Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάσει μια σύνθεση παρατεταμένης de novo λιπαρών οξέων με αύξηση των κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων (MUFA) παραγωγής. Αυτή η αλλαγή στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων σχετίζεται με υπερέκφραση του στεαροϋλ-ΟοΑ 1 (SCD1), το οποίο καταλύει τη μετατροπή των κορεσμένων λιπαρών οξέων σε μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (π.χ. ελαϊκό οξύ). Αρκετές αναφορές έδειξαν ότι η αναστολή της SCD 1 οδήγησε στο πάγωμα του πολλαπλασιασμού και διέγερση απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, οι μηχανισμοί ενεργοποίησης του κυτταρικού θανάτου μένουν να κατανοηθούν καλύτερα.

Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι SCD 1 εξαφάνιση από siRNA προκάλεσε κατάργηση της σύνθεσης de novo μονοακόρεστα στον καρκίνο και μη τα καρκινικά κύτταρα. SCD1 αναστολή ενεργοποιημένης κυτταρικού θανάτου παρατηρήθηκε μόνο σε καρκινικά κύτταρα με την επαγωγή της κασπάσης 3 και PARP δραστηριότητα διάσπασης. Εξωγενή συμπλήρωση με ελαϊκό οξύ, δεν αντιστραφεί η SCD1 κατάλυσης μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η εξάντληση SCD 1 προκαλείται από εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνη χαρακτηριστικά (UPR), όπως Xbp1 ματίσματος mRNA, φωσφορυλίωση eIF2α και την αύξηση της έκφρασης CHOP. Ωστόσο, η έκφραση συνοδός GRP78, ένα άλλο UPR σήμα κατατεθέν, δεν επηρεάστηκε από SCD1 νοκ ντάουν σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα δείχνουν μια περίεργη UPR ενεργοποίησης. Τέλος, δείξαμε ότι η επαγωγή CHOP συμμετείχε σε κυτταρικό ενεργοποίηση θάνατο από SCD1 εξαφάνιση. Πράγματι, η υπερέκφραση των κυρίαρχων αρνητικών κατασκεύασμα CHOP και εξαφάνιση των CHOP εν μέρει αποκατασταθεί η βιωσιμότητα σε SCD 1-εξαντλημένο καρκινικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της de novo σύνθεση μονοακόρεστα από SCD1 εξαφάνιση μπορούσαν να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο την καταπολέμηση του καρκίνου με την πρόκληση κυτταρικού θανάτου μέσω της UPR και την ενεργοποίηση CHOP

Παράθεση:. Minville-Walz Μ, Pierre AS, Pichon L, Bellenger S, Fèvre C, Bellenger J, et al. (2010) Αναστολή της στεαροϋλ-ΟοΑ 1 Έκφραση Προκαλεί CHOP-Dependent κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα ανθρώπινου Cancer. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10.1371 /journal.pone.0014363

Επιμέλεια: Μιχαήλ Polymenis, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Ιούλη 2010? Αποδεκτές: 26 Νοέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Minville-Walz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από INSERM, Περιφέρεια Bourgogne και το Εθνικό Κέντρο Interprofessionnel de l’Economie Laitiare. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάζουν αλλοιώσεις του μεταβολισμού που χαρακτηρίζεται από αυξημένη γλυκόλυση και λιπογένεσης [1], [2]. Ενεργά πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα παρόν όχι μόνο ποσοτικές αλλαγές σε

de novo

λιπίδιο βιοσύνθεσης αλλά και τροποποιήσεις σύνθεση λιπιδικής μεμβράνης που επηρεάζουν τη ρευστότητα της μεμβράνης, μεταγωγή σήματος και γονιδιακή έκφραση [3], [4]. Οι μεταβολές στην σύνθεση των λιπιδίων της μεμβράνης που παρατηρήθηκε σε μια ευρεία ποικιλία καρκίνων, η οποία χαρακτηρίζεται κυρίως από κορεσμένα (SFA) και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων (MUFA) συσσώρευση η οποία εμφανίζεται λιγότερο λόγω της αυξημένης πρόσληψης από SFA και MUFA παρά να επιτείνεται ενδογενούς σύνθεσης λιπαρών οξέων, ανεξάρτητα από επαρκή λιπιδίων παροχή διατροφής [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Αυτές οι τροποποιήσεις του SFA και του περιεχομένου MUFA συνδέονται με την διαμόρφωση της έκφρασης και της δραστηριότητας του lipogenic ενζύμων. Έτσι, η υπερέκφραση του ακετυλο Οο-Α καρβοξυλάση α και λιπαρό οξύ συνθάσης, που εμπλέκονται στα πρώτα στάδια της βιοσύνθεσης λιπαρού οξέος, έχουν περιγραφεί σε διάφορους καρκίνους [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Αυξημένη περιεκτικότητα MUFA θα μπορούσε να είναι επίσης οφείλεται σε μια αυξητική ρύθμιση του στεαροϋλ Οο-Α δεσατουράσης (SCD, δέλτα-9 δεσατουράση) έκφραση, το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο της σύνθεσης MUFA. Πράγματι, SCD καταλύει την εισαγωγή ενός διπλού δεσμού μεταξύ των ανθράκων 9 και 10 από διάφορα κορεσμένα λιπαρά οξέα όπως το παλμιτικό (16:00) και στεατικό (18:00) για να δώσει οξέων παλμιτολεϊκό (16:01) και ελαϊκό (18:01 ) λιπαρά, αντίστοιχα. Αυτό το ενδοπλασματικό δίκτυο κάτοικος ένζυμο υπάρχει σε δύο ισομορφές στον άνθρωπο, SCD 1 και Scd5 [18]. SCD1 βρίσκεται σχεδόν σε όλους τους ιστούς με μια σημαντική έκφραση σε ήπαρ ενώ η έκφραση Scd5 περιορίζεται σε πάγκρεας και τον εγκέφαλο. SCD1 έκφραση, συσχετίζονται με το περιεχόμενο μονοακόρεστα, αυξάνεται σε ηπατοκυτταρικό αδένωμα, του παχέος και του οισοφάγου καρκίνωμα, καθώς και σε γενετικής και χημικώς επαγόμενη όγκους [19], [20], [21]. Για τον καρκίνο του προστάτη, δύο μελέτες παρουσιάζουν αντιφατικά αποτελέσματα σε επίπεδο SCD 1 έκφραση [22], [23]. Έτσι, η έκφραση της SCD 1 μπορεί να σχετίζεται με διεργασίες που περιλαμβάνουν την καρκινογένεση μεταβολή της ισορροπίας πολλαπλασιασμού /απόπτωσης. Πράγματι, SCD1 κύτταρα που υπερεκφράζουν παρουσιάσει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης, ενώ SCD1 knock-down οδηγεί σε χαμηλότερους ρυθμούς του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου

in vivo

και

in vitro

[24], [25] , [26], [27]. Ο μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που παρατηρείται σε SCD 1 με ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα πνεύμονα φαίνεται να περιλαμβάνουν την τροποποίηση ενός δείκτη SFA /MUFA που προκαλεί αναστολή της οδού Akt και ενεργοποίηση της οδού ΑΜΡΚ [24], [28]. Πράγματι, σε περίπτωση απουσίας του SCD 1, τα SFA αυξάνει το περιεχόμενο που ανακουφίζει την ενεργοποίηση της Akt που λαμβάνονται κανονικά από μονοακόρεστα (π.χ. ελαϊκό οξύ) για τη διατήρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [29]. Επιπλέον, διάφορα καρκινικά κύτταρα που στερούνται δράσης SCD 1 μειώσουν

de novo λιπογένεση

μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ΑΜΡΚ [22], [24]. Η μεταβολή της παραγωγής λιπιδίων σε SCD 1 κύτταρα με ανεπαρκές αφορά κυρίως τη μείωση του φωσφολιπιδίου βιοσύνθεσης, η οποία πυροδοτεί κυτταρικό στρες και η έκφραση του απόπτωση σχετίζεται C /ομόλογη πρωτεΐνη πρωτεΐνη ΕΒΡ (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP ανήκει σε μια περίεργη διαδρομή του στρες που ονομάζεται ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) το άγχος που μπορεί να προκαλέσει απόπτωση.

ER στρες προκαλείται από διαφορετικές συνθήκες στρες, όπως αλλαγές στη μετα-μεταφραστική καθεστώς των πρωτεϊνών και τη σύνθεση των λιπιδίων, υποξία, η διατάραξη της ομοιοστασία του ασβεστίου και θρεπτικά στέρηση, και οδηγεί στην ενεργοποίηση της προσαρμοστικής πρόγραμμα, γνωστό ως το ανοιγμένο πρωτεΐνη Response (UPR), για την αποκατάσταση της ισορροπίας [32]. Η ενεργοποίηση της κανονικής UPR εμπλέκει τρεις διακριτές συντονισμένη υποκαταστήματα σηματοδότηση διαμεσολαβείται από μεμβράνη ER αγκυροβολημένο αισθητήρες: RNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (PKR) -όπως ER κινάσης (PERK), την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα 6 (ATF6) και ινοσιτόλη που απαιτούν ενζύμου 1α (IRE1α) [ ,,,0],33]. Σε τόνισε κύτταρα, η GRP78 πρωτεΐνη συνοδός αποσυνδέει από UPR αισθητήρες PERK, ATF6 και IRE1α που οδηγούν στην ενεργοποίηση τους για να ανακουφίσουν την πρώτη ER στρες. PERK φωσφορυλιώνει την 2α ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης της μετάφρασης (ΕΤΕ), αναστέλλοντας έτσι τη σύνθεση της παγκόσμιας πρωτεΐνης. Ενεργός ATF6 μετατοπίζεται στον Golgi και διασπάται από τη μεμβράνη με τοπο-1 και -2 πρωτεάσες. Στη συνέχεια διασπάται ATF6 εντοπίζεται στον πυρήνα και επάγει την μεταγραφή του Xbp1 και ER συνοδούς όπως GRP78. IRE1α διαθέτει μια δραστηριότητα ενδοριβονουκλεάσης που ματίζει εναλλακτικά το mRNA Xbp1 (sXbp1), η οποία μεταφράζεται σε ένα δραστικό παράγοντα μεταγραφής. Ωστόσο, σε μια σοβαρή ή παρατεταμένη στρες, ο UPR μπορεί να προκαλέσει προ-αποπτωτικών σημάτων μέσω της ενεργοποίησης του CHOP παράγοντα μεταγραφής, η οποία ενεργεί για να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου bcl-2, έτσι κάτω ρύθμιση αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και καθιστώντας τα κύτταρα ευαίσθητη στις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες [34], [35], [36].

Ενώ αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ξεκάθαρα τη συμμετοχή SCD1 ως κεντρικό ρυθμιστή της λιπογένεσης σε καρκινικά κύτταρα, το σύνδεση μεταξύ SCD 1 και την επαγωγή της ER στρες και του κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα παραμένει να γίνει καλύτερα κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, ήμασταν κατά συνέπεια ενδιαφέρει αναζητώντας UPR επαγωγή σε καρκινικά κύτταρα που στερούνται την έκφραση της SCD 1 και στη διερεύνηση του ρόλου αυτού του μονοπατιού στρες στη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά την διάρκεια του καρκίνου SCD1 εξαφάνιση. Έχουμε αποδείξει ότι η εξάντληση της SCD 1 σε καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούνται UPR δείκτες και προκάλεσε θάνατο των καρκινικών κυττάρων χωρίς επίδραση στη μη καρκινικό κύτταρο βιωσιμότητας. Επιπλέον, αποδεικνύεται ότι CHOP συμμετείχε σε SCD 1 με τη μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο.

Αποτελέσματα

Η αποτελεσματική αναστολή της έκφρασης SCD 1 και καταστολή της

de novo

μονοακόρεστα σύνθεση

στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η επίδραση της SCD 1 αποσιώπηση χρήση siRNA σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπου (U2OS, SW480 και HCT116). Τα καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με 75 ηΜ siRNA που στοχεύει άσχετη ανθρώπινη mRNA (siRNA SCR) και SCD 1 mRNA (siRNA Scd1.A και Scd1.B). Both siRNA που κατευθύνεται έναντι SCD1 σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (SCR) δραστικά κατέστειλαν έκφραση SCD 1 mRNA και της πρωτεΐνης, το συντομότερο 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήματα 1Α και 1Β).

Α) U2OS κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ( SCR) ή με siRNA κατά SCD1 (Scd1.A και Scd1.B) και συλλέγεται 24 και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για έκφραση της SCD 1 mRNA με πραγματικού χρόνου RT-PCR. έκφραση της SCD 1 mRNA κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνης έκφρασης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM σε σχέση με την έκφραση της SCD 1 mRNA σε κύτταρα U2OS SCR-κατεργασία σε 24 ώρες. *, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR-κατεργασμένα κύτταρα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. Β) U2OS και SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Oligofectamine (-), έλεγχος siRNA (SCR) ή με siRNA κατά SCD1 (Scd1.A και Scd1.B). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση για ανάλυση έκφρασης SCD1 με κηλίδωση Western. Γ) U2OS και SW480 κύτταρα επεξεργασμένα 72 ώρες με siRNA επωάστηκαν για άλλες 6 ώρες με [

14C] στεατικό οξύ και η συνολική εκχύλιση λιπιδίων εκτελέστηκε. δράσης SCD αξιολογήθηκε με HPLC όπως το ποσοστό [

14C] μετατροπή στεατικό οξύ σε [

14C] ελαϊκό οξύ σε κύτταρα κατεργασμένα με siRNA για 72 ώρες. δράσης SCD εκφράστηκε ως η αναλογία% του [

14C] ελαϊκό οξύ σε [

14C] ελαϊκό και στεατικό οξύ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον δύο ξεχωριστά πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR-κατεργασμένα κύτταρα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. Ένας εκπρόσωπος έκφραση της SCD 1 πρωτεΐνης εμφανίζεται για 72 ώρες θεραπείας siRNA. D) κύτταρα U2OS εκτέθηκαν σε DMSO ως όχημα, αναστολείς SCD 1 (CVT-11127 ή MF-438) στα 10 μΜ για 24 ώρες και παρασκευάστηκε όπως παραπάνω C) για τη μέτρηση της δράσης SCD. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05 έναντι κυττάρων υπό αγωγή με όχημα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey

Η

Όπως SCD1 καταλύει τη μετατροπή του στεατικού οξέος σε ελαϊκό οξύ, μια μείωση στην παραγωγή ελαϊκό οξύ θα αποδεικνύει την κατάργηση. της δράσης SCD 1 με siRNA που στοχεύουν αυτό το ένζυμο. Προκειμένου να αντιμετωπιστούν δραστηριότητα SCD μετά από 72 ώρες της SCD 1 φίμωσης, θα υποστούν περαιτέρω επεξεργασία U2OS και SW480 κύτταρα για 6 ώρες με ραδιενεργό [

14C] στεατικό οξύ οδηγεί για τη μέτρηση της παραγωγής [

14C] ελαϊκό οξύ σε Scd1- ελλειμματικά κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SCR-θεραπεία. Η ενσωμάτωση της [

14C] στεατικό οξύ ήταν παρόμοια σε siRNA SCR και SCD 1-κατεργασμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με τον μη-στόχευσης ανθρώπινο mRNA siRNA (SCR) παρουσίασε ρυθμό αποκορεσμό του 31,49% για U2OS και 25,66% για SW480. Στις δύο κυτταρικές σειρές, SCD1 εξαφάνιση οδήγησε σε πτώση-off σε βιοσύνθεση ελαϊκό οξύ με εναπομένουσα ρυθμό αποκορεσμό του 5,135% και 5,28% το U2OS αντιμετωπίζονται από siRNA Scd1.A και Scd1.B, αντίστοιχα, και 5,89% και 7,55% , αντίστοιχα, σε SW480 (σχήμα 1 C). Επιπλέον, εκθέσαμε U2OS κύτταρα για 24 ώρες στους αναστολείς SCD 1 CVT-11127 και MF-438 (10 μΜ). Έχουμε λάβει παρόμοια ικανότητα με αναστολείς SCD 1 από siRNA που κατευθύνεται έναντι SCD1 να αναστέλλουν την παραγωγή του ελαϊκού οξέος από στεατικό οξύ σε κύτταρα U2OS (Σχήμα 1 D).

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μια δραστική αναστολή της δράσης SCD σε siRNA SCD 1 κύτταρα κατεργασμένα. Επιπλέον, σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου, SCD 1 εμφανίζεται ως το κύριο ένζυμο που εμπλέκεται στην ενδογενή παραγωγή του ελαϊκού οξέος.

SCD 1 εξαφάνιση προάγει απόπτωση κυτταρικού θανάτου

Για να εκτιμηθεί επίδραση της SCD1 knockdown στη βιωσιμότητα των κυττάρων, προσδιορίσαμε πρώτος αριθμός των κυττάρων στις 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση αντιδραστηρίου CyQuant® οποία ποσοτικοποιεί την ποσότητα των νουκλεϊκών οξέων. Μόλις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ο αριθμός των κυττάρων ήταν σημαντικά μικρότερη σε SCD 1-εξαντλημένο κύτταρα U2OS σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ενώ σχετικός φθορισμός (RF) αυξήθηκε για siRNA SCR-επεξεργασμένα κύτταρα σε όλο το μήκος της 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, RF δεν άλλαξε σημαντικά για siRNA SCD 1-σιγήσει κυττάρων κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας. Παρατηρήσαμε ότι RF ήταν δύο φορές φορές υψηλότερη σε κύτταρα SCR siRNA σε σύγκριση με siRNA SCD 1-εξαντλημένο U2OS 72 ώρες μετά την επιμόλυνση υποδεικνύοντας αναστολή του πολλαπλασιασμού ή η επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε SCD 1-αποκόπτεται κύτταρα (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, αποδείχθηκε από trypan καταμέτρηση κυττάρων αποκλεισμού μπλε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA ότι SCD 1 knockdown οδηγήσει σε μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας, τόσο σε U2OS και τα κύτταρα SW480 αλλά πολύ πιο δραστικά στα κύτταρα U2OS (Σχήμα 2Β). Περισσότερο από το 30% του SCD 1 siRNA επεξεργασμένου U2OS και περίπου το 20% του SCD 1 siRNA επεξεργασμένου SW480 ήταν θετικά για ΡΙ που αντιπροσωπεύει αύξηση κατά τρία και δύο πτυχές σε σύγκριση με siRNA SCR επεξεργασμένο U2OS και SW480 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 2C). Η αναστολή της δράσης SCD 1 και από τις δύο ενώσεις (CVT-11127 και MF-438) οδήγησε επίσης σε αύξηση του κυτταρικού θανάτου στις 48 ώρες με ένα τρόπο δόσης-απόκρισης (Εικόνα 2D). Ωστόσο, βρήκαμε ότι οι ενώσεις αυτές επηρεάζονται διαφορετικά η βιωσιμότητα των κυττάρων με CVT 11.127 πιο ισχυρή για την επαγωγή κυτταρικού θανάτου από MF-438 σε U2OS. Επιπλέον, δείξαμε ότι η εξάντληση SCD 1 επαγόμενη ενεργοποίηση της απόπτωσης, όπως φαίνεται από την επαγωγή υψηλού επιπέδου της κασπάσης 3 δραστηριότητας και διάσπαση PARP (Σχήματα 2Ε και 2F).

Α) U2OS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA SCR (έλεγχος) και στόχευση SCD1 (Scd1.A και Scd1.B), και συλλέγονται 24 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. κατάσταση πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού CyQuant®. Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος των σχετικών μονάδων φθορισμού ± SEM των τριπλών και αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β) U2OS και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA και συλλέχθηκαν για trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM των τριπλών και αντιπροσωπευτικά δύο άλλων ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ) ad U2OS SW480 κύτταρα επεξεργασμένα 72 ώρες με siRNA συλλέχθηκαν και το συνολικό κυτταρικό θάνατο αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. D) κύτταρα U2OS υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με αναστολείς SCD 1 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και συλλέχθηκαν για χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία πειράματα. Ε) U2OS κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και προετοιμάστηκε για κασπάσης 3 μέτρηση δραστικότητας με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αύξηση έναντι του μάρτυρα (siRNA SCR) και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα. ΣΤ) προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA και διάσπαση PARP (επίπεδο C-ΡΑΚΡ) προσδιορίστηκε με στύπωμα Western. G) U2OS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με έλεγχο siRNA (SCR) και στόχευσης SCD 1 σε απουσία (όχημα) ή παρουσία 100 μΜ ελαϊκό οξύ συνδέεται με BSA. Ο αριθμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού CyQuant® όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής πάνω από τα κύτταρα SCR-αγωγή siRNA οχήματος και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή σχετικές μονάδες φθορισμού ± SEM των τριπλών. *, ** Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR-κατεργασμένων κυττάρων ελαϊκό οξύ του οχήματος και, αντίστοιχα, με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey

Η

τότε η υπόθεση ότι ο κυτταρικός θάνατος προκλήθηκε από τη μείωση του ελαϊκού. περιεκτικότητα σε οξύ κυττάρων. Έτσι, αναλάβαμε να συμπληρώσει siRNA SCD 1-εξαντλημένο κυττάρων με 100 μΜ ελαϊκό οξύ, προκειμένου να αξιολογηθεί η ικανότητα του εξωγενούς συμπλήρωση να αντιστρέψει τον κυτταρικό θάνατο. Σχήμα 2G αποδεικνύεται ότι η έκθεση της SCD 1 ανεπάρκεια U2OS κύτταρα σε εξωγενείς ελαϊκό οξύ δεν άλλαξε το ρυθμό του κυτταροτοξικότητα.

Η αναστολή της έκφρασης SCD 1 ενεργοποιεί μερικώς ξεδιπλωμένη απάντηση πρωτεΐνη

Διαταραχές της ομοιοστασίας ER οδηγούν σε ER στρες με UPR ενεργοποίησης που θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο. Για την παρακολούθηση της ενεργοποίησης του μονοπατιού UPR, ερευνήσαμε το επίπεδο έκφρασης της GRP78, φωσφο-eIF2α και μη συμβατική μάτισμα του mRNA Xbp1. U2OS και SW480 κύτταρα έχουν την λειτουργική μηχανήματα να ανταποκρίνεται σε θαψιγαργίνη επαγόμενης ER στρες, όπως παρατηρήσαμε μάτισμα Xbp1, προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης και GRP78 φωσφο-eIF2α (Σχήματα 3Α και Β). Στη συνέχεια, αναλύσαμε αυτούς τους δείκτες ER στρες στη SCD 1-ανεπαρκή κύτταρα. Κατάργηση των SCD 1 σε U2OS και τα κύτταρα SW480 οδήγησε σε μερική επεξεργασία του mRNA Xbp1: spliced- και υβριδικά-Xbp1 ειδών (s- και h-Xbp1) mRNA αυξήθηκαν σε SCD 1 με ανεπάρκεια κυττάρων υποδεικνύοντας ενεργοποίηση του βραχίονα IRE1α στις δύο κυτταρικές σειρές, σε εντονότερη τρόπο σε κύτταρα SW480 (Σχήμα 3Α). Μετάφραση του s-Xbp1 παράγει το λειτουργικό παράγοντα μεταγραφής Xbp1, η οποία συμμετέχει σε ένα πρόγραμμα μεταγραφής, προκειμένου να πρώτα να αποκαταστήσουν τη λειτουργία ER και την επιβίωση των κυττάρων. Η GRP78 συνοδός ρυθμίζει επίσης το μονοπάτι προ-επιβίωσης κατά τη διάρκεια ER στρες μέσα από τη ρύθμιση του. Ωστόσο, δεν ήμασταν σε θέση να τηρήσει μια τέτοια ρύθμιση στο U2OS και τα κύτταρα SW480 σιγήσει για SCD 1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 3C). Δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή στο mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης για έκφραση GRP78 σε διαφορετικά χρονικά μετά τη διαμόλυνση (24, 48 και 72 ώρες, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). PERK ανήκει επίσης στην UPR και την ενεργοποίηση του επάγει φωσφορυλίωση eIF2α προκαλώντας καταστολή της γενικής μετάφρασης. Παρατηρήσαμε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα που εξαντλούνται σε SCD 1 εκφράζονται μεγαλύτερη ποσότητα φωσφο-eIF2α σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που υποδηλώνει την ενεργοποίηση του PERK βραχίονα (Σχήμα 3D). Για να εκχωρήσετε φωσφορυλίωση eiF2αto SCD1 εξαφάνιση και όχι σε ένα τεχνούργημα που οφείλεται στην ενεργοποίηση PKR από siRNA επιμόλυνση, αναλύσαμε το επίπεδο φωσφο-eIF2α σε U2OS επεξεργασία με 5 και 10 μΜ αναστολέα SCD 1 (CVT-11127 και MF-438) για 10 και 24 ώρες. Παρατηρήσαμε αύξηση της έκφρασης ρ-eIF2α συντομότερο 10 ώρες και για τις δύο αναστολείς αποδεικνύοντας ότι η φωσφορυλίωση του eIF2α προκλήθηκε με εξαφάνιση δράσης SCD 1 (Σχήμα 3Ε).

U2OS και τα κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο siRNA (SCR ) και siRNA κατά της SCD 1 για 72 ώρες. Α) Τα δείγματα παρασκευάστηκαν για mRNA αναλύσεις επεξεργασίας Xbp1 με ημι-ποσοτική RT-PCR. Τα προϊόντα PCR έτρεξαν σε ένα πήγμα αγαρόζης 3% και το ματισμένο Xbp1 (sXbp1), μη συρραμμένο Xbp1 (uXbp1) και υβριδικά είδη Xbp1 (hXbp1) mRNA παρατηρήθηκαν σε κύτταρα siRNA-αγωγή (CTR) και κύτταρα thapsigargine φάρμακο (Tg) ως θετικός μάρτυρας της UPR ενεργοποίησης. Β) Η συνολική πρωτεΐνη προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από μη επεξεργασμένα και θαψιγαργίνη κατεργασμένα κύτταρα (Tg, 0,2 μΜ, 16 ώρες) και αναλύθηκαν για φωσφορυλίωση eiF2α και GRP78 πάνω ρύθμιση με κηλίδωση Western. Γ και Δ) SCD 1-εξαντλημένο U2OS και τα κύτταρα SW480 παρασκευάστηκαν όπως στο 3Β) και αναλύθηκαν με westem blotting-για SCD 1, GRP78 και έκφραση φωσφο-eiF2α. Ε) U2OS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 και 10 μΜ αναστολέων SCD 1 (MF-438 και CVT-11127) και συλλέχθηκαν μετά από 10 ώρες και 24 ώρες της θεραπείας για ανάλυση της έκφρασης φωσφο-eiF2α με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

