Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων άλφα (TNF) είναι σε θέση να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα κυτταρικό θάνατο με τη μεσολάβηση απαιτεί τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ). Κλινική χρήση του TNF μέχρι στιγμής περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό από βαθιές ηπατοτοξικότητα της. Πρόσφατα, βρέθηκε στο σύστημα ποντικού που ειδική προστασία των ηπατοκυττάρων έναντι επιβλαβή αποτελέσματα του TNF μπορεί να επιτευχθεί με την εξάντληση του ΑΤΡ φρουκτόζη μεσολάβηση εκεί. Πριν απασχολούν αυτή είναι αρκετά ελκυστική αρχή επιλογής σε μια πρώτη κλινική δοκιμή, εμείς εδώ διεξοδικά ερευνηθεί η αλληλεξάρτηση μεταξύ της καταστροφής του ATP και TNF ηπατοτοξικότητα σε δύο

in vitro

και

ex vivo

πειράματα με βάση τη χρήση των πρωτογενών υλικά ασθενή ιστό.

Μέθοδοι

πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, και οι δύο μη-νεοπλασματικές και οιδηματώδης φέτες ιστού πρωτογενούς ήπατος ασθενών που προέρχονται χρησιμοποιήθηκαν για να διαλευκανθεί η εξάντληση ATP φρουκτόζη που προκαλείται και TNF-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

Αποτελέσματα

PHH καθώς και φέτες ιστού που παρασκευάζονται από μη-κακοήθη ανθρώπινα ηπατικά δείγμα υποβάλλεται σε μια εξάντληση του ΑΤΡ φρουκτόζη μεσολάβηση αμφότερα αποδειχθεί να προστατεύονται έναντι TNF-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση, λόγω όγκου-ειδικά υπερέκφραση της εξοκινάσης II, η οποία επιβάλλει μια βαθιά παράκαμψης επί ηπατοκυτταρικών ειδικά καταβολισμό φρουκτόζη, αυτό δεν ήταν η περίπτωση για ανθρώπινη οιδηματώδης ήπαρ ιστούς.

Συμπέρασμα

Κανονικό ανθρώπινου ήπατος ιστοί μπορούν να προστατευθούν έναντι παροδικά επαγόμενη από τον TNF κυτταρικό θάνατο με συστημική προεπεξεργασία με φρουκτόζη χρησιμοποιούνται σε μη-τοξικό /φυσιολογικές συγκεντρώσεις. Επιλεκτική TNF-στόχευση της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας όγκων του ήπατος από παροδικές και ειδικές εξάντληση των ηπατοκυτταρικών ATP ανοίγει μια νέα κλινική λεωφόρος για τον TNF-βασισμένη θεραπεία των καρκίνων του ήπατος

Παράθεση:. Weiland Τ, Klein K, Zimmermann Μ, Speicher Τ, Venturelli S, Berger A, et al. (2012) Επιλεκτική προστασία των ιστό ανθρώπινου ήπατος σε TNF-στόχευσης των καρκίνων του Ήπατος με παροδική εξάντληση του τριφωσφορική αδενοσίνη. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10.1371 /journal.pone.0052496

Επιμέλεια: Johannes Haybaeck, Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Graz, Αυστρία

Ελήφθη: 9 Αύγ του 2012? Αποδεκτές: 19 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Weiland et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση ICEPHA 2009-09, η Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), το Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας (BMBF, # 0315755) και το Ίδρυμα Robert Bosch, Στουτγάρδη, Γερμανία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η συστηματική χρήση των εξαιρετικά ισχυρών αντινεοπλασματικών παράγοντα νέκρωσης κυτοκίνης όγκων (TNF) είναι ιδιαίτερα περιορισμένη

που οφείλεται στη διαπίστωση ότι πλειοτροπικές λειτουργίες του TNF προκαλέσουν σοβαρές συστηματικές παρενέργειες

, ιδίως ηπατική τοξικότητα υψηλής ποιότητας [ ,,,0],1], [2]. Ως εκ τούτου, η συστημική χορήγηση του TNF αντικαταστάθηκε σε επιλεγμένες οντότητες όγκου επιτυχώς σε σχήματα που χρησιμοποιεί μόνο τοπικό διαχύσεις των άκρων με TNF [3], [4]. Ωστόσο, τέτοιες στρατηγικές παραμείνει απροσδιόριστη για απομονωμένα ηπατικά αιμάτωσης (IHP) που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των κακοηθειών του ήπατος [5] – [8].

