Αφηρημένο

Ένα από τα τελευταία επιτεύγματα στην έρευνα για τον καρκίνο είναι η αναγνώριση της ενεργοποίησης μεταλλάξεις σε διάφορες οδούς υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του ορθοκολικού καρκίνου (CRC). Υποθέτουμε ότι, εναλλακτική λύση για μεταλλάξεις, υπερέκφραση διαφόρων ογκογόνων RTKs μπορεί επίσης να στηρίξει CRC παθογένεια και διαφορετικές RTK μπορεί ζευγάρι με διακριτών οδών κατάντη σηματοδότησης σε διαφορετικούς υποτύπους του ανθρώπινου CRC. Με ανοσοϊστοχημεία, δείχνουμε εδώ ότι τα μέλη RTK ErbB2, ErbB3 και c-Met ήταν μάλιστα διαφορικά υπερεκφράζεται σε δείγματα παχέος ασθενή με καρκίνο που οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση μονοπατιών σηματοδότησης RTK. Χρησιμοποιώντας ErbB2 ειδικός αναστολέας λαπατινίμπη και c-Met ειδικό αναστολέα PHA-665752, αποδείξαμε επίσης ότι αυτή η συστατική ενεργοποίηση του RTK σηματοδότηση είναι απαραίτητη για την επιβίωση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Επιπλέον, δείχνουμε ότι μοτίβο RTK υπερέκφραση υπαγορεύει τη χρήση των κατάντη ΑΚΤ και /ή ΜΑΡΚ. Τα δεδομένα μας είναι σημαντικές προσθήκες για τα τρέχοντα μοντέλα ογκογόνο μετάλλαξη, και περαιτέρω να εξηγήσει την κλινική παραλλαγή σε θεραπευτικές αποκρίσεις του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν για πιο εξατομικευμένη θεραπεία προσαρμοσμένες στις ατομικές τους ασθενείς με βάση τον τύπο της έκφρασης RTK εκτός από την κατάσταση της μετάλλαξης τους

Παράθεση:. Yao YL, Shao J, Zhang C, Γου JH, Ζανγκ QH, Γουάνγκ JJ , et al. (2013) πολλαπλασιασμό των καρκινικών παχέος προωθείται από δύο Σηματοδοσίας Μεταγωγή πρότυπα έκφρασης: ErbB2 /ErbB3 /ΑΚΤ και ΜΕΤ /ErbB3 /ΜΑΡΚ. PLoS ONE 8 (10): e78086. doi: 10.1371 /journal.pone.0078086

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Ιουνίου 2013? Δεκτές: 7 του Σεπτεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 του Οκτώβρη 2013

Copyright: © 2013 Yao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Κοινωνικής Ανάπτυξης της Kunshan (αρ. KS1130) και του Επιστημονικού Ιδρύματος Έρευνας του Πανεπιστημίου Jiangsu (αρ. 11JGD0090). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας επιθηλιακά κακοήθεια που συμβαίνουν στην παχέος εντέρου ή του ορθού. Περισσότεροι από 1 εκατομμύριο άνθρωποι διαγιγνώσκονται με καρκίνο του παχέος εντέρου κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο με αποτέλεσμα περίπου 0,5 εκατομμύρια θανάτους. Το 2008, ήταν η δεύτερη πιο συχνή αιτία που σχετίζονται με όγκους θανάτου στις γυναίκες και η τρίτη πιο συχνή στους άνδρες. Είναι πιο συχνή στις αναπτυγμένες ό, τι σε αναπτυσσόμενες χώρες [1] – [3]. Η χημειοθεραπεία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επικουρική θεραπεία σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση σε όλους σχεδόν τους ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο [4] – [6]. Με ή χωρίς λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες, η χημειοθεραπεία θεωρείται ότι αυξάνει το προσδόκιμο ζωής και να μειώσει την πιθανότητα επανεμφάνισης. Τα φάρμακα χημειοθεραπείας σχεδιασμένο να λειτουργεί μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών και μπορεί να περιλαμβάνουν συνδυασμούς παραγόντων όπως φθοροουρακίλη, καπεσιταβίνη, UFT, λευκοβορίνη, ιρινοτεκάνη, ή οξαλιπλατίνη [7] – [9]. Ωστόσο, για διάφορους λόγους, η χημειοθεραπεία μπορεί να προκαλέσει άλλα προβλήματα για τους ασθενείς, κυρίως λόγω μη ειδικής επίθεση και σχετικές παρενέργειες, όπως ναυτία, έμετος, απώλεια μαλλιών, κόπωση, αναιμία και λοίμωξη μεταξύ άλλων. Ως εκ τούτου, στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου έχει αναδειχθεί η οποία έχει αναπτυχθεί με βάση τη γνώση του κυτταρική σηματοδότηση. Στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου εξαρτάται κυρίως από τα ναρκωτικά μικρού μορίου και μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία προκαλούν πολύ λιγότερες παρενέργειες σε σύγκριση με τις παραδοσιακές χημειοθεραπεία.

