές 24 ώρες πριν από τα πειράματα. Σε μερικά πειράματα, HUVECs επιμολύνθηκαν με VE-cadherin-GFP (VEcadGFP) χρησιμοποιώντας αδενοϊό (Adv), που περιήλθε ως ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. William Luscinskas (Harvard Medical School). εργαστήριο Dr. Luscinskas έχει προηγουμένως περιγραφεί η διαδικασία για την κατασκευή του πλασμιδίου VEcadGFP και μεταφορά σε ένα φορέα έκφρασης αδενοϊού [35]. HUVECs απλώθηκαν πάνω σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου ινωδονεκτίνη επικαλυμμένα ή γυάλινες καλυπτρίδες και δεδομένου 1-2 ώρες για να εξαπλωθεί, και 3 μί του AdV-VEcadGFP προστέθηκαν στα κύτταρα με 2 mL μέσου ανά υπόστρωμα. HUVECs στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για σχηματισμό μονοστιβάδα, όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι μονοστιβάδες πλύθηκαν με PBS πριν από την προσθήκη επιπλέον HUVECs ή καρκινικά κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα συνολικά) στην κορυφαία επιφάνεια της μονοστιβάδας 22 × 22 mm. Για να γίνει διάκριση μεταξύ των κυττάρων HUVEC εντός της μονοστιβάδας και τα πρόσθετα κύτταρα προστίθενται στη μονοστοιβάδα, προστίθεται HUVECs ή MDA-MB-231 κύτταρα χρωματίστηκαν με το λιπόφιλο DiIC

16 χρωστική (1 μΜ) σε εναιώρημα για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου , που ακολουθείται από φυγοκέντρηση και πλύση με PBS.

απεικόνιση ζωντανών κυττάρων και ανάλυση

μικροσκοπία ζωντανών κυττάρων ολοκληρώθηκε σε κλειστό μικροσκόπιο στάδιο επώασης στους 37 ° C, 5% CO

2 και 55% υγρασία χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus IX71). Εικόνες συνελήφθησαν είτε με QImaging Retiga-SRV συζευγμένου φορτίου συσκευή (CCD) ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (QImaging Corporation) χρησιμοποιώντας λογισμικό IPLab (Becton, Dickinson and Company), ή με αα ψηφιακή φωτογραφική μηχανή QImaging Rolera-MGI CCD (QImaging Corporation) χρησιμοποιώντας Slidebook λογισμικού (έκδοση 4.2.0.9? Ευφυής Καινοτομίες Imaging). αντίθεσης φάσης, αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC), ή /και εικόνες timelapse φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας είτε ένα 20 × /0,45 NA Ph1 στόχο ή ένα στόχο πετρελαίου NA 60 × /1.42. Το κλάσμα των ενσωματωμένων κυττάρων (HUVEC ή ΜϋΑ-ΜΒ-231) υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων που έγινε ενσωματωθεί σε οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της ακολουθίας timelapse από τον συνολικό αριθμό των κυττάρων φάσης-λευκό πάνω από την μονοστιβάδα στο αρχικό πλαίσιο του αλληλουχία. Ο χρόνος για να ολοκληρωθεί η ενσωμάτωση υπολογίστηκε με βάση τη διαφορά μεταξύ του χρόνου, όταν για πρώτη φορά άρχισε να εξαπλώνεται σε μονοστιβάδα και τη στιγμή που το κύτταρο φτάσει το μέγιστο εξάπλωση περιοχή εντός της μονοστοιβάδας το κύτταρο.

Παρέμβαση μικροσκοπία ανάκλασης

μικροσκοπία ανάκλασης παρεμβολή (IRM) χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει επιφάνεια προς επιφάνεια παρεμβολής μεταξύ ακτίνες φωτός που ανακλάται από το υπόστρωμα /μέσο διασύνδεσης και εκείνων που προέρχονται από τη διεπαφή μέσου /κύτταρο, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη εργασία μας [36] – [38] . Στην τεχνική αυτή, η ένταση του φωτός είναι ένα μέτρο της εγγύτητας του κυττάρου στην επιφάνεια του γυαλιού, έτσι ώστε περιοχές της μεμβράνης που βρίσκεται πλησιέστερα προς την επιφάνεια εμφανίζονται σκοτεινές και εκείνοι μακρύτερα εμφανίζονται φωτεινότερα. Ως εκ τούτου, IRM αποτελεί τη βέλτιστη μέθοδο κατά την αξιολόγηση κυτταρικής προσκόλλησης, πρόσφυση, και την εξάπλωση της συμπεριφοράς [36] – [38]. Για πειράματα εξάπλωση, 1 × 10