Πρόσφατα, επαγόμενη από τον TNF ηπατοκυτταρικών απόπτωση αναγνωρίστηκε ως ένα ιδιαίτερα ΑΤΡ- εξαρτώμενη διαδικασία σε ένα μοντέλο ποντικού [9]. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι η φρουκτόζη οδηγεί σε εξάντληση του ΑΤΡ αποκλειστικά σε ηπατοκύτταρα. Ως λειτουργική συνέπεια, ηπατοκύτταρα (σε αντίθεση με επιζήμια αντίστοιχά τους) εμφανίζουν προστασία έναντι TNF-επαγόμενη απόπτωση [9], [10]. Αυτή η βιολογική διαφορά μεταξύ ηπατικών κυττάρων και κακοήθων κυττάρων αποδόθηκε σε μία μεταμόρφωση που σχετίζονται με την υπερέκφραση του εξοκινάσης II (HKII) που οδηγεί σε μια παράκαμψη του ηπατοκυτταρικών ειδικής καταβολισμό φρουκτόζη [10]. Στην παρουσία φρουκτόζης, οι κρίσιμες ήπατος-ειδικών ενζύμων ketohexokinase (KHK) και αλδολάσης Β (AldoB) η καθιέρωση ενός αναστρέψιμη, ηπατοκυτταρικών ειδικά ΑΤΡ παγίδα [11]. Η υπερέκφραση του HKII παρακάμπτει αυτό το νεροχύτη

έτσι ώστε

φρουκτόζη μετατρέπεται κατά προτίμηση σε φρουκτόζη-6-φωσφορική και μεταβολίζονται μέσω του «μυϊκού τύπου» γλυκόλυση χωρίς να επηρεάζει τα κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ (που απεικονίζεται με λεπτομέρεια στο Σχήμα 1).

η αυξημένη έκφραση του εξοκινάσης II (HKII) σε κύτταρα όγκου οδηγεί σε ένα μεταβολισμό μυϊκού τύπου φρουκτόζης (κάτω μέρος της εικόνας), η οποία δεν περιλαμβάνει καμία εξάντληση ή παγίδευσης ΑΤΡ. Αντιθέτως, τα ηπατοκύτταρα (άνω μέρος της εικόνας) χρησιμοποιούν τα ένζυμα ketohexokinase (KHK) και αλδολάση Β (aldoB) και έτσι ένα μεταβολισμό του ήπατος τύπου φρουκτόζης. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει μια πολύ ταχεία ΑΤΡ-εξαρτώμενη μετατροπή της φρουκτόζης μέσω KHK σε φρουκτόζη-1-φωσφορική που ενεργούν ως καταβόθρα φωσφορικό δραματικά μειώνοντας κυτταρικά επίπεδα του ΑΤΡ.

Η

Στο μοριακό επίπεδο,

Αυτή η φρουκτόζη μεσολάβηση ηπατοκυττάρων ειδικά προστατευτική επίδραση έναντι του TNF

είναι πιθανότατα επιτυγχάνεται με προϊόντα αποδόμησης ADP, οι οποίες συσσωρεύονται με τη μορφή της αδενοσίνης. Πρόσφατα,

δείχθηκε ότι η αδενοσίνη προκαλεί μια αυτοκρινή αδενοσίνης 3 ‘, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής

απόκριση, που επηρεάζουν αρνητικά την επαγόμενη από τον TNF δραστικότητα του c-Jun-Ν-τερματικής κινάσης (JNK) σε ένα πρωτεϊνική κινάση Α εξαρτώμενο τρόπο [12].

στη μελέτη μας, ερευνήσαμε τη δυνατότητα να μεταφέρει αυτήν την προσέγγιση από ποντικού δεδομένων στο ανθρώπινο σύστημα σε σχέση με την εξάντληση παροδική ATP φρουκτόζη μεσολάβηση και με αυτόν τον τρόπο την πρόκληση της επιλεκτικής αφοπλισμό του TNF είναι καταστροφική ηπατοκυτταρικών ιδιότητες. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε (i) καλλιεργημένα πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (PHH) και, (ii) ακριβείας-cut φέτες υγιείς ιστούς ανθρώπινου ήπατος

έναντι

κακοήθεις ιστούς ανθρώπινου ήπατος που προέρχονται από το ήπαρ resectates ασθενών σε μια μεταφραστική e

x vivo

προσέγγιση. Εκτός από τις ήδη διεξαχθεί πειραματισμό ποντικού, w

e ήταν πλέον σε θέση να μεταφράσει αποκτήσει γνώση σχετικά με φρουκτόζη μεσολάβηση ηπατική προστασίας στην ανθρώπινη φυσιολογική πλαίσιο παρέχοντας τη βάση για τη μελλοντική φάσης Ι /ΙΙ των κλινικών μελετών