εξωγενή σήματα όπως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση σταθερής αύξησης των κυττάρων όγκου με σύνδεση προς τους υποδοχείς τους. Αυτοί οι υποδοχείς ανήκουν στην κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) οικογένεια και ιδανικοί στόχοι στη θεραπεία του καρκίνου, όπως αποδεικνύεται σε πολλές μελέτες. Μετά από συστηματική προφίλ των γονιδιωμάτων καρκίνο χρησιμοποιώντας την επόμενη γενιά αλληλουχίας, τώρα ξέρουμε ότι η απόκτηση της ενεργοποίησης μεταλλάξεων στην ΚΤΚ ή μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης είναι ένας από τους σημαντικότερους ογκογόνων μηχανισμούς. Ωστόσο, μόνο ένα μικρό υποσύνολο των ασθενών έχουν αυτές τις μεταλλάξεις, υποδηλώνοντας ότι άλλοι εναλλακτικοί μηχανισμοί είναι στο παιχνίδι. Ένας από αυτούς τους εναλλακτικούς μηχανισμούς θα μπορούσε να είναι η υπερέκφραση του προ-πολλαπλασιασμός και προ-επιβίωσης RTKs, και /ή διαφορική χρήση των οδών κατάντη σηματοδότησης. Με περισσότερα σε βάθος ανάλυση των γονιδιωμάτων καρκίνο, είμαστε τώρα αρχίζουν να κατανοούν τις ατομικές διαφορές που σηματοδοτούν μοναδική βιολογία της νόσου και την απαίτηση της κλινικής διαχείρισης.

Η οικογένεια του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και c-Met είναι RTKs που έχουν συχνά αναφερθεί σε ορθοκολικό καρκίνωμα εξέλιξη και μετάσταση. Η ενεργοποίηση αυτών των RTKs μπορεί να διεγείρει μια σειρά συγκεκριμένων οδών πραγματοποίηση απευθείας όγκου κυτταρική μετανάστευση, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό. Η παρεκκλίνουσα ρύθμιση των RTKs συχνά σημειώνεται σε προχωρημένο CRC. Σε σύγκριση με EGFR, άλλα μέλη της οικογένειας EGFR, c-met, ErbB2, ErbB3, και των σχετικών μονοπατιών σηματοδότησης τους είναι σχετικά αγνοώ [10]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η διαφορική έκφραση των RTK c-met, ErbB2, ErbB3, και καθοδική σηματοδότηση μορίων σε πρωτογενή δείγματα ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και σε αντιπροσωπευτικές ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Ένα σύνολο 105 δειγμάτων καρκίνου του παχέος διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και ελήφθησαν από ασθενείς κατά το χρόνο της χειρουργικής εκτομής και ενδοσκόπηση. Κανονική παχέος ιστοί ελήφθησαν από 40 Κινέζους ασθενείς με μη καρκινικές ασθένειες, όπως tediously μακρά του παχέος εντέρου και αγγειακή δυσμορφία. Όλες οι περιπτώσεις αντιμετωπίστηκαν στο Νοσοκομείο οι πρώτοι άνθρωποι της Kunshan, Κίνα μεταξύ Ιανουαρίου 2010 και Αυγούστου 2011 και όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Γραπτή τεκμηριωμένη ενημερωμένη συγκατάθεση για γονιδιακή έκφραση αναλύσεις όλων των ιστών ελήφθη από όλους τους ασθενείς πριν την εγχείρηση ή εξέταση ενδοσκόπησης. Αυτή η διαδικασία εγκρίσεως της μελέτης και εγκρίθηκαν από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου τους πρώτους ανθρώπους της Kunshan, Κίνα. Η διάγνωση και η σταδιοποίηση του καρκίνου του παχέος εντέρου αξιολογήθηκε σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης AJCC (TNM).

Cell Culture και αντιδραστήρια

LoVo, SW948 και κυτταρικές σειρές SW480 ελήφθησαν από την ATCC. EGF ήταν από την Sigma (Μιλάνο, Ιταλία), HRG1-β1 και IGF-1 από την Κ & amp? D Systems, (Minneapolis, ΜΝ). LY294002 ήταν από Calbiochem, U0126 από Promega, PHA-665752 από Tocris Βιοεπιστήμης και Gefitinib από Sequoia Research Products. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) στους 37 ° C σε 5% CO

2.