CHOP συμμετέχει σε SCD 1 εξάντληση που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο

ER στρες απόπτωση, μπριζόλα αυξήσεις έκφρασης και εμφανίζεται ως ένα βασικό τελεστή αυτού του προγράμματος κυτταρικού θανάτου. Εμείς απευθύνεται πρώτη αξιολόγηση της έκφρασης CHOP σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siRNA SCR ή κατά SCD 1. Παρατηρήσαμε μια αύξηση του CHOP mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα που έχασαν την έκφραση της SCD 1 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήματα 4Α και 4Β). Για να εξακριβωθεί ο ρόλος του CHOP σε επαγωγή κυτταρικού θανάτου, εμείς παροδικά επιμολυσμένα με κενό φορέα (CTR) ή κυρίαρχη-αρνητική μορφή CHOP (DN-CHOP) σε κύτταρα U2OS. DN-CHOP κατασκεύασμα λιμάνια μεταλλάξεις στην περιοχή φερμουάρ λευκίνης (L134A /L141A) που αποτρέπει την μεταγραφική δραστηριότητα της [37]. Δείξαμε με χρώση ΡΙ ότι DN-CHOP υπερέκφραση μειωμένη κυτταροτοξικότητα που επάγεται από την αναστολή της SCD 1. σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου-επιμολυσμένα (CTR) (Σχήμα 4C). Επιπλέον, εκτιμάται ότι η επίδραση της αναγκαστικής έκφρασης της DN-CHOP στην ενεργό επαγωγής κασπάσης 3 σε SCD 1-σιγήσει U2OS. Εμείς παρουσίασαν μείωση της κασπάσης 3 ενεργοποίηση σε SCD 1 κύτταρα νοκ ντάουν-U2OS εκφράζουν DN-CHOP και αποδεικνύεται μια προστατευτική επίδραση του DN-CHOP έναντι απόπτωση που προκαλείται από την εξάντληση SCD1 (Σχήμα 4D).

Α) U2OS και SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο siRNA (SCR) και siRNA κατά της SCD 1 για 72 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε και η έκφραση του mRNA CHOP ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνης mRNA έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± πλάσια επαγωγή SEM σε σχέση με siRNA SCR-κατεργασμένων κυττάρων από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR-κατεργασμένα κύτταρα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. Β) Τα πυρηνικά εκχυλίσματα από U2OS παρασκευάστηκαν 72 ώρες μετά την προσθήκη siRNA. CHOP έκφραση αναλύθηκε με κηλίδωση Western και λαμίνη A /C ήταν φόρτωση έλεγχο των δειγμάτων πυρηνικού εκχυλίσματος. C) κύτταρα U2OS διαμολύνθηκαν παροδικά με κενό (CTR) ή κυρίαρχο-αρνητικό CHOP φορέα έκφρασης (DN-CHOP) και επιλέγονται για τρεις ημέρες σε G418. Ανθεκτικά κύτταρα επιμολυσμένα με CTR ή DN-CHOP κατασκεύασμα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SCR ελέγχου siRNA ή κατά SCD1 (Scd1.A και Scd1.B) για 72 ώρες και συλλέχθηκαν για ανάλυση χρώση ιωδιούχου προπιδίου με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές εμφανίζονται ως φορές αύξηση πάνω από το χειριστήριο (siRNA SCR) και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα. *, **, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR επεξεργασμένου CTR και DN-CHOP κύτταρα, αντίστοιχα, από την ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. #, P & lt? 0.05 με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey. D) κύτταρα U2OS παρασκευάστηκαν ως C) και συλλέχθηκαν για την ενεργό ανάλυση κασπάσης 3 με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές εμφανίζονται ως φορές αύξηση πάνω από το χειριστήριο (siRNA SCR) και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, **, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR επεξεργασμένου CTR και DN-CHOP κύτταρα, αντίστοιχα, από την ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. #, P & lt?. 0.05 με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey

Η

CHOP εξαφάνιση μερικώς ανακουφίζει SCD1 εξάντληση απόπτωση

Η προστασία που παρατηρήθηκε με CHOP αναστολής κατά SCD1 εξάντληση μεσολάβηση κυττάρων U2OS θάνατος έχει επίσης αξιολογηθεί σε HCT116 του κόλου κυτταρική γραμμή όγκου. Σε αυτό το σκοπό, χρησιμοποιήσαμε παροδικά CHOP knockdown-HCT116 και BA1 κύτταρα τα οποία είναι κύτταρα HCT116 σταθερά επιμολυσμένα με cDNA CHOP αντιπληροφοριακό ανθρώπινο κατασκεύασμα [38]. Εξάντληση της SCD 1 με siRNA σε HCT116 που προκαλείται περισσότερο από το 30% του κυτταρικού θανάτου, όπως πιστοποιείται από χρώση ΡΙ (Εικόνα 5Α). Δείξαμε επίσης ότι 72 ώρες εξαφάνιση της δραστικότητας SCD1 με siRNA και αναστολείς (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) προκάλεσε απόπτωση στα HCT116 αποδεικνύεται από δραστική κασπάση 3 ή PARP-διάσπασης ανίχνευση (Σχήματα 5Β και 5Γ). Σε αυτά τα κύτταρα, βρήκαμε επίσης ότι η κατάργηση της έκφρασης SCD1 οδήγησε σε αυξητική ρύθμιση της έκφρασης mRNA CHOP όπως έχει ήδη παρατηρηθεί για U2OS και τα κύτταρα SW480 (σχήμα 5D). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ότι το U2OS ότι η μείωση της έκφρασης CHOP αρθεί εν μέρει την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από SCD1 αποσιώπηση. Πράγματι, παρατηρήσαμε μια μείωση της χρώσης ΡΙ σε BA1 κυττάρων σε σύγκριση με τη γονική HCT116 τους (ρ-HCT116) ομολόγους όταν η έκφραση της SCD 1 καταργήθηκε (Σχήμα 5Ε). Επιπλέον, η προστασία έναντι της SCD 1 αποσιώπηση μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από CHOP εξαφάνιση φάνηκε να είναι συγκεκριμένες και όχι την προστασία έναντι όλων των προ-αποπτωτικών παραγόντων. Πράγματι, εξαφάνιση του CHOP δεν τροποποίησε επαγωγή απόπτωσης από ετοποσίδη σε DN-CHOP U2OS ή BA1 σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Έχουμε, επίσης, ανέλαβε να αξιολογήσει τα αποτελέσματά της CHOP εξαφάνιση από επεξεργασία siRNA στην απόπτωση που επάγεται από SCD1 κατάργηση. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε συν-επεξεργασία των κυττάρων HCT116 με έλεγχο siRNA (SCR) ή στρέφεται κατά SCD1 (Scd1.A και Scd1.B), και με siRNA CHOP ή ελέγχου (-). Εμείς επικυρωθεί CHOP siRNA σε κύτταρα HCT116 και έδειξε ότι CHOP siRNA δεν τροποποίησε επίπεδο εξαφάνιση SCD1 mRNA που προκαλείται από SCD1 siRNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εκτιμηθεί η λειτουργία CHO στο SCD 1-επαγόμενη απόπτωση, μπορούμε τότε εκτελείται siRNA συν-διαμόλυνση. Παρατηρήσαμε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση που CHOP φίμωση προστατεύεται HCT116 κατά την απόπτωση κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από SCD1 εξαφάνιση (Σχήματα 5F και 5G).

Α) κύτταρα HCT116 αγωγή 72 ώρες με έλεγχο siRNA (SCR) ή τη στόχευση SCD 1 ( Scd1.A και Scd1.B) συλλέχθηκαν και το συνολικό κυτταρικό θάνατο αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος ± SEM τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. Β) HCT116 κύτταρα κατεργασμένα με siRNA συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και προετοιμάστηκε για κασπάσης 3 μέτρηση δραστικότητας με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα υλικά και μεθόδους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ) HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Α) και συλλέχθηκαν για ανάλυση της SCD 1 και την έκφραση της PARP διάσπαση με κηλίδωση Western. Δ) HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Α) και συλλέχθηκαν για ολική κάθαρση RNA. έκφραση CHOP και SCD 1 mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Όλα τα πειράματα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τα δύο επαναλήψεις εις τριπλούν. Ε) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν σταθερά με αντιπληροφοριακό κατασκεύασμα ανθρώπινου cDNA CHOP και κενό φορέα ελέγχου. BA1 και ρ-HCT116 είναι κλώνοι HCT116 με αντιπληροφοριακό κατασκεύασμα CHOP και του φορέα ελέγχου, αντίστοιχα. Τα κύτταρα σιγήσει από siRNA Scd1.A και Scd1.B για 72 ώρες, και συλλέχθηκαν για ανάλυση ολικής κυτταρικό θάνατο με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος των φορές αλλαγή για ΡΙ θετικών κυττάρων σε σχέση με τις αντίστοιχες siRNA SCR κύτταρα HCT116 ± SEM ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος από τα τρία πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *, **, Ρ & lt? 0,05 vs. siRNA SCR-κατεργασία π-HCT116 και BA1 κύτταρα, αντίστοιχα, από την ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμασία Tuckey. #, P & lt? 0.05 με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey. Στ) και ζ) τα κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με siRNA SCR, Scd1.A ή Scd1.B στους 75 ηΜ, και είτε με 25 ηΜ siRNA SCR (-) ή siRNA CHOP. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση για χρώση ΡΙ και δραστική κασπάση 3 αναλύει με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος ± SEM ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *, **, P & lt? 0,05 έναντι αντίστοιχης siRNA SCR-θεραπεία HCT116 κύτταρα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey. #, Ρ & lt?. 0,05 με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey

Η

εξάντληση SCD 1 δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των μη καρκινικών κυττάρων