.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί κανόνες

Καλλιεργημένα, πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (PHH) υποβάλλονται σε επεξεργασία από πρόσφατα έλαβε το ήπαρ δείγμα που λαμβάνεται σύμφωνα με χειρουργική επέμβαση στο ήπαρ. Κατά συνέπεια, PHH δεν αποτελούν μια κυτταρική γραμμή? PHH είναι πρωτογενή κύτταρα. PHH από διαφορετικούς ασθενείς δότες που παρέχονται από T.S. Weiss με εν επιγνώσει συναίνεση του ασθενούς σε σχέση με τη λήψη των δειγμάτων, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της και εγκρίθηκε από το φιλανθρωπικό κρατικό έλεγχο Ανθρωπίνων Ιστών περιεχόμενο ΑΤΡ προσδιορίστηκε μετά από 30 λεπτά (Α) ή σε διάφορα χρονικά σημεία όπως υποδεικνύεται (Β)? απελευθέρωση LDH του PHH μετά από επώαση με 50 mM φρουκτόζη προσδιορίστηκε μετά υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (C). Τα δεδομένα δίδονται ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Ως εκ τούτου, με την εισαγωγή ηπατική προστασία έναντι του TNF σε απομονωμένες ηπατική αιμάτωση (IHP) φαίνεται να είναι εφικτό από κλινική άποψη. Σε μια μελέτη από Cortez-Pinto

et

al

., Υγιείς εθελοντές καθώς και σε ασθενείς με μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) ήταν εφ ‘άπαξ ένεση με φρουκτόζη. Στη συνέχεια, η εξάντληση του ΑΤΡ παρακολουθήθηκε συνεχώς με φασματοσκοπία NMR για έως 60 λεπτά. Τόσο υγιείς εθελοντές καθώς επίσης ασθενείς NASH βρέθηκαν να επιδεικνύουν μία ταχεία (12 λεπτά μετά την ένεση φρουκτόζη) και παροδική μείωση της κυτταρικής ΑΤΡ (αποκατάσταση των ηπατικών ΑΤΡ καταστημάτων που ανιχνεύεται σε 60 λεπτά μετά την έγχυση φρουκτόζη) [13]. Ως εκ τούτου, το έργο αυτό από Cortez-Pinto

et

al

. θα συμβάλει στην παρακολούθηση και τη χρονική πορεία και την έκταση της καταστροφής του ATP στο μέλλον φάσης Ι /ΙΙ των κλινικών δοκιμών που πρέπει να εκτελεστούν σε ασθενείς που παρουσιάζουν πρωτογενείς και δευτερογενείς καρκίνους του ήπατος.

Επίσης, άλλες ομάδες παρατηρείται μια τέτοια ταχεία καταστρέφουν επίδραση στην ΑΤΡ μέσα σε 30 λεπτά όταν μια δόση μέχρι 250 mg φρουκτόζη /kg σωματικού βάρους εφαρμόστηκε σε υγιείς εθελοντές. Σε συμφωνία με τα πειραματικά αποτελέσματα μας, δεν επιζήμιες επιδράσεις στο ήπαρ (π.χ., σε σχέση με αυξημένες τρανσαμινάσες) έχουν περιγραφεί για τέτοιες διαδικασίες φρουκτόζη-φόρτωσης [13] – [17]

Προς τα πάνω ρύθμιση της εξοκινάσης II και κατάργηση του. μεταβολισμός φρουκτόζη ηπατική τύπου σε ιστούς όγκων του ήπατος

πρόσφατα δείχθηκε σε ηπατική κυτταρικές γραμμές όγκου που κατά τη διαδικασία κακοήθους μετασχηματισμού μια βαθιά προς τα πάνω ρύθμιση του εξοκινάσης II (HKII) συμβαίνει το οποίο θα μπορούσε να εξηγήσει

ότι το φυσιολογικό φαινόμενο της ηπατικής ATP παγίδευσης παρακάμπτεται σε καρκινικά κύτταρα

