Αφηρημένο

Στόχος

Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνηθεί η χρήση μηχανικών εστιασμένος υπέρηχος υψηλής έντασης (Μ-HIFU) ως νεο-επικουρική θεραπεία πριν από την χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου. Ερευνήσαμε επίσης το ρόλο του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) στο Μ-HIFU προκάλεσε αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο όγκου μεταμόσχευση του καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι

RM- 9, ένας προστάτη ποντικού κυτταρική σειρά καρκίνου με ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα STAT3, εμβολιάστηκε υποδόρια σε C57BL /6J ποντικούς. Τα ποντίκια που έφεραν όγκο (με μέγιστη διάμετρο όγκου 5~6 mm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Μ-HIFU ή εικονική έκθεση δύο ημέρες πριν τη χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου. Μετά την ανάκτηση, εάν δεν παρατηρήθηκε υποτροπή του όγκου σε 30 ημέρες, επαναπρόκληση όγκου εκτελέστηκε. Η ανάπτυξη του όγκου ξαναλάβουν, ποσοστό επιβίωσης και κατά του όγκου ανοσοαπόκριση του ζώου αξιολογήθηκαν.

Αποτελέσματα

αριθ επανεμφάνιση του όγκου και μακρινές μεταστάσεις παρατηρήθηκαν στις δύο ομάδες θεραπείας που χρησιμοποιεί M-HIFU + χειρουργική και τη χειρουργική επέμβαση και μόνο. Ωστόσο, σε σύγκριση με μόνη τη χειρουργική επέμβαση, M-HIFU σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση βρέθηκαν να αναστέλλουν σημαντικά την αύξηση ξαναλάβουν όγκων, ρυθμίζουν προς τα κάτω δραστηριότητες ενδονεοπλαστική STAT3, αυξάνουν τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα σε σπλήνες και όγκου λεμφαδένες παροχέτευσης (TDLNs), και τη βελτίωση της η επιβίωση του ξενιστή. Επιπλέον, η M-HIFU σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση βρέθηκε να μειώνει σημαντικά το επίπεδο της ανοσοκαταστολής με ταυτόχρονη αύξηση του αριθμού και των δραστηριοτήτων των δενδριτικών κυττάρων, σε σύγκριση με μόνη τη χειρουργική επέμβαση.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το Μ -HIFU μπορεί να αναστείλει τις δραστηριότητες STAT3, και όταν συνδυάζεται συνεργικά με χειρουργική επέμβαση, μπορεί να παράσχει μια νέα και πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία των καρκίνων του προστάτη

Παράθεση:. Huang Χ, Yuan F, Liang Μ, Lo HW, Shinohara ML , Robertson C, et al. (2012) Μ-HIFU αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων, Καταστέλλει STAT3 Δραστηριότητα και ενισχύει όγκου ειδική ανοσία σε μια μεταμόσχευση όγκου Μοντέλο του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (7): e41632. doi: 10.1371 /journal.pone.0041632

Επιμέλεια: Mitsunobu R. Κάνο, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Ιαπωνία

Ελήφθη: 24, Φεβ, 2012? Αποδεκτές: 22 του Ιούνη 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας μέσω επιχορήγησης #: 5R21CA135221-02 (https://www.nih.gov/), από καρκίνο του προστάτη επιχορήγηση Pre-SPORE από την Duke Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, με επιχορήγηση από το Υπουργείο Άμυνας ( PC100266), με επιχορήγηση από το Ίδρυμα ΑΝΗΣΥΧΙΑ, και με επιχορήγηση από το Ίδρυμα Morris. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες, με περίπου 230.000 περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Μεταξύ των διαφόρων στρατηγικών θεραπείας που χρησιμοποιούνται κλινικά, prostectomy παραμένει η πρώτη θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [2], [3]. Ωστόσο, η χειρουργική επέμβαση δεν είναι κατάλληλο για τη θεραπεία απομακρυσμένων μεταστάσεων και έτσι χρησιμοποιούνται συχνά σε συνεννόηση με ακτινοβολία ή /και χημειοθεραπεία σε ασθενείς με προχωρημένους καρκίνους του προστάτη. Ενώ η ακτινοβολία και η χημειοθεραπεία μετά τη χειρουργική επέμβαση είναι συχνά χρήσιμο, δεν μπορούν να εφαρμοστούν σε όλους τους ασθενείς, ανάλογα με το στάδιο του καρκίνου και την ανοχή του ασθενούς. Επιπλέον, η παρουσία του φραγμού αίματος-προστάτη παρεμποδίζει την απελευθέρωση χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [4]. Το πιο σημαντικό, η χαμηλή εξειδίκευση της ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας στη στόχευση καρκινικών κυττάρων συχνά να οδηγήσουν σε σημαντικές παρενέργειες. Ως εκ τούτου, είναι πολύ επιθυμητό να συνδυάσει την επέμβαση με ένα τοπικά στοχευμένη θεραπεία, όπως εστιασμένος υπέρηχος υψηλής έντασης (HIFU, επίσης γνωστή ως υψηλής έντασης θεραπευτικό υπέρηχο, hitu) η οποία είναι καλά ανεκτή από τους ασθενείς, για την εξάλειψη του πρωτογενούς όγκου ενώ παρέχει το πρόσθετο πλεονέκτημα στην καταστολή της υποτροπής του όγκου και μακρινή μετάσταση.

