Abstract

παράγοντα μεταγραφής STAT6 έχει γίνει ένα δυναμικό μόριο για θεραπευτική παρέμβαση, διότι ρυθμίζει ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών σε μια μεγάλη ποικιλία τύπων κυττάρων. Αν και έχουν ορισμένα γονίδια-στόχους και να αλληλεπιδρά συνεργάτες του STAT6 έχουν ταυτοποιηθεί, ο ακριβής μηχανισμός δράσης πρέπει να διευκρινιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι μοριακές αλληλεπιδράσεις, τα δίκτυα, και τις λειτουργίες του STAT6 με προφίλ της έκφρασης του mRNA του STAT6 σιγήσει ανθρώπινα πνευμονικά κύτταρα (NCI-Η460) χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες. Η ανάλυσή μας έδειξε 273 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μετά STAT6 αποσιώπηση. Η ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης με Ingenuity λογισμικό Pathway Analysis (ΙΡΑ) αποκάλυψε

Η γονιδιακή έκφραση, κυτταρικό θάνατο, Μεταβολισμός λιπιδίων

ως τις λειτουργίες που σχετίζονται με την υψηλότερη βαθμολογία δίκτυο.

βιοσύνθεση της χοληστερόλης ήταν

μεταξύ των πιο εμπλουτισμένο οδούς σε ΙΡΑ καθώς επίσης και σε ανάλυση PANTHER. Αυτά τα αποτελέσματα έχουν επικυρωθεί με πραγματικού χρόνου PCR και χοληστερόλη δοκιμασία χρησιμοποιώντας κωδικοποιημένα siRNA ως αρνητικός έλεγχος. Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν επίσης με II κυψελιδική επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου τύπου, Α549. Στην παρούσα μελέτη έχουμε, για πρώτη φορά, παρουσιάζεται η αντίστροφη σχέση του STAT6 με τη βιοσύνθεση χοληστερόλης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τα παρόντα ευρήματα είναι πιθανώς σημαντικά για την προώθηση της κατανόησης και το σχεδιασμό των θεραπευτικών για τις παθολογικές καταστάσεις όπου τόσο STAT6 και βιοσύνθεσης χοληστερόλης ενοχοποιούνται δηλαδή. άσθμα, αρτηριοσκλήρυνση κλπ

Παράθεση: Dubey R, Chhabra R, Saini Ν (2011) μικρά παρεμβαλλόμενα RNA κατά Μεταγραφή Factor STAT6 οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση της χοληστερόλης στον καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10.1371 /journal.pone.0028509

Επιμέλεια: Sunil Κ Ahuja, Νότια Τέξας Βετεράνων Σύστημα Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: ένατης Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Δεκ του 2011

Copyright: © 2011 ϋυοβγ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς Αναγνωρίζετε το Τμήμα Βιοτεχνολογίας (DBT) για τη χρηματοδότηση του έργου με τίτλο «Μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα STAT6 στη ρύθμιση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας RNAi Τεχνολογία» (GAP0047). RD υποστηρίχθηκε οικονομικά από DBT GAP0047 έργου. RC υποστηρίχθηκε με CSIR-Senior Research Fellowship (Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

STAT6 είναι ένα από τα επτά μέλη της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων που συμμετέχουν στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης όταν τα κύτταρα αντιμετωπίζουν διάφορα εξωκυτταρικά πολυπεπτίδια όπως κυτοκίνες, ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες και ρυθμίζουν ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό , τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [1], [2], [3], [4]. Σε γενικές γραμμές, μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνες STAT υπάρχουν ως λανθάνουσες μορφές στο κυτταρόπλασμα. Η έκθεση κυτοκίνης οδηγεί σε STAT φωσφορυλίωση από Janus κινάσες και άπαξ φωσφορυλιωμένη ο διμερισμός των μεμονωμένων πρωτεϊνών STAT συμβεί μέσω περιοχών SH2 τους που ακολουθείται από μετανάστευση των λειτουργικών διμερούς STAT στον πυρήνα όπου μπορεί να δεσμευτεί DNA και απευθείας ενεργοποιεί τη μεταγραφή του κυτοκίνης αποκριτικών γονιδίων [5] , [6]. Ακριβώς όπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας STAT, STAT6 παίζει ένα διπλό ρόλο του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής είτε την άμεση ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ή με αλληλεπίδραση με μια ευρεία ποικιλία άλλων παραγόντων μεταγραφής [7].