[10]. Να εξετάσει περαιτέρω αυτό το μηχανισμό που χρησιμοποιήθηκε πρόσφατα εκτομή δείγματα ανθρώπινου ήπατος ιστών, δηλαδή κύτταρα τα οποία δεν υπόκεινται σε οποιαδήποτε πιθανά αντικείμενα που σχετίζονται με τη διαδικασία της διαιωνοποίηση. Συγκρίνοντας τις μεταγραφικές επίπεδα HKII, AldoB, και KHK, το μέσο επίπεδο του HKII μεταγραφής βρέθηκε να είναι αυξημένη 7.6-φορές σε ανθρώπινο ήπαρ όγκους σε σύγκριση με μη-ογκογόνους ιστούς πρωτογενούς ανθρώπινου ήπατος που κανονικοποιούνται προς παράγοντα 1 (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, AldoB και KHK βρέθηκαν να μειώθηκε στην πλειονότητα των εξεταζόμενων ιστών όγκου και κυτταρικές γραμμές όγκου (μέση πολλαπλές μεταβολές & lt? 1 σε σύγκριση με μη-ογκογόνους ιστούς πρωτογενούς ανθρώπινου ήπατος που κανονικοποιούνται προς παράγοντα 1) (Πίνακας 1). Σύμφωνα με την υπόθεση Warburg επί αποκτήθηκαν μεταβολές στο μεταβολισμό κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των κακοηθειών, επίσης καρκίνους του ανθρώπινου ήπατος μπορεί να φιλοξενήσει σε ένα περιβάλλον που χαρακτηρίζεται από την έλλειψη θρεπτικών ουσιών και οξυγόνου μέσω μια αλλαγμένη μεταβολικής εξοπλισμού, ιδιαίτερα σε μη-οξειδωτική τους, δηλαδή γλυκολυτικά ενέργεια μεταβολισμός [18]. Ως εκ τούτου, η υπερέκφραση του HKII και έτσι μεταβάλλεται το μεταβολισμό φρουκτόζης σε πρωτογενή ή δευτερογενή καρκίνων του ήπατος μπορεί να χρησιμεύσει ως εργαλείο για τον καθορισμό επιλεκτική ηπατική προστασία στη θεραπεία όγκου TNF-based μέσω ενός προσθετική χορήγηση φρουκτόζης.

Η

TNF-κυτταροτοξικότητα είναι απενεργοποιημένη από εξάντληση ΑΤΡ φρουκτόζη μεσολάβηση σε PHH

στη συνέχεια, συνέπειες της ηπατικής ΑΤΡ εξάντληση αξιολογήθηκαν στο επίπεδο της κυτταροτοξικότητας και την ενεργοποίηση της κασπάσης σε ανθρώπινα πρωτογενή ηπατοκύτταρα. Ως υποκατάστατος δείκτης της ακεραιότητας της μεμβράνης, τα ποσά απελευθέρωσης LDH κατά την έκθεση σε 100 ng /ml και μόνο TNF (100 ng /ml? Απεικονίζεται ως -fruc στην Εικόνα 2Α) ή σε ένα συνδυασμένο προεπεξεργασίας φρουκτόζη (15 λεπτά? + Fruc στο Σχήμα 2Α ) /αγωγή TNF (50 mM φρουκτόζη? 100 ng /ml TNF) προσδιορίστηκαν σε προερχόμενα από δότη δείγματα ανθρώπινου PHH. Κατά τη διάρκεια αυτών των πειραμάτων, η ευαισθητοποίηση σε επαγόμενη από τον TNF κυτταρικό θάνατο ενισχύθηκε με την προσθήκη του αναστολέα σύνθεσης RNA ακτινομυκίνη D (ActD? 1 μg /ml), το οποίο αποκλείει την αυξητική ρύθμιση των τυχόν προστατευτικών γονιδίων επιβίωση [19]. Με εξέταση του PHH προέρχονται από εκτομή ανθρώπινο ήπαρ δείγματα (Σχήμα 3Α), τα επίπεδα της μέσης απελευθέρωσης LDH επαγόμενη από τον TNF βρέθηκαν όλα να είναι εξασθενημένοι σημαντικά κατά τη διάρκεια της φρουκτόζης-φόρτωσης. Σύμφωνα με αυτή την λειτουργική εύρημα, (π.χ., αρχετυπικές πυρηνική συμπύκνωση και σχηματισμό φυσαλίδων μεμβράνης) βρέθηκαν επίσης μορφολογικές αλλαγές που είναι χαρακτηριστική για την αποπτωτική λειτουργία του TNF που επάγεται από κυτταρικό θάνατο καταργείται ουσιαστικά από φρουκτόζη προεπεξεργασίας (Σχήμα 3Β). Όπως επεξηγείται στις PHH διάφορα αποπτωτικά φαινόμενα όπως (i) συμπύκνωση των πυρήνων (Σχήμα 3Β, πάνω αριστερά πάνελ? Χρώση Hoechst) καθώς και (ii) διόγκωση του κυττάρου όγκου μεμβράνες (Σχήμα 3Β, κάτω αριστερά πάνελ? Μικροσκοπία αντίθεσης φάσης) σαφώς ήταν ανιχνεύονται σε απόκριση στην θεραπεία TNF μόνο? Ωστόσο, προκατεργασία με φρουκτόζη οδήγησε ομόφωνα σε μια σχεδόν πλήρη κατάργηση αυτών των TNF-επαγόμενη φαινόμενα (Σχήμα 3Β, άνω και κάτω δεξιά πάνελ). Στην προηγούμενη εργασία, έχει ήδη δείξει ότι σε ηπατοκύτταρα TNF-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του NF-kappa Β καταργείται κατά τη διάρκεια του καθεστώτος του μας ταυτόχρονων απασχόλησης ActD ή CPT, επιβάλλει γενικό αναστολή στα ηπατικά μεταγραφής [20]. Με αυτόν τον τρόπο, ηπατοκύτταρα υποβάλλονται σε συνδυαστική θεραπεία με είτε ActD /TNF ή CPT /TNF δεν έχουν καμία δυνατότητα να εκφράσουν επαρκείς ποσότητες αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως cFLIP ή ΧΙΑΡ του οποίου η έκφραση θα μπορούσε να είχε προκληθεί από τον TNF-επαγόμενη NF-kappa Β- μεσολάβηση σηματοδότησης. Κατά συνέπεια, τα ηπατοκύτταρα υποβάλλονται σε φρουκτόζη μεσολάβηση εξάντληση του ΑΤΡ σε παρουσία είτε ActD /ΤΝΡ ή CPT /TNF δεν είναι σε θέση να εξουδετερώσουν την αναστολή του TNF με τη μεσολάβηση ηπατοκυτταρικών θάνατος μέσω της ενεργοποίησης των οδών τελεστή προ-επιβίωσης, όπως η ενεργοποίηση του NF-kappa Β σηματοδότηση [20].