Τα καρκινικά κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε SCD 1 εξάντληση μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο Εμείς ήταν τότε που ενδιαφέρονται για την ανάλυση της πιθανής επίδρασης της απουσίας του

de novo

μονοακόρεστα σύνθεση σε μη καρκινικά κύτταρα. Σε αυτόν τον στόχο, αξιολογήσαμε επίδραση της αναστολής του SCD 1 χρησιμοποιώντας siRNA επί κανονικών ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF). Αυτά τα κύτταρα έχουν ένα βασικό ρυθμό αποκορεσμού περίπου 15% χαμηλότερα από ό, τι τα κύτταρα U2OS και SW480, όπως φαίνεται προηγουμένως στο σχήμα 1Γ. επεξεργασία τους με siRNA Scd1.A ή Scd1.B οδήγησε σε μείωση της δραστηριότητας SCD να επιτευχθεί μια υπολειπόμενη δραστηριότητα του 8,3% και 6,3%, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). Η υπολειμματική δραστικότητα SCD ήταν παρόμοια με εκείνη που ελήφθη για τα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το siRNA SCD1. Όπως φαίνεται παραπάνω, εκτομή του δράσης SCD σε καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε κυτταροτοξικότητα ενώ εξάντληση της έκφρασης SCD 1 δεν προκάλεσε θάνατο κυττάρου σε NHDF αλλά μειώνεται πολύ λίγο αριθμός κυττάρων τους (Σχήματα 6C και 6D). Στη συνέχεια, σε μη καρκινικά κύτταρα, SCD1 κατάργηση θα μπορούσε να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Κανονικό ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF) επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA (SCR) και siRNA που στοχεύει SCD1 (Scd1.A και Scd1.B ). κύτταρα NHDF συλλέχθηκαν μετά τη θεραπεία siRNA 72 ώρες και συλλέχθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις. Α) Σύνολο πρωτεϊνών προετοιμάστηκαν για ανάλυση της έκφρασης SCD1 από δυτικές-αποτύπωση. Β) NHDF αγωγή 72 ώρες με siRNA επωάστηκαν για άλλες 6 ώρες με [

14C] στεατικό οξύ και η συνολική εκχύλιση λιπιδίων διεξήχθη. Η μετατροπή της [

14C] στεατικό οξύ σε ελαϊκό οξύ εκτελέστηκε με HPLC. δράσης SCD εκφράστηκε ως η αναλογία% του [

14C] ελαϊκό οξύ σε [

14C] ελαϊκό και στεατικό οξύ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM για τουλάχιστον δύο ξεχωριστά πειράματα. Γ) το καθεστώς της διάδοσης των siRNA που έλαβαν NHDF προσδιορίστηκε σε προκαθορισμένο χρόνο από την δοκιμασία πολλαπλασιασμού CyQuant®. Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος των σχετικών μονάδων φθορισμού ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Δ) NHDF συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και το συνολικό ανάλυση κυτταρικού θανάτου εκτελέστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος ± SEM των ΡΙ θετικών κυττάρων (%) από έναν εκπρόσωπο από δύο πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *, P & lt? 0,05 έναντι siRNA SCR-επεξεργασμένα κύτταρα με ανάλυση ANOVA που ακολουθήθηκε από δοκιμή Tuckey

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η έκφραση της SCD 1 σίγασης που οδήγησε σε επαγωγή. της UPR δείκτες (Xbp1 μάτισμα, π-eIF2α και CHOP) και CHOP-εξαρτώμενο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε επίσης ότι η κατάργηση της de novo οδό σύνθεσης MUFA με εξαφάνιση του περιορισμού του ρυθμού ένζυμο SCD 1 αλλοιωμένη βιωσιμότητά της καρκινικών κυττάρων χωρίς να αλλάζει την επιβίωση των μη καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν διάφορες ανάγκες σε de novo σύνθεση MUFA για κανονικά και καρκινικών κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, η εξωγενής προσθήκη ελαϊκό οξύ, το κύριο προϊόν μονοακόρεστα της δράσης SCD 1, δεν εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων στα οποία η ενδογενής βιοσύνθεση μονοακόρεστα κατεστάλη.

Στην έκθεση αυτή, συμφωνούμε με τις προηγούμενες εκθέσεις περιγράφουν ότι SCD 1 εξαφάνιση οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο με απόπτωση σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [22], [25], [27], [39]. Πράγματι, παρατηρήσαμε επαγωγή της κασπάσης 3 και PARP δραστηριότητα-διάσπασης (Σχήματα 2D et 2Ε) σε SCD 1-εξαντλημένο κύτταρα.

Επίσης αποδεικνύεται σε αυτό το έργο που φυσιολογικά και τα καρκινικά κύτταρα δεν ανταποκρίνονται με τον ίδιο τρόπο για να η πρόληψη της σύνθεσης μονοακόρεστα από SCD1 εξαφάνιση. Πράγματι, ενώ τα καρκινικά κύτταρα σκοτώθηκαν από εξάντληση SCD1, μη καρκινικά κύτταρα ήταν ακόμα ζωντανός. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ελαφρά μείωση του αριθμού των κυττάρων σε SCD 1 έλαβαν NHDF ότι ένα μπλοκ ή ένα πιο αργό ρυθμό πολλαπλασιασμού θα μπορούσε να εξηγήσει. Μπορούμε τότε να υποθέτουν ότι η βιωσιμότητα των μη καρκινικών κυττάρων παρέμειναν ανεπηρέαστα οφείλεται στο γεγονός ότι δεν απαιτούν τέτοια ταχεία και υψηλή σύνθεση MUFA. Πράγματι, αυτοί πολλαπλασιάζονται με χαμηλότερο ρυθμό (Σχήμα 6C) και κατά προτίμηση υπέστη σύνθεση νέας μεμβράνης από εξωγενή λιπαρά οξέα μέχρι και λαβείν, ενώ τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται στο υψηλότερο ποσοστό και χρειάζονται de novo σύνθεση των λιπαρών οξέων [10].

Εμείς και