Αφηρημένο

Πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες που συνεπάγονται διαφορές στην υποτροπή του καρκίνου βασίζεται στην αναισθητικών σχημάτων εγείρουν την πιθανότητα ότι ο υποδοχέας μ των οπιοειδών (MOR) μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη του καρκίνου. Με βάση τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας ότι η υπερέκφραση του MOR σε κύτταρα ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) αυξημένη ανάπτυξη και μετάσταση όγκου, η μελέτη αυτή εξέτασε εάν MOR ρυθμίζει σηματοδότηση υποδοχέα αυξητικού παράγοντα και επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC. Χρησιμοποιήσαμε ειδική siRNA, shRNA, χημικοί αναστολείς και φορείς υπερέκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα Η358 NSCLC που ήταν είτε χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις DAMGO, μορφίνη, φεντανύλη, EGF ή IGF. δοκιμασίες λειτουργία Cell, ανοσοστυπώματος και σε προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης διεξήχθησαν στη συνέχεια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν MOR ρυθμίζει οπιοειδών και σηματοδότηση του υποδοχέα EGF παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται (Src, Gab-1, PI3K, Akt και STAT3 ενεργοποίηση), η οποία είναι ζωτικής σημασίας για την επακόλουθη ανθρώπινη πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC και τη μετανάστευση. Επιπλέον, τα ανθρώπινα κύτταρα NSCLC θεραπεία με οπιοειδή, αυξητικούς παράγοντες ή MOR υπερέκφραση παρουσίασε μια αύξηση στην σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκα και βιμεντίνη και μειώνουν ΖΟ-1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης κλαουδίνης-1, Αποτελέσματα συνεπής με ένα φαινότυπο EMT. Περαιτέρω, οι επιπτώσεις αυτές έχουν αντιστραφεί με αποσιώπηση (shRNA) ή χημική αναστολή της MOR, Src, Gab-1, PI3K, Akt και STAT3 (p & lt? 0,05). Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν μια πιθανή άμεση επίδραση των MOR σε οπιοειδών και αυξητικού παράγοντα-σηματοδότηση και την επακόλουθη πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη μετάβαση EMT κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα. Ένα τέτοιο αποτέλεσμα παρέχει μια εύλογη εξήγηση για τις επιδημιολογικές διαπιστώσεις

Παράθεση:. Lennon FE, Mirzapoiazova Τ, Mambetsariev Β, Poroyko VA, Salgia R, Μος J, et al. (2014) του οπιοειδούς υποδοχέα μι Προωθεί οπιοειδές και αυξητικός παράγοντας-επαγόμενο πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και επιθηλιακά μεσεγχυματικά Μετάβασης (ΕΜΤ) στα ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10.1371 /journal.pone.0091577

Επιμέλεια: Olivier de Wever, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 16 Σεπτέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Μάρτη 2014

Copyright: © 2014 Lennon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη ήταν παρέχονται από θεσμικές ή /και νομαρχιακών πηγών και των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας χορηγούν CTSA UL1 TR000430. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Μεθυλναλτρεξόνη αναπτύχθηκε στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο και την άδεια να Progenics Pharmaceuticals, στη συνέχεια υπο -licensed στο Salix Pharmaceuticals. Ο Δρ Moss ήταν μια πληρωμένη σύμβουλος για Progenics Pharmaceuticals και σήμερα είναι μια πληρωμένη σύμβουλος για Salix Pharmaceuticals. Ο ίδιος εισπράττει δικαιώματα μέσα από το Πανεπιστήμιο του Σικάγο. Δεν υπάρχουν δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (ες) ή αιτήσεων διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με υλικό σχετικό με αυτό το άρθρο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο ρόλος της αναισθησίας και αναλγησίας στην επανάληψη και μεταστατικό ποσοστό κακοηθειών έλαβε πρόσφατα σημαντικές προσοχή [1], [2], [3], [4]. Αναδρομικές μελέτες έχουν καταδείξει μια μειωμένη συχνότητα υποτροπής του καρκίνου ακόλουθα περιφερειακά αναισθησία με χαμηλότερες δόσεις οπιοειδών μετά από χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του μαστού, του προστάτη, του καρκίνου του παχέος εντέρου και μελάνωμα, αν και άλλες μελέτες έχουν αποτύχει να ανιχνεύσει σημαντικές διαφορές [5], [6], [7] , [8]. Ορισμένες υποθέσεις για να εξηγήσουν αυτές τις διαφορές στα ποσοστά υποτροπής περιλαμβάνουν ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα και άμεσες επιπτώσεις στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [9], [10], [11]. Η έρευνά μας έχει επικεντρωθεί επί του υποδοχέα mu οπιοειδών (MOR) και το ρόλο του στη ρύθμιση άμεσα κυτταρικές αλλαγές που οδηγούν σε ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [4], [12], [13].

Αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές για τον καρκίνο του πνεύμονα , η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζεται με όλο τον κόσμο, είναι εξαιρετικά περιορισμένη παραδειγματικές την ανάγκη για πρώιμη διάγνωση και νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων [14], [15]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι το MOR υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους ανθρώπινου μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [12]. Περαιτέρω, έχουμε δείξει ότι η υπερέκφραση του MOR στο ανθρώπινο NSCLC αυξήσεις ανάπτυξη πρωτογενούς όγκου και μετάσταση σε μοντέλα ξενομοσχεύματος [13]. Ωστόσο, οι ακριβείς κυτταρικές αλλαγές ρυθμίζονται από MOR σε NSCLC είναι ελλιπώς ορίζονται [4]. Για τα καρκινικά κύτταρα να αναπτυχθούν και μεταστάσεις, πρέπει να υπάρξει μια απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου εκεί (που χαρακτηρίζεται από μείωση της επιθηλιακών πρωτεΐνες κυτταρικής πρόσφυσης συμπεριλαμβανομένων των σφιχτά πρωτεΐνες διασταύρωση, ΖΟ-1 και κλαουδίνης-1) ακολουθούμενη από την απόκτηση των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών συμπεριλαμβανομένων μια απώλεια του Baso-κορυφής πόλωση, κυτταροσκελετικές αναδιαμόρφωση και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα (που χαρακτηρίζεται από αυξήσεις σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες κυτταροσκελετική (δηλαδή βιμεντίνη) και παραγόντων μεταγραφής (δηλ Slug και σαλιγκάρι) [16], [17], [18], [19] . Αυτή η ενορχηστρωμένη ογκογόνο διαδικασία αυτή αναφέρεται ως επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].

ανάπτυξη υποδοχείς παράγοντα, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), συχνά υπερεκφράζονται και /ή μεταλλαγμένο σε NSCLC και ρυθμίζουν ογκογόνες διαδικασίες συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και EMT μετάβαση [23], [24], [25], [26] , [27]. Πολλές θεραπείες που στοχεύουν στην EGFR σε NSCLC υπάρχουν συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων κινάσης τυροσίνης (gefitinib, erlotinib) και μονοκλωνικά αντισώματα (cetuximab) [28], [29], [30], [31]. Ωστόσο, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης για NSCLC παραμένει σε χαμηλά επίπεδα [32], [33], [34]. Πρόσφατα, Fujioka et al., Έδειξαν ότι η μορφίνη μπορεί να τονώσει οδών σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένης της σερίνης /θρεονίνης Akt και κινάσης ΜΑΡ σε NSCLC υποδηλώνοντας ένα ρόλο για την αναστολή MOR ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική για NSCLC [35].

Με βάση την πρόσφατη ενδιαφέρον των επιδράσεων της αναισθησίας και της αναλγησίας αγωγές για την επανάληψη και μεταστατικό δυναμικό των διαφόρων μορφών καρκίνου [1], [2], [3], [4], η προηγούμενη δημοσιευμένα δεδομένα μας δείχνει την MOR ρυθμίζεται αυξητικά στον πνεύμονα ιστός από ασθενείς με NSCLC [12], η υπερέκφραση του MOR προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου σε ανθρώπινα μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC [13], καθώς και τα δεδομένα από Fujioka et al., αποδεικνύοντας ρύθμιση MOR των γεγονότων σηματοδότησης EGF που προκαλείται σε NSCLC [35], αυτή η μελέτη ερεύνησε τις λειτουργικές επιδράσεις των MOR στις θεμελιώδεις ογκογόνες διαδικασίες των οπιοειδών και παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται από ανθρώπινη μετανάστευση του πνεύμονα, του πολλαπλασιασμού και επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει προς το παρόν πολύ λίγες πληροφορίες σχετικά με οπιοειδή ή /και ρύθμιση MOR του EMT και μοριακών μηχανισμών ενσωμάτωσης πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την EMT, η μελέτη αυτή διερευνώνται οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί για αυτά τα γεγονότα τα οποία ενδέχεται να έχουν κλινική χρησιμότητα.

Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο NSCLC κυττάρων Η358 αποκτήθηκε από την ATCC (Walkersville, MD) και καλλιεργήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute πλήρες μέσο (Cambrex, East Rutherford, NJ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2, 95% αέρα, με διόδους 6-10 που χρησιμοποιείται για πειραματισμό. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, τα αντιδραστήρια ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Αντιδραστήρια για την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE αγοράσθηκαν από την Bio-Rad (Richmond, CA) και μεμβράνη μεταφοράς Immobilon-Ρ αγοράστηκε από την Millipore (Millipore Corp., Bedford, ΜΑ). αντι-MOR αντίσωμα κουνελιού αγοράστηκε από GeneTex (San Antonio, ΤΧ). Rabbit anti-EGFR, αντι-φωσφοτυροσίνης-EGFR (ρΥ

845, ρΥ

992, ρΥ

1045, ρΥ

1068), αντι-Grb-2, αντι-Gab-1 , αντι-φωσφοτυροσίνης-Gab-1 κουνελιού (ρΥ

307, ρΥ

627), κουνελιού αντι-Src, κουνελιού αντι-φωσφοτυροσίνης-Src (ρΥ

416), αντι-ρ85 κινάσης ΡΙ3 κουνέλι, κουνέλι αντι-p55 κινάσης ΡΙ3, αντι-φωσφοτυροσίνης-p85 /p55 κινάσης ΡΙ3 κουνέλι (ρΥ