Καλλιεργημένα PHH έξι διαφορετικούς δότες υποβλήθηκαν σε αγωγή με 400 ng /ml ActD μόνο του ή σε συνδυασμό με 100 ng /ml TNF και 50 mM φρουκτόζη όπως υποδεικνύεται. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίσθηκε μετά από 24 ώρες με προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH απεικονίζονται ως μέση φορές μεταβολής σε μη επεξεργασμένο μάρτυρα, ρυθμίστηκε σε 1 (*: ρ & lt? 0,05, unpaired t-test). (Β) Εικόνες από PHH ελήφθησαν 12 ώρες μετά τη θεραπεία και απεικονίζουν επαγόμενη από τον TNF αποπτωτικών συμπύκνωση των πυρήνων στην εξάρτηση της φρουκτόζης-φόρτωσης (+/- fruc) (άνω πίνακα: χρώση Hoechst) και διόγκωση της μεμβράνης (κάτω πίνακα: μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ). Λευκή γραμμή δηλώνει 10 μΜ.

Η

Κατάργηση του TNF-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο κάτω από ΑΤΡ συνθήκες καταστρέφουν το ανθρώπινο ήπαρ ιστούς

Για να προσεγγίσει ερώτησή μας σε ένα περιβάλλον ασθενή μεμονωμένα πέρα ​​από μεμονωμένες , καλλιεργημένα κύτταρα και κυτταρικές σειρές, η

ex vivo

ακριβείας-cut τεχνολογία φέτα ιστού προσαρμόστηκε για πειραματικούς μας κατάσταση [21]. φέτες Ανθρώπινο ηπατικό ιστό με διάμετρο 0,8 cm και πάχος 200-300 μm που αποτελείται από 10-15 κύτταρο στρώματα, τα οποία φιλοξενούν -10