Western Blotting

οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές, και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας μία αποτίμηση πρωτεΐνης (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Δείγματα πρωτεΐνης (30 μg) κλασματώθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με τη χρήση αντισωμάτων έναντι ErbB2, ErbB3, ρ-c-Met, c-Met, ρ-ΜΑΡΚ, ΜΑΡΚ, ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Τα αποτελέσματα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (υπόστρωμα δυτικό σύστημα Pierce ECL ανίχνευσης στυπώματος, Thermo Scientific, Rockford, IL) και έκθεση σε φιλμ αυτοραδιογραφίας (Kodak XAR φιλμ).

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Όλοι οι ιστοί αφαιρέθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη όλη τη νύκτα στους 4 ° C, στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία και τομές των 5 μm πάχος. Χωρισμένο πλάκες βάφτηκαν ανοσοϊστοχημικώς για ErbB2, ErbB3 και ο-ΜΕΤ (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα στους 37 ° C για 30 λεπτά και η αντίδραση με το αντιδραστήριο DAB για 5-10 λεπτά. Τα πλακίδια τοποθετημένα με ουδέτερο κόμμι για μικροσκοπική εξέταση. Κύτταρα με καφέ ενδοκυτταρικούς κόκκους (κυτταρόπλασμα ή πυρήνα) θεωρήθηκαν ότι βάφονται θετικά.

Βιωσιμότητας Κυττάρων

Τα καλλιεργημένα κύτταρα απλώθηκαν σε πυκνότητα 6 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μια πλάκα 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορους παράγοντες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία MTS. CellTiter 96® Υδατικό Αντιδραστήριο One Solution (Promega, Madison, WI) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και οι πλάκες επέστρεψαν στον επωαστή. Μετά από 4 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας έναν υπολογιστή που ελέγχεται πλάκας αναγνώστη.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων έγιναν με τη χρήση t-test του Student ή τη Mann-Whitney U, ανάλογα με την περίπτωση. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS στατιστικού λογισμικού (έκδοση 13.0), και δύο ουρών t-tests εφαρμόστηκαν σε όλα τα δεδομένα εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Η τιμή του

P

μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

διαφορική έκφραση του ErbB3, ErbB2 και γ-ΜΕΤ στα Ανθρώπινα καρκίνο του παχέος εντέρου

για να διερευνηθεί η έκφραση ενός συνόλου γονιδίων υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, εμπεδωμένα με παραφίνη μπλοκ συλλέχθηκαν οποία περιείχαν τα δείγματα των 105 περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου. Πρώτον, η έκφραση του σημαντικού ογκογόνου ετεροδιμερές ErbB2 /ErbB3 προσδιορίστηκε με IHC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ErbB3 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκινικό ιστό, με την έκφραση διανέμονται κυρίως στην μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων. Ο εταίρος του ErbB3 στο ετεροδιμερές, ErbB2, επίσης βρίσκονται κυρίως στην μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων και παρομοίως υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο (Σχήμα 1Β). Ένα άλλο υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, ο πρωτο-ογκογονιδίου c-Met, ανιχνεύθηκε επίσης με IHC, στη μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων στις περισσότερες περιπτώσεις (Σχήμα 1 C). Τέλος, η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης των τριών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας Image-Pro Plus. Τα IHC θετικών περιοχές από πέντε τυχαία πεδία κάθε IHC-χρωματισμένο τμήμα αξιολογήθηκαν ως ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD). Και οι τρεις πρωτεΐνες ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ορθοκολικό ιστούς. (ErbB3: καρκινικούς ιστούς 3264 ± 1032 εναντίον κανονική του παχέος ιστούς 1038 ± 354,

P = 0,0074

, ErbB2: καρκινικούς ιστούς 2616 ± 2019 εναντίον κανονική του παχέος ιστούς 338 ± 154,

P

= 0.016, γ-ΜΕΤ: καρκινικούς ιστούς 3812 ± 739 έναντι κανονική του παχέος ιστούς 978 ± 313,

P

= 0.0057 με Mann-Whitney U test)

