Αφηρημένο

Ιστορικό

Η γλυκοζυλίωση είναι μια σημαντική και καθολική θέση -translational τροποποίηση για πολλές πρωτεΐνες, και ρυθμίζει τις λειτουργίες των πρωτεϊνών. Ωστόσο, απλές και ταχείες μεθόδους για την ανάλυση γλυκάνες σε μεμονωμένες πρωτεΐνες δεν ήταν διαθέσιμες μέχρι πρόσφατα.

Μέθοδοι /Κύρια Ευρήματα

Μια νέα τεχνική για την ανάλυση γλυκοπεπτίδια σε ένα εξαιρετικά ευαίσθητο τρόπο από πλέγμα υποβοηθούμενης λέιζερ εκρόφηση /ιοντισμό φασματομετρία μάζας (MALDI-MS) με τη χρήση του υγρού 3AQ μήτρα /CHCA αναπτύχθηκε πρόσφατα και βελτιστοποιημένη αυτή την τεχνική για να αναλύσει μια μικρή ποσότητα πρωτεΐνης διαμεμβρανικής διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο MALDI-MS για να αξιολογήσει την κατάσταση γλυκοζυλίωσης του τύπου μεμβράνης 1 μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΤ1-ΜΜΡ).

O

-glycosylation του ΜΤ1-ΜΜΡ αναφέρεται να ρυθμίζουν τη δράση της πρωτεάσης της και με τον τρόπο αυτό να επηρεάσει την προσβολή καρκινικών κυττάρων. ΜΤ1-ΜΜΡ που εκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα ΗΤ1080 ινοσαρκώματος ανοσοκαταβυθίστηκε και αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Μετά in-gel τρυπτική πέψη της πρωτεΐνης, ένα ενιαίο σταγονίδιο του προϊόντος πέψης εφαρμόστηκε απευθείας στην υγρή μήτρα σε ένα MALDI πλάκα στόχο. Συγκέντρωση των υδρόφιλων γλυκοπεπτιδίων εντός της κεντρικής περιοχής συνέβη λόγω βαθμιαία εξάτμιση του διαλύματος του δείγματος, ενώ μη γλυκοζυλιωμένη υδρόφοβα πεπτίδια παρέμειναν στην περιφέρεια. Αυτό το συγκεκριμένο διαχωρισμό και τη συγκέντρωση των γλυκοπεπτιδίων να ενεργοποιήσετε την ολοκληρωμένη ανάλυση της ΜΤ1-ΜΜΡ

O

-glycosylation.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε αποδείξει, για πρώτη φορά, ετερογενή

O

-glycosylation προφίλ μιας πρωτεΐνης από μια ολόκληρη ανάλυση πρωτεϊνών με τη χρήση MALDI-MS. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα αναφερθεί ότι έχουν μεταβληθεί γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, αυτό το εύκολο στη χρήση μέθοδο για την ανάλυση γλυκοπεπτίδιο ανοίγει τη δυνατότητα να προσδιορίσει συγκεκριμένα μοτίβα γλυκοζυλίωσης των πρωτεϊνών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως νέα βιοδείκτες για κακοήθεις όγκους.

Παράθεση: Shuo Τ, Koshikawa Ν, Hoshino D, Minegishi Τ, Ao-Kondo H, Oyama M, et al. (2012) Ανίχνευση της ετερογενούς

O

-Glycosylation Προφίλ του ΜΤ1-ΜΜΡ εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα με μια απλή μέθοδο MALDI-MS. PLoS ONE 7 (8): e43751. doi: 10.1371 /journal.pone.0043751

Επιμέλεια: Νίκος Κ Καραμάνος, Πανεπιστήμιο Πατρών, Ελλάδα |

Ελήφθη: 5 Απριλίου του 2012? Αποδεκτές: 27 Ιουλ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2012 |

Copyright: © Shuo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β) [22.700.375] (στο TS), ένα Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (S) [22.220.014] (σε MS) και παγκόσμιο Πρόγραμμα COE «Κέντρο Παιδείας και Έρευνας για το Advanced Γονιδιώματος – Based Medicine – για εξατομικευμένη ιατρική και τον έλεγχο των μολυσματικών ασθενειών σε όλο τον κόσμο »(σε TS και MS) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας (MEXT) της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SS, SI, και KT είναι υπάλληλοι της Shimadzu Corporation. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η γλυκοζυλίωση είναι μια κοινή και πολυποίκιλες συν- και μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης [1 ]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η προσθήκη ή τροποποίηση ενός ή περισσότερων τμημάτων σακχάρου μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις στη λειτουργία των πρωτεϊνών και αυτές οι τροποποιήσεις έχουν ενοχοποιηθεί σε διάφορους τύπους ασθενειών [2]. Ειδικότερα, ορισμένες μεταβολές των πρωτεϊνών

O

-glycosylation έχουν αναφερθεί σε κακοήθεις όγκους [3], [4], [5].

O

-glycosylation αρχίζει με την προσθήκη ενός

N -acetylgalactosamine (ΟαΙΝΑο)

με μία ομάδα υδροξυλίου σε ένα υπόλειμμα σερίνης ή θρεονίνης που ακολουθείται από την μεταγενέστερη προσθήκη γαλακτόζης ή

N

-ακετυλογλυκοζαμίνης (ΟΙοΝΑο), η οποία αποτελεί τον πυρήνα της δομής γλυκάνης αλυσίδα [6]. Πυρήνας

O

-γλυκάνες μπορεί να επεκταθεί περαιτέρω από άλλα τμήματα υδατανθράκων όπως φουκόζη, και /ή σιαλικό οξύ. Έχει αναφερθεί ότι οι κύριες δομές του

εμπλέκονται O

-γλυκάνες στο μεταστατικό ικανότητα των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, Iwai

et al

. έδειξε ότι η αναγκαστική έκφραση β1,3-

Ν

-acetylglucosaminyltransferase 6, η οποία προσθέτει β1,3 που συνδέονται ΟΙοΝΑο με ΟαΙΝΑο στο αναγωγικό άκρο, στο ανθρώπινο ινοσάρκωμα FP-10 κύτταρα (μια ιδιαίτερα επεμβατική παραλλαγή των κυττάρων ΗΤ1080 ) είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του

in vitro

μετανάστευση ικανότητα και στο σχηματισμό των πνευμονικών μεταστάσεων

in vivo

σε ποντικούς [7].