458, ρΥ

199), κουνελιού αντι-STAT3, αντι-φωσφοτυροσίνης-STAT3 (ρΥ

705), κουνελιού αντι-Slug αντισώματα αντι-βιμεντίνης, κουνελιού αντι-ΖΟ-1, κουνελιού αντι-κλαουδίνης-1, κουνελιού αντι-σαλιγκάρι και κουνελιού αγοράστηκαν από τη Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ). Mouse αντίσωμα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). αντισώματα σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας Δευτερεύουσα αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Ν-βρωμιούχο μεθυλναλτρεξόνη ή μεθυλναλτρεξόνη αγοράστηκε από την Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). Ο αναστολέας της κινάσης ΡΙ3 LY294002, Akt Inhibitor Χ, ο Src οικογένεια κινάσης αναστολέα ΡΡ2 και του αναστολέα STAT3 Stattic αγοράστηκαν από EMD Biosciences (Billerica, ΜΑ).

ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως εμείς έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Cellular υλικά από επεξεργασμένο ή ανθρώπινα κύτταρα NSCLC επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM HEPES (ρΗ 7,5), 150 mM NaCl, 20 mM MgCl

2, 1% Triton Χ-100, 0.1% SDS, 0.4 mM Na

3νο

4, 40 mM NaF, 50 μΜ οκαδαϊκό οξύ, 0,2 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 1:250 αραίωση του μείγματος αναστολέα πρωτεάσης Calbiochem 3). Τα δείγματα στη συνέχεια τρέχουν σε SDS-PAGE σε γέλες πολυακρυλαμιδίου 4-15%, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon ™, και αναπτύχθηκε με ειδική πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα. Οπτικοποίηση του ανοσοαντιδραστικές ζώνες επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Σε ορισμένες περιπτώσεις, ανοσοδραστικές ταινίες ποσοτικά χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενη από υπολογιστή πυκνότητας.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Η επιμόλυνση στα ανθρώπινα κύτταρα NSCLC

Σταθερή Ελέγχου και είτε MOR, Gab-1, ή Src siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Η358 όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [12]. Τα κύτταρα (~ 40% συρροή) ήταν άνευ ορού για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με siRNA για 6 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Ορός μέσα που περιέχουν προστέθηκε στη συνέχεια (10% τελική συγκέντρωση ορού) για 42 ώρες. Η αναστολή της έκφρασης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης με ειδικά αντισώματα.

Σταθερό Ελέγχου και MOR Μικρές RNA φουρκέτας Η επιμόλυνση σε Ανθρώπινα Κύτταρα NSCLC

Σταθερό Ελέγχου και MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) διαμολύνθηκαν σταθερά σε κύτταρα Η358 όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [12]. Τα κύτταρα (~ 40% συρροή) ήταν άνευ ορού για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με shRNA για 6 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Ορός μέσα που περιέχουν προστέθηκε στη συνέχεια (10% τελική συγκέντρωση ορού) για 42 ώρες και προστέθηκε αντιδραστήριο επιλογή πουρομυκίνης. Η αναστολή της έκφρασης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης με αντι-MOR αντίσωμα (GeneTex, San Antonio, ΤΧ).

Σταθερό φορέα ελέγχου και MOR1 υπερέκφραση σε κύτταρα ανθρώπινου NSCLC

Myc-DDK-tagged ORF κλώνο του Homo sapiens οπιοειδούς υποδοχέα, μι 1 (OPRM1), την παραλλαγή μεταγραφής MOR-1 (ΟηΟεηε Technologies Inc, MD) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένζυμο Platinum Taq DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας (Invitrogen, CA) και ακολούθως κλωνοποιείται σε ένα pCR8 /GW /διάνυσμα εισόδου Τορο (Invitrogen, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλασμίδιο DNA εκχυλίζεται από επιλεγμένους κλώνους με QIAquick πλασμίδιο Mini κιτ (Qiagen, CA). ORF ακεραιότητα και θραύσμα προσανατολισμός επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Το προϊόν σύντηξης MOR1-Μγο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε φορέα pcDNA3.2 /V5 DEST (Invitrogen, CA) με αντίδραση LR. Η προκύπτουσα κατασκευή (pcDNA3.2-MOR1-Myc) διαμολύνθηκε σε κύτταρα Η358 χρησιμοποιώντας FuGENE HD ™ ως το αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Roche Applied Sciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τη Roche όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως. Τα κύτταρα (~ 40% συρροή) ήταν άνευ ορού για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με pcDNA3.2-MOR1-Μγο για 6 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Ορός μέσα που περιέχουν προστέθηκε στη συνέχεια (10% τελική συγκέντρωση ορού) για 42 ώρες και προστέθηκε νεομυκίνη αντιδραστήριο επιλογής. Η υπερέκφραση επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης με αντι-MOR αντίσωμα (GeneTex, Σαν Αντόνιο, Τέξας).