IL -4 και IL-13 που επάγεται σηματοδότηση STAT6 έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των κυττάρων Th2, Β-λεμφοκυττάρων επαγόμενη έκφραση του IgG και IgE και την εμφάνιση επιφάνειας κυττάρου του MHC τάξης II και CD23 [8], [9] , [10], [11]. Αν και STAT6 κυρίως γνωστό ότι σχετίζονται με την αλλεργική φλεγμονή και το άσθμα, STAT6 απορρύθμιση έχει επίσης εμπλακεί σε διάφορες άλλες ασθένειες. STAT6 διαδραματίζει βασικό ρόλο στην ηπατίτιδα Τ κυττάρων μέσω ενίσχυση της έκφρασης του εοτοξίνες σε ηπατοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, και προκαλεί IL-5 έκφρασης, διείσδυση ηωσινοφίλων και ουδετεροφίλων στο ήπαρ και οδηγεί σε ηπατίτιδα [12]. Υπάρχουν αποδεικνύει επίσης ότι η IL-4 που προκαλείται από την ενεργοποίηση του STAT6 σχετίζεται με μειωμένη ηπατική έκφραση του ΤΝΡα, καθώς και εξασθένηση της στρατολόγησης ήπατος ουδετερόφιλων και μπορεί να προστατεύσει από ηπατική ισχαιμία /επαναιμάτωσης [13]. STAT6 έχει επίσης καταδειχθεί ότι εμπλέκονται σε ακτινωτό mechanosensation σε κύτταρο νεφρού επιθηλιακά [14]. Πρόσφατα, οι πολυμορφισμοί του γονιδίου IL-4 και STAT6 έχουν επίσης βρεθεί συνδέονται με την ανάπτυξη συστηματικός ερυθηματώδης λύκος σε Κινέζους ασθενείς [15]. Shum

κ.ά.

το 2006 παρέχεται μία σύνδεση μεταξύ αλλεργικής φλεγμονής και του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων όπου έχουν δείξει ότι ένα IL-4 /STAT6 ρυθμιζόμενο γονίδιο aP2, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων, απαιτείται Th2 που προκαλείται αλλεργική φλεγμονή των αεραγωγών [16] και πρόσφατα STAT6 έχει βρεθεί ότι παίζει ρόλο στη ρύθμιση της ομοιόστασης των λιπιδίων στο ήπαρ ως παρατηρήθηκε αυξημένη εναπόθεση λιπιδίων σε ποντικούς STAT6 knockout [17]. Εκτός από τις ανωτέρω διαπιστώσεις, Zhang

et al

το 2006 ανέφερε ότι STAT6 σίγηση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου ΗΤ-29 κυττάρων [4]. Σε μια άλλη μελέτη, Das

et al

το 2007 διαπίστωσε ότι STAT6 είναι μία ουσιαστικά εκφράζεται παράγοντα επιβίωσης στον καρκίνο του ανθρώπινου προστάτη [18]. Αυτή η επίδραση του STAT6 ενισχύθηκε περαιτέρω σε μια μελέτη από Cui

κ.ά.

το 2007, όπου έχουν δείξει ότι μη φωσφορυλιωμένη STAT6 μεταγραφικά μέχρι ρυθμίζει την έκφραση της COX-2 και προστατεύει ενάντια σε απόπτωση σε NSCLC (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ) κύτταρα [19].

Παρά το γεγονός ότι, λίγες γονιδίων στόχων και μερικά αλληλεπιδρούν εταίρους STAT6 γίνει γνωστό μέχρι σήμερα, οι ακριβείς μηχανισμοί της STAT6 μεσολάβηση σηματοδότησης είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Στο πλαίσιο αυτό, επιδιώξαμε να μελετηθεί η επίδραση της STAT6 σιγαστήρα για ευρεία πρότυπα γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε κύτταρα NCI-Η460 (καρκίνο του πνεύμονα επιθηλιακά). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν μετά siRNA μεσολαβεί αποσιώπηση του STAT6 σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 επίσης επικυρωθεί σε κύτταρα Α549.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και καρκίνωμα siRNA Μορφομετατροπή

Lung ( κύτταρα NCI-H460 και Α549) ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο για Cell Science, Pune της Ινδίας και διατηρήθηκε σε RPMI-1640 /μέσα DMEM, που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα.

για την επιμόλυνση σε 12 φρεατίων, 1,2 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα επόμενη ημέρα τα κύτταρα επιμολύνονται με 60 ηΜ siRNA επικυρωμένων (Ambion, USA) χρησιμοποιώντας 4 μΙ λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 50 ng /ml ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-4 (Βϋ Pharmingen, USA) για 4 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 h /48 h /72 ώρες μετά την επιμόλυνση και χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. Η μη-επιμολυσμένα και μπερδεμένο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες για όλα τα πειράματα εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

RNA Εκχύλιση και Real Time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA) και 2 μg του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας RevertAid ™ Η Minus αντίστροφη κιτ μεταγραφάσης (Fermentas, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Real Time PCR έγινε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems, Foster City, CA). Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με 18s rRNA. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Pfaffl [20]. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για RT-PCR δίδονται στον Πίνακα S1.