κατά την τελευταία δεκαετία, HIFU έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη μη επεμβατική μορφή θεραπείας για τοπική καλοήθεις και κακοήθεις συμπαγείς όγκους [5]. Εκτεταμένες ζωικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι HIFU είναι κατάλληλη για θερμική εκτομή του εντοπισμένους όγκους πρώιμου σταδίου και για θεραπεία διάσωσης μετά από προηγούμενη αποτυχία της θεραπείας με ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία [6] – [8]. Με την εστίαση υψηλής έντασης δέσμη υπερήχων σε μια καλά καθορισμένη περιοχή μέσα σε ένα ασθενή, ο συγκλίνων ακουστική ενέργεια μπορεί να απορροφηθεί από τον ιστό του όγκου-στόχου, με αποτέλεσμα μία ταχεία αύξηση της θερμοκρασίας πάνω από 65 ° C μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα, οδηγώντας σε νέκρωση των κυττάρων [9] – [11]. Επιπλέον, όταν HIFU χρησιμοποιείται σε μία παλμική κατάσταση με χαμηλή κύκλο (& lt? 2%) μέσω μιας διαδικασίας γνωστής ως μηχανική HIFU (Μ-HIFU), μπορεί να παράγει μη θερμικές, μηχανικές βλάβες του ιστού του όγκου μέσω ακουστικών σπηλαίωση [ ,,,0],12]. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν HIFU μια εγγενώς μη επεμβατική, μη ιονίζουσα θεραπεία που είναι γενικά καλά ανεκτή από τους ασθενείς. Σε αντίθεση με ακτινοβολία και χημειοθεραπεία, θεραπεία HIFU μπορούν να χορηγηθούν κατ ‘επανάληψη χωρίς αύξηση του κινδύνου συστημικής τοξικότητας [5].

Εκτός θερμικής εκτομής ιστών όγκου, HIFU έχει δειχθεί να ενεργοποιήσει μια κατά του όγκου ανοσοαπόκριση και τα δύο σε ποντικούς που φέρουν νευροβλάστωμα [9] και σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους τελικού σταδίου [13]. Έχει προταθεί ότι HIFU-αποκόπτεται συντρίμμια όγκου και υπολειμματική αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους μπορεί να διεγείρει τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) και επακόλουθη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, οδηγώντας στην ανάπτυξη των αντι-καρκινικών άνοσων αποκρίσεων [14], [15]. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από αρκετές κλινικές μελέτες που δείχνουν αυξημένη κυτταροτοξικότητα των λεμφοκυττάρων, βελτιωμένο ποσοστό επιβίωσης και μειωμένη επανεμφάνιση του όγκου και μακρινή μετάσταση [16].

Σε σύγκριση με τα συμβατικά HIFU που βασίζεται κυρίως στη θερμική εκτομή, έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι M-HIFU μπορεί να επάγει ισχυρότερη απελευθέρωση ενδογενούς σήματα κινδύνου [17], την ενίσχυση των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) δραστηριότητα [12] με μειωμένη μακρινή μετάσταση [18] DC και. Παρά τα ενθαρρυντικά παρατηρήσεις, η συνολική κατά του όγκου ανοσοαπόκριση που προκαλείται από HIFU εξακολουθεί να είναι ανεπαρκής, πιθανόν λόγω της ανοσολογικής ανοχής αναπτύχθηκε κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [19], στο οποίο μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) έχει δειχθεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο [20] – [22]. STAT3 είναι γνωστό ότι ενεργοποιούνται από ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών όπως IL-10, το οποίο με τη σειρά του μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω την έκφραση της IL-10. Επιπλέον, ενεργοποιημένα STAT3 (ρ-STAT3 /Y705) αναστέλλει την έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών όπως IL-12 [23] και διεγείρει την έκφραση του Foxp3, ουσιαστικός παράγοντας μεταγραφής για ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) ανάπτυξη [24] . Αν και STAT3 έχει δειχθεί ότι παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ογκογένεση και στην ανοσολογική ανοχή, ο ρόλος του στην M-HIFU προκάλεσε καταπολέμησης των όγκων αποκρίσεις δεν έχει διερευνηθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη στρατηγική της χρησιμοποίησης M -HIFU ως νεο-επικουρική θεραπεία πριν από τη χειρουργική εκτομή του πρωτοπαθούς όγκου του προστάτη για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις αυτής της νέας θεραπείας συνδυασμού σε όγκο τοπικής υποτροπής και μακρινή μετάσταση. Ειδικότερα, επικεντρώθηκε στο ρόλο της STAT3 στη ρύθμιση HIFU επαγόμενη αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, σε σύγκριση με μόνη τη χειρουργική επέμβαση, ο συνδυασμός της Μ-HIFU και χειρουργική θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την υποτροπή του όγκου, καταστέλλει την ανάπτυξη των όγκων επαναχορήγηση βελτιώνοντας παράλληλα ποσοστό επιβίωσης. Επιπλέον, αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν από τη μειωμένη δραστηριότητα ρ-STAT3 με ταυτόχρονα αυξημένη απόκριση κατά του όγκου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η M-HIFU σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπευτική επιλογή στην αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη.

Αποτελέσματα

M-HIFU αποσυντίθεται RM-9 καρκινικών ιστών, Αναστέλλει ανάπτυξη όγκων, και Βελτιώνει Host επιβίωση

Σχήμα 1Α δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες B-mode υπερηχογράφημα του όγκου RM-9 κατά τη διάρκεια της θεραπείας Μ-HIFU. Το επίκεντρο του μετατροπέα HIFU τονίστηκε από ένα σταυρό σύμβολο. Η θεραπεία Μ-HIFU ξεκίνησε στο κέντρο και προχώρησε με το βήμα 1 mm προς το όριο του όγκου. Ένα περιθώριο ασφαλείας τουλάχιστον 1 mm χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας HIFU να αποφύγετε ζημιές στα παρακείμενα του δέρματος, των μυών και των οστών. Μετά από κάθε έκθεσης, ένα φωτεινό σημείο της hyperechogenicity μπορούσε να παρατηρηθεί (υποδεικνύεται από τα βέλη στα άνω πάνελ), που αντιστοιχεί στην παραγωγή των αδρανειακών φυσαλίδων σπηλαίωσης στον ιστό του όγκου [12]. Επειδή παλμική HIFU με χαμηλό κύκλο λειτουργίας 2% χρησιμοποιήθηκε σε M-HIFU, η προκύπτουσα θερμοκρασία εντός του ιστού του όγκου ήταν μικρότερη από 45 ° C μετά από 20-s έκθεσης. Ως εκ τούτου, η θερμική επίδραση ήταν αμελητέα. Η εξέταση των αποκόπηκε καρκινικών ιστών αποκάλυψε αποσύνθεση του ιστού του όγκου και τον σχηματισμό των κοιλοτήτων που είναι χαρακτηριστικές μηχανική λύση που παράγεται από την αδρανειακή φυσαλίδες στην περιοχή αντιμετωπίζονται HIFU (κάτω δεξιά πλευρά του Σχήματος 1Α).

Α,

Υπερηχογράφημα απεικόνισης καθοδηγείται θεραπεία Μ-HIFU. Οι δραστηριότητες σπηλαίωση που προκαλείται από Μ-HIFU εντός του ιστού του όγκου που φαίνεται σε περιοχές με hyperechogenicity, που υποδεικνύεται από τα βέλη στις εικόνες B-mode (άνω πάνελ) και στα εκτομή όγκων (κάτω πάνελ Αριστερά:. δέρματος στην κορυφή του όγκου ήταν άθικτο μετά τη θεραπεία Μ-HIFU? μεσαία: αφαιρείται όγκου δείχνει ανέπαφη την εξωτερική επιφάνεια μετά τη θεραπεία Μ-HIFU? δεξιά:. διχοτομείται όγκου δείχνει μηχανικές βλάβες στο εσωτερικό περιοχή μετά τη θεραπεία Μ-HIFU

Β

, ανάπτυξη όγκου καμπύλη μετά επαναχορήγησης . 2 χ 10

4 RM 9-κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στην ετερόπλευρη σκέλος οπισθίου 30 ημέρες μετά τη θεραπεία Μ-HIFU όταν οι ποντικοί ανακάμψει πλήρως από χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου. Όγκος των επαναχορήγηση όγκων υπολογίστηκε με βάση την δαγκάνα μετρήσεις του μεγέθους του όγκου σε διαστήματα 3 ημερών, αρχής γενομένης από την ημέρα 7 μετά από επαναπρόκληση όγκου * p & lt?. 0.05, ** p & lt?.. 0.01

C,

Αθροιστική καμπύλη επιβίωσης επαναχορήγησης παρακάτω όγκου ποντίκια φθάνοντας τα τελικά σημεία ευθανασίας ήταν θυσιάστηκαν. Υπήρχαν 10 ποντίκια στην ομάδα χειρουργικής επέμβασης και 12 στην ομάδα χειρουργικής επέμβασης HIFU +. P-τιμή 0.019 προσδιορίστηκε από την δοκιμασία log-rank. Τα δεδομένα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Δύο ημέρες μετά την αγωγή Μ-HIFU, οι πρωτογενείς όγκοι αποκόπηκαν από τα ποντίκια σε αμφότερες τις ομάδες. Αυτή τη φορά καθυστέρηση επιλέχθηκε με βάση προηγούμενη παρατήρηση μας ότι η Μ-HIFU 2 ημέρες πριν από την χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου μπορεί να μειώσει σημαντικά τον κίνδυνο μακρινές μεταστάσεις σε ένα μοντέλο ποντικού μελανώματος [18]. Παρακολούθηση παρατήρησης των επόμενων 30 ημερών δεν έδειξε τοπική υποτροπή του όγκου, πιθανώς ως αποτέλεσμα της αυστηρής και ολοκληρωμένη αφαίρεση των ιστών όγκου από χειρουργική επέμβαση. Προς το παρόν, επαναπρόκληση όγκου διεξήχθη και η ανάπτυξη των όγκων επαναχορήγηση ακολουθήθηκε για άλλες 30 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, υπάρχει σαφής διαχωρισμός των καμπυλών ανάπτυξης με τις επαναπροκλήθηκε όγκοι στην χειρουργική ομάδα M-HIFU + σημαντικά μικρότερες από τις στην ομάδα χειρουργικής επέμβασης. Σημαντικές διαφορές στον όγκο του όγκου μεταξύ των δύο ομάδων παρατηρήθηκε ξεκινώντας από την ημέρα 10 έως το τέλος του επόμενου επάνω περιόδου.