(Α, Β, γ. ) Έκφραση του ErbB3, ErbB2 και ο-ΜΕΤ σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Δείγματα 105 εγκλεισμένοι σε παραφίνη ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς αναλύθηκαν με IHC για ErbB3, ErbB2 και c-met, και αντιπροσωπευτικά στοιχεία δείχνουν ισχυρή και ασθενή /αρνητική χρώση για κάθε δείκτη με τις αντίστοιχες φυσιολογικά δείγματα ελέγχου. Μέσος ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) ελήφθη με ανάλυση πέντε πεδία για κάθε διαφάνεια, αξιολογείται από Image-Pro Plus λογισμικό (έκδοση 5.0) για IHC χρώση ErbB3, ErbB2 και ο-ΜΕΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, και * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt?. 0.01 με Mann-Whitney U test

Η

Τα αποτελέσματα της έκφρασης των τριών πρωτεϊνών αναμενόταν, όχι μόνο λόγω της στο ρόλο τους ως πρωτο-ογκογονίδια, αλλά και επειδή οι προηγούμενες παρόμοιες μελέτες έχουν δείξει παρόμοια αποτελέσματα. Ωστόσο, μετά από περαιτέρω έρευνα, βρήκαμε διάφορους βαθμούς μεταβολή στην έκφραση αυτών των τριών πρωτεϊνών σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, κυρίως στην έκφραση ErbB2. Από τις 105 περιπτώσεις που εξετάστηκαν, 45 περιπτώσεις (42,85%) ήταν αρνητικά για χρώση ErbB2, 8 περιπτώσεις έδειξαν ισχυρή χρώση ErbB2, και το υπόλοιπο (52 περιπτώσεις) έδειξαν μέτρια ή ασθενή χρώση ErbB2. Μόνο 9 περιπτώσεις (8,5%) ήταν αρνητικά για χρώση ο-ΜΕΤ, ενώ 14 περιπτώσεις εμφάνισαν ισχυρή χρώση και 82 περιπτώσεις έδειξε μέτρια ή ασθενή χρώση γ-ΜΕΤ. Είναι ενδιαφέρον, ErbB3 ήταν θετικό σε όλους τους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου που εξετάστηκαν (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, η ετερογενής έκφραση αυτών των τριών πρωτεϊνών σε τέσσερα παχέος καρκινικούς ιστούς ερευνήθηκε περαιτέρω με western-blot (Σχήμα 2Β). Η διαφορά στην έκφραση μεταξύ των ιστών του καρκίνου και των φυσιολογικών ιστών και των τριών πρωτεϊνών επιβεβαίωσε την αξιοπιστία της χρώσης IHC, και περαιτέρω έδειξαν ότι τρία είδη σχήματα έκφρασης υπήρχαν στα 105 περιπτώσεις. Όλες οι περιπτώσεις που εξετάστηκαν μπορούσαν να ταξινομηθούν ως: ErbB3: ο-ΜΕΤ συν-υπερ-έκφραση του παχέος εντέρου, ErbB3: ErbB2 συν-υπερ-έκφραση του ορθοκολικού καρκίνου, και ErbB3: ErbB2: ο-ΜΕΤ συν-υπερ-έκφραση του ορθοκολικού καρκίνου (Σχήμα 2C). Πιστεύουμε ότι αυτά τα αποτελέσματα είναι ένα καλό παράδειγμα της μεταβολής του όγκου RTK μοτίβο έκφρασης, και, επιπλέον, ότι οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τα διαφορετικά σχέδια είναι άξιος της εξερεύνησης.

(Α) Λόγος των ισχυρών /μέτρια /αδύναμος /αρνητική χρώση των ErbB3, ErbB2 και ο-ΜΕΤ σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. (Β) Ανίχνευση ErbB3, ErbB2 και ο-ΜΕΤ σε πρωτεΐνη που εξάγεται από δείγματα ιστών από 4 περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου. (C) διάγραμμα Venn δείχνει συν-έκφραση ErbB3, ErbB2 και γ-ΜΕΤ.

Η

πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι μεσολάβηση είτε ErbB3 /ErbB2 ή ErbB3 /C-MET μονοπάτια σηματοδότησης

για τον εντοπισμό κατάλληλο ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές που αντιστοιχούν στα τρία μοριακά μοτίβα που ανακαλύψαμε στα ανθρώπινα δείγματα, η έκφραση του ErbB2, ErbB3 και ο-ΜΕΤ σε 9 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκίνου αναλύθηκε με κηλίδωση Western ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι SW480 είναι ένα αντιπροσωπευτικό κυτταρική γραμμή συν-εκφράζουν ErbB2, ErbB3 και ο-ΜΕΤ. Η κυτταρική γραμμή LoVo μόνο συν-over-εκφράζει ErbB2 και ErbB3, ενώ SW948 είναι ένα αντιπροσωπευτικό κυτταρική σειρά η οποία συν-over-εκφράζει ErbB3 και ο-ΜΕΤ (Εικόνα 3Α). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσεγγιστεί με δοκιμασία MTS, και οι σχετικοί μηχανισμοί θα συζητηθούν περαιτέρω. Μερικοί αναστολείς επιλέγονται και αγωνιστές αυτών των τριών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων ΡΗΑ-665752 (ΡΗΑ) και λαπατινίμπη, οι οποίες είναι αναστολείς της γ-ΜΕΤ και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), αντίστοιχα. Μόλις ο-ΜΕΤ σηματοδότηση εμποδίστηκε από ΡΗΑ, η κυτταρική βιωσιμότητα των SW480 και SW948 μειώθηκε σημαντικά (Εικόνα 3 Β και D)? Ωστόσο καμία σημαντική αλλαγή στην βιωσιμότητα των κυττάρων έλαβε χώρα στα κύτταρα LoVo, ίσως λόγω του χαμηλού τους έκφραση του c-ΜΕΤ (Εικόνα 3C). Αντιστρόφως, η λαπατινίμπη, ένας αναστολέας ErbB2, μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των LoVo και SW480 κύτταρα, ενώ έχουν σχεδόν καμία επίδραση στην SW948 κύτταρα τα οποία έχουν χαμηλή έκφραση ErbB2 (Εικόνα 3D). Οι διαφορές μεταξύ των LoVo και κυττάρων SW948 σε απόκριση τους σε ΡΗΑ και λαπατινίμπη είναι πιθανώς οφείλονται σε διαφορές στην μοτίβο μεταγωγής σήματος τους (Σχήμα 3 Γ και Δ). Επιπλέον, προκειμένου να διερευνηθεί αν οι αγωνιστές μπορεί να διασώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, HGF, ένας αγωνιστής του c-met, και ερεγουλίνη-β1 (HRG1-β1), η οποία συνδέεται με HER3 και επάγει ετεροδιμερισμό της με τα άλλα μέλη της οικογένειας, χρησιμοποιήθηκαν. Τόσο HGF και HRG1-β θα μπορούσε να σώσει εν μέρει την βιωσιμότητα των κυττάρων SW480 (Σχήμα 3Β)? Ωστόσο, η κατάσταση ήταν διαφορετική στα κύτταρα LoVo και SW948. HGF διέγερση προκάλεσε μια ασήμαντη αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε κύτταρα LoVo σύγκριση με κύτταρα LoVo αγωγή με ΡΗΑ (Σχήμα 3C). κύτταρα SW948 ανταποκρίθηκε με μεγαλύτερη ευαισθησία για HGF, με σημαντική αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα SW480 ΡΗΑ-αγωγή (Σχήμα 3D). Ωστόσο SW948 κύτταρα ανταποκρίθηκαν λιγότερο ευαισθησία σε HRG1-β1 σε σύγκριση με LoVo, ίσως λόγω του χαμηλού τους έκφραση του ErbB2, αλλά η κυτταρική βιωσιμότητα των SW948 ήταν ακόμη αυξημένη, πιθανώς λόγω τους άλλους υποδοχείς της οικογένειας EGFR όπως EGFR και ErbB4 οποίο μπορεί τόσο διμερίζονται με ErbB3. Ως εκ τούτου, οι διαφορετικές απαντήσεις διερευνηθεί λόγω των διαφορετικών μοριακών μοντέλων της έκφρασης: ErbB3 /ErbB2 και ErbB3 /c-MET. Η σηματοδότηση κατάντη στη συνέχεια ερευνήθηκε περαιτέρω.

(Α) Ανίχνευση ErbB3, ErbB2 και c-MET στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές LoVo, SW948 και SW480 από δυτικές-κηλίδα. (B, C, D) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία MTS στα ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές LoVo, SW948 και SW480 αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται στην εικόνα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, και * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01 με το t τεστ αταίριαστο του Student

Η

Διαφορετικές Μοριακής Μοτίβα του ορθοκολικού καρκίνου περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση μεταγενέστεροι ΜΑΡΚ ή ΑΚΤ Σηματοδοσίας