Western Blotting

Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA τροποποιημένο {50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ40, 0.25% Na δεοξυχολικό, 1 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 1 mM orthovandate νάτριο, και 1 mM φθοριούχο νάτριο} και διατηρούνται σε πάγο για 30 λεπτά. Το λύμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 12,000 rpm για 30 λεπτά, το υπερκείμενο συλλέγεται και εκτίμηση πρωτεΐνη έγινε χρησιμοποιώντας την μέθοδο BCA. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) διαχωρίστηκαν σε 12% δωδεκυλοθειικό νάτριο – ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 3% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl, ρΗ 7,4) με 0,1% Tween-20 για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 1% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες που ακολουθείται από επώαση με κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα (ALP αντι-ποντικού συνδεδεμένη ή ALP /αντι-κουνελιού συνδεδεμένο) για 1 ώρα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας NBT- BCIP ως υπόστρωμα. Ίση φόρτωση των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας GAPDH αντισώματος. Μέτρηση της έντασης του σήματος σε μεμβράνες PVDF μετά κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας AlphaImager 3400 (Άλφα Innotech Corporation, San Leandro, California). Οι τιμές IDV υπολογίζονται ως οι τιμές πυκνότητας των συγκεκριμένων τιμές πυκνότητας ζώνη /GAPDH πρωτεΐνης. Η πολλαπλή μεταβολή σε σχέση με μη επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια υπολογίστηκε με βάση τις τιμές IDV. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές? Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται.

Illumina μικροσυστοιχιών

Γονιδιώματος μεγάλη επίδραση STAT6 αποσιώπηση μελετήθηκε χρησιμοποιώντας Illumina μικροσυστοιχιών. Δύο βιολογικές επαναλήψεις μη επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 και τα κύτταρα NCI-H460 επιμολυσμένα με 60 ηΜ του STAT6 siRNA (για 48 ώρες) χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα συστοιχία. Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA), καθαρίστηκε και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα RNA ελέγχθηκαν για την ακεραιότητα με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Η Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, ΤΧ, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία βιοτινυλιωμένο, ενισχυμένο RNA. Εν συντομία, 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με ένα εκκινητή ολιγο (dT) χρησιμοποιώντας ένζυμο ArrayScript και ενισχύθηκαν όλη την νύκτα με Τ7 RNA πολυμεράσης και σημαίνεται με βιοτίνη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αυτό επισημασμένο ενισχυμένο RNA (aRNA) υβριδοποιήθηκε προς Illumina Genome-Wide BeadChips έκφρασης (Human Ref-6 v.3.0, Illumina, CA, USA) που αντιπροσωπεύει ~43,000 ανθρώπινο μεταγραφές στους 58 ° C όλη τη νύκτα. Συστοιχίες επωάστηκαν με Cy3 στρεπταβιδίνη και πλένεται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το τσιπ σαρώθηκε χρησιμοποιώντας Illumina σαρωτή (iScan) και την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Illumina Beadstudio 2.0. Τα δεδομένα ήταν μέσο κανονικό και τα γονίδια τα οποία πέρασαν το κατώφλι του p τιμή ανίχνευσης ≤ 0,05 μεταξύ όλων των δειγμάτων και διαφορικό όρος τιμή ρ ≤ 0,05 μεταξύ των δειγμάτων δοκιμής θεωρούνται ότι είναι διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Το διάγραμμα ροής εργασίας του πειράματος αυτού δίδεται στο Σχήμα S1. Τα δεδομένα που ελήφθησαν έχει κατατεθεί στο Gene Expression NCBI του Omnibus [21] και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη γονιδιακής έκφρασης Omnibus (GEO) Σειρά GSE25942 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ; acc = GSE25942)

ανάλυση μονοπατιού Ingenuity (IPA)

Σύνολα δεδομένων που αντιπροσωπεύουν γονίδια με αλλαγμένο προφίλ έκφρασης που προέρχονται από μικροσυστοιχίες αναλύσεις εισήχθησαν στην εργαλείο ανάλυσης Ingenuity Pathway (IPA εργαλείο?. Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, USA? https://www.ingenuity.com). Σε IPA, εκφράζονται διαφορετικά γονίδια χαρτογραφούνται στους γενετικούς δίκτυα που είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων εφευρετικότητα και στη συνέχεια ανάλογα με τη βαθμολογία.

Η βάση του προγράμματος IPA αποτελείται από το Ingenuity δρόμος της Γνωσιακής Βάσης (IPKB), η οποία προέρχεται από γνωστές λειτουργίες και τις αλληλεπιδράσεις των γονιδίων έχει δημοσιευθεί στην βιβλιογραφία. Έτσι, το εργαλείο ΜΠΒ επιτρέπει την ταυτοποίηση των βιολογικών δικτύων, παγκόσμια λειτουργίες και λειτουργικά μονοπάτια ενός συγκεκριμένου συνόλου δεδομένων. Το πρόγραμμα δίνει επίσης την αξία σημασία των γονιδίων, τα άλλα γονίδια με τα οποία αλληλεπιδρά, και πως τα προϊόντα των γονιδίων δρουν άμεσα ή έμμεσα πάνω στο άλλο, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δεν εμπλέκονται στην ανάλυση μικροσυστοιχίας. Τα δίκτυα που δημιουργήθηκαν κατατάσσονται ανάλογα με τον αριθμό των σημαντικά εκφρασμένων γονιδίων που περιέχουν και επίσης κατάλογος των ασθενειών που ήταν πιο σημαντικές. Ένα δίκτυο είναι μια γραφική αναπαράσταση των μοριακών σχέσεων μεταξύ μορίων. Μόρια αντιπροσωπεύονται ως κόμβοι, και η βιολογική σχέση μεταξύ δύο κόμβων παριστάνεται ως μία ακμή (γραμμή). Όλες οι ακμές που υποστηρίζεται από τουλάχιστον 1 αναφορά από τη βιβλιογραφία, από ένα βιβλίο ή από κανονική πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στο Ingenuity Pathways Γνωσιακής Βάσης. Η ένταση του χρώματος κόμβου δείχνει το βαθμό της ανάντη (κόκκινο) ή κατάντη (πράσινο) του κανονισμού. Οι κόμβοι εμφανίζονται με διάφορα σχήματα που αντιπροσωπεύουν την λειτουργική κατηγορία του γονιδιακού προϊόντος.