6 ηπατικά κύτταρα σε μέσο όρο, παρασκευάστηκαν από προσφάτως εκτομή όγκων του ήπατος και της αντίστοιχης μη κακοήθη ιστό ήπατος, επωάστηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων (Σχήμα 4Β). Δείγματα των μη νεοπλασματικών ιστών ανθρώπινου ήπατος και ιστών ανθρώπινου όγκου ήταν διαφορετικής προέλευσης (βλέπε πίνακα στην Εικόνα 4Α), συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC), ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC), παγκρεατικό καρκίνωμα (PC), και χολαγγειοκαρκίνωμα (CC). Όπως έλεγχο βιωσιμότητας, ακρίβεια-cut φέτες ανθρώπινου ηπατικού ιστού (Α? Αριστερή στήλη) και των ιστών ανθρώπινου όγκου (Α? Δεξιά στήλη) μολύνθηκαν από προεπιλογή με ένα γονίδιο δείκτη GFP που κωδικοποιεί αδενοϊικό φορέα (Adv-GFP, ΜΟΙ 1) ένας ώρες μετά την κοπή του ιστού για τον προσδιορισμό της ζωτικότητας των φετών ιστού καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων. Μόνο βιώσιμα κύτταρα, που εμφανίζουν μεγάλες περιοχές είναι θετικό για την έκφραση του γονιδίου maker GFP τόσο οιδηματώδης και μη-νεοπλασματικές πρωτογενή ανθρώπινα ηπατικά ιστούς παρέχει τη δυνατότητα για τη μόλυνση και την επακόλουθη έκφραση των γονιδίων σήμανσης που κωδικοποιούνται από ιό (σημείωση: φέτες ιστού αντιπροσωπεύουν κομμάτια στρώμα πολυ-κυττάρων του χειρουργικά ιστούς (σε επιλεγμένο πάχος τομής 200-300 μm υπολογίζουμε περίπου 10-15 στρώματα κυττάρων)? ως εκ τούτου, δεν είναι τεχνικά δυνατόν να φέρει όλα τα τμήματα των αντίστοιχων φετών σε εστίαση (Εικόνα 4Β))

Τύποι δειγμάτων ιστού που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των δεδομένων στο Σχήμα 4: ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC), παγκρεατικό καρκίνωμα (PC), και χολαγγειοκαρκίνωμα (CC) (Α). Ως παραδείγματα, ακρίβεια-cut φέτες ιστό ανθρώπινου ήπατος (Β? Αριστερή στήλη) και των ιστών ανθρώπινου όγκου (Β? Δεξιά στήλη) μολύνθηκαν με ένα γονίδιο δείκτη GFP που κωδικοποιεί αδενοϊικό φορέα (Adv-GFP, ΜΟΙ 1) μία ώρα μετά την κοπή του ιστού για να προσδιοριστεί η ζωτικότητα των φετών ιστού καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων. Εικόνες ελήφθησαν 24 ώρες μετά τη μόλυνση για να προσδιοριστεί η έκφραση ιικών GFP που μόνο μπορεί να ληφθεί σε ζωτικά περιοχές των δειγμάτων ιστών (φίλτρο 2,5 χ /488 nm? Λευκές ράβδοι εξισώνουν 1000 μΜ)

Η

Ως υποκατάστατο. δείκτες για την κυτταρική τοξικότητα, (i) το ποσό του ιστού που απελευθερώνεται LDH ανά mg πρωτεΐνης, (ii) μια ELISA που βασίζεται προσδιορισμό της κυτοκερατίνης 18-διάσπασης συσχετισμό με δραστικότητα κασπάσης και, (iii) η δραστηριότητα διάσπασης DEVD κασπάσης που επάγεται ανά mg αξιολογήθηκαν πρωτεΐνη ιστού.

τα αποτελέσματα που προκύπτουν από φέτες ιστών έδειξαν την επιλεκτική φύση της φρουκτόζης με τη μεσολάβηση της προστασίας έναντι του TNF επίσης για την πρωτοβάθμια συκώτι και όγκου ιστών που λαμβάνονται από ασθενή. Σε πρωτογενείς μη-κακοήθη φέτες ιστό ανθρώπινου ήπατος, η επίδραση του TNF-επαγόμενη ηπατοτοξικότητα (i) απελευθέρωση LDH (Σχήμα 5Α), (ii) κυτοκερατίνη 18-διάσπασης (Σχήμα 5Β), και (iii) διάσπασης DEVD (Σχήμα 5C) , αντίστοιχα, ήταν σημαντικά μειωμένη σε παρουσία φρουκτόζης σε όλα σχεδόν τα δείγματα. Σε αντίθεση, σε πρωτογενείς φέτες ανθρώπινο ιστό ήπατος όγκου, κατόπιν ταυτόσημη διαδικασία προεπεξεργασία με φρουκτόζη, στις περισσότερες δείγματα ασθενών παρατηρήθηκε καμία προστασία έναντι TNF κυτοτοξικότητας, αν όχι ακόμη και μια ευαισθητοποίηση προς ΤΝΡ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, όπως αποδεικνύεται από τα επίπεδα (i) απελευθέρωση LDH (Σχήμα 5D), (ii) κυτοκερατίνη 18-διάσπασης (Σχήμα 5Ε), και (iii) διάσπασης DEVD (Σχήμα 5F), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα προέρχονται από ανθρώπινο ιστό εναρμονίζεται με αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση απομονωμένων πρωτογενών ποντικού ηπατοκύτταρα