Ανθρώπινο NSCLC κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Μέτρηση

in vitro

κυτταρική ανάπτυξη NSCLC διεξήχθη όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως. Έλεγχος ή siRNA προεπεξεργασία Η358 κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) επωάστηκαν με 0.2 ml μέσου χωρίς ορό που περιέχει είτε φορέα (έλεγχος), η μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 ηΜ), ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 υΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η οικογένεια ΡΡ2 Src κινάσης (100 ηΜ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ) για 72 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO2 /95% αέρα σε καλλιέργεια 96 φρεατίων πλακών. Η

in vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων αναλύθηκε με μέτρηση αυξήσεων σε αριθμό κυττάρων χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CellTiter96 ™ MTS (Promega, Madison, WI) και αναγνώστηκε στα 492 nm. Κάθε δοκιμασία συστάθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον πέντε φορές.

Ανθρώπινο NSCLC τηλέφωνα Μετανάστευση Δοκιμασία

Μέτρηση

in vitro

NSCLC μετανάστευση των κυττάρων έγινε όπως έχουμε ήδη περιγραφεί. Είκοσι τέσσερις μονάδες transwell με μέγεθος 8 μΜ πόρου (Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση της

in vitro

μετανάστευσης κυττάρων όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [12]. Έλεγχος ή siRNA προεπεξεργασία Η358 κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) επωάστηκαν με 0.2 ml μέσου χωρίς ορό που περιέχει είτε φορέα (έλεγχος), η μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 ηΜ), ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 υΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η οικογένεια Src ΡΡ2 αναστολέα κινάσης (100 ηΜ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ) απλώθηκαν σε άνω θάλαμο και μέσα με ορό προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω των πόρων για 18 ώρες. Κύτταρα από την άνω και κάτω θάλαμος ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS CellTiter96 ™ (Promega, San Luis Obispo, CA) και αναγνώστηκε στα 492 nm. % Μετανάστευση ορίστηκε ως η # των κυττάρων στον κατώτερο θάλαμο διαιρούμενο με τον αριθμό των κυττάρων τόσο στην άνω και κάτω θάλαμο. Κάθε δοκιμασία συστάθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον πέντε φορές.

Στατιστική Ανάλυση

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Για την ανάλυση των δεδομένων, πειραματικών δειγμάτων συγκρίθηκαν με ελέγχους από t-test unpaired Student. Για συγκρίσεις πολλαπλών ομάδα, χρησιμοποιήθηκαν μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και post hoc πολλαπλές συγκρίσεις τεστ. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

P

αξία ήταν μικρότερη από 0,05. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα μας στο Σχήμα 1 δείχνουν ότι η αναστολή MOR με την περιφερειακή ανταγωνιστή MOR MNTX εξασθενίζει ΕΟΡ- επαγόμενο πολλαπλασιασμό (Σχήμα 1-Α) και τη μετανάστευση (Σχήμα 1-Β) των ανθρώπινων κυττάρων Η358 NSCLC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν μια σύνδεση μεταξύ MOR και του EGFR σε κύτταρα Η358. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος μηχανιστικά του MOR στη δυναμική EGFR EGF-επαγόμενη, υποβάλλαμε σε αγωγή Η358 κυττάρων με EGF σε διάφορους χρόνους και ανοσοκατακρημνίσθηκαν το EGFR για να προσδιοριστεί πιθανή συσχέτιση MOR. Το Σχήμα 2-Α επιδεικνύει ότι EGF διεγείρει σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ του EGFR και MOR που κορυφώνεται σε 5 έως 15 λεπτά μετά την πρόκληση EFG. Με βάση τα αποτελέσματα μας ότι ένα σύμπλοκο MOR /EGFR μπορεί να προκύψει με EGF διέγερση των κυττάρων Η358, εξετάσαμε έπειτα αν MOR μπορεί να ρυθμίσει τη φωσφορυλίωση του EGFR. Χρησιμοποιώντας ένα πάνελ των αντι-φωσφο-ΕΟΡΚ αντισώματα, Σχήμα 2-Β δείχνει ότι προκατεργασία Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR MNTX απέτυχε να μετριάσει φωσφορυλίωση τυροσίνης EGFR EGF-επαγόμενη

Πίνακας Α:. Ανθρώπινη Η358 κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) αναλύθηκαν για μεθυλναλτρεξόνη (MNTX) αναστολή της EGF-μεσολάβηση πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού MTS. Τα κύτταρα ανάπτυξης σε παρουσία 100 ng /ml EGF και /ή 0-250 ηΜ MNTX για 72 ώρες. MNTX Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05, υποδεικνύεται από ένα αστερίσκους) μεταξύ ελέγχου και MNTX (10, 50, 100, 250 ηΜ) κατεργασία με η = 3 ανά συνθήκη και οι ράβδοι σφάλματος = τυπική απόκλιση. Ανατρέξτε στην ενότητα Μέθοδοι για πειραματικές λεπτομέρειες. Πίνακας Β: Ανθρώπινα κύτταρα Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αναλύθηκαν για μεθυλναλτρεξόνη (MNTX) αναστολή της EGF-μεσολάβηση μετανάστευσης χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία transwell (8 μΜ μέγεθος πόρων). Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν παρουσία 100 ng /ml EGF και /ή 0-250 ηΜ MNTX για 18 ώρες. Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05, υποδεικνύεται από ένα αστερίσκους) μεταξύ ελέγχου και MNTX (50, 100, 250 ηΜ) κατεργασία με η = 3 ανά συνθήκη και οι ράβδοι σφάλματος = τυπική απόκλιση. Δείτε το τμήμα Μέθοδοι για λεπτομέρειες του πειράματος