PANTHER ανάλυση

Το PANTHER (Protein ανάλυση μέσω εξελικτικές σχέσεις) Σύστημα Ταξινόμησης είναι ένα μοναδικό πόρο που ταξινομεί τα γονίδια από τους λειτουργίες, χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες επιστημονικές πειραματικές αποδείξεις και εξελικτικές σχέσεις για να προβλέψει τη λειτουργία ακόμη και εν απουσία της άμεσης πειραματικές αποδείξεις [22]. Τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που λαμβάνεται μετά STAT6 σίγηση σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 εισήχθησαν PANTHER (https://www.pantherdb.org/), όπου ο αριθμός των γονιδίων σε κάθε οδό συγκρίθηκαν έναντι του αριθμού των γονιδίων από NCBI του

Homo sapiens

γονιδιώματος σε αυτό το μονοπάτι. Το διωνυμικό τεστ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει στατιστικά υπερεκπροσώπηση των κατηγοριών ταξινόμησης πάνθηρα. Bonferroni-διορθωμένες τιμές ρ & lt? 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

προσδιορισμού χοληστερόλης

περιεκτικότητα σε χοληστερόλη προσδιορίσθηκε στα κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ επιμέτρησης χοληστερόλης (Biovision, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10

6 κύτταρα λύθηκαν και τα λιπίδια εκχυλίστηκαν με ομογενοποίηση με 200 μΐ χλωροφορμίου: ισοπροπανόλης: Triton Χ-100 (7: 11: 0,1). Αυτά τα λιπιδικά εκχυλίσματα ξηράνθηκαν σε κενό για 30 λεπτά και τα υπολείμματα διαλύθηκαν σε 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος χοληστερόλης Αντίδρασης που παρέχεται με το κιτ. Η χοληστερόλη εκτιμήθηκε με φασματομετρία σε λ = 570 nm σε μια πλάκα 96 φρεατίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα χοληστερόλης ήταν κανονικοποιούνται με τα ποσά της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης.

Ανάδοχος Ανάλυση

Για την αναγνώριση των κοινών κανονιστικών ελέγχων μεταξύ των αλλοιωθεί γονίδια, τα γονίδια του μονοπατιού βιοσύνθεσης της χοληστερόλης (HMGCR- 3-υδροξυ 3-μεθυλογλουταρυλο-συνένζυμο Α ρεδουκτάσης, HMGCS1- 3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρυλο-συνένζυμο Α συνθετάση 1 και IDI1- ισοπεντενυλ-διφωσφορικού δέλτα ισομεράσης 1) πάρθηκαν για ανάλυση υποκινητή. Ensembl [23] χρησιμοποιήθηκε για την ανάκτηση 5,0 kb ανάντη περιοχές από τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής αυτών των γονιδίων και του μεταγραφικού παράγοντα (ες) δέσμευσης εντός αυτής της περιοχής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας υπερεκπροσωπούνται Μεταγραφή Factor Δεσμευτική Πρόβλεψη ιστοσελίδας (OTFBS) του εργαλείου [24] που ανιχνεύει υπερεκπροσωπούνται μοτίβα γνωστών παραγόντων μεταγραφής για ένα σύνολο γονιδίων.

κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Shift δοκιμασία (EMSA)

Ο προσδιορισμός μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας διεξήχθη όπως περιγράφεται από Shiraga