για να διερευνηθεί περαιτέρω το μηχανισμό της κατάντη σηματοδότησης και των δύο μοριακών μοντέλων σε καρκίνο του παχέος εντέρου, κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της ενεργοποίησης του ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ που είναι γνωστά κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης του ErbB2 /ErbB3 και ErbB3 /c-MET συγκροτήματα. Ένα επαγόμενο σύστημα siRNA συμμετείχε στη μελέτη, και η έκφραση ErbB3 θα μπορούσε να σιγήσει δοξυκυκλίνη θεραπείας (DOXY). Μόλις SW948 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PHA ή DOXY, την ενεργοποίηση και των δύο ΑΚΤ και ΜΑΡΚ είχαν μπλοκαριστεί. Αμφότερα αυτά τα δύο μονοπάτια σηματοδότησης θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί με HGF, αλλά καμία σημαντική επανενεργοποίησης βρέθηκε όταν ErbB3 σίγησε ακόμα και με θεραπεία HGF, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ σηματοδότησης σε SW948 εξαρτάτο περισσότερο από ErbB3 (Σχήμα 4Α). Η ενεργοποίηση των ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότηση είχε πρόσβαση σε έναν διαφορετικό τρόπο σε κύτταρα LoVo λόγω της υψηλής τους έκφραση του ErbB2 /ErbB3. Τόσο η ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότησης μπλοκαρίστηκαν αποτελεσματικά όταν έλαβαν θεραπεία με DOXY και λαπατινίμπη, υποδεικνύοντας απομείωση των δύο ErbB3 και άλλων μορίων EGFR που μπορούν να αδρανοποιήσουν ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότησης. HRG1-β1 ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει σε μεγάλο βαθμό τόσο την ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ? Ωστόσο αποτέλεσμα την ενεργοποίησή του για AKT ήταν περισσότερο εξαρτημένοι από ErbB3, ενώ επίδραση της ενεργοποίησης του στις ΜΑΡΚ ήταν περισσότερο εξαρτάται από άλλα μέλη της οικογένειας του EGFR (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, οι συνθήκες επεξεργασίας αναστραφεί μεταξύ των δύο αυτών κυττάρων. Λαπατινίμπη έχει μικρή επίδραση στην ενεργοποίηση σε κύτταρα SW948, αλλά HRG1-β1 μπορεί ακόμη να επάγει την ενεργοποίηση τόσο της ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότηση αν και ο βαθμός ενεργοποίησης είναι πολύ ασθενέστερη από ό, τι στα κύτταρα LoVo (Σχήμα 4C). Ομοίως, ο αναστολέας PHA γ-ΜΕΤ είναι η μόνη σχεδόν καμία επίδραση στην ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότηση, και HGF μπορεί μόλις και μετά βίας να ενεργοποιήσετε είτε ΑΚΤ ή ΜΑΡΚ σηματοδότησης πιθανόν να οφείλεται σε χαμηλή έκφραση του c-MET (Σχήμα 4D). Η ιδιαιτερότητα της σηματοδότησης ανάπτυξη μέσω ErbB3 /ErbB2 ή ErbB3 /c-MET περαιτέρω μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς αναστολείς.

(Α, Β) Ανίχνευση της ΑΚΤ και σηματοδότησης ΜΑΡΚ σε κύτταρα SW948 και LoVo από δυτικές-κηλίδα, με την επεξεργασία που αναφέρεται στο σχήμα. (C, D) Ανίχνευση της ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότησης από δυτικές-κηλίδα στην LoVo και SW948 κυττάρων με HGF ή θεραπεία HRG1-β1, με ή χωρίς διαφορετικές αγωνιστές ή ανταγωνιστές, όπως υποδεικνύεται.

Η

ΑΚΤ και ΜΑΡΚ είναι δύο κυτταρικές σηματοδότησης Pathways διοικητικό βιωσιμότητα των κυττάρων του καρκίνου του παχέος κυτταρικών γραμμών με διαφορετικούς υποδοχείς πρότυπα έκφρασης