in vitro

και ένα μοντέλο ποντικού TNF-επαγόμενης ηπατικής βλάβης

in vivo από

Latta

et

al

. [9]. TNF ασκεί μια βαθιά ηπατική απόπτωση και ηπατική βλάβη ποσοτικοποιείται με διάσπαση DEVD καθώς και από LDH και την απελευθέρωση ALT πλάσματος, αντίστοιχα. Ωστόσο, οξεία επαγόμενη από τον TNF ηπατοτοξικότητα και ηπατική βλάβη σε πρωτογενείς απομονωμένα ηπατοκύτταρα ποντικού και σε ποντικούς, αντίστοιχα, αναστάλθηκε πλήρως από εξάντληση ΑΤΡ με 50 mM φρουκτόζη [9].

φέτες ιστών που προέρχονται από ανθρώπινα ήπατα (A- Γ) ή του ήπατος ιστούς όγκων (D-F), αντίστοιχα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml ActD σε συνδυασμό με 100 ng /ml TNF και 50 mM φρουκτόζη όπως υποδεικνύεται. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH (A /C) και κυτοκερατίνη 18-διάσπασης (B /D) μετά από 24 ώρες και με διάσπαση DEVD μετά από οκτώ ώρες (C /F). Τα δεδομένα απεικονίζονται ως σημαίνουν φορές αλλαγές χωρίς θεραπεία ελέγχου, να οριστεί σε 1 (*: p & lt? 0,05, unpaired t-test)

Η

Ως εκ τούτου, εμείς εδώ δείχνουν για πρώτη φορά

ex. vivo

, αποβολή αντικείμενα καλλιέργειας κυττάρων και τρωκτικών επιφαινόμενα, ότι η συμπληρωματική χορήγηση φρουκτόζης προστατεύει επιλεκτικά πρωταρχικό ανθρώπινο ήπαρ ιστούς

ex vivo

. Αντίθετα, οι πρωτογενείς ιστούς ανθρώπινου όγκου που προέρχονται από ηπατικές μεταστάσεις ουσιαστικά δεν προστατεύονται

ex vivo

. Ωστόσο, σε ατομικό επίπεδο, σε ορισμένες όγκο ασθενών που προέρχονται από δείγματα ιστών, φρουκτόζη φόρτωση απέτυχε να προστατεύσει τα ηπατοκύτταρα. Πρέπει να έχουμε κατά νου ότι η ενδογενής παθολογικές καταστάσεις και διαταραχές του ήπατος μπορεί να μεταβάλλουν τον μεταβολισμό φρουκτόζης και την ευαισθησία στον TNF. Επιπλέον, δότες ιστών που έχουν λάβει νεο-επικουρική θεραπεία μπορεί να οδηγήσει σε μεταβολές στην απόκριση του όγκου πριν από την υποθετική έναρξη οποιασδήποτε TNF-based θεραπευτικό σχήμα

Κατ ‘αναλογία, σε ένα σύνολο ανθρώπινων ηπατικών κυττάρων όγκου -. HepG2 ? Hep3B? ΗυΗ7 και PCL /PRF /5- ούτε καταστρέφουν επίδραση ΑΤΡ που διεγείρεται από προ-θεραπεία με φρουκτόζη (Σχήμα 6Α), ούτε οποιαδήποτε φρουκτόζη μεσολάβηση προστασία έναντι TNF-επαγόμενη απόπτωση θα μπορούσε να επιτευχθεί (σχήμα 6Β). Αν και η ευαισθησία προς TNF προσδιορίστηκε με τη βοήθεια προσδιορισμού απελευθέρωσης LDH ήταν μεταβλητή μεταξύ της χρησιμοποιούμενης όγκου κυτταρικές γραμμές HepG2? HepB3? ΗυΗ7 και PLC /PRF 5, δεν μετριασμό των απελευθέρωσης LDH σε παρουσία 50 mM φρουκτόζης αποδόθηκαν.

Οι ηπατικές κυτταρικές γραμμές όγκου HepG2, Hep3B, ΗυΗ7 και PLC /PRF /5 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις φρουκτόζης (ΈΝΑ). περιεχόμενο ΑΤΡ προσδιορίστηκε μετά από 30 λεπτά (Α) ή σε διάφορα χρονικά σημεία, όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα δίδονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 15). Οι ηπατικές κυτταρικές γραμμές όγκου υπέστησαν αγωγή με 1 μg /ml ActD σε συνδυασμό με 100 ng /ml TNF και 50 mM φρουκτόζη όπως υποδεικνύεται. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH μετά 24 ώρες (η = 15) (Β). Τα δεδομένα απεικονίζονται ως σημαίνουν φορές αλλαγές χωρίς θεραπεία ελέγχου, να οριστεί σε 1.