5 MDA-MB-231 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες επικαλυμμένες με ινονηκτίνη 22 × 22 mm σε HUVEC μέσα ενημέρωσης, με αποτέλεσμα την παρατήρηση των μεμονωμένων κυττάρων. Για αυτά τα πειράματα, ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus IX71) με ένα 60 × /1,42 NA έλαιο αντικειμενικό φακό και μία λυχνία υδραργύρου 100 W (Olympus? Χρησιμοποιούνται σε μήκος κύματος 561) χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με μια κάμερα CCD (Retiga SRV κάμερα, QImaging) για λήψη εικόνας. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα κλειστό θάλαμο μικροσκόπιο το οποίο διατηρείται συνθήκες καλλιέργειας στους 37 ° C, 50% υγρασία, και 5% CO

2. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής εξάπλωσης, ένα πλαίσιο καταγράφηκε κάθε 5 δευτερόλεπτα επί μία περίοδο 1 μhour για Ν = 5 ανεξάρτητα πειράματα. Για στατιστικές αξιολογήσεις των περιοχών εξάπλωσης, οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health). Τα κυτταρικά-όρια εντοπίστηκαν από το χέρι και την περιοχή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ ρουτίνες. Τομείς MDA ΜΒ-231 κύτταρα εξαπλώνονται σε μια μονοστοιβάδα HUVEC επίσης εντοπιστεί με το χέρι και σε σύγκριση με τα μεμονωμένα κύτταρα εξαπλώνεται πάνω στο ενδοθήλιο χωρίς καλυπτρίδα.

Ομοεστιακή Imaging

Ένα σύνολο από 1 × 10

5 MDA-MB-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 μί CellLight Actin-GFP (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και αφέθηκαν να επωαστούν για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, μολύνονται MDA-MB-231 κύτταρα εισήχθησαν σε μία συρρέουσα μονοστοιβάδα HUVEC και αφέθηκε να ενσωματώσει για 15 ώρες. Μετά την ενσωμάτωση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας Texas Red-φαλλοειδίνη (Invitrogen). εικόνες Z-stack συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 710 ομοεστιακό μικροσκόπιο με στόχο 63 × πετρελαίου.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας ένα Student t-test μεταξύ των ζευγών των δεδομένων, ή με τη χρήση ANOVA για τις ομάδες των δεδομένων, όπου Ρ & lt? 0,05 υποδεικνύεται στατιστική σημασία. Μετά ANOVA, πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση ειλικρινά σημαντικό κριτήριο διαφορά της Τουρκίας. Όλες οι μετρήσεις που αναφέρονται εδώ σε μορφή μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα.

Αποτελέσματα

Ενσωμάτωση στο ενδοθήλιο είναι το πρώτο βήμα στο μεταστατικό καρκίνο του μετενσάρκωσης