για να διερευνηθεί περαιτέρω η διακύμανση έκφρασης RTK σε ορθοκολικό κυτταρικές σειρές, μία σειρά δοκιμών της βιωσιμότητας των κυττάρων και κυτταρική σηματοδότηση πορείες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ειδικούς αναστολείς της ΑΚΤ και ΜΑΡΚ. Για τα κύτταρα LoVo, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με LY294002, ένας αναστολέας της σηματοδότησης ΑΚΤ. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική επίδραση, όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με έναν αναστολέα του c-met, U0126. Εάν LoVo υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δύο αναστολείς, το αποτέλεσμα διάσωση του HRG1-β1 επί κυττάρων ήταν πολύ ισχυρότερη από εκείνη του HGF (Σχήμα 5Α), και τη σηματοδότηση ανάλυση ενεργοποίησης με κηλίδα western επίσης να εννοηθεί ότι η ενεργοποίηση και των δύο ΑΚΤ και ΜΑΡΚ αποκαταστάθηκε μερικώς από HRG1 -β1 ακόμη και όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με αναστολείς (Σχήμα 5Β). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων δεν ήταν πολύ εξαρτάται από ErbB3 /c-ΜΕΤ /ΜΑΡΚ σηματοδότηση, αλλά αντίθετα εξαρτάται από ErbB3 /ErbB2 /σηματοδότηση ΑΚΤ. Ωστόσο, η κατάσταση δεν είναι η ίδια σε κύτταρα SW948, στα οποία η βλάβη της βιωσιμότητας των κυττάρων από τον αναστολέα του c-met, U0126, ήταν ισχυρότερη από εκείνη που προκαλείται από LY294002, και η επανορθωτική δράση ήταν διαφορετική από εκείνη στα κύτταρα LoVo όταν κατεργάζεται τόσο με LY294002 και U0126, με την επανορθωτική δράση του HGF είναι ισχυρότερη από HRG1-β1, και την ενεργοποίηση τόσο της ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ που επάγεται περισσότερο έντονα από HGF από HRG1-β1 (Σχήμα 5C, D). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο καρκίνος του παχέος εμφανίζει διακύμανση ογκογόνο RTK λόγω των διαφορετικών μοριακών μορφών έκφρασης που περιλαμβάνει ErbB2 /ErbB3 /ΑΚΤ και ErbB3 /c-ΜΕΤ /ΜΑΡΚ.

Οι διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε LoVo (Α , Β) και SW948 (C, D) κύτταρα μετά από θεραπεία με διαφορετικές αγωνιστές ή αναστολείς, όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, και ** Ρ & lt?. 0.01 με το t τεστ unpaired Student για

Η

Συζήτηση

Η ενεργοποίηση των RTKs είναι κρίσιμη για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών και κακοήθη κύτταρα. Πρόσφατα, διάφορες μεταλλάξεις ενεργοποίησης RTK έχουν ταυτοποιηθεί σε μία υποομάδα ασθενών με καρκίνο με αλληλούχιση επόμενης γενιάς, γεγονός που υποδηλώνει ότι συστατική ενεργοποίηση των RTKs είναι ένας από τους μηχανισμούς υπόβαθρο της ανάπτυξης του καρκίνου. Ωστόσο, το υπόλοιπο του πληθυσμού των ασθενών με καρκίνο έχουν τέτοιες μεταλλάξεις υπονοώντας ότι υπάρχουν εναλλακτικοί μηχανισμοί ενεργοποίησης RTK. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ένα τέτοιων εναλλακτικών μηχανισμών είναι η υπερέκφραση των μελών της οικογένειας RTK c-MET, και ErbB2, ErbB3, στα κύτταρα CRC, καθώς και εκπρόσωπος κυτταρικές σειρές CRC.

C-ΜΕΤ είναι ένα από τα κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTK), τα οποία είναι ευρέως κατανεμημένα στην επιφάνεια των κυττάρων που προέρχονται επιθηλιακών-ενδοθηλιακή. μόνο γνωστός συνδετήρας, αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων του (HGF), εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης [11]. C-ΜΕΤ διμερίζεται και autophosphorylates κατά τη δέσμευση συνδέτη, το οποίο με τη σειρά του δημιουργεί ενεργές θέσεις σύνδεσης για πρωτεΐνες οι οποίες μεσολαβούν σειριακή ενεργοποίηση κατάντη σηματοδότησης περιλαμβανομένων ΜΑΡΚ, ΡΙ3Κ-ΑΚΤ, SRC και STAT. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι ο-ΜΕΤ υπερεκφράζεται σε μια ποικιλία καρκινωμάτων συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, του νεφρού, του παχέος εντέρου, του θυρεοειδούς, του ήπατος, και γαστρικά καρκινώματα [12] – [14]. Είναι καλά γνωστό ότι το c-ΜΕΤ παίζει σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη του καρκίνου μέσω proliferation- και τα αποτελέσματά της αγγειογένεσης προώθηση ασκείται από κατάντη ογκογόνο οδούς, και η μετάσταση αποτέλεσμα προαγωγής η οποία εξαρτάται κυρίως από την παραγωγή μεταλλοπρωτεάσης. Λόγω του ρόλου της στην ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου, ο-ΜΕΤ θεωρείται ότι είναι ένας σημαντικός στόχος στην αντικαρκινική θεραπεία, και μερικά βιολογικά ανταγωνιστές ή μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν c-ΜΕΤ έχουν προκύψει που είναι γνωστά ως ο-ΜΕΤ ΤΚΙ [15] – [ ,,,0],18]. Ορισμένες γαστρικό καρκίνο και NSCLC κυτταρικές σειρές εμφανίζουν εξαιρετική ευαισθησία γ-ΜΕΤ ΤΚΙ, αλλά, κύτταρα /όγκοι που έλαβαν θεραπεία με γ-ΜΕΤ ΤΚΙ τελικά αναπτύσσουν αντίσταση. Αυτή η αντίσταση σε γ-ΜΕΤ ΤΚΙ είναι αποτέλεσμα της υπέρβασης της αναστολής μέσω συνεχών υψηλών ΜΑΡΚ και τη δραστηριότητα PI3K /AKT, και τα μέλη της οικογένειας του EGFR μπορούν να δράσουν ως συμπληρωματικά υποδοχείς για ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση της PI3K /AKT, ενώ ο-ΜΕΤ έχει αποκλειστεί [19] – [22]. Ενώ απόκτηση νέων μεταλλάξεων μπορεί να είναι μία από τις πιθανές εξηγήσεις για αυτή την αντίσταση στην κλινική θεραπεία, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις πολλών RTKs συμπεριλαμβανομένων ErbB2, ErbB3 και c-ΜΕΤ ανακαλύφθηκαν σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλων μορφών καρκίνου [23] – [27]. RTK υπερέκφραση και ενεργοποίηση σήματος dowmstream παρέχει μια εναλλακτική λύση και δωρεάν μηχανισμό. Ωστόσο, η μεταβλητότητα των ογκογόνων επιπέδων έκφρασης RTK μπορούν επίσης υπογραμμίζουν τη σημασία της εξατομικευμένης θεραπείας του καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, δεν έχουμε μόνο επιβεβαιώθηκε η υπερ-έκφραση του c-met, ErbB2 και ErbB3 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου αλλά επίσης αποκάλυψε την παραλλαγή και συμπληρωματικές αυτών των υποδοχέων. Επιπλέον, προσδιορίσαμε

in vitro

μοντέλα κυτταρικής γραμμής με διαφορετικά πρότυπα μοριακά έκφρασης που φανερώνουν διαφορετικές ευαισθησία στην θεραπεία και των δύο ανταγωνιστές και αγωνιστές του ο-ΜΕΤ και σηματοδότηση EGFR.

Το γονίδιο ErbB2 είναι επίσης αναφέρεται συνήθως ως Her-2 /neu, ένας από τους υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα που οδηγεί κυτταρικής σηματοδότησης που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση και την κίνηση [28], [29]. Είναι επίσης ένα καυτό στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων που βασίζονται σε σηματοδότηση. Trastuzumab, ένα από τα σχετικά φάρμακα που στοχεύουν ErbB2, δεσμεύεται με ErbB2 και προκαλεί αποσύνδεση ανεξάρτητη συνδεσμικού ετεροδιμερή HER2-HER3, αναστέλλοντας έτσι κατάντη σηματοδότησης. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η θεραπεία τραστουζουμάμπη μπορεί να επάγει αντίσταση τόσο με ενίσχυση από σηματοδότηση μέσω άλλων υποδοχέων ErbB και με cross-talk με ετερόλογη RTKs [30] – [32]. Όπως αναφέρουμε στην παρούσα μελέτη, ο-ΜΕΤ έχει επίσης βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ErbB2 trastuzumab ανθεκτικά μετά από έκθεση σε trastuzumab. Επιπλέον, μια μηχανιστική μελέτη αποκάλυψε ότι η ενεργοποίηση του c-MET προστατεύει τα κύτταρα από trastuzumab με την κατάργηση της επαγωγής της p27. Αυτό είναι σύμφωνο με το αποτέλεσμα που ελήφθη στη μελέτη μας, που δείχνουν ότι υπάρχουν διαφορετικές μοριακές μορφές στην ανθρώπινη ορθοκολικό καρκίνο. Η ετερογενής έκφραση της ErbB2 και ErbB3 με διάφορους συνδυασμούς των RTK συνεπάγεται δυνητικά διαφορετικά έργα χημειοθεραπεία

Είναι αναμενόμενο ότι ένας αυξανόμενος αριθμός των μοριακών σηματοδότησης φαρμάκων βάσει διαδρομής θα προκύψει, με στόχο την ποικιλία των στόχων.? Ωστόσο, είναι πολύ πιθανό ότι κανένα από αυτά τα φάρμακα μόνο του θα έχει δεσπόζουσα δράση κατά των όγκων. Η συνδυασμένη θεραπεία για τον καρκίνο είναι μια συνεχής και αναπτυσσόμενη έννοια και το σημαντικότερο, την προσωπική ανίχνευση και ανάλυση των προτύπων μοριακής έκφρασης ενός ατόμου είναι απαραίτητη για την πιο αποτελεσματική θεραπεία με λιγότερες παρενέργειες.