ΜΤ1-ΜΜΡ είναι ένας τύπος Ι διαμεμβρανική πρωτεϊνάσης το οποίο παίζει κρίσιμο ρόλο στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων, χάρη στην ικανότητά του να διασπά ένα ευρύ φάσμα των μακρομορίων εξωκυτταρικής μήτρας συμπεριλαμβανομένων κολλαγόνα και λαμινίνες, και να ενεργοποιήσει προΜΜΡ-2 [8]. ΜΤ1-ΜΜΡ έχει μια δομή πολλών περιοχών με έναν καταλυτικό τομέα (Thr

112-Gly

285), ένα πεδίο άρθρωσης (Glu

286-Ile

318), μια όμοια της αιμοπηκτίνης ( Cys

319-Cys

508) και έναν τομέα στελέχους (Pro

509-Ala

541) στην εξωκυτταρική περιοχή [9]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ΜΤ1-ΜΜΡ είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο από

O

-γλυκάνη σε πολλαπλές θέσεις μέσα στην περιοχή της άρθρωσης. Αυτή η τροποποίηση έχει εμπλακεί στην αναγνώριση του υποστρώματος [10], την σταθερότητα της πρωτεΐνης [11], και του κύκλου εργασιών του ενζύμου [12]. Για παράδειγμα, Wu

et al

. έδειξαν ότι ΜΤ1-ΜΜΡ

O

-glycosylation επηρεάζει ενεργοποίηση προΜΜΡ-2 στην κυτταρική επιφάνεια [10]. Πιθανές θέσεις γλυκοζυλίωσης του ΜΤ1-ΜΜΡ προτάθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας αμινοξέων και τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση [10], [13] και τα γλυκάνης ομάδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λεκτίνες και γλυκοσιδάσες [10], [11]. ΜΤ1-ΜΜΡ συνήθως εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα (1-2 × 10

5 μόρια /κύτταρο), ακόμη και σε καρκινικά κύτταρα [14]. Ως εκ τούτου, αυτές οι βιοχημικές μεθόδους δεν είναι κατάλληλες για την ανάλυση της κατάστασης ετερογενή γλυκοζυλίωση των ΜΤ1-ΜΜΡ, ιδιαίτερα σε κλινικά δείγματα.

MALDI-MS [15], [16] είναι ένα απαραίτητο αναλυτικό εργαλείο για την κατανόηση τόσο του πεπτιδίου και γλυκάνης τμήματα γλυκοπεπτιδίων [17]. Ωστόσο, γλυκοπεπτίδια είναι γενικά πιο αναποτελεσματικά ιονίζεται από μη γλυκοζυλιωμένες πεπτίδια, και επιπλέον, το ποσό του γλυκοπεπτιδίου που παράγεται από πέψη με πρωτεάση του δείγματος πρωτεΐνης είναι συνήθως αρκετά μικρή σε σύγκριση με εκείνη του μη γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίου. Ως εκ τούτου, πριν από τον διαχωρισμό γλυκοζυλιωμένης και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτιδίων αναπόφευκτα απαιτείται για την ανάλυση MS [18]. Μία πρόσφατα αναπτύχθηκε MALDI τεχνική χρησιμοποιώντας ένα 3AQ υγρή μήτρα /CHCA, το οποίο αποτελείται από 3-αμινοκινολίνης και α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως, ενεργοποιημένη σε στοχευόμενους διαχωρισμό γλυκοζυλιωμένης και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτίδια που βασίζονται στις διαφορές υδροφιλία τους μετά από ένα σταγονίδιο πρωτεάση πέψης εφαρμόστηκε πάνω υγρή μήτρα σε ένα MALDI πλάκα στόχο [19]. Αυτή η μέθοδος διαχωρισμού σε στοχευόμενους χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση

N

-glycosylation ριβονουκλεάσης Β, το οποίο χρησιμοποιείται ως μοντέλο γλυκοπρωτεΐνη. Εδώ εφαρμόζεται και να βελτιστοποιηθεί η νέα μέθοδος MALDI-MS για να αναλύσει το

O

-glycosylation προφίλ των ΜΤ1-ΜΜΡ εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα σε χαμηλό επίπεδο και προσπάθησε να ανιχνεύσει την ετερογενή κατάσταση τροποποίηση.

Αποτελέσματα

On-στόχο Διαχωρισμός των πεπτιδίων σε ένα υγρό Matrix 3AQ /CHCA

Τα πεπτίδια διαφορετικών υδροφιλικότητας μπορεί να διαχωριστεί από την 3AQ υγρή μήτρα /CHCA στίγματα πάνω σε ένα MALDI πλάκα στόχο [19] . Η μήτρα 3AQ /CHCA σχηματίζει ένα κίτρινο χρώμα παχύρρευστο κηλίδα όταν εφαρμόζεται στην πλάκα στόχο όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1Α. Μια ενιαία σταγονίδιο πρωτεολυτικών πέψης ενός δείγματος πρωτεΐνης που περιέχει τόσο γλυκοζυλιωμένη και μη γλυκοζυλιωμένη πεπτίδια στη συνέχεια κηλίδα επί της επιφάνειας του υγρού πλέγματος. Το δείγμα απλώνεται ομοιόμορφα πάνω στην υγρή μήτρα και το διάλυμα του δείγματος εξατμίζεται σταδιακά μέσα σε περίπου 12 λεπτά (εικ. 1Β). Κατά τη διάρκεια της εξάτμισης, οι υδρόφιλες συστατικά όπως γλυκοπεπτιδίων συμπυκνώθηκε εντός της κεντρικής περιοχής. Σε αντίθεση, υδρόφοβα πεπτίδια τείνουν να αποκλείονται από την εξάτμιση διάλυμα και αφήνονται στην περιφέρεια του υγρού πλέγματος.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου διαχωρισμού επί στοχευόμενα περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη. 3AQ /CHCA πρώτα κηλίδα επί της πλάκας στόχου MALDI, και στη συνέχεια τα πρωτεολυτικά ολόκληρο πέψης πρωτεΐνης που περιέχει τόσο γλυκοζυλιωμένη και μη γλυκοζυλιωμένη πεπτίδια εφαρμόζεται στην επάνω επιφάνεια του υγρού πλέγματος. (Β) Χρόνος παρακολούθησης πορεία της σταγόνας δείγματος στο υγρό της μήτρας. Η εξάτμιση του διαλύματος του δείγματος επιτρέπει το σταγονίδιο να συρρικνωθεί, έτσι ώστε οι υδρόφιλες συστατικά σταδιακά συμπυκνώνεται σε ένα εστιασμένο σταγονίδιο.

Η

Ανίχνευση γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια του Ενδογενούς ΜΤ1-ΜΜΡ

ΜΤ1-ΜΜΡ αποτελεί αναπόσπαστο πρωτεϊνάση μεμβράνη που εκφράζεται στην επιφάνεια των επιθετικών καρκινικών κυττάρων. Πρέπει πρώτα προσπαθήσει να ανιχνεύσει το φάσμα MS παράγεται από γλυκοπεπτίδια του ΜΤ1-ΜΜΡ που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα. Η ενδογενής ΜΤ1-ΜΜΡ ανοσοκατακρημνίστηκε από κυτταρολύματα μεμβράνη ανθρώπινων κυττάρων ινοσαρκώματος ΗΤ1080 χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα που παρασκευάζεται στο εργαστήριο μας, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Τα σιαλικά οξέα, τα οποία αντιστέκονται ιονισμού στο MS ανάλυση [20], απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας σιαλιδάσης. Τα δείγματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (Σχ. 2Α). Αραιώσεις αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) επίσης εφαρμόζονται στην γέλη για την εκτίμηση ποσότητα πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η γέλη χρωματίστηκε με Coomassie Blue και περίπου 150 ng της πρωτεΐνης ΜΤ1-ΜΜΡ αποκόπηκε (Εικ. 2Α, η ταινία σε αγκύλες). Το απομονωμένο θραύσμα γέλη υποβλήθηκε σε πέψη σε πήκτωμα με θρυψίνη και το ένα εξηκοστό του προϊόντος πέψης εφαρμόστηκε απευθείας πάνω στο 3AQ /CHCA μήτρα σε ένα MALDI πλάκα στόχο.

(Α) Ενδογενής ΜΤ1-ΜΜΡ ανοσοκαταβυθίστηκε με αντίσωμα συζευγμένο με ρητίνη αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ από προϊόντα λύσης μεμβράνης των κυττάρων ΗΤ1080 αγρίου τύπου και περαιτέρω διαχωρίστηκε με SDS-PAGE και χρώση με Coomassie Blue. Σιαλιδάσης, το οποίο περιέχει BSA ως φέρουσα πρωτεΐνη, φορτώθηκε υπό το φως λωρίδα (συμβολίζεται με αστερίσκο). Οι αριθμοί στο αριστερό μέρος του πίνακα αντιπροσωπεύει μοριακές μάζες σε kilodaltons (kDa). (Β) Το πολυπεπτίδιο ζώνη που αντιστοιχεί σε ΜΤ1-ΜΜΡ αποκόπηκε, υπέστη πέψη σε πήκτωμα με θρυψίνη. Ένα κλάσμα του θρυπτικού ΜΤ1-ΜΜΡ πέψης που προέρχονται από κύτταρα ΗΤ1080 εφαρμόστηκε απευθείας πάνω στο 3AQ υγρή μήτρα /CHCA στην MALDI πλάκα στόχο. φάσμα MS ελήφθη εντός της κεντρικής περιοχής του υγρού μήτρας (ανοικτός κύκλος [○]). Στερεοσκοπικό μικροσκόπιο εικόνα του τόπου δείγματος φαίνεται στο αριστερό άνω ένθετο. Αριθμός αντιπροσωπεύει τον σωρευτικό ένταση της κορυφής κορυφής (αυθαίρετες μονάδες).

Η

Το τρυπτικό ΜΤ1-ΜΜΡ πέψη εφαρμόζεται στο υγρό μήτρα σε ένα MALDI πλάκα στόχο αφέθηκε να εξατμισθεί και το κεντρικό τμήμα του δείγματος χώρο φόρτωσης ακτινοβολήθηκε χρησιμοποιώντας μια ακτίνα λέιζερ (Εικ. 2Β, εισάγεται εικόνα). Το φάσμα MS δημιουργούνται περιελάμβανε αρκετές κορυφές (

m /z

2,042.5, 2,245.1, 2,406.9, 2,609.7, 2,771.6, 2.974,0 και 3,135.8) και οι αποστάσεις μεταξύ των κορυφών αντιστοιχεί ακριβώς στις μάζες των τυπικών μονοσακχαρίτες: 162 και 203 Da για εξόζης (Hex) και

N

-acetylhexosamine (HexNAc), αντίστοιχα (Εικ. 2Β). Ως εκ τούτου, αυτές οι κορυφές πιστεύεται ότι προέρχεται από ένα μόνο πεπτίδιο γλυκοζυλιωμένη διαφορικά.

