Αφηρημένο

Ιστορικό

πολλαπλασιαστή υπεροξειδιοσώματος ενεργοποιημένος γάμμα υποδοχέας (PPARγ) αγωνιστές, όπως οι θειαζολινεδιόνες (TZDs), έχουν μελετηθεί για την πιθανή χρήση τους ως θεραπευτικοί παράγοντες του καρκίνου. Ερευνήσαμε την επίδραση των τεσσάρων TZDs-ροσιγλιταζόνη (Rosi), Η ciglitazone (CGZ), τρογλιταζόνη (TGZ) και πιογλιταζόνη (Pio) -ον πολλαπλασιασμός των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων, έκφραση ΡΡΑΚγ και δραστικότητα αναφοράς λουσιφεράσης PPAR. Εμείς διερευνηθεί αν ΤΖϋδ ενεργούν σε ένα PPARγ εξαρτημένα ή ανεξάρτητα με τη χρήση μοριακών προσεγγίσεων για την αναστολή ή υπερεκφράζουν δραστηριότητα PPARγ.

Κύρια Ευρήματα

Η θεραπεία με CGZ ή TGZ για 24 ώρες μειώθηκε πολλαπλασιασμό σε τρεις ωοθηκών κυτταρικές σειρές καρκίνου, Ovcar3, Caov3 και Skov3, ενώ Rosi και Pio δεν είχε καμία επίδραση. Αυτή η μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ovcar3 οφειλόταν σε ένα υψηλότερο κλάσμα των κυττάρων στην G

0 /G

1 στάδιο του κυτταρικού κύκλου. CGZ και TGZ θεραπεία αυξημένη απόπτωση μετά από 4 ώρες επεξεργασίας, αλλά όχι μετά από 8 ή 12 ώρες. Η θεραπεία με TGZ ή CGZ αυξημένη έκφραση PPARγ mRNA σε κύτταρα Ovcar3? Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν αμετάβλητες. Παραδόξως, δοκιμασίες υποκινητή λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι κανένα από τα TZDs αυξημένη δραστηριότητα ΡΡΑΡγ. Η υπερέκφραση του PPARγ άγριου τύπου αυξημένη δραστηριότητα δημοσιογράφος. Αυτό περαιτέρω αυξάνεται με TGZ, Rosi, και Pio που δείχνει ότι τα κύτταρα αυτά έχουν την ενδογενή ικανότητα να μεσολαβήσει PPARγ διενεργοποίηση. Για να καθοριστεί εάν PPARγ μεσολαβεί στην επαγόμενη από TZD μείωση του πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CGZ ή TGZ απουσία ή παρουσία ενός κυρίαρχο αρνητικό (DN) ή άγριου τύπου υπερέκφραση κατασκευάσει ΡΡΑΡγ. Ούτε διάνυσμα άλλαξε την ΤΖΟ μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που υποδηλώνει αυτό το αποτέλεσμα της ΤΖϋδ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μπορεί να είναι PPARγ ανεξάρτητη.

Συμπεράσματα

CGZ και TGZ να προκαλέσει μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που είναι PPARγ ανεξάρτητος. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται από το εύρημα ότι ένα DN ή υπερέκφραση του άγριου τύπου PPARγ δεν επηρέασε τις αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου

Παράθεση:. Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry ΤΕ (2011) Ειδικά θειαζολιδινεδιόνες Παρεμπόδιση των ωοθηκών Cancer Cell Γραμμή Πολλαπλασιασμός και Αιτία κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε ένα PPARγ ανεξάρτητο τρόπο. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10.1371 /journal.pone.0016179

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 17 Αυγ του 2010? Αποδεκτές: 14 του Δεκέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 21 Γενάρη του 2011

Copyright: © 2011 Al-Alem et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (αριθμοί επιχορήγηση CA95609, HD057446 και RR15592). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη κορυφαία αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες. Από τους τρεις κύριους τύπους καρκίνου των ωοθηκών (επιθηλιακά, των γεννητικών κυττάρων, και το καλώδιο σεξ καρκίνους στρωματικών), επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών αντιπροσωπεύει περίπου το 90% όλων των περιπτώσεων, και είναι η πρώτη αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες [1], [2] . Παρά την έντονη έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών με νέους στόχους που συνεχώς διερευνάται, οι στόχοι της θεραπείας παραμένουν αραιά. Μία από τις προκλήσεις στην έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών είναι η απουσία ενός πειραματικού ζωικού μοντέλου που ανακεφαλαιώνει την ανθρώπινη ασθένεια που μπορεί να χειραγωγηθεί πειραματικά [1], [3]. Έτσι, οι κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών έχουν χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση των θεμελιωδών διεργασιών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τρία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, Ovcar3, Caov3 και Skvo3, τα οποία προέρχονται από επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών του ανθρώπου [4], [5] για να διερευνήσουν περαιτέρω θεραπευτικούς τρόπους εις την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό.

Ένα από οι θεραπευτικοί στόχοι υπό έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών είναι πυρηνικούς υποδοχείς. Οι Φάρμακα που ενεργοποιούν ή αναστέλλουν πυρηνικών υποδοχέων έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία πολλών ασθενειών. Πράγματι, περίπου το 13% των φαρμάκων που κυκλοφορούν σήμερα στην αγορά-στόχο πυρηνικών υποδοχέων [6]. ΡΡΑΚγ είναι ένα εξαιρετικά συντηρημένη πυρηνικού υποδοχέα [7] που εκφράζεται σε όλο το σώμα [8] και υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού, καθιστώντας το ένα δυνητικά σημαντικό παράγοντα στην ανάπτυξη του καρκίνου.

Η ενδογενής συνδετήρες ΡΡΑΚγ είναι ακόμη άγνωστη, αλλά καλά χαρακτηρισμένο υποψήφιοι περιλαμβάνουν πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, Prostaglandin J

2 (PGJ

2) και το αραχιδονικό οξύ [9]. Συνθετικά συνδετήρες ΡΡΑΚγ περιλαμβάνουν τις θειαζολιδινεδιόνες (TZDs), τα οποία αποτελούνται από Rosiglitazone (Avandia®), τρογλιταζόνη (Rezulin®), πιογλιταζόνη (Glustin ® /Actos®), και Η ciglitazone, τα οποία έχουν αναπτυχθεί ή /και να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία του τύπου σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ [10], [11], [12]. Η χρήση TZDs ως μία θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο έχει διερευνηθεί αλλά τα αποτελέσματα ήταν αμφιλεγόμενα [13], [14], [15]. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν μοριακά, φυσιολογικές και φαρμακολογικές προσεγγίσεις για τη διερεύνηση της επίδρασης των τεσσάρων διαφορετικών ΤΖϋδ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και να καθορίσει αν οι επιδράσεις αυτές είναι PPARγ εξαρτημένα ή ανεξάρτητα.

Αποτελέσματα

Ovcar3, κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών Caov3 και Skov3 εκφράζουν PPARγ

προκειμένου να καθοριστεί εάν ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα εκφράζουν PPARγ, πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση κηλίδας Western εκτελέστηκε. Υπήρχε διαφορική έκφραση PPARγ στις τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Ενώ η έκφραση ΡΡΑΚγ mRNA ήταν υψηλότερη σε Skov3 κύτταρα (Σχήμα 1Α), κύτταρα Skov3 είχαν τα χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΡΑΚγ (Σχήμα 1Β). Σε αντίθεση, Ovcar3 είχαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης ΡΡΑΚγ mRNA αλλά άφθονη έκφραση του ΡΡΑΚγ πρωτεΐνης (Σχήματα 1Α και 1Β, αντίστοιχα). δραστικότητα ΡΡΑΚγ στις τρεις κυτταρικές σειρές εξετάστηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα διαμολυσμένα με 3XPPRE-Luc-

Renilla

κατασκευάσει και σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με λουσιφεράση και

Renilla

κατασκευάσματα λείπει το PPRE. Ovcar 3 κύτταρα εμφάνισαν περίπου 2 φορές περισσότερο ενδογενή δραστικότητα PPRE σύγκριση με τα κύτταρα Caov3, ενώ τα κύτταρα Skov3 έδειξε 50% μεγαλύτερη δραστηριότητα PPRE σύγκριση με τα κύτταρα Ovcar3 (Σχήμα 1 C).

(Α) έκφραση mRNA (Β) Η έκφραση πρωτεΐνης και (Γ) PPRE λουσιφεράσης δραστηριότητα. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα έκφρασης ΡΡΑΚγ και δραστικότητα σε κύτταρα Ovcar3. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05). Κύτταρα επιμολυσμένα με Luc και Renilla κατασκευάσματα που στερούνται PPRE (PPRE -) ήταν σημαντικά χαμηλότερες από την ίδια κυτταρική σειρά επιμολύνθηκαν με PPRE-Luciferase-Renilla κατασκευάσματα (PPRE +) από t-test του Welch (

ρ

& lt? 0,05) .

η

ρετινοϊκό οξύ Υποδοχέων (RXR) δεν είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στην δραστηριότητα του PPARγ

PPARγ συνδέεται με ετεροδιμερικού συντρόφου του RXR πριν δέσμευσης στο DNA [16]. RXR είναι γνωστό ότι εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε κύτταρα και έχει αποδειχθεί ότι ετεροδιμερίζονται με άλλους υποδοχείς εκτός ΡΡΑΡγ, όπως ο υποδοχέας βιταμίνης D [17]. Για RXR να ενεργοποιηθεί, συνδέτη του 9-

cis-ρετινοϊκό οξύ

(9-

Cis

-RA) πρέπει να είναι παρούσα. Για να διασφαλίσετε ότι ενεργοποιείται RXR δεν είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στα πειράματά μας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 9-

Cis

-RA. Σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με διαφορετικές κατασκευές PPARγ συμπεριλαμβανομένων Δ467 η οποία είναι ένα κυρίαρχο αρνητικό (DN) μορφή του ΡΡΑΚγ [18], [19], καθώς και μια υπερ μορφή έκφρασης του άγριου τύπου ΡΡΑΚγ (ΟΕ), το οποίο χρησιμοποιείται για την αύξηση ΡΡΑΚγ έκφρασης. Μια μορφή DN του ΡΡΑΚγ χρησιμοποιήθηκε σε όλες αυτές τις μελέτες βασίζονται σε αρχικά πειράματα που αποκάλυψαν ότι DN διαμόλυνση μείωσε την δραστικότητα PPRE 40% κάτω από τα επίπεδα σε κύτταρα επιμολυσμένα με shRNA PPARγ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προκειμένου να εξασφαλισθεί ότι ΡΡΑΚγ υπερεκφράστηκε είτε με τη μορφή DN ή ΟΕ σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (δηλαδή κύτταρα επιμολυσμένα με pGL3), η έκφραση της πρωτεΐνης PPARγ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως αναμενόταν υπήρξε μια αξιοσημείωτη επαγωγή τόσο της μορφής DN και ΟΕ του ΡΡΑΚγ (Σχήμα ένθετο 2Α). Μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο, DN ή φορέα ΟΕ, τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με μάρτυρα φορέα ή 1 μΜ 9-

Cis

-RA για 24 ώρες στο σκοτάδι. Παρατηρήσαμε ότι η παρουσία του 9-

Cis

-RA δεν επηρέασε τη δραστικότητα της δοκιμασίας ρεπόρτερ PPARγ σε 3 κύτταρα Ovcar, υποδεικνύοντας ότι ενεργοποιημένα RXR δεν είναι ένας περιοριστικός παράγοντας σε αυτή την κυτταρική σειρά (Εικόνα 2Α). Η προσθήκη του 9-

Cis

-RA σε κύτταρα Caov3 δεν άλλαξε δραστηριότητα PPRE μέχρι ΡΡΑΚγ βρέθηκε να υπερεκφράζεται (Σχήμα 2Β) υποδηλώνοντας ότι ενεργοποιήθηκε RXR δεν περιορίζει την ταχύτητα μέχρι ΡΡΑΚγ είναι ιδιαίτερα άφθονη σε αυτή την κυτταρική σειρά. Παραδόξως, σε κύτταρα Skov3, 9-

Cis

-RA αύξησε τη δοκιμασία δραστικότητας ανταποκριτή ΡΡΑΚγ σε κύτταρα ελέγχου (pGL3), αλλά δεν είχε καμία επίδραση όταν PPARγ ήταν υπερεκφράζεται σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 2C).

τα κύτταρα διπλό επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή PPRE και ένα από τα ακόλουθα: κενό φορέα (pGL3), DN μορφή PPARγ (DN) ή μορφή άγριου τύπου του PPARγ (Ο.Ε.). Μετά τη διπλή επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή 1 μΜ 9-

Cis

-RA στο σκοτάδι. δραστικότητα λουσιφεράσης PPRE απεικονίζεται για το (Α) Ovcar3, (Β) Caov3, και (Γ) Skov3. Οι έλεγχοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον κενό φορέα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος, που δείχνεται ως η πρώτη γραμμή σε κάθε πάνελ. Τα αποτελέσματα για τη δοκιμασία λουσιφεράσης PPRE είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 9 μετρήσεις. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05). Εισαγωγή Πίνακας Α: Western blot του PPARγ πρωτεΐνης σε κύτταρα Ovcar3 διπλό επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή PPRE και είτε κενό φορέα, DN ή Ο.Ε. PPARγ κατασκευάσματα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον έλεγχο του οχήματος για 24 ώρες

Η

CGZ και TGZ αιτία. μια μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

για να ορίσετε τις επιπτώσεις των υποκαταστατών PPARγ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, διεξήχθησαν δοκιμασίες MTS. Ovcar3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις 0, 0,1, 1 ή 10 μΜ Rosi, CGZ, TGZ ή Pio για 24 ώρες. Η μέγιστη συγκέντρωση ΤΖϋ που χρησιμοποιήθηκε ήταν 10 μΜ δεδομένου ότι οι ΡΡΑΚγ συγκεκριμένες ενέργειες που αναφέρθηκαν με TZDs σε συγκεντρώσεις ≤10 μΜ [20] και υψηλότερες συγκεντρώσεις είναι γνωστό ότι επάγουν κυτταρικό θάνατο [21]. Η χορήγηση των τεσσάρων TZDs οδήγησε σε διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η θεραπεία με CGZ μειωμένο πολλαπλασιασμό του 80%, TGZ προκάλεσε μία μείωση 65%, ενώ Rosi και Pio δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3Α-D μαύρες ράβδοι). Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε εάν η μείωση στον πολλαπλασιασμό μετά την αγωγή ΤΖϋ είναι κοινή σε όλες τις άλλες ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, η θεραπεία ΤΖϋ του Caov3 και Skov3 εξερευνήθηκε. Μια παρόμοια μείωση του πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές όταν έλαβαν θεραπεία με CGZ και TGZ στα 10 μΜ. κύτταρα Caov3 δείχνουν 80% και 30% μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με CGZ και TGZ, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α-Β). SKOV3 κυττάρων δείχνουν 45% και 35% μείωση κατά την θεραπεία με 10 μΜ CGZ και TGZ, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α-Β). Παρόμοια με κύτταρα Ovcar3, κύτταρα Caov3 και Skov3 κατεργάζεται με Rosi ή Pio δεν επιδεικνύουν μία αλλαγή στον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3C-D).

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και υποβάλλονται σε θεραπεία για άλλες 24 ώρες με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή 0.1, 1.0 ή 10 μΜ CGZ (Α), TGZ (Β), Rosi (C), ή Pio (D). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία MTS. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από τρία ξεχωριστά πειράματα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε μέσα σε κάθε κυτταρική γραμμή. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετική μέσα σε μια ομάδα θεραπείας (

σ

& lt? 0,05). Μαύρες γραμμές: Ovcar3, Grey: Caov3, ανοιχτό γκρι:. Skov3

Η

CGZ και TGZ μείωση BrdU DNA ενσωμάτωση

Η MTS μέτρα προσδιορισμού των μιτοχονδρίων στα κύτταρα, η οποία είναι ενδεικτική της τους βιωσιμότητα [22] και θεωρείται έμμεση εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, υπάρχει μια αναφορά ότι η TZDs μπορεί να επηρεάσει τη δοκιμασία MTS [23]. Συνεπώς, μετρήσαμε επίσης τον ρυθμό της αντιγραφής του DNA σε κύτταρα Ovcar3 χρησιμοποιώντας ενσωμάτωσης BrdU ως μια άλλη δείκτης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. κύτταρα Ovcar3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0, 0,1, 1 ή 10 μΜ Rosi, CGZ, TGZ ή Pio για 24 ώρες. δοκιμασίες BrdU δείχνουν παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα της δοκιμασίας MTS. Υπήρξε περίπου μια μείωση 70% στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε επεξεργασία με 10 μΜ του CGZ ή TGZ, και καμία επίδραση της Rosi ή Pio στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 4Α-D).

κύτταρα Ovcar3 στερήθηκαν τον ορό για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ένα επιπλέον χρόνο 24 ωρών με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή 0.1, 1.0 ή 10 μΜ CGZ (Α), TGZ (Β), Rosi (C), Pio (D). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία BrdU. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετική μέσα σε μια ομάδα θεραπείας (

σ

& lt? 0,05).

Η

έκφραση του PPARγ mRNA ενισχύεται από τη θεραπεία ΤΖΟ των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

για να αξιολογηθεί η συσχέτιση αυτών των συνδετήρων με ρύθμιση του PPARγ, εξετάσαμε την επίδραση της TZDs στην έκφραση του PPARγ στα κύτταρα Ovcar3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 μΜ TZDs και PPARγ mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν 24 ώρες αργότερα. PPAR (εκφράσεως είναι αυξημένο στα κύτταρα Ovcar3 σε επεξεργασία με CGZ (6,9 φορές) και TGZ (18,1 φορές) (Σχήμα 5Α). Παραδόξως, υπήρξε μια αύξηση στην PPAR (πρωτεΐνη εξής Rosi αλλά όχι CGZ ή θεραπεία TGZ (Σχήμα 5Β). Σε μια προσπάθεια να εξηγήσει αυτή την ασυμφωνία μεταξύ του mRNA και της έκφρασης πρωτεΐνης, ερευνήσαμε μια χρονική πορεία του PPAR (mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με τις διάφορες TZDs για 4, 8, 12 ή 24 ώρες και τα δύο σε πραγματικό χρόνο PCR και ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθησαν. δεν παρατηρήσαμε συσχετισμό μεταξύ των προτύπων έκφρασης για PPAR (mRNA και πρωτεΐνη σε όλη την ώρα που υποδεικνύει ότι υπάρχουν πιθανώς άλλοι μηχανισμοί που επηρεάζουν τα επίπεδα του PPAR (πρωτεΐνη στα κύτταρα αυτά. μια πιθανότητα είναι ότι η TZDs αύξηση του κύκλου εργασιών και αποικοδόμηση του PPAR (πρωτεΐνη όπως φαίνεται σε άλλα συστήματα [24], [25].

PPARγ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης μετρήθηκαν σε κύτταρα Ovcar3 χρησιμοποιώντας (Α) Real time PCR και (Β) ανάλυση κηλίδας Western μετά ΤΖϋ . θεραπεία κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί άλλες 24 ώρες με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή ένα από τα ακόλουθα: 10 μΜ Rosi, CGZ, TGZ, ή Pio. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από δύο μεμονωμένα πειράματα. Μπαρ με διαφορετικούς εκθέτες διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05).

Η

Από CGZ και TGZ προκάλεσε μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Caov3 και Skov3, μετρήσαμε την έκφραση του mRNA από ΡΡΑΚγ σε αυτά τα κύτταρα. Σε κύτταρα Caov3, η έκφραση του mRNA των PPARγ μετά CGZ και TGZ θεραπείας ήταν 3,6 και 4,4 φορές πάνω από τον έλεγχο του οχήματος, αντίστοιχα, αν οι αλλαγές αυτές δεν φθάνουν σημασία. SKOV3 κυττάρων δεν έδειξαν μεταβολές στην έκφραση PPARγ μετά την επεξεργασία οι TZDs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι PPAR (mRNA είναι παρόν και ρυθμίζεται από TZDs σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αν και σε διαφορετικό βαθμό, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και του συνδέτη χρησιμοποιείται για την ενεργοποίηση PPARg.

CGZ και TGZ δεν επάγουν απόπτωση

σε αυτό και τα επόμενα πειράματα εξετάσαμε μόνο κύτταρα Ovcar3 καθώς αυτά τα κύτταρα έδειξαν τα πιο αξιοσημείωτα αποτελέσματα όταν κατεργάζεται με TZDs. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται συνήθως στη μελέτη του καρκίνου των ωοθηκών, διευκολύνοντας σύγκριση με προηγούμενες μελέτες. σε μια προσπάθεια για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού μεσολάβηση της μείωσης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εξετάσαμε εάν η απόπτωση συμβάλλει σε αυτή τη μείωση. Παρατηρήσαμε μια μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά από 24 ώρες θεραπείας (Σχήματα 3 και 4). Εάν αυτή η μείωση οφείλεται σε απόπτωση, τότε αυτό κυτταρικό θάνατο θα πρέπει να έχουν συμβεί σε προγενέστερο χρονικό σημείο. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την επίδραση της TZDs σε κύτταρα Ovcar3 και προσδιορίζεται εάν τα κύτταρα ήταν είτε βιώσιμη ή υφίστανται απόπτωση και ήταν νεκρά κατά 4, 8 ή 12 ώρες μετά τη θεραπεία με χρήση ανάλυσης FACS. Υπήρξε μια μικρή αύξηση σε αποπτωτικά και τα νεκρά κύτταρα μετά από 4 ώρες επεξεργασίας με CGZ και TGZ (Σχήμα 6Α). Ωστόσο, αυτή η αύξηση δεν ανιχνεύθηκε σε δείγματα που κατεργάζονται για 8 ή 12 ώρες (Σχήμα 6Β και 6C). Trypan blue πειράματα για να επιβεβαιώσουν ζωντανά έναντι νεκρών κυττάρων έδειξε παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κύτταρα Ovcar3 στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή 10 μΜ CGZ ή TGZ για (Α ) 4 ώρες, (Β) σε 8 ώρες, ή (C) 12 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM των 3 μετρήσεων από τρία ξεχωριστά πειράματα. Ανοιχτό γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν βιώσιμα κύτταρα? σκούρο γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν κύτταρα που υφίστανται πρώιμο και όψιμο απόπτωση όπως επίσης και αυτές που είναι νεκρός. Μπαρ που δεν μοιράζονται ένα γράμμα ή ονομασία αριθμός είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05)

Η

CGZ και TGZ αιτία διακοπή του κυτταρικού κύκλου

Σε μια. προσπάθεια να διευκρινιστεί η αιτία που διέπουν τη μείωση του πολλαπλασιασμού, αξιολογήθηκαν επίσης τα αποτελέσματα της ΤΖϋδ στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Μια σημαντική αύξηση των κυττάρων στο G

0 /G

1 φάση παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία με TGZ και CGZ (Σχήμα 7Α). χορήγηση CGZ οδήγησε σε σημαντική μείωση στην G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 7Β), ενώ καμία αλλαγή στη φάση S παρατηρήθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με CGZ ή TGZ (Σχήμα 7C). Κύτταρα κατεργασμένα με Rosi ή Pio δεν παρουσίασαν καμία αλλαγή στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με τον έλεγχο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Cells Ovcar3 στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί άλλες 24 ώρες με τον έλεγχο του οχήματος (DMSO ) ή 10 μΜ CGZ ή TGZ. (Α) G

0 /G

1, (Β) G

2, (C) S φάση. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ που δεν μοιράζονται ένα γράμμα ή ονομασία αριθμός είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05).