et al

. [37]. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από μη επιμολυσμένα, siRNA επιμολυσμένα (60 ηΜ, 48 h /72 h) και κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κιτ αντιδραστηρίου εκχύλισης Cytoplasmic (Pierce) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Οι ακολουθίες ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται στην EMSA ελήφθησαν από μια προηγούμενη μελέτη που δημοσιεύθηκε [25]. Δίκλωνο DNA δημιουργήθηκε με ανάμιξη ισομοριακών ποσοτήτων των συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων σε ρυθμιστικό ανόπτησης (Ambion, CA, USA). Μεταλλαγμένη αλληλουχία του παράγοντα μεταγραφής χρησιμοποιήθηκε επίσης για να ελεγχθεί η ειδικότητα της πρόσδεσης του παράγοντα μεταγραφής. Αυτές ανοπτήθηκαν δίκλωνο DNA σημάνθηκαν με [C32-Ρ] -ΑΤΡ (BRIT, Hyderabad, Ινδία) υπό την παρουσία Τ4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πυρηνικά εκχυλίσματα (18 μg) από τα μη μορφομετατραπέντα και siRNA επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό την παρουσία ρυθμιστικού αντίδρασης περιείχε 8 mM Tris-KCl (ρΗ 8.0), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 12% γλυκερόλη , 1 mg BSA και 1 mg πολυ (dI-dC). Είτε το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο σημασμένο δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο (40.000 cpm) προστέθηκε στη συνέχεια στο μίγμα της αντίδρασης και επωάστηκε για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Με τη λήξη της επώασης, τα δείγματα φορτώθηκαν σε μία μη-αναγωγική 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτροφορήθηκαν σε 0,5Χ ΤΒΕ. Οι πηκτές στη συνέχεια ξηράνθηκαν και υποβλήθηκαν σε Phosphorimager αναλύσεις (FLA 2000, Fujifilm, Ιαπωνία). Οι πυκνομετρικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το AlphaImager 3400 (Άλφα Innotech Corporation, San Leandro, California). Το ίδιο κουτί ορθογώνιο μέγεθος συντάχθηκε γύρω από κάθε μπάντα και την ένταση της κάθε αναλύθηκε με το πρόγραμμα μετά την αφαίρεση της έντασης φόντο.

Annexin-V δοκιμασία

Η απόπτωση αξιολογήθηκε από την γκουάβα νεξίνη και το σύστημα γκουάβα PCA (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA). Η έκθεση των φωσφατιδυλοσερίνη (PS) στην επιφάνεια των κυττάρων (που σχετίζεται με την έναρξη της απόπτωσης) αποτελεί τη βάση του προσδιορισμού γκουάβα νεξίνη. Η δοκιμασία Γκουάβα νεξίνη χρησιμοποιεί δύο κηλίδες (αννεξίνη V και 7-αμινο ακτινομυκίνη D [7-AAD)]. Αννεξίνης V-ΡΕ συνδέεται με PS στην κυτταρική επιφάνεια των αποπτωτικών κυττάρων και 7-AAD, η χρωστική κύτταρο διαπερνά είναι ένας δείκτης της δομικής ακεραιότητας της μεμβράνης. 7-AAD εξαιρείται από ζωντανά, υγιή και νωρίς αποπτωτικά κύτταρα, αλλά διαπερνά όψιμο στάδιο αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα. Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του φθορισμού και Αννεξίνη-ΡΕ του κατασκευαστή αναλύθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού cytosoft (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA). Ένα ελάχιστο 2.000 γεγονότων μετρήθηκαν.

κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

Για την ανάλυση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 mg /ml ΚΝάση επί 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ιωδιούχο βαφή φθορισμού προπίδιο (50 μg /ml, Sigma, USA) που δεσμεύονται με DNA μέσω παρεμβολής μεταξύ των βάσεων στους 4 ° C για 30 λεπτά και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής (γκουάβα Technologies, Hayward, Καλιφόρνια, ΗΠΑ ). Ένα ελάχιστο 5.000 εκδηλώσεις μετρήθηκαν.

Αποτελέσματα

προς τα κάτω ρύθμιση STAT6 χρησιμοποιώντας STAT6 ειδικά siRNA

Η αποτελεσματικότητα της STAT6 ειδικά siRNA να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση STAT6 στα κύτταρα NCI-Η460 ήταν αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR για την έκφραση RNA και κηλίδωση Western για τα επίπεδα της πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1β, τα επίπεδα του RNA μειώθηκε κατά 1,20 φορές στις 24 ώρες, 2,12 φορές (τιμή ρ = 0,046) σε 48 ώρες και κατά 1,66 φορές (τιμή ρ = 0.05) σε 72 ώρες σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460, σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα ΝΟΙ-Η460 κύτταρα. Δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή στα μη επιμολυσμένα κύτταρα και κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης του STAT6 μειώθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1α και 1β, υπήρξε 1,12 φορές μείωση στις 24 ώρες, 1,79 φορές (τιμή ρ = 0,02) μείωση στις 48 ώρες και 2,40 φορές (τιμή ρ = 0,028) μείωση κατά 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του STAT6 ειδικών siRNA σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 σε αντίστοιχα χρονικά σημεία. Εμείς επόμενη ελέγξει την έκφραση του φωσφορυλιωμένου STAT6 (pSTAT6) πρωτεΐνη η οποία είναι η ενεργοποιημένη μορφή σηματοδότηση του STAT6. Σε συμφωνία με τα επίπεδα πρωτεΐνης STAT6, η έκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης pSTAT6 ήταν επίσης μειωμένη σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Υπήρχε 1,13 φορές μείωση στις 24 ώρες, 1,85 φορές (τιμή ρ = 0.0008) μείωση στις 48 ώρες και 2,67 φορές (τιμή ρ = 0,001) μείωση κατά 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του STAT6 ειδικών siRNA σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460, σε σύγκριση με μη μορφομετατραπέντα NCI -H460 κύτταρα στα αντίστοιχα χρονικά σημεία (Σχ. 1α και β). Μη σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA (αρνητικός έλεγχος) σε διαφορετικά χρονικά σημεία.