MDA-MB-231 μεταστατικό καρκίνο του μαστού τα κύτταρα εισήχθησαν στην κορυφαία επιφάνεια μίας μονοστοιβάδας ΕΚ και παρακολουθείται όπως αλληλεπίδραση με το ενδοθήλιο (Ταινία S1). Αρχικά, MDA-MB-231 κύτταρα ήταν φωτεινό λευκό και σφαιρικά, σε αντίθεση με την υποκείμενη φάση-σκοτεινό και πεπλατυσμένη ενδοθήλιο (Σχ. 1Α). Μέσα σε αρκετές ώρες, τα κύτταρα MDA-MB-231 άρχισαν να ενσωματώσει στο ενδοθήλιο, σε μια διαδικασία που κυμαίνονταν κατά μέσο όρο από 40 έως 60 λεπτά (Εικ. 1Β) και ήταν οπτικά διακριτή από ουδετερόφιλων μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου (Εικ. 1 C) . Συγκεκριμένα, φαίνεται ότι η ECs πλησίον της θέσεως της ενσωμάτωσης ήταν φυσικώς εκτοπιστεί, δημιουργώντας κενά για το κύτταρο MDA-MB-231 για να εξαπλωθεί επί του υποκείμενου πλέγματος (Εικ. 1Α), ενώ τα ουδετερόφιλα πιέζεται μέσω του ενδοθηλίου, χωρίς να διαταράσσεται η μονοστιβάδα ( Εικ. 1 C). Κάποια ECs αποσπάται από το υποκείμενο μήτρα, στρογγυλοποιούνται προς τα πάνω και έγινε σφαιρικό μετά την ενσωμάτωση των MDA-MB-231 κυττάρων σε μονοστιβάδα (Εικ. 2). Περίπου 25% του ECs μονοκατοικιών μετά την ενσωμάτωση των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2). Ωστόσο, η ενσωμάτωση του MDA-MB-231 κυττάρων στο ενδοθήλιο εμφανίστηκε πιο αργά, με μια μικρότερη κλίση «εξάπλωση περιοχής έναντι του χρόνου», και είχε μια χαμηλότερη τελική κυτταρική περιοχής σε σύγκριση με MDA-MB-231 κύτταρα εξάπλωση επάνω σε ένα endothelium- ελεύθερο φιμπρονεκτίνης-επικαλυμμένο υπόστρωμα (Εικ. 3D), υποδεικνύοντας ότι το ενδοθήλιο δεν ευνοεί την ενσωμάτωση του καρκινικού κυττάρου, αλλά μάλλον περιορισμένη συνολική εξάπλωση περιοχή. Επιπλέον, η ενσωμάτωση των κυττάρων MDA-MB-231 στο ενδοθήλιο εμφανίστηκε πιο αργά, με μια μικρότερη κλίση «σωρευτικό ενσωμάτωση συναρτήσει του χρόνου», σε σύγκριση με ECs ενσωμάτωση σε μονοστιβάδα ECs (Εικ. 3Α). Έτσι, είναι πιθανό ότι η ενσωμάτωση των κυττάρων MDA-MB-231 κυττάρων στο ενδοθήλιο λαμβάνει χώρα με διαφορετικό μηχανισμό από τη μητρική ECs εξαπλώνεται στον ίδιο ενδοθήλιο. κύτταρα μελανώματος Α375 και SW1990 παγκρεατικά κύτταρα εισήχθησαν επίσης στην κορυφαία επιφάνεια του ενδοθηλίου. Παρομοίως με MDA-MB-231 κύτταρα, τα κύτταρα μελανώματος και τα παγκρεατικά κύτταρα άρχισαν να ενσωματώσει στο ενδοθήλιο σε μια διαδικασία που διήρκεσε περίπου 15 λεπτά και 50 λεπτά αντίστοιχα. καρκίνος Α375 κύτταρα ενσωματώθηκαν στην μονοστιβάδα με πολύ ταχύτερο ρυθμό σε σύγκριση με μεταστατικό καρκίνο του μαστού κύτταρα και δυναμική ενσωμάτωσή τους έμοιαζε στενά με εκείνο του φυσικού ECs εξαπλώνεται στον μονοστιβάδα ΕΚ. Α375 κύτταρα μελανώματος είχε ένα τελικό κλάσμα της ενσωμάτωσης που έμοιαζε ECs εξαπλώνεται σε ECs, ενώ ο καρκίνος SW1990 κύτταρα είχαν μια πολύ χαμηλότερη κλάσμα ενσωμάτωση σε σύγκριση με όλες τις ομάδες (Σχήμα 3C). Επιπλέον, ομοεστιακό εικόνες (Σχήμα 4Α) αποκάλυψε ότι μετά από 15 ώρες από την ενσωμάτωση, MDA-MB-231 (πράσινο) κύτταρα μετατοπίζεται ECs (κόκκινο), με την κατανομή μεταξύ γειτονικών ECs. Ορθογώνια προβλέψεις δείχνουν ότι MDA-MB-231 κύτταρα είναι στη διάδοση μεταξύ της ECS γεγονός και να μην μεταναστεύουν κάτω από αυτά κατά τη διάρκεια της ενσωμάτωσης (Εικόνα 4Β).

(Α) εικόνα αντίθεσης φάσης των MDA-MB-231 κύτταρα (φωτεινό λευκό ) στην κορυφή ενός ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών (HUVEC) μονοστοιβάδα. μπαρ κλίμακα είναι 20 μm. (Β) MDA-MB-231 κυττάρων (μαύρα βέλη) αρχίζει να ενσωματωθούν στο ενδοθήλιο, όπως υποδεικνύεται από την αλλαγή του στην μικροσκοπία αντίθεσης φάσης από φωτεινό λευκό σε σκοτεινό. μπαρ κλίμακα είναι 20 μm και εφαρμόζεται σε όλες τις εικόνες στον πίνακα Β χρονικό διάστημα μετά την επίστρωση MDA-MB-231 κύτταρα για το ενδοθήλιο αναγράφεται στην πάνω δεξιά γωνία κάθε εικόνας σε ώρα: Μορφή δεύτερο: λεπτά. Το τελικό ποσοστό ενσωμάτωσης για αυτό το πείραμα ήταν 95%. ακολουθία εικόνας (C) αντίθεσης φάσης ενός διαμετακινήθηκαν ουδετερόφιλων μέσω ενός ΤΝΡ-α-ενεργοποιημένο ενδοθήλιο. μπαρ κλίμακα είναι 20 μm και εφαρμόζεται σε όλες τις εικόνες στον πίνακα Γ Μήκος του χρόνου μετά την επίστρωση των ουδετερόφιλων στο ενδοθήλιο αναγράφεται στην πάνω δεξιά γωνία κάθε εικόνας σε ώρες: λεπτά:. μορφή δεύτερη

Η

αντίθεσης φάσης (αριστερά) και DiIC

16 φθορισμού (δεξιά) εικόνες MDA ΜΒ-231 κύτταρα επιστρώνονται επάνω σε ένα μη επεξεργασμένο μονοστοιβάδα HUVEC, σε χρονικά σημεία αμέσως μετά την επίστρωση (επάνω) και μετά από 16 ώρες από την αλληλεπίδραση με το ενδοθήλιο (κάτω ). Κόκκινα βέλη δείχνουν τη σταδιακή-λευκά κύτταρα που δεν εκπέμπουν φθορισμό? αυτά είναι τα ενδοθηλιακά κύτταρα που έχουν αναγκαστεί να βγει από τη μονοστοιβάδα και ως εκ τούτου έχουν αποσπαστεί και να γίνει στρογγυλεμένες. μπαρ κλίμακα είναι 25 μm και εφαρμόζεται σε όλες τις εικόνες.

Η

(Α) Σωρευτική κλάσμα των ΑΕΚ ή MDA-MB-231 κύτταρα (231), SW1990 (1990), και τα κύτταρα Α375 ενσωματωθεί στο ενδοθήλιο ως συνάρτηση του χρόνου μετά την επίστρωση. Τα σημεία των δεδομένων παριστούν τον μέσο όρο ± SEM για τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα (Ν & gt? 20 κύτταρα για κάθε πείραμα). (Β) Τελική κλάσμα των κυττάρων MDA-MB-231 ενσωματώνεται στο μη επεξεργασμένο ή ΤΝΡ-α επεξεργασμένα ενδοθήλιο μετά από 15 ώρες. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή, ενώ μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. P & gt? 0.05 μεταξύ αυτών των τιμών δείχνει ότι υπάρχει στατιστική διαφορά (n.s.). (C) Τελική κλάσμα των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, ECs, κύτταρα μελανώματος Α375 και κύτταρα SW1990 παγκρεατικών ενσωματωθεί στο ενδοθήλιο μετά από 15 ώρες. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή, ενώ μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (*) Δείχνει τη σημασία (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με ECs. (D) Plot εξάπλωσης περιοχή συναρτήσει του χρόνου αποκαλύπτει τις διαφορές στη διάδοση δυναμική για MDA-MB-231 κύτταρα εξάπλωση επάνω σε ένα φιμπρονεκτίνη επικαλυμμένα καλυπτρίδα ( «μονά κύτταρα») ή σε ένα μη επεξεργασμένο ενδοθήλιο ( «σε μονοστιβάδα»).

(α) έναν εκπρόσωπο MDA-MB-231 (πράσινο? ακτίνη-GFP) κύτταρο μολυσμένο με GFP-ακτίνης παρουσιάζεται εξαπλώνεται σε μια μονοστοιβάδα HUVEC (κόκκινο? Φαλλοϊδίνη). Οι ορθογώνιες προβολές παρουσιάζονται. (Β) Σχηματική δείχνουν ότι ένα καρκινικό κύτταρο (πράσινο) μετατοπίζει ECs (κόκκινο), με την κατανομή μεταξύ των παρακείμενων ECs κατά την ενσωμάτωση.

Η

Η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου από τον TNF-α δεν επηρεάζει τη δυναμική ενσωμάτωση του καρκίνου του μαστού και κύτταρα μελανώματος

η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου αποτελεί ένα βασικό βήμα στον καταρράκτη προσκόλληση λευκοκυττάρων και η προηγούμενη εργασία μας έχει αποδείξει ότι μετανάστευση λευκοκυττάρων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κατάσταση ενεργοποίησης του ενδοθηλίου [19], [28], [ ,,,0],30]. Η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου από τον TNF-α ρυθμίζει προς τα πάνω όχι μόνο μόρια προσκόλλησης όπως ICAM-1 και προσκόλλησης αγγειακού κυττάρου μόριο-1 (VCAM-1), αλλά επίσης αυξάνει τη συσταλτικότητα ΕΚ [31] και μειώνει τη λειτουργία φραγμού ΕΚ [20]. Ως εκ τούτου, ο επόμενος στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί αν η ενσωμάτωση του μεταστατικού καρκίνου του μαστού κυττάρων στο ενδοθήλιο απαιτούσε την ECs να ενεργοποιηθεί. Περιέργως, βρήκαμε ότι η σωρευτική κλάσμα ενσωμάτωση συναρτήσει του χρόνου των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα ήταν παρόμοια, ανεξάρτητα από το αν η ECs υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡ-α (Εικ. 3Α). Επιπλέον, το τελικό κλάσμα των κυττάρων που ενσωματώνονται σε ένα TNF-α-ενεργοποιημένο ενδοθήλιο Μετά από 15 ώρες δεν ήταν διαφορετικό από το κλάσμα που ενσωματώνεται σε ένα άνευ αγωγής ενδοθήλιο (Σχ. 3Β). Τέλος, ο χρόνος που απαιτείται για την ολοκλήρωση ενσωμάτωση (από ένα στρογγυλεμένο σφαίρα σε ένα πεπλατυσμένο κύτταρο μέσα στο ενδοθήλιο) δεν εξαρτάται από το εάν η ενδοθήλιο υφίσταται κατεργασία με ΤΝΡ-α (Εικ. 5C). Παρόμοια με κύτταρα καρκίνου του μαστού, το κλάσμα της ενσωμάτωσης του μελανώματος Α375 κυττάρων σε ECs ήταν συγκρίσιμα, ανεξαρτήτως του αν η ECs υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡ-α (Σχήμα S1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μερικά μεταστατικά καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να ολοκληρώσει τα πρώτα στάδια της εξαγγείωσης, ακόμη και απουσία μιας φλεγμονώδους ερεθίσματος. Ωστόσο, το κλάσμα της ενσωμάτωσης μετά από 15 ώρες για τα κύτταρα του παγκρέατος SW1990 ήταν στατιστικά διαφορετική μεταξύ μη επεξεργασμένων ECs και εκείνων που έλαβαν θεραπεία με TNF-α (Σχήμα S2). κύτταρα SW1990 ενσωματώνεται σε ένα πολύ ταχύτερο ρυθμό και υψηλότερες κλάσμα σε ΤΝΡ-α θεραπεία ECs σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ECs.

(Α) Σωρευτική κλάσμα MDA ΜΒ-231 κύτταρα-ενσωματώνεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα επί μία φιμπρονεκτίνη επικαλυμμένα 0.87 kPa ή 280 kPa πηκτής πολυακρυλαμιδίου, ή γυαλί (50 GPa). Τα σημεία των δεδομένων παριστούν τον μέσο όρο ± SEM για τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα (Ν & gt? 20 κύτταρα για κάθε πείραμα). (Β) Τελική κλάσμα των κυττάρων MDA-MB-231 ενσωματώνεται στο (μη επεξεργασμένα) ενδοθήλιο ως συνάρτηση του υποενδοθηλιακό ακαμψία υποστρώματος. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή, ενώ μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. P & gt? 0.05 μεταξύ αυτών των τιμών δείχνει ότι υπάρχει στατιστική διαφορά (n.s.). (C) Χρόνος για MDA-MB-231 κύτταρα για να ολοκληρωθεί η ενσωμάτωση είναι ανεξάρτητη από τις μηχανικές ιδιότητες του υποστρώματος κάτω από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε γυάλινες καλυπτρίδες επικαλυμμένες με ινονηκτίνη (50 GPa) ή γέλες πολυακρυλαμιδίου (0,87 kPa ή 280 kPa) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (χωρίς TNF) ή επεξεργασμένα με ΤΝΡ-α (TNF). Αριθ στατιστική διαφορά στο χρόνο ενσωμάτωση μετρήθηκε ως συνάρτηση του υποενδοθηλιακό ακαμψία του υποστρώματος ή τη θεραπεία των ενδοθηλιακών κυττάρων (Ρ & gt? 0,05).

Η

Ενσωμάτωση είναι ανεξάρτητη από υποενδοθηλιακό ακαμψία υπόστρωμα για τον καρκίνο του μαστού και κύτταρα μελανώματος

προηγούμενη εργασία μας απέδειξε επίσης ότι μετανάστευση λευκοκυττάρων εξαρτάται από τις μηχανικές ιδιότητες του υποστρώματος κάτω από τα ενδοθηλιακά κύτταρα [19], [30]. Άκαμπτο υποενδοθηλιακό μήτρες προωθούν μυοσίνης εξαρτάται ελαφριάς αλυσίδας κινάσης συσταλτικότητα ΕΚ, οδηγώντας σε μεσοκυττάρια χάσματα και την ενίσχυση των λευκοκυττάρων μετενσάρκωσης [19], [30]. Ως εκ τούτου, ο επόμενος στόχος μας ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσον η ενσωμάτωση των καρκινικών κυττάρων μεταστατικό καρκίνο του μαστού στο ενδοθήλιο εξαρτιόταν από υπενδοθηλιακό ακαμψία του υποστρώματος. Σε αντίθεση με μετανάστευση των ουδετερόφιλων, η οποία αυξάνει με υποενδοθηλιακό ακαμψία υπόστρωμα, η δυναμική της ενσωμάτωσης των κυττάρων MDA-MB-231 στο ενδοθήλιο ήταν παρόμοια για μαλακά (0,87 kPa), το ενδιάμεσο (280 kPa), και πολύ σκληρό (γυαλί? 50 GPa) υποενδοθηλιακό υποστρώματα (Εικ. 5Α). Επιπλέον, η τελική ενσωματώνεται κλάσμα των κυττάρων MDA-MB-231 στο ενδοθήλιο ήταν ανεξάρτητη από υποενδοθηλιακό ακαμψία του υποστρώματος (Σχ. 3Β). και ο συνολικός χρόνος που απαιτείται για την ολοκλήρωση μετανάστευση ήταν ανεξάρτητη από υποενδοθηλιακό ακαμψία του υποστρώματος (Σχ. 5C). Α375 κύτταρα μελανώματος ενσωματωθεί μαλακό, ενδιάμεση, και πολύ σκληρό υποενδοθηλιακό μήτρες με παρόμοια δυναμική ενσωμάτωση και τελικό κλάσμα της ενσωμάτωσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού (Εικ S3). SW1990 παγκρεατικά κύτταρα παρουσίασαν διαφορετική συμπεριφορά από τα κύτταρα του μελανώματος και του καρκίνου του μαστού κύτταρα (Σχ S4). Όταν τα κύτταρα SW1990 απλώθηκαν σε μαλακό και ενδιάμεσα υποστρώματα, θα εμφανιστεί ένα παρόμοιο επίπεδο δυναμικής ενσωμάτωσης και τελικό κλάσμα της ενσωμάτωσης μετά από 15 ώρες (Εικ S4). Ωστόσο, όταν επιτρέπεται να ενσωματώσει σε πολύ δύσκαμπτο μήτρες (γυαλί? 50 GPa), που εμφανίζεται πολύ χαμηλότερο κλάσμα της ενσωμάτωσης και βραδύτερο ρυθμό ενσωμάτωσης. Ενώ επόμενα στάδια της μεταστατικής καταρράκτη μπορεί να εξαρτάται από το υπόστρωμα ακαμψία, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα πρώτα στάδια της εξαγγείωσης κυττάρων καρκίνου του μαστού και εξαγγείωση μελανώματος συμβαίνουν ανεξάρτητα από τις μηχανικές ιδιότητες της μήτρας κάτω από το ενδοθήλιο ενώ ενσωμάτωση παγκρεατικών κυττάρων αλλάζει σε πολύ σκληρό υποστρώματα.

τα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν VE-cadherin κατά μήκος των συνόρων με ενσωματωμένα κύτταρα καρκίνου του μαστού

Αγγειακά ενδοθηλιακά καντερίνη (VE-καδερίνη) αποτελεί ένα από τα βασικά μόρια ομόφιλης πρόσφυσης που εκφράζονται από ECs κατά κυττάρου-κυττάρου σύνορα σε ένα συρρέουσα μονοστιβάδα. Η ακεραιότητα του ενδοθηλίου ως αγγειακή φράγμα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη σωστή λειτουργία της VE-cadherin μόρια προσκόλλησης [39], [40]. Όπως ενσωματώνεται ΑΕΚ σε ένα υγιές συρροή ενδοθήλιο, GFP-VE-cadherin εκφράστηκε από όλα τα ECs που γειτνιάζουν με την ενσωματώνονται DiIC

16-επισημασμένο ΕΚ (Εικ. 6Α, Movie S2), υποδεικνύοντας ότι η προσθήκη των νέων ΑΕΚ στην μονοστιβάδα δεν το έκανε διαταράσσουν την ακεραιότητα των κόμβων ΕΚ. Εμείς δίπλα προσπάθησαν να προσδιορίσουν πιθανές αλλαγές σε VE-καδερίνη μορφολογία μετά την ενσωμάτωση των MDA-MB-231 κυττάρων στο ενδοθήλιο. Εντυπωσιακά, ECs γειτονικό ενσωματώνεται DiIC

16-επισημασμένο MDA-MB-231 κύτταρα δεν εκφράζουν GFP-VE-cadherin στις διαχωριστικές με τα κύτταρα MDA-MB-231, αν και συνέχισαν να εκφράζουν GFP-VE-cadherin στους κόμβους με άλλα ECs (Εικ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρώιμη φάση της εξαγγείωσης των καρκινικών κυττάρων δεν επηρεάζει μόνο VE-cadherin-εξαρτώμενη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, αλλά μπορεί επίσης να παρέχει μια εύκολα προσβάσιμη διαδρομή εξαγγείωσης άλλα κυκλοφορούντα κύτταρα όγκου.

DiIC16 σημασμένο HUVECs (Α) ή MDA-MB-231 (Β) απλώθηκαν σε ενδοθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν VE-καντερίνη-GFP ​​(VE-cad-GFP). Εικόνες συλλήφθηκαν μετά την ενσωμάτωση κάθε τύπου κυττάρου. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm και εφαρμόζεται σε όλες τις εικόνες σε αυτό το σχήμα.

Η

ενσωμάτωση κυττάρων καρκίνου του μαστού ξεκινά από την εξάρθρωση VE-cadherin στις διασταυρώσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων

Πριν από την έναρξη της MDA- ενσωμάτωση ΜΒ-231 στο ενδοθήλιο, παρατηρήσαμε άθικτο GFP-VE-cadherin στη διασταύρωση ΕΚ ακριβώς κάτω από το MDA-MB-231 κυττάρων (Εικόνα 7Α?. κόκκινα βέλη, Ταινία S2). Αυτό ήταν σε άμεση αντίθεση με τα κύτταρα MDA-MB-231, που ενσωματώνεται στο ενδοθήλιο σε προηγούμενα χρονικά σημεία, όπου GFP-VE-καδερίνης δεν εκφράζεται από τα γειτονικά ECs (Σχήμα 7Α?. Κίτρινα βέλη). Το πρώτο βήμα της ενσωμάτωσης δημιούργησε μια αναστάτωση στο GFP-VE-cadherin στη διασταύρωση ΕΚ ακριβώς κάτω από το κύτταρο MDA-MB-231, που οδηγεί στο σχηματισμό ενός μικρού (~ 2 μm

2) τρύπα στη διασταύρωση ΕΚ (Εικ . 7Β? κόκκινο βέλος). Μια δεύτερη μικρή τρύπα μερικές φορές σχηματίζεται (Σχήμα 5Β?. Δύο κόκκινα βέλη) πριν από το κενό που έγιναν σημαντικά μεγαλύτερη (~ 33 μm

2 σε Τ = 6:35) και καθάρισαν την περιοχή του τμήματος του σώματος του ΕΚ. Τέλος, αυτό που ξεκίνησε ως ένα μικρό κενό στο GFP-VE-cadherin πολλαπλασιάστηκε σε μια τεράστια τρύπα στο ενδοθήλιο, το οποίο έγινε καταλαμβάνεται από το κύτταρο MDA-MB-231 (Σχ. 7Β). Παρατηρήσαμε επίσης σημαντική μετατόπιση και την αναδιάρθρωση της GFP-VE-cadherin στα κοντινά κόμβους ΕΚ-ΕΚ (Σχήμα 7Β?. Κίτρινα βέλη).

DiIC

16-σημασμένα κύτταρα MDA-MB-231 απλώθηκαν σε ενδοθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν VE-cadherin-GFP (VE-cad-GFP). (Α) Ορατή είναι διαφορική αντίθεση παρέμβασης (DIC), DiIC

16 (κόκκινο) φθορισμού, και VE-cadherin-GFP (πράσινο) φθορισμό, και επικάλυψη εικόνων. Σε αυτό το χρονικό σημείο, ένας MDA-MB-231 έχει ήδη ενσωματωθεί στο ενδοθήλιο (κίτρινα βέλη), και το VE-cadherin-GFP είναι ακόμα άθικτο στη θέση ακριβώς κάτω από ένα άλλο κύτταρο MDA-MB-231 που δεν έχει ακόμη αρχίσει να ενσωματώνουν (κόκκινα βέλη). αλληλουχία timelapse (Β) φθορισμού ενός DiIC

16-επισημασμένο MDA-MB-231 κυττάρων (κόκκινο) που ενσωματώνει σε ένα ενδοθήλιο εκφράζουν VE-καντερίνη-GFP ​​(πράσινη). Χρονικό διάστημα μετά την επίστρωση MDA-MB-231 κυττάρων στο ενδοθήλιο αναγράφεται στην πάνω δεξιά γωνία κάθε εικόνας σε ώρα: Μορφή λεπτό. Κλίμακα μπαρ στον πίνακα Α (DIC εικόνα) είναι 10 μm και εφαρμόζεται σε όλες τις εικόνες σε αυτό το σχήμα.

Η

Συζήτηση

μετάσταση του καρκίνου εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο [1], [2], και ένα από τα κρίσιμα βήματα που ρυθμίζουν μετάσταση είναι εξαγγείωση από το αγγειακό σύστημα. Ενώ οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη διαδικασία αυτή είναι ασαφείς, το ενδοθήλιο είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο, ενεργώντας είτε ως φραγμός σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα, ή ένα προαγωγό της διεισδυτικής ικανότητας σε άλλα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41]. ΕΚ απόπτωση και κάθαρση από τη βασική μεμβράνη έχουν προηγουμένως αναφερθεί ως παρενέργειες κατά τη διάρκεια των καρκινικών κυττάρων εξαγγείωση [10], [13]. Ομοίως, σφαιροειδή καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών εκτοπίσει mesothelial κύτταρα κατά τη διάρκεια παρεμβολή στο submesothelial χώρου [16].