Η

Επιδράσεις της ΤΖϋδ σχετικά με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης PPRE

Για να διευκρινιστεί αν οι αντιπολλαπλασιαστικές και του κυτταρικού κύκλου επιπτώσεις σύλληψη δει με επιλεγμένα ΤΖϋδ είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα των PPARγ διενεργοποίηση, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα με ένα πλασμίδιο 3XPPRE-MTK-pGL3-δημοσιογράφος. Δύο επιπλέον κατασκευάσματα διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα, δηλαδή, μια μορφή DN του ΡΡΑΚγ και μία υπερέκφραση (ΟΕ) ενός κατασκευάσματος άγριου τύπου ΡΡΑΚγ. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 10 μΜ του Rosi, CGZ, TGZ, ή Pio. Καμία από τις θεραπείες ΤΖϋ μόνος αυξημένη δραστηριότητα PPRE (Σχήμα 8). Εντούτοις, κύτταρα μετεμβολιασμένα με DN έδειξε μια κατά προσέγγιση 40% μείωση της δραστηριότητας που προκαλείται PPRE τόσο μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα κύτταρα ΤΖϋ. Επιπλέον, αύξηση της έκφρασης του άγριου τύπου ΡΡΑΚγ έδειξαν αύξηση στην δραστικότητα λουσιφεράσης όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οποιοδήποτε από τα τέσσερα διαφορετικά TZDs σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν μόνο αγωγή με TZDs (Σχήμα 8Α-8ϋ).

Ovcar3 κύτταρα διπλό επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή PPRE και ένα από τα ακόλουθα: κενό φορέα, DN, ή ΟΕ ΡΡΑΚγ. Μετά τη διπλή επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) ή 10 μΜ (Α) CGZ, (Β) TGZ, (Γ) Rosi, (D) ή Pio. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 3 μετρήσεις από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05).

Η

Ανάλυση ΤΖΟ μεσολάβηση PPARγ εξαρτημένων και ανεξάρτητων ενεργειών

Για για να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματα της TZDs είναι PPARγ εξαρτώνται από, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ TZDs απουσία ή παρουσία ανταγωνιστών ΡΡΑΚγ (GW9662, T007). Η δοκιμασία MTS διεξήχθη για να προσδιοριστεί αν η παρουσία των ανταγωνιστών θα μπορούσε να αναστρέψει τα αποτελέσματα της TZDs επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε μερική »διάσωση» όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον GW9662 (Σχήμα 9Α) ή η T007 (Σχήμα 9Β) ενώσεων σε συνδυασμό με CGZ ή TGZ. Ωστόσο, η εξέλιξη του δράση ήταν ασυνεπής μεταξύ των δύο ανταγωνιστών και ακόμη και με την ίδια ανταγωνιστής με την παρουσία των διαφόρων TZDs. Για παράδειγμα, T007 ήταν σε θέση να εμποδίσει πλήρως τα αποτελέσματα της CGZ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην μεσολαβούμενη μείωση TGZ στον πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, η χρήση του GW9662 ή ενώσεων T007 μόνη της δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό από μόνα τους όπως ήταν αναμενόμενο. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι αυτοί οι ανταγωνιστές μπορούν να αναμιχθούν αγωνιστές ή όχι PPARγ συγκεκριμένες [9], [26]. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η χρήση ενός φαρμακολογική προσέγγιση που απασχολούν αναφερθεί ανταγωνιστές PPARγ μόνη της δεν απαντά στο ερώτημα κατά πόσον η επίδραση των ΤΖϋδ δρουν μέσω PPARγ. Αυτό μας οδήγησε να χρησιμοποιήσετε μια μοριακή προσέγγιση χρησιμοποιώντας DN ή Ο.Ε. PPARγ κατασκευάζει να ερευνήσει αν οι επιδράσεις που παρατηρήθηκαν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου ήταν PPARγ εξαρτημένα ή ανεξάρτητα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GW9662 (Α) ή T007 (Β ) για 24 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 4 μετρήσεις. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετικές (

σ

& lt? 0,05).

Η

επιμόλυνση κυττάρων με μορφές DN ή Ο.Ε. του PPARγ, χωρίς την παρουσία των υποκαταστατών δεν άλλαξε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως υποδεικνύεται από δοκιμασίες BrdU (σχήμα 10). Το πιο σημαντικό, τα αποτελέσματα της CGZ και TGZ επί του πολλαπλασιασμού δεν υπερνικήθηκαν από την παρουσία της μορφής DN του ΡΡΑΚγ (Σχήμα 10). Πραγματοποιήθηκαν προσδιορισμοί λουσιφεράσης εκτελείται σε δείγματα στις ίδιες πλάκες, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα είχαν επιμολύνθηκαν και έκφραση του DN προκάλεσε την αναμενόμενη μείωση, ενώ η υπερέκφραση του PPARγ άγριου τύπου αυξημένη δραστηριότητα PPRE, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με τους προσδιορισμούς BrdU, στοιχεία κυτταρικού κύκλου δείχνουν επίσης ότι η επίδραση του CGZ και TGZ δεν είναι PPARγ εξαρτώνται από (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κύτταρα Ovcar3 ήταν διπλά επιμολυσμένα, στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ένα επιπλέον 24 ώρες με τον έλεγχο του οχήματος (DMSO) OR10 μΜ CGZ ή TGZ. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία ανίχνευση BrdU. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM για τουλάχιστον 9 μετρήσεων από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ που δεν μοιράζονται μια ονομασία επιστολή είναι σημαντικά διαφορετική μέσα σε μια ομάδα θεραπείας (