α) Η κηλίδα western του STAT6 και φωσφορυλιωμένη μορφή του STAT6 () πρωτεΐνη pSTAT6 επί κυτταρικά εκχυλίσματα από μη επιμολυσμένα, STAT6 ειδικές siRNA και κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 σε διαφορετικά χρονικά σημεία, όπως υποδεικνύεται. β) Διάγραμμα αντιπροσωπεύει την πτυχή αλλαγή στο επίπεδο STAT6 mRNA, πρωτεΐνη STAT6 και το επίπεδο της πρωτεΐνης pSTAT6 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα NCI-H460 στα αντίστοιχα χρονικά σημεία. Κωδικοποιημένα siRNA σε διαφορετικά χρονικά σημεία χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για πυκνομετρική ανάλυση για την ανάλυση κηλίδος western. Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν σε 18s rRNA έκφραση σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. ** Δείχνει τιμή p & lt? 0.01 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. γ).

Η

Γονιδιώματος ευρύ επιπτώσεις της STAT6 αποσιώπηση στην κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η460 χρησιμοποιώντας Illumina μικροσυστοιχιών

Τα προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε μη επιμολυσμένα κύτταρα NCI-Η460 και τα κύτταρα NCI-Η460 επιμολυσμένα με STAT6 siRNA προσδιορίστηκαν από μικροσυστοιχιών Illumina χρησιμοποιώντας δύο βιολογικές επαναλήψεις. πείραμα σειρά Illumina εντοπίστηκαν 273 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (

187 μειωτικά και 86 ρυθμίζεται προς τα πάνω)

. Πρώτες δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Beadstudio 2.0. Τα δεδομένα συστοιχία ήταν μέσο κανονικό και φιλτράρεται μέσω ανίχνευσης τιμή ρ ≤ 0.05 και η διαφορική τιμή p ≤ 0,05. Ο κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, μαζί με τις αλλαγές φορές τους παρέχεται στον πίνακα S2.

Διευκρίνιση των οδών και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων

Για να διερευνήσουν πιθανές βιολογικές αλληλεπιδράσεις του με διαφορετικό τρόπο ρυθμιζόμενων γονιδίων, τα σύνολα δεδομένων εκπροσωπούν γονιδίων με αλλαγμένη προφίλ έκφρασης που προέρχονται από αναλύσεις μικροσυστοιχιών εισήχθησαν στην εργαλείο ανάλυσης Ingenuity Pathway.

Ο κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που αναλύθηκαν από το IPA αποκάλυψε 20 σημαντικά δίκτυα (Πίνακας S3). Σύκο. 2a αντιπροσωπεύει την λίστα των top 5 των δικτύων που προσδιορίζονται από το IPA. Των δικτύων αυτών,

Η γονιδιακή έκφραση, το θάνατο των κυττάρων, το μεταβολισμό των λιπιδίων

ήταν η υψηλότερη βαθμολογία δίκτυο με 28 μόρια εστίαση και το σκορ σημασία των 54 (Σχ. 2β). Το σκορ είναι η πιθανότητα ότι μια συλλογή γονιδίων ίσο ή μεγαλύτερο από τον αριθμό σε ένα δίκτυο θα μπορούσε να επιτευχθεί από την τύχη και μόνο. Η βαθμολογία των 3 δείχνει μια ευκαιρία 1/1000 ότι τα γονίδια εστίαση είναι σε ένα δίκτυο που δεν οφείλονται σε τυχαία πιθανότητα. Ο κατάλογος των γονιδίων σε αυτό το δίκτυο με τις αντίστοιχες μεταβολές φορές τους στα στοιχεία συστοιχίας παρέχονται στον Πίνακα S4.

Για να διερευνήσουν τις πιθανές αλληλεπιδράσεις του με διαφορετικό τρόπο ρυθμιζόμενων γονιδίων, των συνόλων δεδομένων που αντιπροσωπεύουν 273 γονιδίων με αλλαγμένη προφίλ έκφρασης που λαμβάνεται από το Illumina μικροσυστοιχιών εισήχθησαν στην εργαλείο ανάλυσης Ingenuity Pathway και τα ακόλουθα στοιχεία που απεικονίζονται: α) η λίστα των κορυφαίων πέντε δικτύων με τις αντίστοιχες βαθμολογίες τους, που παίρνονται από το IPA β) πιο υψηλή βαθμολογία δίκτυο στην ανάλυση του ΜΠΒ η εκπροσώπηση του δικτύου από τα πιο υψηλή βαθμολογία δικτύου ( Gene Expression, Cell Death, μεταβολισμού των λιπιδίων). Τα γονίδια που είναι σκιασμένα προσδιορίστηκαν να είναι σημαντικές από την στατιστική ανάλυση. Τα γονίδια σκιασμένο κόκκινο ρυθμίζεται προς τα πάνω και εκείνων που είναι πράσινα είναι μειωτικά. Η ένταση της σκίασης δείχνει σε ποιο βαθμό κάθε γονίδιο ήταν ή κατιούσα ρύθμιση. Μια συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο προϊόντων γονιδίου και μια διακεκομμένη γραμμή σημαίνει ότι υπάρχει μια έμμεση αλληλεπίδραση. Τα γονίδια που σημειώνονται με μπλε αστερίσκο έχουν επικυρωθεί από πραγματικό χρόνο PCR. Τα γονίδια που συνδέονται με την γονιδιακή έκφραση, κυτταρικού θανάτου και Lipid Metabolism κύκλο με πορτοκαλί, μπλε και μοβ χρώματα, αντίστοιχα. γ) κατάλογος Τοξικολογίας μονοπάτι στην ανάλυση του ΜΠΒ. Ο άξονας x αναπαριστά τις κορυφαίες λειτουργίες της τοξικολογίας, όπως υπολογίζεται από το IPA βασίζεται σε διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια επισημαίνονται και η y-άξονας αντιπροσωπεύει την αναλογία του αριθμού των γονιδίων από το σύνολο δεδομένων που χάρτη με την οδό και τον αριθμό όλων των γνωστών γονιδίων που αποδίδεται στο μονοπάτι. Η κίτρινη γραμμή αναπαριστά το όριο της τιμή p & lt? 0.05 όπως υπολογίζεται με δοκιμή του Fischer.

Η

Η ανάλυση IPA επίσης ομάδες των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε βιολογικούς μηχανισμούς που σχετίζονται με ομάδες τοξικότητα. Στη λίστα τοξικολογία,

βιοσύνθεση της χοληστερόλης και p53 Σηματοδοσίας

βγήκε να είναι οι κορυφαίοι δύο πιο σημαντικές οδοί με τιμή ρ 0.011 και 0.013, αντίστοιχα (Εικ. 2γ). Τα γονίδια που σχετίζονται με την κορυφή της λίστας tox δίνονται επίσης στον Πίνακα S5.

Παράλληλα, διαφορικά εκφρασμένων λίστα γονίδιο που λαμβάνονται μετά STAT6 αποσιώπηση στα κύτταρα NCI-H460 τροφοδοτείται στην διαδικτυακή πηγή PANTHER να αποκαλύψει εμπλουτισμένο μονοπάτια. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αυτή την ανάλυση επίσης βρήκαμε βιοσύνθεσης χοληστερόλης και σηματοδότηση της αποπτώσεως μεταξύ των σημαντικά εμπλουτισμένη οδούς. Οι οδοί που πέρασαν το κατώφλι του τιμή p & lt? 0.05 σε ανάλυση PANTHER παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

STAT6 αποσιώπηση αυξάνει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη χοληστερόλη βιοσύνθεση /ομοιόστασης και ενισχύει τα επίπεδα της χοληστερόλης

Από το πιο πάνω δίκτυο που ελήφθη στο ανάλυση ΙΡΑ ήταν

η γονιδιακή έκφραση, το θάνατο των κυττάρων, Μεταβολισμός λιπιδίων

και βιοσύνθεση χοληστερόλης βγήκε εμπλουτίζεται τόσο ΙΡΑ και ανάλυση PANTHER ελέγξαμε τις αλλαγές στα επίπεδα της χοληστερόλης μετά STAT6 αποσιώπηση από siRNA στα κύτταρα NCI-Η460. Κωδικοποιημένα siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σύκο. 3α δείχνει ότι το STAT6 σίγασης αυξημένα επίπεδα χοληστερόλης σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, με 1,23 φορές αύξηση στις 24 ώρες, 1,8 φορές (τιμή ρ = 0,005) αύξηση στις 48 ώρες και 2,3 φορές (τιμή ρ = 0,004) αύξηση σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των siRNA στα κύτταρα NCI-Η460. Ωστόσο, καμία τέτοια αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα της χοληστερόλης στα κύτταρα NCI-H460 επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA. Λάβαμε επίσης παρόμοια αποτελέσματα σε κύτταρα Α549 (Εικ. 3α). Υπήρχε 1,28 φορές αύξηση στις 24 ώρες, 1,6 φορές αύξηση (τιμή ρ = 0,03) στις 48 ώρες και 2,2 φορές αύξηση (τιμή ρ = 0.04) σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των siRNA σε κύτταρα Α549, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση των επιπέδων χοληστερόλης θα μπορούσε να είναι ένα γενικό φαινόμενο των STAT6 φίμωση στα κύτταρα του πνεύμονα.