Η

Πίνακας Α:. Human Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (μάρτυρας) ή 100 ng /ml EGF για 5, 15, ή 30 λεπτά. Τα κυτταρολύματα ελήφθησαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-EGFR αντίσωμα. Τα ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν επί συνολικού κυτταρολύματα (αριστερά) και ανοσοκαταβυθίστηκαν υλικό (δεξιά) χρησιμοποιώντας αντι-MOR (α) και αντι-EGFR (β) αντισώματα. Ο υποδοχέας οπιοειδών mu έχει προσληφθεί στον EGFR με διέγερση EGF. Πίνακας Β: Ανθρώπινα Η358 μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) ήταν είτε χωρίς επεξεργασία (έλεγχος) ή έλαβαν μόνο 100 ηΜ MNTX, 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά, ή 100 ηΜ MNTX και 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά. Τα κυτταρολύματα ελήφθησαν και ανοσοστυπώθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ρΥ

845 EGFR (α), αντι-ρΥ

992 EGFR (β), αντι-ρΥ

1045 EGFR (γ), αντι-ρΥ

1068 EGFR (d), αντι-EGFR (ε) και αντι-ακτίνης (ε) αντισώματα. MNTX δεν αναστέλλει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης του EGFR EGF-επαγόμενη.

Η

επόμενο εξέτασε κατά πόσον MOR μπορεί να ρυθμίσει EGFR μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης. Εξετάσαμε πρώτα την πρωτεΐνη προσαρμογέα, πρωτεΐνη υποδοχέα δεσμευμένου αυξητικό παράγοντα 2 (Grb-2), το οποίο περιέχει ένα πεδίο SH2 και SH3 δύο τομέων και μπορεί να δεσμεύει άμεσα τον EGFR [36]. Τα αποτελέσματα του Σχήματος 3-Α αποδείξει, χρησιμοποιώντας ανοσοκαθίζηση του EGFR και ανοσοκηλίδωση με αντίσωμα αντι-Grb-2, ότι EGF επάγει Grb-2 σχηματισμού EGFR /σύμπλοκο το οποίο μετριάζει προεπεξεργασία των κυττάρων με Η358 MNTX. Πρόσληψη Grb-2 στο EGFR είναι σημαντικό για την πρόσληψη της μεμβράνης πλάσματος και την επακόλουθη φωσφορυλίωση τυροσίνης της πρωτεΐνης ικριωμάτων, Grb2 σχετιζόμενη πρωτεΐνη δέσμευσης 1 (Gab-1) [37]. Σχήμα 3-Β δείχνει ότι το ΕΤΠ διέγερση των κυττάρων Η358 επάγει φωσφορυλίωση τυροσίνης της Gab-1 (Tyr307 και Tyr627), η οποία κορυφώνεται σε περίπου 5 λεπτά και μετριάζει MOR αναστολή με MNTX

Πίνακας Α:. Ανθρωπίνων H358 μη -μικρό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) ήταν είτε χωρίς επεξεργασία (έλεγχος) ή κατεργασία με 100 ηΜ MNTX (1 ώρα προ-επώασης), 10 ng /ml EGF επί 15 λεπτά, ή 100 ηΜ MNTX και 10 ng /ml EGF. Τα κυτταρολύματα ελήφθησαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-EGFR αντίσωμα. Τα ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν επί συνολικά κυτταρολύματα και ανοσοκατακρημνίσθηκαν υλικό χρησιμοποιώντας αντι-Grb-2 (A, C) και αντι-EGFR (b, d) αντίσωμα. MNTX αναστέλλει ΕΟΡ-επαγόμενη πρόσληψη Grb-2 στο EGFR. Πίνακας Β: Ανθρώπινα Η358 μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) ήταν είτε χωρίς επεξεργασία (έλεγχος) ή έλαβαν μόνο 100 ηΜ MNTX, 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά, ή 100 ηΜ MNTX και 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά. Ελήφθησαν κυτταρολύματα και ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-ρΥ

627 Gab-1 (α), αντι-ρΥ

307 Gab-1 (β) και αντι-ακτίνης (γ) αντισώματα. MNTX εξασθενεί EGF επαγόμενη Gab-1 φωσφορυλίωση τυροσίνης.

Η

Από φωσφορυλίωση τυροσίνης του Gab-1 με διάφορες κινάσες τυροσίνης συμπεριλαμβανομένης Src προάγει πρόσδεση σε μόρια σηματοδότησης περιλαμβανομένων φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσες (ΡΙ3Κ) που δημιουργούν ΡΙΡ3 και ενεργοποιούν κατάντη επενεργητές συμπεριλαμβανομένων Akt και STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], μπορούμε επόμενο εξετάστηκε αν η αναστολή MOR μπορεί επίσης να επηρεάσει Gab-1 σύνδεση /μόρια. Σχήμα 4-Α δείχνει ότι, όπως Gab-1, EGF πρόκληση των κυττάρων Η358 επάγει φωσφορυλίωση τυροσίνης Src (Tyr416), το κανονιστικό PI3K άλφα υπομονάδες p85 και p55 (Tyr458 /Tyr199), και τον παράγοντα μεταγραφής STAT3 (Tyr705), η οποία κορυφή σε περίπου 5 λεπτά και εξασθενημένα από την αναστολή MOR με MNTX σε στατιστικά σημαντικό τρόπο (Σχήμα 4-Β)

Πίνακας Α:. Ανθρώπινα κύτταρα Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ήταν είτε χωρίς θεραπεία (έλεγχος ) ή έλαβαν μόνο 100 ηΜ MNTX, 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά, ή 100 ηΜ MNTX και 10 ng /ml EGF για 5, 15 ή 30 λεπτά. Ελήφθησαν κυτταρολύματα και ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-Src (ρΥ

416) (α), αντι-φωσφο-ρ85 /ρ55 κινάσης ΡΙ3 (ρΥ

458 /ρΥ

199) (b, c) , αντι-φωσφο-STAT3 (ρΥ

705) (δ) και αντι-ακτίνης (ε) αντισώματα. Πίνακας Β: Γραφική ποσοτικοποίηση της ανοσοαντιδραστικότητας των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν περιγράφεται στο Σχήμα 3-Β και Πίνακας Α με ομαλοποίηση με τη συνολική ειδική πρωτεΐνη και η = 3 ανεξάρτητα πειράματα ανά συνθήκη. Ένας αστερίσκος (*) υποδεικνύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) από τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος = τυπική απόκλιση.

Η

Είμαστε δίπλα εξέτασε το μηχανισμό με τον οποίο το ΕΤΠ και DAMGO ([D-Ala2, Ν-MePhe4, Gly-ολ] εγκεφαλίνη), ένα συνθετικό οπιοειδές πεπτίδιο με ειδικότητα για MOR) επάγουν πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Το Σχήμα 5 απεικονίζει ότι siRNA ή /και χημική αναστολή του MOR, Gab-1, Src, ΡΙ3Κ, Akt και STAT3 μειώνουν σημαντικά EGF και DAMGO-επαγόμενο πολλαπλασιασμό (Σχήμα 5-Α) και τη μετανάστευση (Σχήμα 5-Β).

Πίνακας Α: Ανθρώπινα κύτταρα Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αναλύθηκαν για EGF και DAMGO μεσολάβηση πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού MTS. Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή κατεργασία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) ή 100 ηΜ DAMGO για 72 ώρες με ή χωρίς προκατεργασία των κυττάρων με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 ηΜ), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 μΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η οικογένεια Src αναστολέας κινάσης ΡΡ2 (100 ηΜ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ). Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05, υποδεικνύεται από ένα αστερίσκους) μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας με η = 3 ανεξάρτητα πειράματα ανά συνθήκη και οι ράβδοι σφάλματος = τυπική απόκλιση. Ανατρέξτε στην ενότητα Μέθοδοι για πειραματικές λεπτομέρειες. Πίνακας Β: Ανθρώπινα κύτταρα Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αναλύθηκαν για EGF και DAMGO μεσολάβηση μετανάστευσης χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία transwell (8 μΜ μέγεθος πόρων). Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή κατεργασία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) ή 100 ηΜ DAMGO για 18 ώρες με ή χωρίς προκατεργασία των κυττάρων με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 ηΜ), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 μΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η οικογένεια Src αναστολέας κινάσης ΡΡ2 (100 ηΜ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ). Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05, υποδεικνύεται από ένα αστερίσκους) μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας με η = 3 ανεξάρτητα πειράματα ανά συνθήκη και οι ράβδοι σφάλματος = τυπική απόκλιση. Ανατρέξτε στην ενότητα Μέθοδοι για πειραματικές λεπτομέρειες.

Η

Από πολύ λίγα είναι γνωστά για ρύθμιση MOR των επιθηλιακών μεσεγχυματικών μετασχηματισμού (EMT) και μοριακών μηχανισμών ενσωμάτωσης πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την EMT, θα εξεταστεί αν MOR1 υπερέκφραση ρυθμίζει EMT καρκίνο του πνεύμονα. Στο Σχήμα 6-Α, Β, παρατηρήσαμε ότι MOR υπερέκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα Η358 NSCLC προκάλεσε μια αλλαγή στην έκφραση δείκτη ΕΜΤ η οποία είναι συνεπής με ένα επιθηλιακό μετάβαση μεσεγχυματικά [19]. Δεδομένου ότι το MOR είναι ο κύριος υποδοχέας για ορισμένα οπιοειδή [4], [43], από την επόμενη αξιολογηθεί αν τα οπιοειδή μπορεί να επάγει ΕΜΤ σε ανθρώπινα κύτταρα Η358 NSCLC. Το σχήμα 6-C δείχνει ότι DAMGO, μορφίνη και η φαιντανύλη όλα επάγουν EMT σε NSCLC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

Πίνακας Α:. Ελέγχου (μη επιμολυσμένα) (C), σταθερό έλεγχο φορέα (VC) και MOR1 υπερεκφράζουν (O /E) κυτταρικές σειρές Η358 παρήχθησαν, λύματα κυττάρων που λαμβάνονται και ανοσοστυπώθηκαν με δείκτες EMT αντι-βιμεντίνη (α), αντι-σαλιγκάρι (β), αντι-Slug (γ), αντι-κλαουδίνης-1 (δ), αντι-ΖΟ-1 (ε), αντι-MOR (στ) και αντι-ακτίνης (ζ) αντισώματα. Μια αύξηση στην βιμεντίνη, σαλιγκάρι και έκφραση Slug και μια μείωση στην κλαουδίνης-1 και ΖΟ-1 έκφραση προτείνουν μια μετάβαση επιθηλιακά μεσεγχυματικά. Πίνακας Β: Γραφική ποσοτικοποίηση της ανοσοαντιδραστικότητας των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν περιγράφεται στο Πλαίσιο Α με n = 3 ανεξάρτητα πειράματα ανά συνθήκη. Ένας αστερίσκος (*) υποδεικνύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) από τον έλεγχο με γραμμές σφάλματος = τυπική απόκλιση. Πίνακας C: Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία, θεραπεία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 100 ηΜ DAMGO, μορφίνη ή φαιντανύλη ή 100 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης (IGF) για 96 ώρες, κυτταρολύματα που λαμβάνονται και ανοσοστυπώθηκαν με δείκτες EMT αντι-βιμεντίνη (α), αντι-σαλιγκάρι (β), αντι-Slug (γ), αντι-κλαουδίνης-1 (δ), αντι-ΖΟ-1 (ε), αντι-MOR (στ) και αντι-ακτίνης (ζ) αντισώματα. Μία μείωση της βιμεντίνη, σαλιγκάρι και έκφραση Slug και αύξηση των κλαουδίνης-1 και ΖΟ-1 έκφραση υποδεικνύουν αναστολή των επιθηλιακών μετάβασης μεσεγχυματικών. Πίνακας D: shRNA ελέγχου ή MOR shRNA Η358 κυτταρικές σειρές παρήχθησαν, λύματα κυττάρων που λαμβάνονται και ανοσοστυπώθηκαν με δείκτες EMT αντι-βιμεντίνη (α), αντι-σαλιγκάρι (β), αντι-Slug (γ), αντι-κλαουδίνης-1 (d ), αντι-ΖΟ-1 (ε), αντι-MOR (στ) και αντι-ακτίνης (ζ) αντισώματα. Μια αύξηση στην βιμεντίνη, σαλιγκάρι και Slug έκφρασης και μια μείωση στην κλαουδίνης-1 και ΖΟ-1 έκφραση προτείνουν μια μετάβαση επιθηλιακά μεσεγχυματικά.

Η

Θεωρώντας αυτές Η358 NSCLC ανθρώπινα κύτταρα εκφράζουν βασικά επίπεδα του MOR και ανταποκρίνονται σε θεραπεία με οπιοειδή, εξετάσαμε αν η φίμωση (shRNA) του MOR θα επηρεάσει τα οπιοειδή και την ανάπτυξη EMT παράγοντας που προκαλείται. Σχήμα 6-Α δείχνει MOR σίγηση αναστέλλει οπιοειδών και EGF /αλλαγές IGF-επαγόμενη έκφραση δείκτη EMT. Το Σχήμα 7-Α δείχνει ότι Η358 κύτταρα αναπτύσσονται σε αποικίες με καλά οριοθετημένες σύνορα και ισχυρές συγκολλήσεις μεταξύ κυττάρων. Αντίθετα, μορφίνη ή IGF-επεξεργασμένα κύτταρα Η358 δείχνουν μία απώλεια του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις και μια αλλαγή από κυβοειδές σε ένα επίμηκες φαινότυπο με αρκετές κυτταρικές προεξοχές ορατή. Οι αλλαγές αυτές είναι συνεπείς με τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ)

Πίνακας Α:. Η358 NSCLC ανθρώπινα κύτταρα ήταν είτε χωρίς θεραπεία (έλεγχος), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 nm μορφίνη ή 100 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης (IGF) για 96 ώρες και φωτεινού εικόνες ελήφθησαν (20 ×). κύτταρα Η358 αναπτύσσονται σε αποικίες με καλά οριοθετημένες σύνορα και ισχυρές συγκολλήσεις μεταξύ κυττάρων. Αντίθετα, μορφίνη ή IGF-επεξεργασμένα κύτταρα Η358 δείχνουν μία απώλεια του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις και μια αλλαγή από κυβοειδές σε ένα επίμηκες φαινότυπο με αρκετές κυτταρικές προεξοχές ορατή. Οι αλλαγές αυτές είναι συνεπείς με τα επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT). Πίνακας Β: Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία, θεραπεία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 100 ηΜ DAMGO, μορφίνη ή φαιντανύλη ή 100 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης (IGF) για 96 ώρες με ή χωρίς προεπεξεργασία με ο περιφερικός ανταγωνιστής MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 ηΜ), η οικογένεια Src αναστολέας κινάσης ΡΡ2 (100 ηΜ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ). Τα κυτταρολύματα κατόπιν ελήφθησαν και ανοσοστυπώθηκαν με δείκτες EMT αντι-βιμεντίνη (a, c, e) ή αντι-κλαουδίνης-1 (b, d, f) αντισώματα. Μια αύξηση στην έκφραση βιμεντίνη και μια μείωση στην κλαουδίνης-1 έκφραση προτείνουν μια επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση.

Η

Εξετάσαμε επόμενο δυναμικό πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος που θα μπορούσαν δυνητικά ρυθμίζουν οπιοειδών και ανάπτυξη EMT προκαλούμενης από παράγοντα. Εικόνα 7-Β δείχνει προεπεξεργασία με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX), η οικογένεια Src αναστολέας κινάσης ΡΡ2 ή ο αναστολέας STAT3 Stattic αντιστρέψει τις προκαλούμενης από παράγοντα ανάπτυξης οπιοειδών και αλλαγές στη βιμεντίνη και κλαουδίνης-1 έκφρασης. Επιπλέον, το Σχήμα 8 δείχνει siRNA ή /και χημική αναστολή του MOR, Gab-1, Src, ΡΙ3Κ, Akt και STAT3 αναστέλλει δραματικά EMT (όπως προσδιορίζεται από την αναστολή της ανάπτυξης των οπιοειδών και αύξηση παράγοντας-επάγεται σε βιμεντίνη έκφραση και μείωση στην claudin- 1 έκφραση). Τόσο MNTX και η ναλοξόνη αναστολέας MOR εξασθενημένος οπιοειδών και ανάπτυξη ένδειξη παράγοντας επαγόμενη EMT μια γενική επίδραση του MOR ανταγωνιστές σε αυτή τη διαδικασία (Σχήματα 7 και 8 και συμπληρωματικά στοιχεία, Εικόνα S1). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν MOR παίζει έναν κεντρικό ρόλο στις διαδικασίες του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικών μεμονωμένα και σε συνδυασμό με οπιοειδή και αυξητικούς παράγοντες

Πίνακας Α:. Γραφική αναπαράσταση της έκφρασης βιμεντίνη% έλεγχο. Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία, θεραπεία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 100 ηΜ DAMGO, μορφίνη ή φαιντανύλη ή 100 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης (IGF) για 96 ώρες με ή χωρίς προκατεργασία των κυττάρων με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 μΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η Src κινάση της οικογένειας αναστολέας ΡΡ2 (100 nM ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ). Τα κυτταρολύματα κατόπιν ελήφθησαν και ανοσοστυπώθηκαν με το αντι-βιμεντίνη αντίσωμα δείκτη EMT. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν και ανοσοαντιδραστικές ζώνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενη από υπολογιστή πυκνομετρία. Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05 υποδεικνύονται με αστερίσκους (*)) μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας με μπάρες σφάλματος = τυπική απόκλιση. Μια αύξηση στην έκφραση βιμεντίνη είναι ενδεικτικό ενός επιθηλιακού μετάβαση μεσεγχυματικά. Πίνακας Β: Γραφική αναπαράσταση της έκφρασης ελέγχου% κλαουδίνης-1. Η358 κύτταρα ανθρώπινου NSCLC ήταν είτε χωρίς θεραπεία, θεραπεία με 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 100 ηΜ DAMGO, μορφίνη ή φαιντανύλη ή 100 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης (IGF) για 96 ώρες με ή χωρίς προκατεργασία των κυττάρων με το περιφερικό ανταγωνιστή MOR, μεθυλναλτρεξόνη (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, ο αναστολέας κινάσης ΡΙ3 LY294002 (10 μΜ), Akt αναστολέα X (5 μΜ), η Src κινάση της οικογένειας αναστολέας ΡΡ2 (100 nM ) ή ο αναστολέας STAT3 Stattic (10 μΜ). Τα κυτταρολύματα κατόπιν ελήφθησαν και ανοσοστυπώθηκαν με το αντίσωμα δείκτη ΕΜΤ αντι-κλαουδίνης-1. Τρία ανεξάρτητα πειράματα ανά συνθήκη διεξήχθησαν και ανοσοαντιδραστικές ζώνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενη από υπολογιστή πυκνομετρία. Υπάρχει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05 υποδεικνύονται με αστερίσκους (*)) μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας με μπάρες σφάλματος = τυπική απόκλιση. Μια μείωση στην κλαουδίνης-1 έκφρασης είναι ενδεικτικά της επιθηλιακής μετάβασης μεσεγχυματικά.

Η

Συζήτηση

NSCLC, η οποία αντιπροσωπεύει περίπου 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα, είναι μια ασθένεια με υψηλή θνησιμότητα και λίγες επιλογές θεραπείας [44], [45]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι το MOR ρυθμίζεται αυξητικά στον πνευμονικό ιστό από ασθενείς με NSCLC [12] και ότι η υπερέκφραση του MOR προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου σε ανθρώπινα μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC [13]. Περαιτέρω, τα δεδομένα από Fujioka et al., Δείχνουν ότι η MOR ρυθμίζει EGF-επαγόμενη σηματοδότηση γεγονότων σε NSCLC [35].