Μετά επαναχορήγηση του φαρμάκου, κανένα ζώο δεν πέθανε. Τα ποντίκια με όγκους ξαναδοθεί θυσιάστηκαν μόνο όταν φτάσει τελικά σημεία ευθανασίας για την ανάπτυξη του όγκου. Ιστοί πνεύμονα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο ανατομής, αλλά δεν παρατηρήθηκε μεταστατικό οζίδιο. Όταν η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε, RM-9 οζίδια όγκου βρέθηκαν να είναι καλά περιβάλλεται από μία κάψουλα συνδετικού ιστού, υποδεικνύοντας μια πιθανή αιτία για την απουσία μακρινές μεταστάσεις. Η σωρευτική επιβίωση στην M-HIFU + ομάδα χειρουργείο βρέθηκε να είναι στατιστικώς υψηλότερη από ότι στην ομάδα χειρουργικής (Σχήμα 1 C), υποδεικνύοντας μια πιθανή καταστολής όγκων επίδραση του Μ-HIFU σε συνδυασμό με χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου.

Καρκίνος του προστάτη RM-9 κύτταρα Συστατικώς Express p-STAT3, που μπορεί να μειωθεί με την M-HIFU Θεραπεία

φωσφο-STAT3 (Y705), η ενεργοποιημένη μορφή της STAT3, παίζει καθοριστικό ρόλο στην πρόκληση ανοσολογική επιτήρηση, την ανάπτυξη όγκου και μετάσταση όγκου [20], [22], [25]. Ως εκ τούτου, την αναστολή ή την κατεδάφιση ενεργή STAT3 είναι ενδιαφέρον τόσο για την άμεση θεραπεία αντι-όγκου και ειδικά όγκου ανοσοθεραπεία. Πριν αποσαφήνιση του ρόλου του M-HIFU στην ενεργοποίηση STAT3, εξετάσαμε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές για δραστικότητα STAT3 και βρήκαν ότι ένα υψηλό επίπεδο ρ-STAT3 εκφράστηκε σε RM-9 κύτταρα. Όπως φαίνεται από IF χρώση και μικροσκοπία φθορισμού (Σχήμα 2Α), σχεδόν όλα τα κύτταρα RM-9 χρωματίστηκαν θετικά για ρ-STAT3, όπως υποδεικνύεται από τα ροζ συγχωνευθείσα σήματα (βέλη). Αυτό το

in vitro

παρατήρηση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω

in vivo

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, εξετάσαμε RM-9 όγκους που συγκομίζονται σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία (10-, 15-, και 20-ημερών) μετά τον εμβολιασμό για ρ-STAT3 χρησιμοποιώντας IHC και τα αποτελέσματα δείχνουν συστατική ενεργοποίηση STAT3 σε RM-9 όγκους κατά τη διάρκεια των 20 ημερών της ανάπτυξης του όγκου. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν επίσης ότι το RM-9 κύτταρα και οι όγκοι είναι ιδανικά για την εξέταση των επιπτώσεων της M-HIFU σχετικά με τη δραστηριότητα STAT3.

Α,

έκφραση της p-STAT3 στο RM-9 κύτταρα. RM-9 κύτταρα υποβλήθηκαν σε χρώση IF για ρ-STAT3 και χρώση ϋΑΡΙ για πυρήνες. Σύμφωνα με μικροσκοπία φθορισμού, π-STAT3 σημαδεύτηκε από κόκκινο φθορισμό, ενώ οι πυρήνες σημάνθηκαν με μπλε σήματα. Οι p-STAT3 θετικά πυρήνες που υποδεικνύεται από συγχωνευθείσας ροζ σήματα. Στερεά βέλη δείχνουν προς αντιπρόσωπο π-STAT3-θετικών πυρήνων ενώ το διακεκομμένο βέλος σηματοδοτεί μια p-STAT3-αρνητικό πυρήνα.

B,

πρότυπο έκφρασης του ρ-STAT3

in vivo.

RM-9 όγκοι αφαιρέθηκαν σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία ανάπτυξη όπως υποδεικνύεται και υποβάλλεται σε χρώση IHC για ρ-STAT3. Μετά αντιχρωματίζεται με αιματοξυλίνη, π-STAT3 θετικά πυρήνες που υποδεικνύεται από σκούρο καφέ σήματα (βέλη), ενώ π-STAT3 αρνητικά πυρήνες ήταν σε μπλε χρώμα.

C,

Μειωμένα επίπεδα p-STAT3 στο RM-9 όγκους μετά από αγωγή Μ-HIFU. Δύο ημέρες μετά την αγωγή Μ-HIFU, RM-9 όγκοι αφαιρέθηκαν και υποβλήθηκαν σε χρώση IHC για ρ-STAT3. Τρεις όγκοι σε κάθε ομάδα αναλύθηκαν και τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία εμφανίζονται. Η IHC ήταν ανεξάρτητα εκτελείται τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Ο μαθητής του

t-test

διεξήχθη για να προσδιοριστεί π-αξίες. * P & lt? 0,05.

D,

Έκφραση κάτω ρύθμιση τριών STAT3 γονιδίων κατάντη στόχου με την κατεργασία M-HIFU. Δύο ημέρες μετά την αγωγή Μ-HIFU, RM-9 όγκους απομακρύνθηκε και mRNA απομονώθηκε. RT-PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για να ανιχνεύσει επίπεδα της κυκλίνης D1, Bcl-xL, IL-10 και β-ακτίνης. σήματα Band ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΙΗ ImageJ. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της M-HIFU στην ενεργοποίηση STAT3 χρησιμοποιώντας RM-9 ποντικών που φέρουν όγκο. Δύο ημέρες μετά την αγωγή Μ-HIFU, RM-9 όγκοι αφαιρέθηκαν από τους ποντικούς και υποβλήθηκαν σε ρ-STAT3 IHC (n = 3 ανά ομάδα). Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 2C, ρ-STAT3 επίπεδο μειώθηκε σημαντικά κατά 1,8-φορές ακόλουθα M-HIFU, υποδεικνύοντας ότι η χορήγηση του M-HIFU μπορεί να αναστείλει αποτελεσματικά την ενεργοποίηση STAT3 σε RM-9 όγκους. Επιπλέον, συνεπής με την παρατηρούμενη μείωση του ρ-STAT3 από την M-HIFU, τα επίπεδα έκφρασης των τριών γονιδίων στόχων STAT3 ήταν σημαντικά μειωμένες από την M-HIFU, καθώς, όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της RT-PCR στο σχήμα 2D. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να ανιχνευθεί σε RM-9 καρκινικά κύτταρα του προστάτη

in vitro

και

in vivo,

και ότι η Μ-HIFU μειώνει τα επίπεδα της ενεργοποίησης STAT3 και STAT3- στοχευόμενων γονιδίων σε RM-9 όγκων.

Μ-HIFU Ενισχύει όγκου-ειδική κυτταροτοξικότητα

Για να διερευνηθεί κατά πόσο Μ-HIFU αποτελέσματα της θεραπείας στην αύξηση των αποκρίσεων CTL [26], αναλύσαμε μεταβολή η συχνότητα του CD8

+ Τ κύτταρα και ΙΡΝ-γ παραγωγή τους, τόσο στην ομάδα χειρουργική M-HIFU + και στην ομάδα της μονοθεραπείας χειρουργική επέμβαση. Βρήκαμε ότι 2 ημέρες μετά την χειρουργική επέμβαση του αριθμού των CD8

+ Τ κυττάρων αυξήθηκε στην ομάδα χειρουργική M-HIFU + (Σχήμα 3Α και Β), σε σύγκριση με την ομάδα που είχε μόνη χειρουργική επέμβαση. Ογκοειδικό παραγωγή ΙΡΝ-γ στους ξενιστές που φέρουν όγκο περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία ELISPOT. Σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν 12 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση από τρεις ποντικούς ανά ομάδα, και τα δείγματα συνενώθηκαν και συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα είτε άσχετο EL-4 όγκου RM-9 ή (σπληνοκύτταρα έναντι των κυττάρων του όγκου σε 10:01 αναλογία), στη συνέχεια αναλύονται για να προσδιορισμό της παραγωγής IFN-γ. θεραπεία M-HIFU αυξήθηκε σημαντικά ΙΡΝ-γ παραγωγή CTL έως 4 φορές του μη HIFU ελέγχου (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3C, D). Αυτή η αυξημένη απόκριση δεν παρατηρήθηκε σε EL-4 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η παραγωγή ΙΡΝ-γ ήταν RM-9 όγκου ειδικό από τον ξενιστή που φέρει όγκο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με Μ-HIFU μπορεί να προάγει την παραγωγή της ΙΡΝ-γ παραγωγή CTL, ένας από τους πιο κρίσιμους παράγοντες στην ανοσία κατά του όγκου.

Α,

2 ημέρες μετά την αγωγή, οι σπλήνες από τρεις ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με ή χωρίς Μ-HIFU συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν. Αναλογία σπληνός CD8

+ Τ κυττάρων προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται.

Β,

στατιστική σημασία της αύξησης των CD8

+ κυτταρικό πληθυσμό συνδυάζοντας HIFU με χειρουργική επέμβαση. * Ρ & lt? 0,05

C

, δώδεκα ημέρες μετά την επέμβαση ή Μ-HIFU συν θεραπεία χειρουργική επέμβαση, τρία ποντίκια από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν και οι σπλήνες τους συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν. δοκιμασία ΙΡΝ-γ ELISpot πραγματοποιήθηκε με τα συγκεντρωτικά σπληνοκύτταρα. Μιτομυκίνη-C αγωγή RM-9 κύτταρα προστέθηκαν ως διεγέρτες σε αναλογία 1:10 (RM9: σπληνοκύτταρα). EL-4 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα άσχετο έλεγχο κύτταρο. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται.

D

, Καταμέτρηση των κυττάρων IFN-γ-θετικά και, και στατιστική ανάλυση με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης ELISpot. *** P & lt?. 0.0001

Η

M-HIFU θεραπεία αυξάνει ο πληθυσμός των CTLs και ΑΧ στις σπλήνες και TDLNs

ΑΧ είναι οι μόνοι επαγγελματίες κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου ότι μπορεί προνομιακή αφελής Τ κύτταρα, και παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην παραγωγή του όγκου-ειδικά CTLs. DCs μπορούν να προσδιοριστούν με την έκφραση του CD11c ως δείκτη κυτταρικής επιφάνειας. Από ρ-STAT3 είναι μια περιστροφική καταστολέας της ενεργοποίησης DC [27], [28], αξιολογήσαμε τη συχνότητα των CD11c

+ κυτταρικό πληθυσμό σε σπλήνες και TDLNs 6 ημερών μετά τη θεραπεία Μ-HIFU σε ποντίκια που φέρουν όγκους RM-9 μεταμοσχευθούν . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α έως 4D, αναλογίες CD11c

+ κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σπλήνες και TDLNs με περισσότερο από 3-φορές και 1,2-φορές της ομάδας ελέγχου χωρίς θεραπεία HIFU, αντίστοιχα (και στις δύο περιπτώσεις, ρ & lt? 0.001 ). Αξιολογήσαμε επίσης το ποσοστό των CD11c

+ κυττάρων στο χρονικό σημείο της 2 ημέρες μετά τη θεραπεία Μ-HIFU, αλλά φάνηκε να είναι πολύ νωρίς για να παρατηρηθεί μια αύξηση του πληθυσμού DC (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Επιπλέον, η θεραπεία Μ-HIFU ενίσχυσε την έκφραση του συν-διεγερτικού μορίου, CD80 και CD86, επί DCs (Σχήμα 4Ε και 4F). Συλλογικά, θεραπεία M-HIFU εμφανίζεται να ενισχύει την πρόσληψη ή /και επέκταση των DCs, εκτός από την ωρίμανση των DC.

Τρία ποντίκια από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν έξι ημέρες μετά την χειρουργική επέμβαση ή HIFU συν θεραπεία χειρουργική επέμβαση. εναιώρημα ξεχωριστών κυττάρων παρασκευάζονται από τις σπλήνες ομαδοποιήθηκαν ή TDLNs? και CD11c

+ πληθυσμό κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται.

Μια

,

C

, Εκπρόσωπος σχέδια ροής στην ανίχνευση CD11c

+ κυττάρων στη σπλήνα (

Α

) και TDLNs (

C

).

Β

,

D

, Στατιστική σημαντικότητα στην αύξηση του πληθυσμού DC στο σπλήνα (

Β

) και TDLNs (

D

) με βάση την τα αποτελέσματα των

Μια

και

C,

αντίστοιχα.

E

,

F

, την αξιολόγηση της συνεχούς διέγερσης από την ανίχνευση CD80-θετικό (

E

) και CD86-θετικό (

F

) CD11c

+ κύτταρα στη σπλήνα και TDLNs. * P & lt? 0,05, *** p & lt?. 0.0001

Η

M-HIFU Βελτιωμένη απόκριση αντι-όγκου είναι, στο μέρος, που προκαλείται από την καταστολή των Treg κυττάρων Γενιάς

STAT3 επίσης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ενίσχυση της ανάπτυξης των CD4

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) [24]. Tregs αναστέλλουν ανοσοαποκρίσεις και έχουν ενοχοποιηθεί στην πρόκληση ανοχής στην ανοσία κατά του όγκου. Εδώ, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η θεραπεία Μ-HIFU καταστέλλει την παραγωγή ή την επέκταση των Tregs σε ποντίκια με όγκο μεταμοσχευθούν. Σπληνοκύτταρα και TDLNs κύτταρα συλλέχθηκαν 6 ημέρες μετά την αγωγή Μ-HIFU όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για την αξιολόγηση της συχνότητας των Tregs. Το αποτέλεσμα φαίνεται στο Σχήμα 5 απεκάλυψε ότι η αγωγή Μ-HIFU προκάλεσε σημαντική μείωση του πληθυσμού Treg κατά περίπου 50% σε σπλήνα (ρ & lt? 0.001), και περίπου 10% σε TDLNs (ρ & lt? 0.001). Παρόμοια με την παρατήρηση από ΑΧ, αλλαγές στον πληθυσμό Treg δεν ήταν σημαντικά 2 ημέρες μετά τη θεραπεία M-HIFU (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, εκτός από την επέκταση του πληθυσμού DC και αυξάνοντας την ωρίμανση DC, κατεργασία M-HIFU μειωμένο μέγεθος του πληθυσμού των Tregs, τα οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την ανάπτυξη της ανοσίας κατά των όγκων.

Single κύτταρο εναιώρημα παρασκευάσθηκε από τα συγκεντρωτικά σπλήνες ή TDLNs. Πληθυσμό των CD4

+ Foxp3

+ κυττάρων στη συνέχεια προσδιορίζεται ως Treg με κυτταρομετρία ροής. Στοιχεία έδειξαν οι εκπρόσωποι από τρεις ανεξάρτητες χρώση και την επακόλουθη ανάλυση ροής.

Μια

,

C

, Εκπρόσωπος σχέδια ροής στην ανίχνευση Tregs στο σπλήνα (

Α

) και TDLNs (

C

).

Β

,

D

, το ποσοστό του πληθυσμού Treg στον σπλήνα (

Β

) και TDLN (

D

) με βάση τα αποτελέσματα φαίνεται στο

Μια

και

C

, αντίστοιχα. ** P & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.0001

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη για να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους το Μ-HIFU προκαλεί αντι- επιπτώσεις του όγκου και να διερευνήσουν στρατηγικές για τη βέλτιστη χρήση του Μ-HIFU στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Ο μακροπρόθεσμος στόχος μας είναι να καθιερώσουμε λογικές για τη χρήση του Μ-HIFU θεραπείας συνδυασμού ως μια βελτιωμένη μορφή θεραπείας για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η Μ-HIFU μπορεί να αναστείλει την ενεργοποίηση STAT3, η οποία οδηγεί σε μία απόκριση κατά του όγκου μέσω δύο πιθανούς μηχανισμούς. Πρώτον, η μείωση του ρ-STAT3 στους όγκους αναστέλλει άμεσα την ανάπτυξη του όγκου. Δεύτερον, μια μείωση της δραστηριότητας STAT3 οδηγεί σε αυξημένο αριθμό CTLs ογκο-ειδικά και DCs, καθώς και μια μείωση του αριθμού των Treg, και στη συνέχεια ένα εξάρτημα της αντικαρκινικής ανοσίας.