Ανάλυση της γλυκοζυλιωμένης πεπτίδια

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις κορυφές γλυκοπεπτιδίου που προέρχονται από ΜΤ1-ΜΜΡ από το δεύτερο και το τρίτο στάδιο της σκλήρυνσης κατά πλάκας αναλύσεις (MS

2 και MS

3), χρησιμοποιήσαμε ένα FLAG-tagged ΜΤ1-ΜΜΡ (ΜΤ1-FLAG) που εκφράζεται σε ΗΤ1080 κύτταρα επειδή από το λόγο ότι μια μεγάλη ποσότητα της FLAG-tagged πρωτεΐνη μπορεί να καθαριστεί εύκολα και αποτελεσματικά. Για την αναπαραγωγή της φυσικής διάταξης γλυκοζυλίωσης του ΜΤ1-ΜΜΡ στα κύτταρα, ΜΤ1-FLAG εκφράστηκε σταθερά σε επίπεδο συγκρίσιμο με εκείνο του ενδογενούς πρωτεΐνης σε κύτταρα άγριου τύπου. Εκφράσαμε ΜΤ1-FLAG σε ένα παράγωγο ΗΤ1080 στο οποίο η έκφραση της ενδογενούς ΜΤ1-ΜΜΡ χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας shRNA. Επίπεδα ΜΤ1-ΜΜΡ έκφραση στα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. S1 Α). ΜΤ1-FLAG καθαρίστηκε από προϊόντα λύσης μεμβράνης των ανάστροφων κυττάρων χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Περίπου 400 ng της πρωτεΐνης ΜΤ1-FLAG λύθηκε με SDS-PAGE (Σχ. S1B) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη μέθοδο διαχωρισμού on-στόχους μέσω MALDI-MS.

Το ληφθέν φάσμα MS του ΜΤ1-FLAG ήταν σχεδόν ταυτόσημη με εκείνη του ενδογενούς ΜΤ1-ΜΜΡ (Εικ. 3 έναντι Εικ. 2Β), εκτός από ένα υδρόφιλο FLAG-tag (DYKDDDDK) που περιέχει πεπτίδιο κορυφή σε

m /z

1,786.9 σε ΜΤ1-FLAG. Η σύγκρουση που προκαλείται διάσπαση των μεγάλων πρωτονιωμένο ιόν [Μ + Η]

+ κορυφές (

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 3,134.2 και) μέσω του MS

2 υποδεικνύεται ότι το θραύσμα ιόντα αντιστοιχούν σε μία σειρά από απώλειες μονοσακχαριτών από το γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο

299TTSRPSVPDKPK

310 (Εικ. 4). Οι γλυκομορφές αυτού του πεπτιδίου που περιέχεται από 2 έως 5 Hex και HexNAc. φάσματα ιόντων θραύσμα ελήφθησαν επίσης από άλλο γλυκοπεπτιδικά

278GIQQLYGGESGFPTK

292 ως sodiated ιόν [Μ + Na]

+ κορυφής στο

m /z

1,968.7 (Εικ. S2A). Το ιόν προϊόν MS

2 σε

m /z

1,024.0 φάνηκε να είναι ένα Hex-HexNAc πεπτίδιο που περιέχει

287SGFPTK

292 από MS

3 κατακερματισμού (Εικ. S2B). Μια περίληψη των προσδιορισθέντων γλυκοπεπτιδίων υποδεικνύονται σχηματικά με τη δομή της ΜΤ1-ΜΜΡ (Εικ. 5). Έτσι, ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια του ΜΤ1-ΜΜΡ από MS ανάλυση ενός ολόκληρου εκχυλίσματος πρωτεΐνης από μία πηκτή. Τέτοιες γλυκοπεπτίδιο κορυφές δεν ελήφθησαν όταν το ίδιο δείγμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μία συμβατική στερεά DHB μήτρα [21], όπως παρουσιάζεται στο Σχ. S3. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς την ανωτερότητα της νέας μεθόδου με τη χρήση του υγρού 3AQ μήτρα /CHCA.

Ένα κλάσμα του θρυπτικού ΜΤ1-FLAG πέψης εφαρμόστηκε απευθείας πάνω στο υγρό 3AQ μήτρα /CHCA. φάσμα MS ελήφθη εντός της κεντρικής περιοχής του υγρού πλέγματος. Οι γλυκάνη τμήματα και οι αλληλουχίες αμινοξέων των πεπτιδίων που περιλαμβάνουν θέσεις γλυκοζυλίωσης αυτών γλυκοπεπτίδια αποδόθηκαν με MS

2 και MS

3. Αριθμός αντιπροσωπεύει τη σωρευτική ένταση της κορυφής κορυφής (αυθαίρετες μονάδες).

Η

Ion κορυφές που προέρχονται από το φάσμα MS της πέψης θρυπτικού ΜΤ1-FLAG στο

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 3,134.2 και (Εικ. 3) υποβλήθηκαν σε MS

2 ανάλυσης. Αυτά κομμάτι ιόντα είχαν διατεθεί για την απώλεια του ενιαίου μονοσακχαρίτες (162 και 203 Da για Hex και HexNAc, αντίστοιχα) από τον ίδιο πεπτίδιο ιόντων (

299TTSRPSVPD

307).

Η

MT1- ΜΜΡ είναι ένας τύπος Ι διαμεμβρανική πρωτεϊνάσης, και έχει μια ιδιαίτερη πολλών τομέων δομή με ένα καταλυτικό τομέα, έναν τομέα άρθρωσης, ένα αιμοπηξίνη που μοιάζει τομέα και έναν τομέα στέλεχος στην εξωκυτταρική περιοχή. Υπογραμμίσεις δείχνουν γλυκοπεπτίδια που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη.

Η

Η ετερογενής γλυκοζυλίωση Προφίλ του ΜΤ1-ΜΜΡ

Για να προετοιμάσει ένα πρότυπο δείγμα πρωτεΐνης να δημιουργήσει συνθήκες δοκιμασίας για ανάλυση γλυκοπεπτίδια, έχουμε ετοιμάσει ένα διαλυτό ΜΤ1-ΜΜΡ, η οποία στερείται την διαμεμβρανική περιοχή που εκφράστηκε σε κύτταρα Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK). Αποτέλεσμα της MS ανάλυση του διαλυτού ΜΤ1-ΜΜΡ παρουσιάζεται στο Σχ. S4. Μόνο μία κύρια αιχμή γλυκοπεπτίδια ανιχνεύθηκε για το πεπτίδιο

299TTSRPSVPDKPK

310. Από την άλλη πλευρά, πολλαπλά γλυκοπεπτιδίου κορυφές ανιχνεύθηκαν από το ίδιο πεπτίδιο του ΜΤ1-FLAG εκφράζεται σε κύτταρα ΗΤ1080 (Εικ. 3). Ως εκ τούτου, το πρότυπο γλυκοζυλίωσης του ΜΤ1-FLAG λαμβάνεται από κύτταρα ΗΤ1080 αντιπροσωπεύει ένα ετερογενές προφίλ γλυκοζυλίωσης του πεπτιδίου και δεν είναι λόγω της αποικοδόμησης ή τροποποίησης των τμημάτων υδατανθράκων κατά τη διάρκεια της παρασκευής του δείγματος και την εφαρμογή του στο MS ανάλυση. Στο σύνολό τους, αυτή η σε στόχο μέθοδος διαχωρισμού μπορεί να γίνει ένα ισχυρό εύκολο στη χρήση εργαλείο για την ανάλυση ετερογενή πρότυπα γλυκοζυλίωσης των πρωτεϊνών της επιλογής.

Ανίχνευση μη γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίων στην ίδια πλάκα Target

MS φάσματα γλυκοπεπτίδια προτίμηση λαμβάνονται από την κεντρική περιοχή της μήτρας του δείγματος-φορτωμένο. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι καταφέραμε διαχωρισμό γλυκοζυλιωμένης και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτιδίων στην υγρή μήτρα. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το διαχωρισμό των μη γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίων επί της μήτρας, αναλύσαμε την περιφέρεια της περιοχής δείγματος φορτώνονται σε υγρή μήτρα από την ακτινοβολία λέιζερ. Πράγματι, πολλοί μη τροποποιημένα πεπτίδια που προέρχονται από το ΜΤ1-ΜΜΡ πέψης ανιχνεύθηκαν (Εικ. S5, κορυφές που σημειώνονται με αστερίσκους), ενώ γλυκοπεπτίδια δεν ανιχνεύθηκαν στην περιοχή αυτή.

Συνολικά, πετύχαμε περίπου 50% κάλυψη αλληλουχία του η εξωκυττάρια περιοχή του ΜΤ1-ΜΜΡ χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο (Εικ. S6). Έτσι, μια ολόκληρη ανάλυση πρωτεΐνη της γλυκοζυλιωμένης και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτιδίων επιτεύχθηκε ακολουθώντας συμβατικές SDS-PAGE, in-gel πέψη, και την άμεση εφαρμογή ενός ενιαίου σταγονιδίων ενός δείγματος πέψη επί της 3AQ υγρή μήτρα /CHCA στην MALDI πλάκα στόχο.

Κάτω Όριο της πρωτεΐνης ποσό για την Δοκιμασία

καθορίστηκε τελικά η MS φάσματα που δημιουργούνται από γλυκοπεπτίδια μέσα σε ένα μικρότερο ποσό της πρωτεΐνης του δείγματος. Διαφορετικές ποσότητες πρωτεϊνών ΜΤ1-FLAG υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και η γέλη χρωματίστηκε με Coomassie Blue. Η ποσότητα του ΜΤ1-FLAG εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας BSA ως προτύπου πρωτεΐνης (Εικ. 6Α). Τμήματα του πηκτώματος που περιέχει το δείγμα πρωτεΐνες αποκόπηκαν και αναλύθηκαν παρομοίως (Σχ. 6Β). Αν και οι εντάσεις κορυφής του MS φάσματα μειωθεί, ανάλογα με το ποσό του δείγματος, θα μπορούσε να ανιχνεύσει γλυκοπεπτιδίου κορυφές ακόμη και από το μικρότερο ποσό του δείγματος και η ποσότητα της πρωτεΐνης φορτώθηκε σε υγρή μήτρα σε αυτή την περίπτωση εκτιμάται ότι είναι περίπου 1,6 ng.

(Α) ΜΤ1-FLAG αραιώθηκε σειριακά και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue. Σιαλιδάσης, το οποίο περιέχει BSA ως φέρουσα πρωτεΐνη, φορτώθηκε στην ακριανή αριστερή λωρίδα (συμβολίζεται με αστερίσκο). Οι αριθμοί στα αριστερά του πάνελ αντιπροσωπεύουν μοριακές μάζες σε kilodaltons (kDa). (Β) Οι πολυπεπτιδικές ζώνες που αντιστοιχούν σε ΜΤ1-FLAG αποκόπηκαν, in-gel σε πέψη με θρυψίνη, και αναλύθηκε με MS με τη χρήση του υγρού 3AQ μήτρα /CHCA. Τα γλυκοπεπτίδια που περιέχονται σε ολόκληρο πρωτεΐνη πέψης λαμβάνεται από ΜΤ1-FLAG (περίπου 1,6 ng βασίζεται σε σύγκριση με ένα πρότυπο BSA) ανιχνεύθηκαν στο κέντρο του υγρού πλέγματος. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τη σωρευτική ένταση από τα κορυφαία κορυφές (αυθαίρετες μονάδες). Αιχμές βελών δείχνουν γλυκοπεπτίδια ιόντα (βλέπε Εικ. 3).

Η

Συζήτηση

Πολλές βιοχημικές εργαλεία είναι διαθέσιμα για την ανάλυση

Ν

-glycosylation των πρωτεϊνών, ενώ εκείνες για

O

-glycosylation είναι περιορισμένες. Ως εκ τούτου, η ανάλυση του

O

-glycosylation καθεστώς των πρωτεϊνών με τη χρήση μικρών ποσοτήτων δείγματος ήταν τεχνικά δύσκολο. Μια on-στόχο μέθοδο διαχωρισμού, κάνοντας χρήση της 3AQ υγρής μήτρας /CHCA για MALDI-MS, αναπτύχθηκε πρόσφατα και εφαρμόστηκε για την ανάλυση

Ν-

γλυκοζυλίωσης ριβονουκλεάσης Β Εφαρμόσαμε αυτή τη μέθοδο για την ανάλυση

O

-glycosylation του ΜΤ1-ΜΜΡ που εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα.

Η μέθοδος διαχωρισμού επί στοχευόμενα χρησιμοποιώντας την υγρή μήτρα είναι εξαιρετικά εύκολη και γρήγορη για να αναλύσει ένα μείγμα γλυκοζυλιωμένων και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτιδίων σε σύγκριση με συμβατικά MS ανάλυση χρησιμοποιώντας DHB. Δεδομένου γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια ασθενώς ιονισμένο σε σύγκριση με μη γλυκοζυλιωμένη αυτά, δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί γλυκοπεπτιδίου σήματα όταν η ίδια ΜΤ1-FLAG πέψης εφαρμόστηκε σε μήτρα DHB (Εικ. S3). Ως εκ τούτου, DHB δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση γλυκοπεπτίδιο χωρίς προηγούμενη επεξεργασία για το διαχωρισμό του τελευταίου. Σε αντίθεση, πριν τον διαχωρισμό γλυκοζυλιωμένης και μη γλυκοζυλιωμένης πεπτίδια δεν είναι αναγκαία για ανάλυση MS, όταν χρησιμοποιεί 3AQ /CHCA. Δεδομένου ότι δεν απαιτείται ένα επιπλέον στάδιο διαχωρισμού ακόλουθο πρωτεολυτική πέψη, μόνο μια μικρή ποσότητα του δείγματος πρωτεΐνης ήταν επαρκής για να ληφθεί σαφή αποτελέσματα όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 6. Επιπλέον, το υγρό 3AQ μήτρα /CHCA είναι συμβατή με όχι μόνο αναλύσεις δειγμάτων μπλε χρώση πρωτεΐνης Coomassie αλλά και των χρωματισμένων με άργυρο αυτά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Silver χρώση επιτρέπει την ανίχνευση των περισσότερων πρωτεϊνών, δεδομένου ότι είναι πιο ευαίσθητη από χρώση με Coomassie blue. Στο σύνολό τους, η μέθοδος MALDI-MS χρησιμοποιώντας 3AQ /CHCA μπορεί να καταστήσει δυνατή τη διερεύνηση της γλυκοζυλίωσης μιας πρωτεΐνης η οποία εκφράζεται σε λεπτά ποσότητες ή /και υπάρχει σε ειδική περιοχή επιφάνειας όπως λιπιδικών σχεδιών, όπου ο καθαρισμός είναι πιο πολύπλοκη.

σε αυτή τη μελέτη, κυρίως χρησιμοποιημένα πρωτεΐνη ΜΤ1-FLAG εκφράζεται σε κύτταρα ΗΤ1080 να αξιολογήσει την ευελιξία της νέας εφαρμογής της υγρής μήτρας να αναλύσει γλυκοπρωτεΐνες με MS. Αυτό είναι απλά επειδή έχουμε μελετήσει ΜΤ1-ΜΜΡ εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα και ήθελε να το χρησιμοποιήσει ως πρότυπο διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα. Διαπιστώσαμε γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο κορυφές ΜΤ1-ΜΜΡ που προέρχονται από

278GIQQLYGGESGFPTK

292 και

299TTSRPSVPDKPK

310 (Εικ. 3). Ως εκ τούτου, τα κατάλοιπα Thr και Ser μέσα σε αυτά τα πεπτίδια αντιπροσωπεύουν το δυνατόν

O

-glycosylation sites. Thr

291, Thr

299, Thr

300, και Ser

301 προτάθηκαν για να είναι περιοχές του

O

-glycosylation με ανάλυση μετάλλαξης [10], [13]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι Ser

304 και γλυκοζυλιωμένη σε κύτταρα ΗΤ1080 με την ανίχνευση ενός σήματος γλυκοπεπτιδίου από

303PSVPDKPK

310 από MS

2 ανάλυση της sodiated ιόν [Μ + Na]

+ κορυφή στα

m /z

2,791.9 όπως στο Σχ. 3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρά το γεγονός ότι τα αποτελέσματα αυτά είναι σε μεγάλο βαθμό επιβεβαίωσης, η ανάλυση αποκάλυψε επίσης την ετερογενή

O

-glycosylated πεπτίδιο κορυφές από

299TTSRPSVPDKPK

310 (Εικ. 4). Έτσι, μια ολόκληρη πρωτεΐνη MS ανάλυση χρησιμοποιώντας υγρή μήτρα είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάλυση της ετερογένειας γλυκοζυλίωσης. Η μέθοδος είναι εύκολο στη χρήση ακόμη και για κλινικά δείγματα όπου ειδικά αντισώματα είναι διαθέσιμα για καθαρισμό ανοσοσυγγένειας των πρωτεϊνών στόχων από κύτταρα, ιστούς, ορούς, και τα ούρα. Από αλλαγμένη γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών έχει συνδεθεί με την πρόοδο του καρκίνου [3], [4], [5], η μέθοδος διαχωρισμού επί-στόχο χρησιμοποιώντας 3AQ /CHCA θα επιταχύνει την ανάλυση των ετερογένεια των

O

-glycosylation για διαφορετικούς σχετίζονται με τον καρκίνο πρωτεΐνες. Αν υπάρχουν καρκίνο συγκεκριμένες παραλλαγές, η εντοπίστηκαν

O

-γλυκάνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέες υποψήφιες βιοδεικτών για τους κακοήθεις όγκους. Επιπλέον, υπάρχει αυξανόμενη ενδιαφέρον για τα φαρμακευτικά προϊόντα βιοτεχνολογίας με βάση τα οποία κατασκευάζονται με τη χρήση ζωντανών κυττάρων. Η κατάσταση γλυκοζυλίωσης των εν λόγω βιολογικών προϊόντων έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντική για τις φαρμακολογικές ιδιότητες του [22]. Η παρούσα μέθοδος MALDI-MS μπορεί να γίνει ένα πολύτιμο εργαλείο για γλυκοανάλυσης των κλινικών δειγμάτων, καθώς και εκτίμηση για την ποιότητα των βιολογικών προϊόντων ναρκωτικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινα ΗΤ1080 ινοσαρκώματος κύτταρα (American Type Culture Collection, Manassas, VA) διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 10 μΜ MMI270 (ένα συνθετικό αναστολέα υδροξαμικού μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας, ένα είδος δώρο της Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland), και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

φορείς λεντοϊών για ΜΤ1-ΜΜΡ Έκφραση και Knockdown

Η ακολουθία shRNA χρησιμοποιείται για την εξουδετέρωση των ΜΤ1-ΜΜΡ ήταν 5′-CACCGCAGCCTCTCACTACTCTTTCCGAAGAAAGAGTAGTGAGAGGCTGC-3 ‘. Ένα θραύσμα DNA που κωδικοποιεί την αλληλουχία υποκλωνοποιήθηκε σε pENTR /U6 ΤΟΡΟ (Invitrogen) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε μέσω ανασυνδυασμού στο φορέα pLenti6 φακοϊό BLOCK αυτό (Invitrogen). Ένα κατασκεύασμα που κωδικοποιεί ανθρώπινο ΜΤ1-ΜΜΡ ετικέτα με τον επίτοπο FLAG (DYKDDDDK) περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Ένα cDNA κλώνος του FLAG-επισημασμένη ΜΤ1-ΜΜΡ (ΜΤ1-FLAG) ενισχύθηκε από το PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5’-CACCATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3 ‘και 5′-TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3’. Η ενισχυμένη σειρά ΜΤ1-FLAG υποκλωνοποιήθηκε σε pENTR /D-ΤΟΡΟ και στη συνέχεια μεταφέρθηκε μέσω ανασυνδυασμού στο φορέα έκφρασης λεντοϊού pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen). Αυτοί οι φορείς λεντοϊών παράχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ΜΤ1-ΜΜΡ Knockdown και Αντιστρεπτές Κυτταρική Γραμμή

ΜΤ1-FLAG εκφράστηκε σε κύτταρα ΗΤ1080 μολυσμένα φακοϊό (ανάστροφων κύτταρα) στα οποία η έκφραση του ενδογενούς ΜΤ1-ΜΜΡ πρώτα εξαντληθεί με την έκφραση του shRNA στόχευση της ενδογενούς ΜΤ1-ΜΜΡ (knockdown κύτταρα). ΜΤ1-FLAG εκφράστηκε σε επίπεδο παρόμοιο με εκείνο της πρωτεΐνης άγριου τύπου με βάση την ανάλυση Western blot.

κυτταρολύματος πλήρους κυττάρου Παρασκευή

35 cm

2 πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχουν υποσυμβάλλουσες άγριου τύπου, ΜΤ1-ΜΜΡ knockdown και ΜΤ1-FLAG κύτταρα ΗΤ1080 ανάστροφων συμπληρωμένο με 10 μΜ MMI270 πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με βρασμό σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 200 μL Laemmli [24] που περιείχε 5% β-μερκαπτοαιθανόλη. Ένα κλάσμα 10 μι του λύματος χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση Western blot.

Μεμβράνης Κυτταρολύματος Παρασκευή

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν στους 4 ° C. Δεκαέξι 150 cm

2 πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχουν υποσυμβάλλουσες καλλιέργειες του άγριου τύπου ή ΜΤ1-FLAG κύτταρα ανάστροφων ΗΤ1080 supplementated με 10 μΜ MMI270 στα μέσα ενημέρωσης πλύθηκαν με PBS και αποξέστηκαν σε 32 mL ρυθμιστικού σακχαρόζης /Hepes (0,25 Μ σακχαρόζης /20 mM Hepes-NaOH, ρΗ 7.2) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (πρωτεάση σετ αναστολέα κοκτέιλ Ι, Calbiochem, San Diego, CA). Τα κύτταρα στο ρυθμιστικό διάλυμα ήταν Dounce-ομογενοποιείται (10 φορές). Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 1000 χ g για 7 λεπτά. Ο σβώλος ομογενοποιήθηκε εκ νέου σε 16 mL σακχαρόζης /ρυθμιστικού Hepes, και το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε 1,000 Χ g για 7 λεπτά. Τα υπερκείμενα συνενώθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 χ g για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο από αυτή τη φυγοκέντρηση υπερφυγοκεντρήθηκε στα 105.000 χ g για 1 ώρα. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού λύσης (1% Triton Χ-100/20 mM Hepes-NaOH, ρΗ 7.2) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στα 20.000 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο αναφέρεται ως το προϊόν λύσεως μεμβράνης, καταλήγοντας σε μία συγκέντρωση πρωτεΐνης περίπου 10 mg /mL. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στο προϊόν λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) με BSA ως πρότυπο αναφοράς.

Η ενδογενής ΜΤ1-ΜΜΡ Απομόνωση

ένα μονοκλωνικό αντίσωμα για ενδογενή απομόνωση ΜΤ1-ΜΜΡ παρασκευάστηκε στο εργαστήριο μας με μια μέθοδο γενετικής ανοσοποίησης [25] χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο πλασμίδιο έκφρασης ΜΤ1-ΜΜΡ πλήρους μήκους. Αυτό το αντίσωμα αναγνωρίζει μία περιοχή μέσα σε έναν τομέα στελέχους της ΜΤ1-ΜΜΡ (ένα έγγραφο στο πλαίσιο της προετοιμασίας). Ένα 70 μg του κλάσματος του ειδικού αντισώματος ΜΤ1-ΜΜΡ ομοιοπολικά συνδεδεμένο με 10 mg του εποξυ-functionalized μαγνητικά σφαιρίδια μετά την υπό την προϋπόθεση πρωτόκολλο (Dynabeads Μ-270 εποξυ, Invitrogen). Για ανοσοκαταβύθιση, 1 mL προϊόντων λύσης μεμβράνης που παρασκευάζονται από κύτταρα ΗΤ1080 άγριου τύπου επωάστηκε 24 ώρες στους 4 ° C με 10 mg σφαιριδίων αντισώματος-συζευγμένου αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ. Μετά την επώαση, η ρητίνη συλλέχθηκε με ένα μαγνήτη και πλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το δεσμευμένο ΜΤ1-ΜΜΡ εκλούστηκε με 0.1 Μ γλυκίνη-ΗΟΙ (ρΗ 3.0), και στη συνέχεια εξουδετερώθηκε με 1 Μ Tris-HCl (ρΗ 8.0). Το έκλουσμα συμπυκνώθηκε σε 20 μΐ (περίπου 7.5 ng πρωτεΐνης /μL) με δια-διήθηση χρησιμοποιώντας μια συσκευή Ultra Amicon (cut-off: 10 kDa, Millipore, Billerica, ΜΑ).

FLAG-επισημασμένη ΜΤ1-ΜΜΡ Απομόνωση

Απομόνωση ΜΤ1-FLAG διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-ΡΕΑΟ Μ2 μαγνητικά σφαιρίδια (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 mL προϊόντα λύσης μεμβράνης που παρασκευάζεται από ΜΤ1-FLAG κύτταρα ΗΤ1080 ανάστροφων επωάστηκε 16 ώρες στους 4 ° C με 20 μι της ρητίνης. Το ΜΤ1-FLAG εκλούστηκε με 3 × FLAG πεπτιδίου σε TBS που περιέχει 0.1% CHAPS. Το έκλουσμα συμπυκνώθηκε σε 20 μι (περίπου 25 ng πρωτεΐνης /μΙ), όπως περιγράφεται παραπάνω.

Διαλυτό ΜΤ1-ΜΜΡ Παρασκευή

Ένα ΜΤ1-ΜΜΡ διαμεμβρανικό μετάλλαγμα εξάλειψης καθαρίστηκε από το ρυθμισμένο μέσο της κύτταρα Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

σιαλιδάσης θεραπεία

Για-σιαλυλίωση, 500 ng του αναλύτη υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 mU του σιαλιδάσης /νευραμινιδάσης F (ΕΚ 3.2 .1.18. από

Streptococcus

, Seikagaku Co., Tokyo, Japan) στους 37 ° C για 16 ώρες σε 20 μΐ TBS που περιέχει 0.1% CHAPS.

SDS-PAGE

δείγματα σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος του Laemmli που περιέχει 5% β-μερκαπτοαιθανόλη έβρασαν για 5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 20.000 χ g για 5 λεπτά στους 25 ° C. Τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ασυνεχή Tris-γλυκίνη-SDS-PAGE χρησιμοποιώντας μια πηκτή στοιβασίας 4% και 10% διαχωριστική γέλη.

Western Blot

Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα υλικά σε πηκτές SDS-PAGE ήταν ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), και οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS. Ανοσοαντιδραστικά υλικά ανιχνεύθηκαν με χρώση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας Western Lightning (Perkin Elmer Inc, Waltman, ΜΑ). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ (222-1D8, ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Kazushi Iwata, Daiichi Fine Chemical, Takaoka, Japan), ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-FLAG (Sigma-Aldrich ), ένα μονοκλωνικό αντι-β-τουμπουλίνης αντίσωμα (Ε7, Μελέτες Ανάπτυξης Hybridoma Bank, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, USA), υπεροξειδάση κοχλιαρίας-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG και IgG αντίσωμα αντι-κουνελιού (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ).

Πυκνότητας

Η ένταση του Coomassie μπλε-χρωματισμένο πρωτεΐνη ποσοτικά με τη χρήση ImageJ 1,43 λογισμικού (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

3AQ /CHCA Υγρό Matrix

Συμπυκνωμένο 3AQ /CHCA παρασκευάστηκε με διάλυση 35 mg 3-αμινοκινολίνης (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich) σε 150 μL ενός κορεσμένου διαλύματος α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, France) σε μεθανόλη. Το συμπυκνωμένο διάλυμα 3AQ /CHCA αραιώνεται 10 φορές με τη χρήση 100 mM φωσφορικό αμμώνιο, και αναφέρονται ως το υγρό 3AQ μήτρα /CHCA. Ένα κορεσμένο διάλυμα CHCA παρασκευάστηκε με διάλυση 10 mg του CHCA σε 540 μι 50% ακετονιτρίλιο /0,1% τριφθοροοξικό οξύ και 60 μί 100 mM φωσφορικού αμμωνίου.

DHB Matrix

DHB (2 , 5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ) διάλυμα μήτρα παρασκευάστηκε με διάλυση 10 mg του DHB (LaserBio Labs) σε 1 mL 50% ακετονιτρίλιο /0,1% τριφθοροοξικό οξύ. Για την ανάλυση μήτρα DHB, ένα κλάσμα 0,5 μι θρυπτικού ΜΤ1-ΜΜΡ πέψη που είχε αναμιχθεί με έναν ίσο όγκο διαλύματος μήτρας DHB κηλιδώθηκε πάνω σε πλάκα στόχο και αφέθηκε να ξηρανθεί.

θρυπτικής In-γέλη Πέψη

-gel πέψη διεξήχθη σύμφωνα με την μέθοδο του Shevchenko

κ.ά.

[27]. Μία περιοχή του πηκτώματος που περιείχε ΜΤ1-ΜΜΡ πρωτεΐνη χρωματίστηκαν με κολλοειδές Coomassie Blue G-250 (SimpleBlue SafeStain, Invitrogen) αποκόπηκε και κόπηκε σε μικρά κομμάτια. Τα τεμάχια γέλης ΜΤ1-ΜΜΡ έγιναν αποχρωματίσθηκαν με 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου σε 50% μεθανόλη και στη συνέχεια ξηραίνεται υπό κενό φυγοκέντρηση.