Αφηρημένο

Ιστορικό

miR-23b βρίσκεται στον αριθμό των χρωμοσωμάτων 9 και παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικές όργανα ειδικά σε σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου. Ωστόσο, η λειτουργική σημασία του miR-23b-3ρ στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC), δεν έχει αναφερθεί.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

μέτρησαν τα επίπεδα miR-23b-3ρ σε 29 ζεύγη καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και φυσιολογικών ιστών συμφωνημένα τους χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Το επίπεδο έκφρασης του miR-23b-3ρ συσχετίστηκε με το ποσοστό επιβίωσης πέντε χρόνια των ασθενών με καρκίνο νεφρού. Σε 15 περιπτώσεις (52%), η έκφραση του miR-23β-3ρ βρέθηκε να είναι υψηλή. Όλοι οι ασθενείς με μέτρια έως χαμηλή έκφραση του miR-23b-3ρ επέζησε από 5 χρόνια, ενώ εκείνα με υψηλή έκφραση του miR-23b-3ρ, μόνο το 50% επέζησε. Μετά από να χτυπήσει κάτω την έκφραση miRNA-23β-3ρ σε κυτταρικές σειρές RCC, υπήρχε μια επαγωγή της απόπτωσης και μείωση επεμβατικές δυνατότητες. MiR-23β-3ρ φάνηκε να στοχεύουν άμεσα γονίδιο PTEN μέσω δοκιμασιών δημοσιογράφος 3’ΙΙΤΡ. Αναστολή της miR-23b-3ρ επάγει την έκφραση του γονιδίου PTEN με ταυτόχρονη μείωση της ΡΙ3-κινάσης, ολική Akt και IL-32. Ανοσοϊστοχημεία έδειξε την έλλειψη έκφρασης πρωτεΐνης ΡΤΕΝ σε καρκινικά περιοχές των δειγμάτων ιστού όπου η έκφραση του miR-23β-3ρ ήταν υψηλό. Μελετήσαμε το

in vitro

αποτελέσματα της διαιτητικής χημειο genistein προληπτικό παράγοντα για την έκφραση του miR-23b-3ρ και διαπίστωσε ότι αναστέλλεται η έκφραση του miR-23b-3ρ σε κυτταρικές σειρές RCC.

Συμπεράσματα

Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το miR-23b-3ρ είναι ένα ογκογόνο miRNA και αναστέλλει κατασταλτικό γονίδιο PTEN όγκου σε RCC. Ως εκ τούτου, η αναστολή του miR-23b-3ρ μπορεί να είναι ένα χρήσιμο θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του νεφρικού καρκινώματος

Παράθεση:. Zaman MS, Thamminana S, Shahryari V, Chiyomaru T, Ντενγκ G, Saini S, et al. (2012) Αναστολή της PTEN Gene Expression από Ογκογόνες miR-23b-3ρ στον Καρκίνο νεφρών. PLoS ONE 7 (11): e50203. doi: 10.1371 /journal.pone.0050203

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Αυγ, 2012? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Νοεμ 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από την αναθεώρηση Merit VA, VA Πρόγραμμα Έργων και ΝΙΗ Grant RO1CA130860 (PI: R. Dahiya). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

miRNAs έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται σε διάφορες ασθένειες των νεφρών [1]. miR-23b βρίσκεται στον αριθμό των χρωμοσωμάτων 9 σε ένα σύμπλεγμα με miR-27b και miR-24-1 [2]. Έχει δειχθεί να παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικά όργανα, ιδίως σε σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου. Σε καρκίνους όπως της ουροδόχου κύστης και στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [3] – [4] έχει αποδειχθεί ότι είναι πάνω από εκφράζεται. Σε καρκίνο του νεφρού miR-23β-5P δρα ως δυνητικός oncomir με καταστολή προλίνη οξειδάση, η οποία είναι μια νέα πρωτεΐνη καταστολής όγκου [5]. Ότι στον καρκίνο του προστάτη [6], παίζει το ρόλο ενός ογκοκατασταλτικού microRNA όπως στοχεύει η ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής c-myc. Αυτό τελικά οδηγεί σε μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης της προ-καρκινικές ένζυμο μιτοχονδριακό γλουταμινάσης, η οποία είναι ένας στόχος για miR-23b [7]. Στην περίπτωση του καρκίνου του μαστού έχει δειχθεί ότι μέχρι ρυθμίζεται με miR-27b και miR-24-1 από τον παράγοντα μεταγραφής oncosuppressor ΕΚβ [8]. Ομοίως, στην ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα δρα ως καταστολέας όγκου μέσω στόχευσης του ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) και c-met αποτέλεσμα μειωμένη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC [9]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου λειτουργεί στην καταστολή της μετάστασης του καρκίνου με τη στόχευση prometastatic γονίδια FZD7 ή MAP3k1 [10].

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το ρόλο του miR-23b-3ρ σε νεφρική σαφές καρκίνωμα. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-23b-3ρ αυξήθηκε σε κυτταρικές σειρές Caki-2 A-498 και και την πλειοψηφία των δειγμάτων ιστού. Η αυξημένη έκφραση συσχετίστηκε επίσης με χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης για ασθενείς με νεφρική καρκίνωμα. Η αναστολή της έκφρασης miR-23b-3ρ σε κύτταρα Caki-2 A-498 και προκάλεσε μια αύξηση στην απόπτωση και μία μείωση στην επεμβατική ιδιότητες. έκφραση ΡΤΕΝ πρωτεΐνη βρέθηκε να αυξηθεί μετά να χτυπήσει κάτω miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα με μια συνακόλουθη μείωση στην έκφραση της ΡΙ3-κινάσης, ολική Akt και IL-32. Το γονίδιο PTEN φάνηκε να είναι ένας άμεσος στόχος του miR-23b-3ρ από 3 δοκιμασίες »λουσιφεράσης. Ανοσοϊστοχημεία έδειξε την έλλειψη της έκφρασης πρωτεΐνης ΡΤΕΝ σε καρκινικά περιοχές των δειγμάτων ιστού, όπου η έκφραση του miR-23b-3ρ ήταν υψηλή.

Αποτελέσματα

miR-23b-3ρ είναι Up Ρυθμιζόμενης στο νεφρικό καρκίνωμα δείγματα ιστού και του καρκίνου των νεφρών τηλέφωνα Γραμμές

Για να κατανοήσουμε την κλινική σημασία του miR-23b σε καρκίνο του νεφρού μετρήσαμε τα επίπεδα miR-23b-3ρ σε 29 ζεύγη των ανθρώπινων καρκίνων του νεφρού (όλο το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα σαφή κυττάρων) και να συνδυαστούν κανονικούς ιστούς με πραγματικού χρόνου PCR. Σε 15 περιπτώσεις (52%), miR-23β-3ρ βρέθηκε να είναι αυξημένη (T /N [Tumor /Normal] ήταν μεγαλύτερη από 1,2). Σε 5 δείγματα (17%), η έκφραση ήταν μέτρια (Τ /Ν 0,8-1,2). Η έκφραση του miR-23β-3ρ μετρήθηκε επίσης σε καλλιεργημένα νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2 και μη κακοήθη φυσιολογικά κύτταρα ΗΚ-2. έκφραση miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα ήταν περίπου 11x εκείνη των κυττάρων HK-2, ενώ εκείνο του ACHN ήταν 4.1x, Caki-1 4.8x, και Caki-2 5.8x (Σχήμα 1).

Α) Αναλογία T /N έκφραση σε δείγματα ιστών βρέθηκε να είναι υψηλή σε μια πλειονότητα των δειγμάτων. Β) τα κύτταρα Α-498 και Caki-2 είχαν υψηλή έκφραση του miR-23β-3ρ σε σύγκριση με μη κακοήθη φυσιολογικά κύτταρα ΗΚ-2 (Τ-Tumor, Ν-Normal), [ρ τιμή (Α) 0.032? τιμή p (B) 0,018)].

Η

Συσχέτιση του miR-23b-3ρ Έκφραση με την επιβίωση σε καρκίνο του νεφρού

Το επίπεδο έκφρασης του miR-23b-3ρ συσχετίζονται με 5 χρόνια επιβίωση των ασθενών. Για εκείνους τους ασθενείς με μέτρια έως χαμηλή έκφραση miR-23β-3ρ (n = 12) (Σχήμα 2), όλα επιβίωσαν 5 χρόνια μετά την επέμβαση, ενώ εκείνοι με υψηλά miR-23β-3ρ (n = 12) έκφρασης, μόνο το 50% επιβίωσαν (Σχήμα 2). Η καμπύλη επιβίωσης με βάση τον αριθμό των ασθενών (24) για τις οποίες είχαμε πληροφορίες επιβίωση έξω από συνολικά 29 ασθενείς. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ του βαθμού του όγκου, το στάδιο και τα επίπεδα miRNA-23β-3ρ.

Η

λειτουργικός ρόλος του miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα

Για να διαλευκανθεί το λειτουργικό ρόλο του miR-23b-3ρ σε καρκίνο του νεφρού που γκρέμισε την έκφραση του miR-23b-3ρ στο Α-498 και Caki-2 νεφρική καρκινικών κυττάρων με ένα εμπορικά διαθέσιμο αναστολέα miR-23b-3ρ. Αντι-miR-Αρνητικός έλεγχος # 1 χρησιμοποιήθηκε επίσης για αυτά τα πειράματα. Το επίπεδο miR-23β-3ρ μειώθηκε κατά περισσότερο από 99%, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα σε Α-498 κύτταρα (Σχήμα 3α). επιμόλυνση αντι-miR-23b-3ρ σε κύτταρα Caki-2 μείωσε επίσης το επίπεδο έκφρασης miR-23b-3ρ σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 3β).

Η έκφραση του miR-23b-3ρ μειώθηκε κατά περισσότερο από 99% μετά την αναστολή της και στα δύο Α-498 (Α) και τα κύτταρα Caki-2 (Β).

Η

Επίδραση στην κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Τα αποτελέσματα του miR-23b- 3ρ γκρεμίζω επί του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. δοκιμασία απόπτωση έδειξαν μια σημαντική αύξηση του αριθμού των συνολικών αποπτωτικών κυττάρων (πρώιμη αποπτωτική συν αποπτωτικών) και στα δύο Α-498 (8,87%) (Σχήμα 4α) και τα κύτταρα 2 Caki-(11,74%) (Σχήμα 4Β) με miR-23b- 3ρ γκρεμίζω σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο [Α-498 (3,37%) και Caki-2 (3,68%)]. Δεν υπήρχαν σημαντικές αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο και για τα δύο κύτταρα Α-498 και Caki-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) δοκιμασία απόπτωση έδειξε σημαντική αύξηση στον αριθμό του συνόλου των αποπτωτικών κυττάρων (8.87%) στην αντι- αναστολέα miR-23β-3ρ επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (3,37%) σε ένα-498 κύτταρα (τιμή ρ 0,029). Β) Σε Caki-2 κύτταρα ο συνολικός αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων (11,74%) στην αναστολέα αντι- miR-23β-3ρ επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (3,68%) (ρ τιμή 0,030).

επίδραση στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση Properties

για να προσδιορίσετε αν το miR-23b-3ρ επηρεάζει τη νεφρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε cytoselect 24 και χρησιμοποιήθηκε μετανάστευση των κυττάρων και κιτ εισβολή. Α-498 και Caki-2 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με αναστολέα αντι-miR-23β-3ρ και αντι-miR-αρνητικό έλεγχο. Τόσο κύτταρα Caki-2 A-498 και έδειξε μια μείωση 30% στο κελί εισβολή στα δείγματα όπου miR-23β-3ρ ανεστάλη σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες (Σχήμα 5α και 5β). Καμία σημαντική αλλαγή στην μετανάστευση παρατηρήθηκε και στα δύο κύτταρα Α-498 και Caki-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επεμβατική ιδιότητες του Α-498 (Α) και τα κύτταρα Caki-2 (Β) μειώθηκαν κατά 30 % μετά το miR-23b-3ρ χτυπήσει κάτω σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Υ-άξονα-Απορρόφηση στα 560 nm [τιμή p (A) 0.026? τιμή p (Β) 0.030].

Η

PTEN αυξάνεται μετά Knock Down του miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα

Για να δείτε το αποτέλεσμα του miR-23b-3ρ έκφραση σε διαφορετικά γονίδια που εμπλέκονται στην απόπτωση και εισβολή ελέγξαμε την πρωτεΐνη έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες. Η προ αποπτωτικών γονιδίων PTEN βρέθηκε να είναι μέχρι ρυθμίζεται μετά miR-23b-3ρ γκρεμίζω σε Α-498 κύτταρα (Εικόνα 6Α). Βρήκαμε επίσης μια μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΡΙ3-κινάσης και ολικής Akt. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια μείωση στην έκφραση της προ φλεγμονώδους κυτοκίνης IL32 παρατηρήθηκε επίσης μετά miR-23β-3ρ γκρεμίζω. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικά με οπτική πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ Λογισμικό έκδοση 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Διπλώστε αλλαγή αυτή υπολογίζεται ως ο λόγος μεταξύ του καθαρού ένταση κάθε δείγμα επιμολυσμένα με αντι-miR-23b-3P διαιρείται με GAPDH και τα αρνητικά δείγματα ελέγχου επιμολυσμένα διαιρείται με το GAPDH (Anti-miR-23b-3ρ επιμολυσμένα δείγματα /GAPDH) /(Neg ελέγχου miR επιμολυσμένα δείγματα /GAPDH) (Σχήμα 6Β).

Α) Εκφραση του ΡΤΕΝ, ΡΙ3-κινάση, Akt και IL-32 σε Α-498 κύτταρα, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας ομαλοποίηση. Β) Ποσοτική δεδομένα για ανάλυση Western blot. PTEN είχε μέχρι ρυθμίζεται, ενώ ΡΙ3-κινάσης, Akt και IL-32 έκφρασης κάτω ρύθμιση.

Η

ΡΤΕΝ είναι ένας άμεσος στόχος του miR-23b-3ρ

Από μια σημαντική αύξηση στην απόπτωση παρατηρήθηκε τόσο σε κύτταρα Caki-2 A-498 και και αυξημένη έκφραση ΡΤΕΝ σε Α-498 κύτταρα μετά από miR-23b-3ρ γκρεμίζω, ψάξαμε να δούμε αν miR-23b-3ρ στοχεύει στην προ αποπτωτικών γονιδίων PTEN. Χρησιμοποιώντας TargetScan (targetscan.org) και microrna.org εντοπίσαμε συμπληρωματικές αλληλουχίες προς miR-23b στην 3’UTR του γονιδίου ΡΤΕΝ (Σχήμα 7α). Πραγματοποιήσαμε λουσιφεράσης ανταποκριτή χρησιμοποιώντας ένα 3’PTEN κατασκευή με miR-23b-3ρ ή miR-μάρτυρα που εκφράζει ένα-498 κύτταρα και παρατηρείται μια σταθερή μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης (Σχήμα 7β) σε επιμολύνσεις miR-23b-3ρ γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR -23b-3ρ καταστέλλει PTEN άμεσα.

Α) ανάλυση λογισμικού δείχνει αλληλουχίες συμπληρωματικές προς τις ακολουθίες των σπόρων του miR-23b-3ρ στο γονίδιο 3 ‘UTR του PTEN. Β) Δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε μία μείωση στην σχετική λουσιφεράσης μονάδες σε δείγματα με συνυπάρχουσα επιμολυσμένα με miR-23β-3ρ ήταν και «γονιδιακό κατασκεύασμα UTR σε σύγκριση με τον έλεγχο κατασκευάσματα (Neg Con-αρνητικός έλεγχος? Πλασμιδιακό κατασκεύασμα Con-Control λείπει ΡΤΕΝ 3 ‘ΡΤΕΝ 3 UTR sites για miR-23b-3ρ? PTEN-PTEN πλασμίδιο κατασκεύασμα που έχει PTEN sites 3’ΙΙΤΡ γονίδιο για miR-23b-3P?. (τιμή p 0,017)

Η

Η έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης στο Normal και περιφέρειες του καρκίνου των δειγμάτων ιστού που έχει μια υψηλή έκφραση του miR-23b-3ρ

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι το ΡΤΕΝ είναι ένας στόχος του miR-23b-3p ελέγξαμε για την έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης σε φυσιολογικά και καρκινικά περιοχές του ιστού του ασθενούς επελέγησαν δείγματα τα οποία είχαν υψηλή έκφραση του miR-23β-3ρ, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC). Δέκα δείγματα τα οποία έχουν υψηλή έκφραση miR-23β-3ρ. ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα του ΡΤΕΝ ανοσοϊστοχημείας παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Α.

Α) Εκπρόσωπος εικόνες της ανοσοϊστοχημείας (IHC) αναλύσεις. Β) Γραφική αναπαράσταση των δεδομένων που δείχνουν ότι η έκφραση ΡΤΕΝ ήταν υψηλή σε κανονικές περιοχές των δειγμάτων νεφρική ασθενή με καρκίνο, ενώ σε καρκινικά περιοχές δεν παρατηρήθηκε έχουν υψηλή έκφραση του miR-23b-3ρ PTEN.

Η

IHC αποτελέσματα χρώσης ιστών βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με γρήγορη βαθμολογία (επί τοις εκατό κύτταρα βάφονται × ένταση της κηλίδας). Γρήγορη σκορ που λαμβάνονται από τα δείγματα όγκων ομαλοποιήθηκε με τη γρήγορη σκορ των κανονικών δειγμάτων τους (Τ /Ν) και Chi-square τεστ πραγματοποιήθηκε με τα επίπεδα έκφρασης miR-23b-3ρ στα ίδια δείγματα ασθενούς (Σχήμα 8Β). Όλα τα φυσιολογικά δείγματα εκφρασμένη πρωτεΐνη PTEN αν και σε ποικίλα επίπεδα. χρώση PTEN ήταν απούσα από τα δείγματα όγκων που εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα του miR-23b-3ρ (p & lt? 0.001). (Σχήμα 8Β)

Γενιστεΐνη Μειώνει την έκφραση του miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα

επίσης εξετάσαμε την επίδραση του παράγοντα χημειοπροφύλαξη, γενιστεΐνη (ένα προϊόν σόγιας), σχετικά με την έκφραση του miR-23b-3ρ σε α-498 κύτταρα. Η θεραπεία με γενιστεΐνη (25 μΜ) για 96 ώρες μείωσε την έκφραση του miR-23β-3ρ κατά 50%, ενώ η υψηλότερη συγκέντρωση της γενιστεΐνης (50 μΜ) για την ίδια χρονική περίοδο μειωμένης έκφρασης κατά 45% (Σχήμα 9).

έκφραση miR-23β-3ρ μειώθηκε κατά 50% σε 25 μΜ γενιστεΐνης αντιμετωπίζεται μια-498 κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, 50 μΜ γενιστεΐνης μειωμένη έκφραση miR-23β-3ρ κατά 45% (τιμή ρ 0,030).

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το miR-23b-3ρ λειτουργεί ως ογκογόνο microRNA στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα. Η έκφρασή του είναι αυξημένη σε ασθενείς με νεφρική κυτταρικές σειρές καρκινώματος και δείγματα ιστού (σαφής καρκίνωμα) σε σύγκριση με φυσιολογική νεφρική κύτταρα και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς, αντίστοιχα. Επιπλέον βρήκαμε ότι τα υψηλά επίπεδα του miR-23b-3ρ να οδηγήσει σε μείωση της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του νεφρού. Για τη μελέτη του λειτουργικού ρόλου του miR-23b-3ρ έκφραση της χτυπήθηκε κάτω στο Caki-2 νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές Α-498 και. Αυτό οδήγησε σε μια αύξηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον κύτταρα Caki-2 A-498 και έδειξε μειωμένη κυτταρική εισβολή του miR-23b-3ρ γκρέμισε κύτταρα, αλλά καμία σημαντική αλλαγή στη μετανάστευση. Western ανάλυση των miR-23b-3ρ γκρεμίζω έδειξαν αυξημένη έκφραση ΡΤΕΝ και ταυτόχρονη μείωση στην έκφραση της ΡΙ3-κινάσης, Akt και IL-32. PTEN βρέθηκε να είναι ένας άμεσος στόχος του miR-23b-3ρ μέσω προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς.

Η σημαντική αλλαγή στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων μετά από να χτυπήσει κάτω του miR-23b-3ρ τόσο Α-498 και Caki -2 κύτταρα μας οδηγήσει στην αναζήτηση για τα γονίδια και τα μονοπάτια που εμπλέκονται στην απόπτωση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΡΤΕΝ μπορεί να επάγει την απόπτωση μέσω μιας οδού που εξαρτάται ΡΙ3-κινάσης [11]. ΡΤΕΝ δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο μέσω της δράσης πρωτεϊνικής φωσφατάσης προϊόν της [12], υποβαθμίζοντας ΡΙΡ3 σε ανενεργούς φωσφατιδυλινοσιτόλη (4,5) -diphosphate ΡΙΡ2 [13], [14]. Αυτό με τη σειρά του ρυθμίζει αρνητικά το μονοπάτι PI3K προ-επιβίωσης /Akt σηματοδότησης. Η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπατιού ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, ανάπτυξης, απόπτωση και κυτταροσκελετικές αναδιάταξη. ΡΙ3Κ είναι ετεροδιμερείς κινάσες λιπιδίων που αποτελούνται από ρυθμιστικές και καταλυτικές υπομονάδες κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια [15]. Μία από τις κύριες λειτουργίες της PI3K είναι να συνθέσει το δεύτερο PtdIns messenger (3,4,5) P3 (ΡΙΡ3) από PtdIns (4,5) P2 (PIP2). ΑΚΤ, μια κινάση σερίνης /θρεονίνης που έχει ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων, ενεργοποιείται από την πρόσληψη στην πλασματική μεμβράνη μέσω της άμεσης επαφής του πλεκστρίνης-ομολογίας της (ΡΗ) με ΡΙΡ3, και φωσφορυλίωση στη Thr308 και Ser473. ΑΚΤ ενεργεί κατάντη της ΡΙ3Κ να ρυθμίζουν πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και την ανάπτυξη, αλλά και άλλα μονοπάτια σηματοδότησης είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζονται από δραστικότητα ΡΙ3Κ και μπορεί να εμπλέκεται σε ΡΙ3Κ μεσολάβηση ογκογένεση. ΡΤΕΝ είναι ένας από τους πιο συχνά χάνονται ογκοκατασταλτικών γονιδίων στον καρκίνο του ανθρώπου. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, μεταλλάξεις και διαγραφές ΡΤΕΝ συμβεί ότι αδρανοποιούν την ενζυμική της δράση που οδηγεί σε αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μειωμένη κυτταρικό θάνατο. Η συχνή γενετική απενεργοποίηση του ΡΤΕΝ εμφανίζεται σε γλοιοβλάστωμα, καρκίνο του ενδομητρίου, καρκίνους του προστάτη? και μειωμένη έκφραση βρίσκεται σε πολλά άλλα όγκους όπως του πνεύμονα και του καρκίνου του μαστού [15]. Σε αυτή τη μελέτη Western ανάλυση έδειξε επίσης μια μείωση στην έκφραση της IL-32 μετά την αναστολή της miR-23b-3ρ σε Α-498 κύτταρα. Δεν παρακολουθεί IL-32 στο μέσο καλλιέργειας. IL-32 είναι μια κυτοκίνη και είναι προ-καρκινικές ρόλος έχει τεκμηριωθεί σε διάφορες μελέτες [16], [17], [18]. Η ΡΙ3-κινάσης έχει δειχθεί ότι επάγει IL-32 έκφραση σε μια σειρά από μελέτες [19], [20], [21], [22], ειδικά σε καρκίνο του παγκρέατος που έχει καθιερωθεί η προ- καρκινικές ρόλο της. Ως εκ τούτου, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι ο λόγος για την μείωση της IL-32 έκφρασης κατά γκρεμίσουμε του miR-23b-3ρ είναι ότι επηρεάζει επίσης την έκφραση της ΡΙ3-κινάσης και Akt. Μια αναζήτηση λογισμικού για τις περιοχές στις ΡΙ3-κινάσης και Akt δεσμευτική miR-23b-3ρ διεξήχθη στις όμως δεν βρήκαμε καμία απόδειξη ότι ΡΙ3-κινάσης και Akt είναι άμεσοι στόχοι του miR-23β-3ρ.

Γενιστεΐνη (40,5,7-trihydroxyflavone), μία από τις κύριες ισοφλαβόνες σόγιας, έχει ένα ευρύ φάσμα των χημειοπροληπτικές δράσεων. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις της γενιστεΐνης έχουν αποδοθεί σε διάφορες οδούς σηματοδότησης και τους μηχανισμούς που επηρεάζουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, εισβολή, μετάσταση και αγγειογένεση, ιδιότητες που θα μπορούσαν δυνητικά να εμποδίσει έναρξη και την εξέλιξη [23] του όγκου, [24]. Η γενιστεΐνη είναι άφθονο σε προϊόντα σόγιας και έχει ταυτοποιηθεί ως ένας αναστολέας των κινασών τυροσίνης πρωτείνης και έτσι μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση [25], [26]. Εχει αναφερθεί ότι έχει οιστρογονικές ιδιότητες και αντι-νεοπλασματική δραστικότητα σε πολλαπλούς τύπους όγκου [27]. Σε προηγούμενη μελέτη Hillman et. al. έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός της γενιστεΐνης με πρωτογενή ακτινοβολία του όγκου δρα αποτελεσματικά ως θεραπευτική προσέγγιση, σε καθιερωμένους όγκους νεφρού, λόγω της ανάπτυξης του όγκου αναστέλλεται τόσο σε πρωτογενή και μεταστατικές θέσεις. Σε genistein μελέτη τους μόνο είχε την τάση να τονωθεί η ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου των νεφρών και την αύξηση της μετάστασης [28]. Έτσι, αυτά τα ευρήματα μας ώθησε να παρακολουθεί την έκφραση του miRNA-23β-3ρ μετά την επεξεργασία των A-498 κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις genistein. Βρήκαμε μια μείωση 50% στην έκφραση του miR-23β-3ρ μετά την επεξεργασία των A-498 κυττάρων με 25 μΜ γενιστεΐνης για 96 ώρες (Εικόνα 8). Σε μια προηγούμενη μελέτη [29] αναφέραμε επίσης μία μείωση του miR-21 έκφραση σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού που σχηματίζεται μετά την έγχυση 25 μΜ γενιστεΐνης αντιμετωπίζεται μια-498 κύτταρα υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς σε σύγκριση με μικρότερους όγκους που σχηματίζονται από μη επεξεργασμένα κύτταρα Α-498. Μετρήσαμε επίσης την έκφραση του miR-23b-3ρ σε αυτές όγκους και δεν μπορούσε να βρει οποιαδήποτε σημαντική αλλαγή στην έκφραση του.

Εν ολίγοις, miR-23b-3ρ είναι ένα ογκογονίδιο στο RCC και αναστέλλει άμεσα τον όγκο ΡΤΕΝ καταστολέα γονίδιο. Έτσι miR-23β-3ρ μπορεί να είναι χρήσιμο ως διαγνωστικός δείκτης νεφρικών καρκίνου και ως θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του νεφροκυτταρικού καρκινώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) νεφρική δείγματα καρκίνου ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01).

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Ανθρώπινο νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές α-498, ACHN, Caki-1, Caki-2, και ένα φυσιολογικό κύτταρο γραμμή νεφρού (HK-2) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Ακεραιότητα από τις κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε από την ATCC χρησιμοποιώντας DNA (STR) προφίλ. Κανονική νεφρικά κύτταρα ΗΚ-2 καλλιεργήθηκαν ως μια μονοστοιβάδα σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Κ-SFM) συμπληρωμένο με 0.05 mg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών (ΒΡΕ), 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml πενικιλλίνη και 50 mg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών Α-498 και ACHN καλλιεργήθηκαν ως μια μονοστοιβάδα σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-1 και Caki-2 καλλιεργήθηκαν με τον ίδιο τρόπο σε McCoy’s5A μέσα μαζικής ενημέρωσης (UCSF Cell Culture Διευκόλυνσης, San Francisco, CA, USA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO2 στους 37 ° C.

γενιστεΐνη θεραπεία μιας-498 κύτταρα

Α-498 κύτταρα (60 -70% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μΜ και 50 μΜ). Η γενιστεΐνη (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε DMSO, και τα κύτταρα σε αγωγή με φορέα (DMSO) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Φρέσκο ​​genistein χορηγήθηκε καθημερινά με μια αλλαγή του μέσου, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ημέρες.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), συμπληρωματικό DNA ήταν ενισχυμένο με απογραφεί Gene Δοκιμασία Προϊόντα που περιέχουν δύο γονιδίων-ειδικούς εκκινητές και ένα TaqMan MGB καθετήρα (6-FAM βαφής-επισημασμένο) χρησιμοποιώντας ένα TaqMan Οικουμενική Fast PCR Master Mix σε 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA , ΗΠΑ). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας περιλαμβάνονται 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα (s), 40 κύκλοι των 95 ° C για 3s και 60 ° C για 30s, ανάλογα με το Fast πρωτόκολλο καθολική PCR TaqMan. Σύνολο microRNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ από την Qiagen miRNeasy (Valencia, CA, USA). Για τα πειράματα σε πραγματικό χρόνο miRNA ο κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Applied Biosystems Taqman microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), με 200 ng του συνολικού εξαχθέντος miRNA. RNU48 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Χρησιμοποιήθηκε επίσης ως ενδογενής έλεγχος για πραγματικού χρόνου PCR πειράματα, όπου miRNAs απομονώθηκαν από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) νεφρική δείγματα. Σύνολο miRNA εξήχθη από δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNA FFPE από Qiagen.

Micro ανατομή των νεφρών καρκινικούς ιστούς και RNA Εκχύλιση από FFPE Ανθρώπινα Νεφρική όγκου δείγματα

Δίπλα φυσιολογικών και καρκινικών νεφρικούς ιστούς ελήφθησαν από 29 αντιπροσωπευτικά τμήματα ιστού FFPE της ριζοσπαστικής δείγματα νεφρεκτομή από το Τμήμα Παθολογίας των υποθέσεων παλαιμάχων (VA) Ιατρικό Κέντρο του Σαν Φρανσίσκο. Τα μπλοκ ήταν από ασθενείς με καρκίνο του νεφρού που χειρουργήθηκαν στο Ιατρικό Κέντρο VA μεταξύ 1980-2009. Ενότητες (4 μm) των μπλοκ ετοιμάστηκαν, H & amp? Ε βάφονται, και διαφάνειες εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγος για να σηματοδοτήσει τις κανονικές και του καρκίνου περιοχές. Στη συνέχεια, 12 μm πλάκες κατασκευασμένες από τα μπλοκ και μικρο ανατομή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το επισημαίνονται Η &? Ε χρώση διαφάνειες ως πρότυπο. εξόρυξη microRNA έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης Qiagen FFPE miRNA. Τα επίπεδα του miR-23β-3ρ αξιολογήθηκαν με την δοκιμασία Taqman miR όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά PCR, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-23b-3ρ σε καρκινικούς περιοχές κανονικοποιήθηκαν σε γειτονικό φυσιολογικό αντίστοιχά τους.

διαμόλυνσης κυττάρων

Α498 και Caki-2 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με miRNA-23b -3p αναστολέα (

mir

Vana® miRNA αναστολέα της Applied Biosystems, Δοκιμασία Α.Δ.Τ.. MH10711) ή αντι-miR αρνητικού ελέγχου # 1 (από Ambion, Austin, TX, USA Κατάλογος όχι. AM17010), χρησιμοποιώντας X- αντιδραστηρίου επιμόλυνσης tremeGENE siRNA (Roche Diagnostics Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) 24 ώρες πριν την επιμόλυνση και παροδικά επιμολυσμένα σε συρροή 40-50%. Mock επιμόλυνση, με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκε επίσης ως μάρτυρας. Το μείγμα μετεμβολιασμού διαλύθηκε σε Ορίί-ΜΕΜ μέσου χωρίς ορό (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA) και κατά το χρόνο της επιμόλυνση τα κύτταρα σπάρθηκαν σε Minimum Essential Medium (UCSF διευκόλυνση κυτταρικής καλλιέργειας) Eagle, το με 10% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA) και χωρίς αντιβιοτικά. Την επόμενη ημέρα το μέσο άλλαξε σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle που περιέχει τόσο FBS και 1% αντιβιοτικό (πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, 100x, UCSF Cell Culture Facility). Τα κύτταρα σβωλοποιήθηκαν, μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης για κυτταρομετρία ροής, RNA και πρωτεϊνικής εκχύλισης.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, (UCSF Cell Culture Facility), και επαναιωρήθηκαν στο πυρηνική χρώση 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Για την απόπτωση, τα κύτταρα στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση ήταν διπλή χρώση με την χρωστική βιωσιμότητας 7 -αμινο-ακτινομυκίνη D (7-AAD) και αννεξίνης V-FITC χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC kit /7-αμινο-ακτινομυκίνη D (Beckman Coulter) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

Ένα cytoselect μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή κιτ προσδιορισμού 24 φρεατίων (Cell Biolabs, Inc ., San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (8 μm, Χρωματομετρική μορφή) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ανάλυση Western

ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA? Thermo Scientific, Rockford, IL, USA? 50 mmol λ-1 Tris (ρΗ 8.0), 150 mmol Γ1 NaCl, 0.5% δεοξυχολικό, 0.1% SDS και 1.0% ΝΡ-40) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). δοκιμασίες πρωτεΐνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BCA κιτ δοκιμασίας Πρωτεΐνης (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνολική πρωτεΐνη (40 μg) υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 12% πηκτώματα SDS-PAGE, κηλίδωση Western και διεξήχθη με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων και πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια. Αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων ΡΤΕΝ (αρ. Κατ. 9552S) και Akt (αρ. Κατ. 4691S) αγοράστηκαν από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA), ΡΙ3-κινάση (cat ηο. Ab69870) και IL-32 (cat ηο. ab62580) ήταν από Abcam (Cambridge, MA, USA), ενώ GAPDH (αρ. κατ. sc-32233) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

Η πρωτεΐνη επίπεδα έκφρασης ποσοτικά με οπτική πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ Λογισμικό έκδοση 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Διπλώστε αλλαγή αυτή υπολογίζεται ως ο λόγος μεταξύ του καθαρού ένταση κάθε δείγμα επιμολυσμένα με αντι-miR-23b-3P διαιρείται με GAPDH και τα αρνητικά δείγματα ελέγχου επιμολυσμένα διαιρείται με το GAPDH (Anti-miR-23b-3ρ επιμολυσμένα δείγματα /GAPDH) /(Neg ελέγχου miR επιμολυσμένα δείγματα /GAPDH).

Luciferase Assay Reporter

κύτταρα σε πλάκες 24-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 30 ηΜ προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-23b -3p (Applied Biosystems) και το κατασκεύασμα ΡΤΕΝ (αρ. καταλόγου HmiT015535, Genecopoeia, Rockville, MD, USA) ή το μόρφωμα ελέγχου, pEZX-MT01 (Genecopoeia) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κατασκεύασμα ελέγχου δεν είχε θέσεις στόχους miR-23b-3ρ. Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η δράση φωτοφεράσης προσδιορίστηκε σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία ανταποκριτή (Promega).

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε σε πλακίδια νεφρικό καρκίνο ιστού [κατασκευασμένο από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) καρκίνο νεφρικών κυττάρων χρησιμοποιώντας μικροτόμο (Leica)]. Οι πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν και ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με φούρνο μικροκυμάτων τα πλακίδια σε 10 mmol ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου /λίτρο. Τα πλακίδια επωάστηκαν για μια νύχτα με αντι-ΡΤΕΝ αντίσωμα (σηματοδότηση κυττάρου). Η χρώση έγινε με τη χρήση του LABVISION Corporation (Thermo Fisher Scientific) Anti-Rabbit Σύστημα βαφής (LOT-RHD 80924) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση έκδοση StatView 5.0 για Windows. έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορετικές ομάδες. ρ-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Chi-square test εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-23b-3ρ και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PTEN σε δείγματα ιστών.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και βοήθεια με η προετοιμασία του χειρογράφου.