Συστατική ενεργοποίηση STAT3 παρατηρείται συχνά σε πολλούς ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του καρκίνου του μαστού, καρκίνο κεφαλής και λαιμού, γλοιώματος και του καρκίνου του προστάτη [20], [22], [25]. Είναι καλά γνωστό ότι επίμονα ενεργοποιημένο STAT3 ως βασικός ρυθμιστής της μοριακής και βιολογικών γεγονότων που προάγουν την καρκινογένεση [29]. Η ανώμαλη δραστηριότητα STAT3 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην απορρυθμισμένη ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, καθώς και στην προώθηση της αγγειογένεσης. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα STAT3 προάγει εισβολή και μετάσταση, συμβάλλοντας έτσι στην εξέλιξη του όγκου [20], [22], [30]. Κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, η δραστηριότητα της STAT3 είναι επίσης αυξημένη σε σχετίζονται με όγκους λεμφοκύτταρα [31], [32]. Η αναστολή STAT3 είτε καρκινικά κύτταρα ή μυελοειδή κύτταρα όγκου-διηθητικά εκμαιεύει Th1 αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις, η ταυτόχρονη με την αύξηση του αριθμού των CTLs και μειωμένη Tregs [33]. Έτσι, καταστέλλοντας την ενεργοποίηση της STAT3 με φυσικές (

δηλαδή,

HIFU) ή φαρμακολογικές προσεγγίσεις παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον τόσο για την άμεση θεραπεία αντι-όγκου και ειδικά όγκου ανοσοθεραπεία.

Με βάση την προαναφερθείσα κατανόηση περίπου STAT3, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση της M-HIFU στην ενεργοποίηση STAT3 σε

in vivo

μοντέλο μεταμόσχευσης του καρκίνου του προστάτη. Πράγματι, το επίπεδο της ενδοογκική ρ-STAT3 μειώθηκε ουσιαστικά με την κατεργασία του M-HIFU. Σε μια προηγούμενη μελέτη του μοντέλου μεταμόσχευσης Β16 μελανώματος, ρ-STAT3 επίπεδο ήταν επίσης βρέθηκε να είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται από κατεργασία M-HIFU [34], υποδηλώνοντας τις επιδράσεις της M-HIFU στην ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να είναι κοινή μεταξύ των διαφορετικών όγκων.

Η λειτουργική ρύθμιση προς τα κάτω του ρ-STAT3 περαιτέρω επαληθεύεται από την μειωμένη έκφραση των κατάντη γονιδίων στόχων του. Η κυκλίνη D1, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω από την ενεργοποιημένη STAT3, είναι ένας ρυθμιστής αλλοστερικό εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών 4 και 6 (CDK4 /6) και προωθεί την G1 /S μετάβαση μέσω της CDK4 /6 μεσολάβηση φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση της πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος [ ,,,0],32], [35]. Την αναστολή της έκφρασης της κυκλίνης D1 θα επιβραδύνουν τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1 από την είσοδο στην S φάση, και ως εκ τούτου, να μειώσει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [36] – [40]. Bcl-xL, επίσης ένα σημαντικό γονίδιο στόχος STAT3, είναι ένα αντι-αποπτωτικό μόριο της οικογένειας Bcl-2 και ενισχύει την εξέλιξη του όγκου [32], [41], [42]. Bcl-xL υπερέκφραση απαντάται συχνά και σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [43], [44]. Η εξάντληση της κυρίαρχη έκφραση Bcl-xL μειώνει σημαντικά την βιωσιμότητα των κυττάρων όγκου μετά από αποπτωτικά ερεθίσματα [45]. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα μας από RT-PCR έδειξε σαφώς ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του ρ-STAT3 συνοδεύτηκε από τη μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 και Bcl-xL στον ιστό του όγκου μετά από αγωγή Μ-HIFU. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Μ-HIFU είναι ικανό να αναστέλλει την ανώμαλη δραστικότητα STAT3 και ως εκ τούτου μπορούν να προκαλέσουν αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, καθώς και υποχώρηση του καρκίνου του προστάτη

in vivo

.

Εκτός από την ενδοογκική ογκογόνο ρόλο, π-STAT3 εμπλέκεται σε ανοσοκαταστολή μέσω παρεμβολής διέγερση DC αναστέλλοντας την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών που διεγείρουν DC [28]. Εναλλακτικά, ρ-STAT3 προωθεί τα καρκινικά κύτταρα για να παράγουν πολλαπλούς ογκογόνους κυτοκίνες, όπως IL-10, το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί σηματοδότηση STAT3 μέσω μιας θετικής ανάδρασης και αναστέλλει λειτουργική διέγερση DC [28], [32], [33]. DC διέγερση είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική παρουσίαση και την ανάπτυξη των αντι-καρκινικών ανοσοαπόκριση από τα Τ κύτταρα αντιγόνο. προηγούμενες μελέτες μας με τη χρήση του μοντέλο όγκου MC38 έχουν δείξει ότι η HIFU δημιουργείται μηχανική βλάβη των κυττάρων του όγκου μπορεί να οδηγήσει σε DC διέγερση [17], και στη συνέχεια αυξήθηκε δραστηριότητες CTL [12]. Σε αυτή τη μελέτη, επαληθεύεται περαιτέρω ότι η Μ-HIFU μπορεί να ενισχύσει τη λειτουργία του DCs

in vivo

, όπως αποδεικνύεται από τη σημαντική αύξηση του πληθυσμού των DCs με ταυτοχρόνως ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση του συν-διεγερτικών μορίων, όπως CD80 και CD86.

Μια άλλη ανοσοκατασταλτική λειτουργία του ρ-STAT3 σχετίζεται με το ρόλο της στην ενίσχυση της δημιουργίας Tregs, τα οποία καταστέλλουν ανοσολογικές αποκρίσεις σε αυτο-αντιγόνο σχετιζόμενο με όγκο, συμπεριλαμβανομένων αντιγόνου. STAT3 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο ενορχηστρώνοντας πολλαπλές κρίσιμες πτυχές της λειτουργίας των Τ κυττάρων στη φλεγμονή και την ομοιόσταση. Ειδικότερα, η έκφραση του Foxp3, η οποία είναι απαραίτητη για τις ρυθμιστικές λειτουργίες του Treg, εξαρτάται από την ενεργοποίηση STAT3 [24]. Η αναστολή της δραστικότητας STAT3 μειώνει μετατροπή του Foxp3-αρνητικών Τ κύτταρα να σχετίζονται με όγκους και αυξάνει Tregs CD8

+ διείσδυση Τ κυττάρων σε καρκινικά – μια στρατηγική που έχει χρησιμοποιηθεί για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου πρωτογενούς [46]. Ομοίως, στη μελέτη μας, η θεραπεία M-HIFU βρέθηκε να μειώνει σημαντικά το ποσοστό των Treg τόσο σπλήνα και TDLNs, ταυτόχρονα με την καταστολή της δραστηριότητας STAT3 σε αυτούς τους ιστούς. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το Μ-HIFU μπορεί να μειώσει Treg-προκάλεσε ανοσολογικής ανοχής σε RM-9 μοντέλο.

Εν ολίγοις, έχουμε αποκαλύψει έναν ειδικό μηχανισμό για την M-HIFU που προκαλείται από αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση, η οποία διαμεσολαβείται μέσω της αναστολής της ενεργοποίησης STAT3

in vivo

. Περαιτέρω, έχουμε βρει ότι η Μ-HIFU πραγματοποιείται σε κατάλληλο χρόνο (δηλαδή, 2 ημέρες για RM-9 μοντέλο) πριν από την χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς όγκου μπορεί να ενισχύσει την προστασία του ξενιστή έναντι επανεμφάνιση του όγκου, και ως εκ τούτου μπορεί να αυξήσει την επιβίωση των ασθενείς από την κακοήθεια του καρκίνου του προστάτη. Αν και σε αυτή τη μελέτη εστιάσαμε στον μηχανισμό που σχετίζεται με STAT3, συμμετοχή άλλων μηχανισμών για M-HIFU προκαλούμενη ανοσία κατά του όγκου είναι επίσης δυνατή, και θα διερευνηθεί στο μέλλον. Συνολικά, έχουμε αποδείξει ότι η Μ-HIFU είναι μια πολλά υποσχόμενη νεο-επικουρική θεραπεία που μπορεί να συνδυαστεί με χειρουργική επέμβαση συνεργικά για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Μοντέλο Ζώων

C57BL /6J ποντίκια, ηλικίας 6~8 εβδομάδων, αγοράστηκαν από το Εργαστήριο Jackson (Bar Harbor, ΜΕ, USA) και στεγάζεται στο Duke Ιχθυοτροφείο πριν και μετά την αγωγή Μ-HIFU και /ή χειρουργική επέμβαση. Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με την καθιερωμένη πολιτική φροντίδα των ζώων και όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο Duke φροντίδας ζώων & amp? Χρήση Επιτροπή.

κυτταρική γραμμή και Cell Culture

ποντικού καρκίνου του προστάτη κυτταρική σειρά RM-9, που ιδρύθηκε από τον Δρ Thompson στο Baylor College of Medicine, ήταν ένα δώρο από τον Dr. Mouraviev. EL4 κυτταρική γραμμή λεμφώματος ποντικού αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο Eagle Medium πλήρης Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 mM L-γλουταμίνη, 50 IU /mL πενικιλλίνη και 50 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C με 5% CO

2.

Αντισώματα, Kits και τα χημικά αντιδραστήρια

Η ακόλουθη kit και τα αντισώματα αγοράστηκαν από eBiosciences (San Diego, CA, USA): ποντίκι ρυθμιστικών Τ κυττάρων Χρώση Set (FJK-16 s), ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού CD8 και αντι-ποντικού CD16 /32 αντίσωμα. APC-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού CD11c, συζευγμένο με FITC αντι-ποντικού CD80, και ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD86 ήταν από BD Bioscience (San Jose, CA, USA). φωσφο-STAT3 (Y705) αντίσωμα αντι-ποντικού κουνελιού αγοράστηκε από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA). Mouse Ιντερφερόνη-γ kit ELISpot ήταν από Mabtech Inc (Cincinnati, ΟΗ, USA). αντίσωμα αντι-κουνελιού Texas Red-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αγοράστηκε από Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, USA). Τοποθέτηση μέσου λύση με ή χωρίς DAPI, λύση κλείδωμα, Vectastain Elite ABC Kit (Rabbit IgG) και κιτ AEC ήταν από Vector Lab. SV συνολικό σύστημα απομόνωσης RNA αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI, USA). ένζυμα σύνθεση του DNA ήταν από την Invitrogen εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Όγκου Μοντέλο, HIFU θεραπεία, χειρουργική εκτομή, και μετεγχειρητική φροντίδα και Μετρήσεων

RM-9 μοντέλο όγκου ιδρύθηκε από υποδόρια ένεση 8 × 10

4 RM-9 κυττάρων εντός του δεξιού οπισθίου σκέλους του C57BL /6J ποντικούς. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για περίπου 7 ημέρες έως ότου έφθασαν 5~6 mm σε διάμετρο.