Τα συνολικά επίπεδα χοληστερόλης μετά STAT6 knockdown ελέγχθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία σε NCI-Η460 και Α549 κύτταρα. Κωδικοποιημένα siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. α) ανάλυση στυπώματος Western έγινε για να αναλυθεί η μεταβολή στην έκφραση του pSTAT6 πρωτεΐνης κατά IL-4 θεραπεία σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για πυκνομετρική ανάλυση. Γράφημα αντιπροσωπεύει την φορές μεταβολή στην έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. β) Real Time PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μεταβολών στο επίπεδο έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση της χοληστερόλης και της ομοιόστασης σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 και Α549 κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση STAT6 ειδικών siRNA. Τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση 18s rRNA. Τα δεδομένα πραγματικού χρόνου που εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. γ) προσδιορισμός της χοληστερόλης διεξήχθη για να προσδιοριστεί η επίδραση της IL-4 θεραπεία για τα συνολικά επίπεδα χοληστερόλης σε μη επιμολυσμένα και siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 και Α549 κύτταρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. δ) Η western blot του HMGCS1, HMGCR και IDI1 έγινε σε κυτταρικά εκχυλίσματα από μη επιμολυσμένα και siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 σε διαφορετικά χρονικά σημεία. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για πυκνομετρική ανάλυση. Γράφημα αντιπροσωπεύει την φορές μεταβολή στην έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Υποδηλώνει τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα.

Η

Δεδομένου ότι η IL-4 είναι γνωστόν ότι φωσφορυλιώνει STAT6, θελήσαμε να κοιτάξουμε για το ρόλο της IL-4 στην σύνθεση της χοληστερόλης. Σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460, υπήρχε 1,48 φορές (τιμή ρ = 0.01) αλλαγή στο επίπεδο του pSTAT6 (φωσφορυλιωμένη μορφή του STAT6) πρωτεΐνης μετά IL-4 θεραπεία, 0,48 φορές (τιμή ρ = 0.01) αλλαγή μετά την επιμόλυνση του STAT6 siRNA και 0,69 φορές (τιμή ρ = 0.05) αλλαγή όταν τα κύτταρα επιμολυσμένα με STAT6 siRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-4 (Σχ. 3β). Που αντιστοιχεί σε αυτό, δεν υπήρχε 0,8 φορές (p value = 0,05) μεταβολή στα επίπεδα της χοληστερόλης μετά από IL-4 θεραπεία, 1,5 φορές (τιμή p = 0,01) αλλαγή μετά από επιμόλυνση των STAT6 siRNA και 1,32 φορές (τιμή p = 0,03) αλλαγή όταν τα κύτταρα επιμολυσμένα με STAT6 siRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-4 (Σχ. 3d). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε Α549 κυτταρική γραμμή (Σχ. 3d).

επόμενο κοίταξε για τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που συνδέονται με την βιοσύνθεση χοληστερόλης /ομοιόστασης που λαμβάνεται από τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. Σε συμφωνία με τις Illumina δεδομένων πίνακα, τα επίπεδα μεταγραφής αυτών των γονιδίων επιβεβαιώθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω με PCR σε πραγματικό χρόνο. Παρατηρήσαμε 1,27 φορές (τιμή ρ = 0.03) αύξηση στα επίπεδα HMGCR, η οποία είναι το βασικό ρυθμιστικό ένζυμο της οδού βιοσύνθεσης χοληστερόλης. Παρατηρήσαμε επίσης 1,94 φορές (τιμή p = 0,03) αύξηση HMGCS1, 2,7 φορές αύξηση στην IDI1, 4,2 φορές (τιμή p = 0,04) αύξηση CYP27B1

(κυτοχρώματος P450, οικογένεια 27, υποοικογένεια Β, πολυπεπτίδιο 1)

, και 3,0 φορές αύξηση στην INSIG1

(Insulin προκαλούμενη γονίδιο 1)

επίπεδα στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων NCI-H460 με STAT6 συγκεκριμένες siRNA σε σύγκριση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η460 (Σχ. 3c).

Παρόμοια αύξηση των επιπέδων μεταγραφής αυτών των γονιδίων παρατηρήθηκαν επίσης σε ένα άλλο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή, Α549 (Σχ. 3c), όπου παρατηρήσαμε 1,6 φορές (τιμή ρ = 0.03) αύξηση στα επίπεδα HMGCR, 1,4 φορές αύξηση στην HMGCS1, 1,56 φορές αύξηση στην IDI1, 2,4 φορές αύξηση στην CYP27B1, και 1,25 φορές αύξηση στα επίπεδα INSIG1 στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των Α549 κυττάρων με συγκεκριμένες STAT6 siRNA σε σύγκριση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα Α549. Αυτό σημαίνει ότι τα αποτελέσματα της STAT6 αποσιώπησης είναι γενική και δεν περιορίζεται σε κάποιο συγκεκριμένο πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου.

Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του HMGCR, HMGCS1 και IDI1 εξετάστηκαν επίσης μη επιμολυσμένα και siRNA επιμολυσμένα κύτταρα NCI-Η460 σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Υπήρχαν 2,9, 3,5 (τιμή ρ = 0,048) και 4,3 φορές αύξηση στα επίπεδα HMGCS1, 0.94, 1.8 και 2.4 (ρ τιμή = 0,03) φορές αύξηση στα επίπεδα HMGCR, 1.6, 2.4 και 2.5 (τιμή ρ = 0,024) πλάσια αύξηση στην Όπως φαίνεται στο Σχ. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.