Η

Συγκρίνοντας τα μεταγραφικά επίπεδα των γλυκολυτικών ενζύμων HKII, AldoB, και KHK, το μέσο επίπεδο της HKII μεταγραφής βρέθηκε να αυξηθεί κατά μέσο όρο 34 φορές στα ανθρώπινα ηπατικά κυτταρικές γραμμές όγκου HepG2, Hep3B, ΗυΗ7 και PLC /PRF /5 σε σύγκριση με μη-ογκογόνους ιστούς πρωτογενούς ανθρώπινου ήπατος που κανονικοποιούνται σε παράγοντα 1. σε αντίθεση, τα ένζυμα AldoB και KHK βρέθηκαν να είναι σταθερή ή μειώθηκε στις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές όγκου (μέση πολλαπλές μεταβολές & lt? 1 σε σύγκριση με μη-ογκογόνους ιστούς πρωτογενούς ανθρώπινου ήπατος που ρυθμίζεται σύμφωνα με τον παράγοντα 1) όπως απεικονίζεται στον πίνακα 1. η ενζυματική εξοπλισμός των καρκινικών κυττάρων είναι ιδιαίτερα ενδεικτικό για το HKII παράκαμψη παράκαμψη της ATP βυθίζονται που δραστηριοποιούνται στην πρωτογενή ηπατοκύτταρα. Κατά συνέπεια, δεν εξάντληση του ΑΤΡ ήταν εμφανής σε παρουσία έως και 50 mM φρουκτόζη. Είναι ενδιαφέρον ότι από μια μηχανιστική άποψη, σε προηγούμενη εργασία που ήδη έχει αποδειχθεί ότι οι επιδράσεις της φρουκτόζης στην εξάντληση ΑΤΡ και επαγόμενη από τον TNF θάνατο των καρκινικών κυττάρων μπορεί να είναι «τεχνητά» αντιστρέφεται όταν πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού, είναι «φυσικά» ανεπαρκή για HKII όπως PHH, είχαν γονίδιο συμπληρώνεται με ένα φορέα που φέρει το γονίδιο ποντικού HKII [10]. Στη μελέτη της Speicher

et

al

. διαπιστώθηκε ότι η φυσιολογική παγίδα φρουκτόζη /ΑΤΡ παρακαμφθεί (όπως στα ηπατικά κύτταρα όγκου)? ως εκ τούτου, η κρατική προστασία «αρχικά» επιτυγχάνεται σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα σύμφωνα με φρουκτόζη φόρτωσης τώρα χάθηκε, την εφαρμογή μιας κατάφωρα αυξημένη ευαισθησία /τοξικότητα των πρωτογενών ηπατοκυττάρων προς την TNF-επαγόμενη απόπτωση [10].

Συμπεράσματα

TNF αποτελεί έναν πολύ ισχυρό αντινεοπλασματικό φάρμακο, το οποίο όμως μέχρι στιγμής δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε ασθενείς με πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους του ήπατος που οφείλεται σε βαθιά ηπατοτοξικότητα της. Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, η συνδυαστική χρήση της φρουκτόζης

που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκμετάλλευση μεταβολικές διαφορές που αποτελεί επιλεκτική προστασία των υγιών ηπατοκυττάρων προς TNF

φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική επιλογή. Με βάση τα αποτελέσματα μας απασχολούν αποκλειστικά ανθρώπινα πρωτογενή ηπατοκύτταρα και ακρίβεια-cut φέτες υγιείς ιστούς ανθρώπινου ήπατος

έναντι

κακοήθεις ιστούς ανθρώπινου ήπατος, φαίνεται εφικτό ότι η φρουκτόζη που προκαλείται εξάντληση του ΑΤΡ αντιπροσωπεύει ένα γενικό τρόπο για την προστασία του ανθρώπινου ήπατος από ανεπιθύμητες κυτταρικό θάνατο ενεργειακά εξαρτώμενη που προκαλείται από TNF σε IHP θεραπεία με βάση το τοπικό καρκίνο του σύμφωνα με την οποία διατηρείται η ευαισθησία των όγκων του ήπατος προς την κυτταροτοξική θεραπεία.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Christine Geisler, Igor Liebermann, Ανδρέα Schenk και Ιρίνα Smirnow για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια.