Αφηρημένο

Ο αποκλεισμός του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) δραστηριότητα υπήρξε πρωταρχικός θεραπευτικός στόχος για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Καθώς οι ασθενείς με EGFR φυσικού τύπου έδειξαν μόνο μέτριο όφελος από αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (ΤΚΙδ), υπάρχει μία ανάγκη για επιπλέον θεραπευτικές προσεγγίσεις σε ασθενείς με EGFR φυσικού τύπου. Ως βασική συνιστώσα της κατάντη σηματοδότησης ιντεγκρίνης και γνωστό υποδοχέα cross-talk με EGFR, υποθέσαμε ότι η στόχευση κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) δραστηριότητα, η οποία έχει επίσης αποδειχθεί ότι συσχετίζονται με την επιθετική στάδιο NSCLC, θα οδηγήσει σε αυξημένη δραστηριότητα του EGFR TKIs . Ως εκ τούτου, EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικών κυττάρων NSCLC (Α549, Η1299, H1975) υποβλήθηκαν σε αγωγή με την erlotinib EGFR ΤΚΙ και αναστολείς ΡΑΚ (PF-573 228 ή PF-562 271) τόσο ως μεμονωμένοι παράγοντες και σε συνδυασμό. Έχουμε καθορίζεται βιωσιμότητα των κυττάρων, την απόπτωση και 3-διαστάσεων της ανάπτυξης

in vitro

και αξιολογείται η ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Θεραπεία της EGFR ΤΚΙ ανθεκτικών NSCLC κυττάρων με αναστολέα ΡΑΚ μόνος ανέστειλαν αποτελεσματικά την βιωσιμότητα των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν? Ωστόσο, η χρήση του σε συνδυασμό με την erlotinib EGFR ΤΚΙ ήταν πιο αποτελεσματικό στη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων από είτε μόνη θεραπεία όταν δοκιμάστηκε τόσο σε 2- και 3-διαστάσεων δοκιμασίες

in vitro

, με αυξημένη όφελος παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549. Αυτή η αυξημένη αποτελεσματικότητα μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην παρατηρούμενη αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt όταν τα φάρμακα χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό, όπου και πάλι Α549 κύτταρα έδειξαν την πλέον αναστολή μετά από αγωγή με το συνδυασμό των φαρμάκων. Συνδυάζοντας erlotinib με αναστολέα ΡΑΚ ήταν επίσης ισχυρός

in vivo

όπως αποδεικνύεται από την μειωμένη ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος Α549 ποντικού. Διαπιστώσαμε, επίσης, ότι η αυξημένη ευαισθησία ήταν ανεξάρτητα από το καθεστώς LKB1 μεταλλάξεων. Συνοπτικά, έχουμε αποδείξει την αποτελεσματικότητα του συνδυασμού αναστολέων erlotinib και FAK για χρήση σε γνωστές EGFR φυσικού τύπου, ανθεκτικά κύτταρα EGFR ΤΚΙ, με τη δυνατότητα ότι ένα υποσύνολο τύπων κυττάρων, η οποία περιλαμβάνει Α549, θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε αυτή τη θεραπεία συνδυασμού. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω αξιολόγηση αυτής της θεραπείας συνδυασμού είναι δικαιολογημένη και θα μπορούσε να αποδειχθεί μια αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς με εγγενή EGFR ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLC

Παράθεση:. Howe GA, Xiao Β, Zhao Η Αλ-Zahrani KN, Χασίμ MS, Villeneuve J, et al. (2016) Αναστολείς κινάσης εστιακής συγκόλλησης σε Συνδυασμό με erlotinib καταδεικνύουν αυξημένη αντι-όγκου δραστηριότητα σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10.1371 /journal.pone.0150567

Συντάκτης: Jeremy J.W. Chen, Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Επιστημών, Ταϊβάν

Ελήφθη: 28 Σεπτεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 14 του Φλεβάρη 2016? Δημοσιεύθηκε: 10, Μαρτίου, 2016

Copyright: © 2016 Howe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση για να CLA από τον πνεύμονα Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο (https://www.lungcancerresearchfoundation.org). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή ή την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία αυτού του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες: DMSO, διμεθυλοσουλφοξείδιο? ECM, εξωκυτταρική μήτρα? EGFR, υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα? ΡΑΚ, κινάση εστιακής προσκόλλησης? LKB1, κινάση ήπατος Β1? NSCLC, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα? PBS, αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό? PF-228, PF-573228? PF-271, PF-562271? ΤΚΙ, αναστολέας της τυροσινικής κινάσης

Εισαγωγή

καρκίνους του πνεύμονα ευθύνονται για περισσότερους θανάτους σε όλο τον κόσμο από κάθε άλλο είδος καρκίνου [1] με ~ 80% των καρκίνων του πνεύμονα που έχουν ταξινομηθεί ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [2]. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε περισσότερο από 80% των NSCLCs, ως εκ τούτου, EGFR έχει ένα πρωταρχικό θεραπευτικό στόχο για NSCLC [3,4]. Για το σκοπό αυτό, έχουν παράγοντες έχουν σχεδιαστεί για τη στόχευση τόσο την εξωκυτταρική περιοχή και ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης του EGFR. Αναστολείς στόχευση της περιοχής της κινάσης του EGFR, όπως erlotinib και gefitinib, έχουν δείξει υπόσχεση σε ασθενείς με ενεργοποίηση μεταλλάξεων (δηλαδή στα εξόνια 18, 19 ή 21) σε EGFR [5-8], αν και αυτοί οι αναστολείς έχουν επιδείξει μόνο μέτρια οφέλη για τους ασθενείς υπόθαλψη EGFR άγριου τύπου [9,10]. Επιπλέον, δευτεροβάθμια μεταλλάξεις στο EGFR ή ενίσχυση γ-ΜΕΤ μπορεί να αναπτύξει, προσδίδει αντοχή στο παρελθόν ευαίσθητους ασθενείς [11]. Καθώς η συχνότητα εμφάνισης του EGFR ενεργοποίηση μεταλλάξεων είναι σχετικά χαμηλή στην πλειονότητα της Βόρειας Αμερικής και της Ευρώπης πληθυσμοί [12-15], είναι αναγκαίο να ενισχυθεί η ευαισθησία σε αναστολείς κινάσης τυροσίνης EGFR (ΤΚΙδ) για ασθενείς με EGFR φυσικού τύπου.

κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) είναι μία κινάση τυροσίνης μη-υποδοχέα που εντοπίζεται σε θέσεις προσκόλλησης κυττάρου στην εξωκυτταρική μήτρα (ECM) και μεσολαβεί εκδηλώσεις κατάντη της ιντεγκρίνης εμπλοκής του ECM σηματοδότησης. FAK είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση [16]. έκφραση ΡΑΚ έχει επίσης δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου καρκίνου του πνεύμονα [17], τοποθετώντας έτσι FAK ως ένα σημαντικό στόχο για ρύθμιση στη θεραπεία του καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, οι αναστολείς ΡΑΚ έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένου φαρμακολογική αναστολέων της δράσης κινάσης τυροσίνης ΡΑΚ [18,19]. Αναστολή της ΡΑΚ έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών σημαντική για την ανάπτυξη του όγκου και της εξέλιξης της νόσου, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης και της μετάστασης [20-22]. Επιπροσθέτως, οι αναστολείς ΡΑΚ έχουν αποδειχθεί ότι αναστέλλουν αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου σε έναν αριθμό υποδόριου ξενομοσχεύματος μοντέλων [23,24] δείχνει υπόσχεση σαν απλούς παράγοντες καθώς και σε συνδυασμό με άλλους αναστολείς [24-26].

NSCLC, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του FAK παρατηρήθηκε σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό πνεύμονα, και αυτή η αυξημένη έκφραση συσχετίζεται με υψηλότερα στάδια της νόσου [27]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν έναν σημαντικό ρόλο για FAK στην εξέλιξη της NSCLC. Πρόσφατη απόδειξη έχει επίσης ενοχοποιηθεί β1 ιντεγκρίνης έκφραση σε αντίσταση στο gefitinib EGFR ΤΚΙ, με αυξημένη ευαισθησία gefitinib να δει εξής β1 ιντεγκρίνης εξάντληση σε κύτταρα NSCLC [28]. Δεδομένου ότι η FAK είναι ένας από τους κύριους κινάσες ενεργοποιούνται κατάντη του β1 ιντεγκρίνης, υποδεικνύεται η σημασία της ECM-εστιακής προσκόλλησης σύμπλεγμα σηματοδότησης σε αντίσταση στη θεραπεία EGFR ΤΚΙ. Δεδομένου ότι αποτελεί πάγια πρακτική για τη θεραπεία ασθενών με NSCLC με EGFR TKIs και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι FAK παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και της εξέλιξης, στόχος μας ήταν να δοκιμαστεί η χρησιμότητα του συνδυασμού του αναστολέα του EGFR erlotinib με αναστολή της FAK στα NSCLC. Εμείς ερεύνησε τις επιπτώσεις των δύο αναστολείς ΡΑΚ, PF-573228 (PF-228) και PF-562271 (PF-271) για την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC στον πολιτισμό και την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού τόσο ως μεμονωμένοι παράγοντες και σε συνδυασμό με erlotinib. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός αναστολή της FAK με ερλοτινίμπη μειώνει πιο αποτελεσματικά τη βιωσιμότητα EGFR άγριου τύπου NSCLC κυττάρων

in vitro

και ξενομοσχεύματος ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, είτε από φαρμακευτική αγωγή και μόνο, με ιδιαίτερη αποτελεσματικότητα στον τύπο Α549 κυττάρου. Έτσι, τα αποτελέσματα μας έχουν εντοπίσει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική συνδυασμού φαρμάκων που στοχεύουν EGFR και ΡΑΚ σε NSCLC, και δείχνουν ότι η θεραπευτική αγωγή περιλαμβάνει ένα αναστολέα της FAK μπορεί να αποδειχθεί πιο ωφέλιμη από τη θεραπεία με erlotinib και μόνο σε ασθενείς οι οποίοι φέρουν εγγενή EGFR ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLC.

Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές Α549 (EGFR άγριου τύπου) και Η1299 (EGFR άγριου τύπου) αγοράστηκαν από την ATCC, ενώ H1975 (EGFR L858R και Τ790Μ μεταλλάξεις), HCC827 (EGFR ΔE746-Ε750) και HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) κυτταρικές σειρές ήταν ένα δώρο του Δρ Ming Τσάο (Princess Margaret Hospital, Toronto, ON). Α549 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM (Mediatech, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Medicorp, Montreal, QC), ενώ Η1299, H1975, HCC827 και HCC4006 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (HyClone Laboratories, Logan , UT) με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 37 ° C και 5% CO

2. Η FAK αναστολέας PF-573228 (PF-228) αγοράστηκε από την Tocris Βιοεπιστημών (Bristol, UK) και διαλύθηκε σε DMSO. Erlotinib και το ΡΑΚ αναστολέας PF-562271 (PF-271) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Biochempartner ΣΙΑ Ε.Π.Ε. (Σαγκάη, Κίνα) και διαλύθηκε σε DMSO για

in vitro Κατασκευαστικές εργασίες καλλιέργειας κυττάρων.

Παραγωγή ανθεκτικών κυττάρων erlotinib

HCC4006 κύτταρα τα οποία ήταν αρχικά ευαίσθητοι σε erlotinib, έγιναν ανθεκτικά σε erlotinib έως 5 γύρους κλιμάκωση δόσης ξεκινώντας με 0.005 μΜ erlotinib και αυξανόμενη συγκέντρωση κατά έναν παράγοντα 5 έως ότου τα κύτταρα ανθεκτικά σε 3 μΜ erlotinib απομονώθηκαν. Γονικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοδύναμες ποσότητες DMSO σε κύτταρα που υποβάλλονται σε επιλογή για αντίσταση κατά τη διάρκεια του πειράματος κλιμάκωσης δόσης, και αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για όλα τα επόμενα πειράματα.

Το πλασμίδιο επιμόλυνση LKB1 σε κύτταρα Α549

Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με pcDNA3-FLAG-LKB1 (πλασμίδιο 8590 [29], Addgene, Cambridge ΜΑ) για να υπερεκφράζουν LKB1 ή με pcDNA3.1 ως έλεγχος φορέα χρησιμοποιώντας GeneJuice αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Novagen, Etobicoke, ON). Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πολλαπλούς δίσκους καλλιέργειας ιστού και μετά από 48 ώρες, ενεργά διαιρούμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 μg /ml Geneticin (Invitrogen, Burlington, ΟΝ) για να διευκολύνει την επιλογή των κυττάρων που εκφράζουν το πλασμίδιο. Τα κύτταρα σε κάθε τρυβλίο καλλιέργειας ιστού που απομένει μετά την επιλογή συνενώθηκαν για να δημιουργηθεί ένας αριθμός συγκεντρωμένων κλώνων και των δύο LKB1 εκφράζουν και μη εκφράζοντα κύτταρα Α549. Επιβεβαίωση της έκφρασης LKB1 σε FLAG-LKB1 επιμολυσμένα κύτταρα και συνέχισε έλλειψη έκφρασης LKB1 σε κύτταρα ελέγχου επιβεβαιώθηκε με στύπωση western για LKB1.

siRNA διαμόλυνση

Η1299 κύτταρα είτε ψευδο-επιμολυσμένα (PBS) ή επιμολυσμένα με siGENOME μη στόχευση ελέγχου siRNA # 2 ή siGENOME SMARTpool LKB1 siRNA (cat # Μ-005035-02, Dharmacon, Lafayette, CO) με αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen, Burlington, ΟΝ). Αποτελεσματικότητα της LKB1 νοκ ντάουν επιβεβαιώθηκε μέσω western αποτύπωση. Για προσδιορισμούς ΜΤΤ χρησιμοποιώντας siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα, φαρμακευτική αγωγή άρχισε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για πειράματα που περιλαμβάνουν διέγερση των κυττάρων με EGF για την κηλίδωση Western, siRNA επιμολυσμένα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό για όλη τη νύχτα αρχίζει στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση πριν αυξητικού παράγοντα διέγερσης.

ΜΤΤ βιωσιμότητα κυττάρου δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 4000 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Για τα πειράματα κλιμάκωσης της δόσης και του φαρμάκου συνδυασμού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε erlotinib ή PF-228 μόνο ή σε συνδυασμό σε διάφορες συγκεντρώσεις του φαρμάκου σε DMEM ή RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% FBS για 48 ώρες. Η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογείται στη συνέχεια με αντιδραστήριο ΜΤΤ (θειαζολυλο μπλε βρωμιούχο τετραζόλιο? Sigma, Oakville, ΟΝ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30] με απορρόφηση προσδιορίζεται στα 570 nm με αναγνώστη Multiskan Ascent πλάκα (Thermo Scientific, Rockford, IL). Οι αγωγές πραγματοποιήθηκαν σε αντίγραφα των έξι με τις μέσες τιμές εκφράζονται ως επί τοις εκατό βιωσιμότητα σε σχέση με τον έλεγχο αγωγή DMSO (100% βιώσιμα). Η φύση της επίδρασης της erlotinib σε συνδυασμό με τον αναστολέα της FAK PF-228 προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Chou-Talalay [31] χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK). Τα δεδομένα για την κυτταρική βιωσιμότητα όπως μετρήθηκε με ΜΤΤ για κάθε φάρμακο μόνο και σε συνδυασμό χρησιμοποιήθηκε στο πρόγραμμα CalcuSyn να παραχθεί κλάσμα που πλήττονται CI (Fa-CI) οικόπεδα δεικνύει τον δείκτη συνδυασμού (CI) για κάθε συνδυασμό φαρμάκου. CI τιμές & lt? 1 δείχνουν συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις, οι τιμές CI & gt? 1 δεικνύουν ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις και τιμές CI = 1 δείχνουν προσθετικό αλληλεπιδράσεις.

FAK ανοσοκαθίζηση και in vitro δοκιμασία κινάσης

Ανοσοκαταβύθιση και αντιδράσεις κινάσης έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, ίσες ποσότητες των συνολικών κυτταρικών λύματος (600 μg) ανοσοκαταβυθίστηκαν για FAK με αντι-ΡΑΚ αντίσωμα (BD Bioscience, Mississauga, ΟΝ) και 20 μΙ σφαιριδίων πρωτεΐνης Α /Ο sepharose (GE Healthcare, Uppala, Σουηδία) ενώ περιστρέφεται για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με 200 mM ΝΕΤΝ (20 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 1 mM EDTA, ρΗ 8,0, 200 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630), ακολουθούμενο από μία πλύση σε ρυθμιστικό κινάσης (0,25 mM NaVO

3, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 1 mM NaF, 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 15 mM MgCl

2). DMSO (έλεγχος οχήματος) ή ΡΑΚ αναστολέα PF-228 σε 1 ή 5 μΜ συγκεντρώσεις στη συνέχεια προστέθηκαν στην αντίδραση σε 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος κινάσης και επωάστηκε για 20 λεπτά στους 30 ° C. Η δοκιμασία κινάσης στη συνέχεια αρχίζει με 1 μΙ [

32Ρ] γΑΤΡ (5 μΟί /μΙ) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 30 ° C με ανάμιξη κάθε 10 λεπτά. η αντίδραση τερματίσθηκε μετά την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 4Χ δϋδ. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7,5% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη υποβλήθηκε σε αυτοραδιογραφία για εξέλιξη των γεγονότων φωσφορυλίωσης FAK και ανιχνεύτηκαν για τα συνολικά επίπεδα FAK με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται παρακάτω.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο διαλύτη (DMSO), ερλοτινίμπη , PF-228, ή και τα δύο erlotinib και PF-228 σε μέσο που περιέχει 5% FBS για 48 ώρες. Τόσο τα μη προσκολλημένα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 70% αιθανόλη για διαπερατοποίηση. Τα κυτταρικά εναιωρήματα στη συνέχεια κατεργάζεται με διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (/ml ιωδιούχου προπιδίου 48 μg, 40 μg /ml RNase Α) επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ένα σύνολο 1 χ 10

4 κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την ροή Beckman Coulter Epics XL κυτταρόμετρο (Beckman-Coulter, Mississauga, ΟΝ) και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε από κύτταρα με λιγότερο από περιεχόμενο 2Ν DNA χρησιμοποιώντας ροή FCS Express κυτταρομετρία λογισμικό ανάλυσης (de novo Software, Los Angeles, CA).

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά συνολική εκχύλιση πρωτεϊνών, κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: (Κατ. # 9272) (. S473, Cat # 9271) κουνελιού αντι-Ακί, pAkt, LKB1 (Cat # D60C5.) Και PARP αντισώματα ήταν από τη Cell (Cat # 9542). Signaling Technology (Danvers, ΜΑ), ποντικού αντι-ΡΑΚ (κλώνος 77 /FAK) ήταν από BD Transduction Laboratories (Mississauga, ΟΝ), και αντίσωμα αντι-β-ακτίνης ποντικού (κλώνος AC-74) ήταν από την Sigma (St. Louis , ΜΟ). Μετά την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα, οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 χ 5 λεπτά και επωάστηκαν σε ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP) συζευγμένου γίδινου αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας (Calbiochem, San Diego, CA) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλένονται 6 χ 5 λεπτά και επωάστηκαν σε Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) πριν από την ανάπτυξη της εικόνας χρησιμοποιώντας το Σύστημα GeneGnome Bio Imaging και λογισμικό GeneSnap (Syngene, Frederick, MD).

ανάπτυξη αποικίας δοκιμασία

Lab-Tek II διαφάνειες 4-καλά θάλαμο (Nalge Nunc International, Naperville, IL) επικαλύφθηκαν με 100 μΙ εκχυλίσματος βασικής μεμβράνης μειώνεται αυξητικός παράγοντας (ΒΜΕ? Trevigen, Gaithersburg, MD), το οποίο στερεοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται επάνω στο στερεοποιημένο στρώμα ΒΜΕ σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο που περιέχει 10% FBS και 2,5% ΒΜΕ. Το μέσο ανανεώνεται ανά τρεις ημέρες. μεγέθη αποικία κυττάρων προσδιορίστηκαν με το λογισμικό ImageJ από συνολικά 4 εικόνες από καθένα από φρεάτια εις διπλούν για κάθε πείραμα.

In vivo όγκου ανάπτυξης

καρκίνος του πνεύμονα Α549 κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα) ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερα τα αριστερά και δεξιά οπίσθια πλευρά του 6-εβδομάδων CD-1 γυμνούς ποντικούς (Charles River, Wilmington, ΜΑ). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα, σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός με σίτιση κατά βούληση και νερό για τη διάρκεια του πειράματος. Τρεις ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια (4 ποντίκια /θεραπεία) υποβλήθηκαν πρώτα σε επεξεργασία με από του στόματος καθετηριασμό με έκδοχο ελέγχου, ή με προηγουμένως αποδειχθεί αποτελεσματικές συγκεντρώσεις της erlotinib (50 μg /g) [33], PF-271 (50 μg /g) [ ,,,0],23], ή ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων σε PBS με 5% Gelucire (έλεγχος οχήματος). Τα φάρμακα συνέχεια χορηγούνται από του στόματος καθετηριασμό ημερησίως για πέντε διαδοχικές ημέρες που ακολουθείται από δύο ημέρες χωρίς θεραπεία και η διαδικασία επαναλήφθηκε στη συνέχεια για όλη τη διάρκεια του πειράματος. Μετρήσεις του μεγέθους του όγκου λήφθηκαν μια φορά την εβδομάδα με μέτρηση πάχος και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος όγκου = (πλάτος)

2 x (μήκος) /2. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν και εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Οτάβα Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από το

Ζώα για Πράξη Έρευνας

και του Καναδικού Συμβουλίου Φροντίδας Ζώων του

Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση πειραματόζωα

(Vol. 1, 2η έκδ., 1993), και να πληρούν τα πρότυπα της πρακτικής στους κλάδους της εργαστηριακής επιστήμης των ζώων και των εργαστηριακών ζώων κτηνιατρική. Όπως ανά εγκεκριμένο πρωτόκολλο, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία με διοξείδιο του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση σε προκαθορισμένα πειραματικά τελικά σημεία συμπεριλαμβανομένης) μάζας όγκου στο σημείο όπου παρεμβαίνει σημαντικά με φυσιολογικές σωματικές λειτουργίες ή προκαλεί πόνο, β) η απώλεια βάρους Συνεπής ή ταχεία σώμα που υπερβαίνουν το 20% του σωματικού βάρους γ) έλκος /μόλυνση του στην θέση του όγκου (θραύση του φράγματος του δέρματος), ε) Tumor βάρος & gt?. 10% του σωματικού βάρους g ποντικού) Σοβαρή αναπνευστική δυσφορία ή h) περιπατητική αγωνία για οποιονδήποτε λόγο

Ex vivo όγκου πνεύμονα ανάλυση

χειρουργικά όγκοι NSCLC και φυσιολογικό παρακείμενο πνευμονικό ιστό συλλέχθηκαν μετά από παθολογικές αξιολόγηση από πέντε ασθενείς, οι οποίοι παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το The Ottawa Hospital επιτροπής για την έρευνα Δεοντολογίας ( πρωτόκολλο # 20120559-01H). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών περιγράφονται στον Πίνακα 1. Ο ιστός υποβλήθηκε σε επεξεργασία την ίδια ημέρα για χρήση σε

ex vivo

πειράματα. Μια γροθιά βιοψία (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Germany) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί πυρήνες διαμέτρου 2 mm και από τις δύο πνευμονικό ιστό όγκου και κανονικό ιστό πνεύμονα και περαιτέρω χωρισμένο σε 1 χιλιοστό πάχους φέτες με τρεις φέτες στη συνέχεια διανέμονται τυχαία σε τριπλούν φρεάτια 24 -Καλά πλάκα καλλιέργειας ιστού. φέτες ιστού διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 U /ml διάλυμα αντιβιοτικού /αντιμυκητιακού (Gibco, Waltham, ΜΑ) στους 37 ° C και 5% CO

2. Καθώς κάθε τομή ιστού δεν είναι αναγκαστικά πανομοιότυπη από άποψη κυτταρική πυκνότητα ή βιωσιμότητα του κατά το χρόνο της απομόνωσης, την επομένη απομόνωση, η βιωσιμότητα των φετών ιστού εκτιμήθηκε σε ανά φρεάτιο βάση πριν από την προσθήκη του φαρμάκου μετά από επώαση για 4 ώρες με 10 % alamarBlue λύση (Abd Serotec, Raleigh, NC). Δημοσίευση αναγνώσεις φαρμακευτική αγωγή ήταν τότε κανονικοποιούνται σε αυτές τις βασικές μετρήσεις της βιωσιμότητας για κάθε φρεάτιο. φέτες ιστού υποβλήθηκαν σε αγωγή την επόμενη ημέρα απομόνωση είτε με τον έλεγχο του οχήματος (DMSO), erlotinib (10 μΜ), PF-271 (5 μΜ), ή ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων για 48 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογείται στη συνέχεια κατά 10% διάλυμα alamarBlue . Ο φθορισμός μετρήθηκε (διέγερση 530 nm /εκπομπή 590 nm) με αναγνώστη Fluoroskan Ascent πλάκας φθορισμού (Thermo Scientific, Rockford, IL) 4 ώρες μετά την προσθήκη alamarBlue.

Η

Στατιστικές αναλύσεις

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν με ANOVA, ενώ μόνο οι συγκρίσεις έγιναν με

t

δοκιμές αταίριαστο του Student. Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν ως

P

& lt? 0,05 από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα που εκτελούνται.

Αποτελέσματα

Η αναστολή της FAK μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC

Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές NSCLC με FAK TKIs, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές γραμμές δύο EGFR φυσικού τύπου (Α549, Η1299) με γνωστές αναισθησία με το EGFR TKIs [34], καθώς και το EGFR μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά H1975, με επίκτητη αντοχή EGFR ΤΚΙ λόγω μετάλλαξης Τ790Μ στο γονίδιο EGFR [35]. Αυτές οι τρεις κυτταρικές σειρές μας παρείχε, συνεπώς, με λογικές παραδείγματα για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα της προσθήκης ενός αναστολέα της τυροσινικής κινάσης FAK στη θεραπεία erlotinib, προκειμένου να αναστέλλουν πιο ισχυρά την ανάπτυξη του EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC.

Εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά το FAK αναστολέα PF-228 [36] και αξιολογείται η ικανότητά της να δοσοεξαρτώμενο (από 0,001 έως 25 μΜ) αναστέλλει την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών NSCLC

in vitro

. Η επεξεργασία των κυττάρων με κλιμακούμενες δόσεις του PF-228 έδειξε ότι όλοι οι ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές τρία EGFR (Α549, Η1299, H1975) ήταν ευαίσθητα σε αυτό το φάρμακο σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 1 μΜ (Εικ 1Α). Οι τιμές IC50 για PF-228 προσδιορίζεται από την γραφική παράσταση ήταν: 5,6 μΜ (R

2 = 0,92) στο Α549, 6.6 μΜ (R

2 = 0,95) σε Η1299 και 10,4 μΜ (R

2 = 0,80 ) σε H1975. Είναι ενδιαφέρον ότι, η βιωσιμότητα των δύο EGFR ΤΚΙ-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (HCC827, HCC4006) [34] ήταν πολύ υψηλότερη (~ 75% των κυττάρων που παραμένουν βιώσιμα σε σύγκριση με έλεγχο που λαμβάνουν θεραπεία) από τα EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (~ 10% των κυττάρων που παραμένουν βιώσιμη σε σύγκριση με τον έλεγχο υπό θεραπεία) με την υψηλότερη δόση του PF-228 δοκιμάστηκαν (25 μΜ) (Εικόνα 1Α), αν και ο λόγος για αυτή τη διαφορά στην βιωσιμότητα δεν είναι ακόμη κατανοητός. Δεδομένου ότι οι δύο κυτταρικές σειρές οι οποίες είχαν εγγενή αντοχή στην erlotinib και ήταν και οι δύο EGFR φυσικού τύπου φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητη στον αναστολέα FAK από τα κύτταρα H1975 που είχε μεταλλάξεις του EGFR με αποτέλεσμα αποκτήσει ευαισθησία, εξετάσαμε αν τα κύτταρα αρχικά ευαίσθητοι σε erlotinib έγινε επίσης πιο ευαίσθητα στην ΡΑΚ μετά την απόκτηση επίκτητης αντοχής φαρμάκου. HCC4006 κύτταρα τα οποία καθίστανται ανθεκτικά στην erlotinib εξής σειριακό πέρασμα σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib έως 3μΜ, οδήγησε σε κυτταρικούς κλώνους με σημαντικά μικρότερη ευαισθησία σε erlotinib με IC50s του 1,3 μΜ (R

2 = 0,87) και 16,8 μΜ (R

2 = 0.73) για κλώνοι ανθεκτικοί 1 και 2 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που είχαν σειριακά σε ίσους όγκους ελέγχου DMSO με IC50 0,21 μΜ (R

2 = 0,91) (Σχήμα 1Β). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι και οι δύο από αυτούς τους κλώνους παρουσίασαν αντίσταση erlotinib σε παρόμοια ή υψηλότερα επίπεδα των ανθεκτικών γονικές γραμμές επιλέγεται (με IC50s που κυμαίνονται από 1.2 μm, 5.3μm και 5.9μM για Α549, Η1299 και H1975 αντίστοιχα). Η erlotinib ανθεκτικά κύτταρα HCC4006 έδειξαν αυξημένη ευαισθησία σε ΡΑΚ αναστολείς με IC50s του 8,0 μΜ (R

2 = 0.96) και 8.7 μΜ (R

2 = 0,95) για τους κλώνους 1 και 2 αντίστοιχα σε σύγκριση με τον έλεγχο HCC4006 κλώνος με IC50 12,3 μΜ (R

2 = 0,90) (Σχήμα 1C). Ενώ ανθεκτικά erlotinib κλώνους κυττάρων έκανε επίδειξη αυξημένη ευαισθησία στο Φακ αναστολείς, παρέμειναν λιγότερο ευαίσθητα στην PF-228 σε σύγκριση με EGFR φυσικού τύπου εγγενώς ερλοτινίμπη ανθεκτικά Α549 ή Η1299 κύτταρα. Είναι έτσι πιθανό ότι ο κύριος μηχανισμός της επίκτητης αντίστασης στην erlotinib σε EGFR μεταλλαγμένο NSCLC εξαρτάται σημαντικά από τη δραστηριότητα ΡΑΚ.

(Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από θεραπεία με PF-228 σε κυμαινόμενες δόσεις για 48 ώρες σε πλήρη μέσο με 5% FBS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ με τη βιωσιμότητα των κυττάρων DMSO επεξεργασμένου οριστεί ως 100%. Τα στοιχεία δείχνουν τη μέση ± SEM για τον log [αναστολέα] έναντι κανονικοποιημένη απόκριση από δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελούνται. κύτταρα (Β) HCC4006 σειριακά που αναπτύσσονται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib έως 3 μΜ επιβεβαιώθηκαν ανθεκτικά σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ακόλουθη δοκιμασία ΜΤΤ από κύτταρα επεξεργασμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά ως η μέση του log [αναστολέα] έναντι κανονικοποιημένη απόκριση ± SEM (Ν = 2). κύτταρα (C) Η erlotinib ανθεκτικά HCC4006 είναι πιο ευαίσθητα σε ΡΑΚ PF-228 αναστολέα από μητρικά κύτταρα HCC4006. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του PF-228 και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή του log [αναστολέα] έναντι κανονικοποιημένη απόκριση ± SEM (Ν = 2). (Δ) την σχετική έκφραση της πρωτεΐνης μεταξύ των γονικών κυτταρικών σειρών erlotinib ανθεκτικά (Α549, Η1299, H1975) και ευαίσθητα (HCC827, HCC4006). (Ε) κυτταρολύματα Α549 ανοσοκαταβυθίστηκαν για ενδογενή FAK και υποβλήθηκε σε

in vitro

δοκιμασίες κινάσης με την παρουσία είτε DMSO (έλεγχος οχήματος) ή PF-228 (1 μΜ ή 5 μΜ). Αυτοραδιογραφία αποκάλυψε φωσφορυλίωση της FAK (ΡΑΚ Autorad) και western αποτύπωση έδειξε συνολικά επίπεδα της FAK (ΙΒ: FAK).

Η

Θα αξιολογηθεί επίσης κατά πόσον η ευαισθησία σε FAK αναστολέων παρατηρήθηκε στις γονικές κυτταρικές σειρές NSCLC συνδέθηκε με βασική έκφραση οποιωνδήποτε σημαντικών πρωτεϊνών σε αυτά τα μονοπάτια στόχος φαρμάκου. Η ευαισθησία προς FAK φαρμάκου δεν φάνηκε να συσχετίζεται με το συνολικό επίπεδο των ΡΑΚ, EGFR ή β1 ιντεγκρίνης πρωτεΐνες, όπως τα επίπεδα αυτά εμφανίστηκαν μεταβλητή σε τόσο ευαίσθητες και μη ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 D). Δεδομένου ότι οι τρεις EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές NSCLC είχαν τιμές IC50 για PF-228 που κυμαίνονται από 5 έως 10 μm, και ότι το εργαστήριο μας είχε προηγουμένως παρατηρηθεί αναστολή τόσο αυτοφωσφορυλίωσης και κινάσης δραστικότητα των ΡΑΚ στα 5 μΜ PF-228 [20] , επιβεβαιώσαμε τη δράση αυτού του αναστολέα σε κύτταρα Α549 μετά από

in vitro

δοκιμασίες κινάσης για ΡΑΚ αυτοφωσφορυλίωση. Η προσθήκη του PF-228 για την αντίδραση κινάσης ανέστειλαν σημαντικά FAK αυτοφωσφορυλίωσης σε Α549 κύτταρα (Σχ 1Ε) με παρόμοια αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε κυτταρικές σειρές Η1299 και H1975 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, τα επόμενα πειράματα εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις PF-228 στην περιοχή των 1-10 μΜ.

FAK αναστολέα PF-228 συνεργεί με erlotinib να μειωθεί πιο αποτελεσματικά την βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα EGFR φυσικού τύπου NSCLC

Επειδή η θεραπεία με FAK ΤΚΙ μόνος φάνηκε να αναστέλλει την βιωσιμότητα των EGFR ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC δοκιμάστηκε στο σχήμα 1, έχουμε δίπλα θέλαμε να καθοριστεί αν προσθήκη PF-228 θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει κύτταρα με την erlotinib, ή τουλάχιστον , θα οδηγήσουν σε μείωση του πρόσθετου στην βιωσιμότητα των κυττάρων πάνω και πέρα ​​από αυτό της θεραπείας μόνο με erlotinib. Τα κύτταρα έτσι σε επεξεργασία με erlotinib (1-25 μΜ) ή PF-228 (1-10 μΜ) μόνο του και σε συνδυασμό, και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με δραστηριότητα ΜΤΤ. Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν εμφάνισαν αντίσταση στη θεραπεία erlotinib μόνος, ακόμη και σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις (δηλαδή 25 μΜ, Σχήμα 2Α), επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών σχετικά με EGFR αντίσταση ΤΚΙ στα δύο EGFR φυσικού τύπου και μετάλλαξης που περιέχουν κυτταρικές γραμμές Τ790Μ [34, 35,37-39]. Όταν erlotinib και PF-228 χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό παρατηρήσαμε αυξημένη κυτταροτοξική δράση σε Α549, Η1299 και H1975 κυττάρων όπως είχαμε υποθέσει (Σχήμα 2Α). Η μέθοδος Chou-Talalay χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η φύση της επίδρασης του συνδυασμού φαρμάκων [31]. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) προσδιορίστηκε μέσω σχεδίαζε το κλάσμα επηρεαστεί όταν CI τιμές λιγότερο από 1 θεωρούνται συνεργιστική, CI τιμές μεγαλύτερες από 1 θεωρούνται ανταγωνιστικές, και οι τιμές CI ίση με 1 θεωρείται πρόσθετο. Ο συνδυασμός της erlotinib και PF-228 με αποτέλεσμα τη μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων βρέθηκε να είναι συνεργιστική και στις τρεις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 2Β). Ως δευτερεύον σύστημα χρησιμοποιήσαμε τη χρήση ανθρώπινων εκφυτεύματα καρκίνου του πνεύμονα όγκου ασθενούς για την περαιτέρω επαλήθευση της αποτελεσματικότητας των FAK TKIs σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Tumor μοσχεύματα από μη επιλεγμένους ασθενείς που υποβάλλονται σε θωρακοτομή για καρκίνους του πνεύμονα πρώιμο στάδιο κατεργάστηκαν

in vitro

με erlotinib ή ΡΑΚ TKIs μόνα τους ή σε συνδυασμό. Η θεραπεία της εκφυτευμένων όγκου πνεύμονα με erlotinib μόνος έδειξε μια μέτρια αλλά όχι στατιστικά σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 2C, αριστερό πάνελ). Παρόμοια μέτριες μειώσεις της κυτταρικής βιωσιμότητας παρατηρήθηκαν επίσης σε γειτονικές φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων μετά την αγωγή erlotinib μόνο (Σχήμα 2C, δεξί πάνελ). Παρατηρήσαμε ότι ο ασθενής καρκίνων του πνεύμονα ήταν επίσης ευαίσθητα σε ΡΑΚ ΤΚΙ αναστολή με μια τάση προς πιο αποτελεσματική αναστολή όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με erlotinib (Σχήμα 2C). Παρά το μικρό μέγεθος του δείγματος και τη μεταβλητότητα που συνδέεται με τις δοκιμές σε ετερογενείς ιστούς (δηλαδή διαφορετικές αναλογίες των όγκων στο στρώμα μπορεί να συμβεί σε κάθε δείγμα ασθενούς), ήμασταν ενθαρρύνονται από το προφανές όφελος του συνδυασμού φαρμάκων για θεραπεία διάρκειας erlotinib μόνη της, παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε πειράματα κυτταρικής σειράς μας. Από πρόσθετη σημασία, παρακείμενο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό εμφανίστηκε να είναι ανεπηρέαστη από θεραπείες FAK ΤΚΙ μόνη ή σε συνδυασμό με ερλοτινίμπη (Σχήμα 2C), γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή επιλεκτική αναστολή των όγκων NSCLC.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με PF -228 και erlotinib για 48 ώρες και προσδιορίστηκαν για την βιωσιμότητα των κυττάρων με τη χρήση ΜΤΤ δοκιμασία. Τα στοιχεία δείχνουν τη μέση ± SEM για τη βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζεται σαν ποσοστό του ελέγχου κυττάρων DMSO-αγωγή (100% βιώσιμα) από δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελούνται. (Β) ο δείκτης κλάσμα επηρεάζονται /Συνδυασμός (CI) οικοπέδων που δείχνει τη συνεργιστική κυτταροτοξικότητα της erlotinib και PF-228. ΠΙ & lt? 1 θεωρούνται συνεργιστική, ΠΙ & gt? 1 θεωρούνται ανταγωνιστικές, και ΚΠ = 1 θεωρούνται πρόσθετο. (Γ) ΡΑΚ αναστολή μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στον ιστό του ανθρώπινου πνεύμονα όγκου αλλά όχι κανονικό ιστό πνεύμονα

ex vivo

. Οι ιστοί από πέντε μη επιλεγμένους ασθενείς έλαβαν θεραπεία για 48 ώρες με τον έλεγχο του οχήματος (DMSO), erlotinib (10 μΜ), PF-271 (5 μΜ), ή ο συνδυασμός της erlotinib και PF-271. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε τόσο για ιστό όγκου και κανονικό ιστό με alamarBlue από τρία φρεάτια ανά συνθήκη με κάθε φρεάτιο να περιέχει τρία 2 mm τεμάχια ιστού χ 1 mm. Ο φθορισμός κανονικοποιήθηκε με την αρχική τιμή αναγνώσεις φθορισμού για κάθε καλά ληφθεί πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Πειραματισμός έγινε ανεξάρτητα σε κάθε δείγμα ασθενούς μέση τιμή φθορισμού ενδείκνυται για κάθε κατάσταση ως μια οριζόντια γραμμή και στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν με ANOVA και αναφέρεται ως

P

τιμές πάνω από τη σύγκριση.

Η

με σκοπό να προσδιοριστεί αν η παρατηρούμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων συσχετίζεται με αυξημένο επίπεδο απόπτωσης σε κατεργασμένα κύτταρα, αναλύσαμε τον πληθυσμό SubG1 των κυττάρων μετά από θεραπεία με είτε erlotinib ή PF-228 μόνο ή σε συνδυασμό χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου του περιεχομένου DNA και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Σε κύτταρα Α549, η θεραπεία συνδυασμού της erlotinib και PF-228 (5 αγωγή μΜ) οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αύξηση του πληθυσμού SubG1 των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο (~ 6-πλάσια αύξηση), εκτός από την εμφανίζουν σημαντική αύξηση της ποσοστό των κυττάρων SubG1 σύγκριση τόσο με τη θεραπεία erlotinib μόνο (

P

& lt? 0.001) και θεραπεία PF-228 μόνο (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 3Α).