σ

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

ΤΖϋδ έχουν δείξει να έχουν ένα ευρύ φάσμα των επιδράσεων σε καρκινικά κύτταρα. Η υποτιθέμενη στόχος της TZDs, ΡΡΑΚγ, υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του προστάτη και των ωοθηκών [2], [27], [28], [29]. Παρά το γεγονός ότι, οι ακριβείς TZDs ρόλος και ΡΡΑΚγ παίξουν στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένει άγνωστη, αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι CGZ και TGZ έχουν αντι-πολλαπλασιαστικές δράσεις σε τρεις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, ενώ Rosi και Pio δεν έχουν καμία επίδραση. Το γεγονός ότι αυτοί οι αντι-πολλαπλασιαστικές δράσεις παρατηρήθηκε και στις τρεις κυτταρικές σειρές υποδηλώνει ότι αυτό είναι ένα κοινό φαινόμενο και δεν περιορίζεται σε μία μόνο κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών. Τα πειράματα που περιγράφονται στο παρόν επίσης να αποδείξει ότι οι τέσσερις ΤΖϋδ έχουν ξεχωριστές δράσεις για τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, ενδεχομένως, τόσο μέσω PPARγ εξαρτάται καθώς και ανεξάρτητες πορείες. Αν και πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι οι διάφορες κυτταρικές σειρές αντιδρούν διαφορετικά σε ΤΖϋδ, [30], [31], [32], [33], με τις γνώσεις μας, μια άμεση σύγκριση μεταξύ των τεσσάρων αυτών ΤΖϋδ στον καρκίνο των ωοθηκών και οριοθετούν το αν οι επιδράσεις αυτές είναι PPARγ εξαρτάται από τη χρήση μοριακών, φυσιολογικές και φαρμακολογικές προσεγγίσεις δεν έχει διερευνηθεί.

στην παρούσα μελέτη, 10 μΜ CGZ και TGZ μειώθηκε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε τρεις από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών που μελετήθηκαν. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σε συμφωνία με άλλες μελέτες που χρησιμοποιούν ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, καθώς και άλλες κυτταρικές σειρές όπου CGZ ή /και μειωμένη δραστηριότητα TGZ ΜΤΤ [20], [21], [34]. Ωστόσο, τα ευρήματά μας έρχονται σε αντίθεση με καρκινικές κυτταρικές γραμμές από άλλους ιστούς όπως του μαστού, του θυρεοειδούς, της ουροδόχου κύστης και άλλες που συνήθως απαιτούν πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις TZDs να αποσπάσει μια βιολογική απόκριση. Στην πραγματικότητα, δόσεις μέχρι και 100 μΜ, οι οποίες υπερβαίνουν τις συγκεκριμένες συγκεντρώσεις που αναφέρονται συνδετήρα 10 μΜ ή λιγότερο [12], μπορεί να απαιτείται πριν από την αναστολή του πολλαπλασιασμού παρατηρείται [35], [36], [37], [38] , [39]. Ωστόσο, αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονται εν μέρει στη χρήση διαφορετικών κυτταρικών γραμμών ή διαφορές στις συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας όπου, για παράδειγμα, οι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει 1% FBS [39], 5% FBS [35], [36], [37 ], [38], [39] ή 10% FBS [21]. Τα παρόντα ευρήματα καταδεικνύουν ότι αυτή η μείωση του πολλαπλασιασμού οφείλεται σε αύξηση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και όχι μια αύξηση στην απόπτωση. Παρομοίως, άλλες εκθέσεις έχουν δείξει ότι TZDs να οδηγήσει στην υποβάθμιση των κυκλίνης D1 σε καρκίνο του προστάτη [40], η οποία προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και μία μείωση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ομοίως, σε Α2780 καρκίνο κυττάρων των ωοθηκών, CGZ μειώνεται κυκλίνη D1 μαζί με άλλους παράγοντες προ-επιβίωσης καταλήγοντας σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου [21]. Γιανγκ και οι συνεργάτες του [20] ανέφερε ότι CGZ και TGZ θεραπεία ES-2 και PA-1 καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου? Ωστόσο, αυτή η αλλαγή στην κινητική του κυτταρικού κύκλου συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα απόπτωσης. Αν και οι μελέτες μας υποστηρίζουν τα προηγούμενα ευρήματα σε διαφορετικά ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που τα TZDs μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με ανάσχεση των κυττάρων στη φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου, υπάρχει η πιθανότητα ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις TZDs χρησιμοποιούνται σε αυτές τις προηγούμενα αποτελέσματα μελετών σε επαγωγή της απόπτωσης [20].

Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι κάθε μία από τις ΤΖϋδ έχει ξεχωριστές δράσεις στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. CGZ και TGZ προκαλέσει μια δραματική μείωση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών ενώ Rosi και Pio δεν είχε καμία επίδραση. Αυτό δεν είναι απροσδόκητο εφόσον κάθε ΤΖϋ έχει διαφορετική συγγένεια και σύνδεσης προς PPAR [7], [41], προσλαμβάνει διαφορετικές συνενεργοποιητές [42] και μπορεί να προκαλέσει διακριτές κυτταρικές αποκρίσεις. Αυτές οι μοναδικές δράσεις έχουν οδηγήσει στην ιδέα ότι οι TZDs είναι εκλεκτικοί ρυθμιστές του ΡΡΑΚγ και συνεπώς στοχεύουν διακριτά γονίδια με αποτέλεσμα επιλεκτικότητα ιστού [12], [42], [43], [44]. Επιπλέον, TZDs έχουν διαφορετικές εξειδικεύσεις για PPARs. Για παράδειγμα, Rosi και Pio θεωρούνται οι πιο ισχυροί αγωνιστές ΡΡΑΚγ από τα τέσσερα TZDs χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή [11]. Τα ευρήματα ότι οι ισχυροί αγωνιστές PPARγ δεν αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων περαιτέρω υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι οι ενέργειες της TZDs μπορεί να είναι ανεξάρτητη από PPAR. Επιπλέον, Rosi, CGZ και TGZ είναι ειδικά για ΡΡΑΚγ ενώ Pio έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν επίσης ΡΡΑΚα [45], [46]. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας μπορεί να αντανακλούν τις διαφορές στην επιλεκτική διαμόρφωση των PPARγ, οι διαφορές στην ειδικότητα για PPARγ, ή την ενεργοποίηση των διακριτών ανεξάρτητων οδών PPARγ.

Για να αρχίσουμε να καταλαβαίνουμε την επιλεκτική ρύθμιση των PPARγ με ΤΖϋδ στη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε τα προφίλ mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης του ΡΡΑΚγ και την ενεργοποίηση του προαγωγού PPARγ κατόπιν θεραπεία ΤΖϋ. Υπάρχει μία δραματική αύξηση στην έκφραση mRNA PPARγ όταν τα κύτταρα Ovcar3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGZ και σε μικρότερο βαθμό με CGZ και Rosi. Αντίθετα, η υψηλότερη έκφραση του ΡΡΑΚγ πρωτεΐνης παρατηρήθηκε όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Rosi. Αυτή η ασυμφωνία μεταξύ της έκφρασης του PPARγ mRNA και της πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία TZD δεν έχει παρατηρηθεί ούτε εξετάστηκαν προηγουμένως, ωστόσο, τα επίπεδα του PPARγ πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία ΤΖϋ έχουν αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά μεταβλητή μεταξύ ES-2 και ΡΑ-1 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [ ,,,0],21]. Εμείς ως αίτημα ότι η εξέταση μιας στατικής 24 ώρες χρονική στιγμή δεν θα μπορούσε να συλλάβει με ακρίβεια την επαγωγή του PPARγ mRNA και πρωτεΐνης. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε το επίπεδο του ΡΡΑΚγ mRNA καθώς και τα σχήματα πρωτεΐνη σε διαφορετικούς χρόνους μετά την αγωγή ΤΖϋ και παρατηρείται έλλειψη συσχετισμού μεταξύ PPARγ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε όλα τα χρονικά σημεία. Μια εναλλακτική θεωρία για να εξηγήσει αυτήν την ασυμφωνία είναι ότι η αύξηση στην έκφραση του mRNA PPARγ όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με TGZ μπορεί να αυξήσει τον κύκλο εργασιών και την υποβάθμιση του PPARγ πρωτεΐνης μειώνοντας έτσι την έκφραση της πρωτεΐνης. Αυτό έχει προηγουμένως αποδειχθεί σε άλλα συστήματα όπου δείχθηκε ότι με αυξανόμενες δόσεις TZDs, υπήρξε μια αύξηση στην πρωτεϊνική αποδόμηση PPARγ η οποία οδήγησε σε μείωση των επιπέδων σταθερής κατάστασης της πρωτεΐνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα [24], [25] . Αυτό υποτίθεται ότι συμβαίνουν λόγω TZDs μεσολαβήσει αλλαγές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης του ΡΡΑΚγ με ΜΕΚ που αφήνει PPARγ επιρρεπή σε αποικοδόμηση [47]. Υπό το φως αυτών των πληροφοριών, τα δεδομένα μας σε πρωτεΐνη θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι ΤΖϋδ αιτία διαφορική αποδόμηση των PPAR (μετά την ενεργοποίηση και ότι το ποσοστό κύκλο εργασιών της PPAR (πρωτεΐνη στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TGZ είναι ταχύτερη από αυτή του CGZ και Rosi που προκύπτουν σε μια μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι Rosi αυξάνει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης του PPAR (ενώ τα αποτελέσματά τους στον πολλαπλασιασμό μετά την αγωγή με CGZ και TGZ οι PPAR (ανεξάρτητα. Εναλλακτικά, TZDs μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στην ίδια την πρωτεΐνη, όπως όπως φωσφορυλίωση, η οποία μεταβάλλει άλλες δράσεις της πρωτεΐνης και όχι μόνο αλλάζει τη συνολική διενεργοποίηση της, όπως πρόσφατα έχει αποδειχθεί από Choi et al. [48].

Υπό το φως των αποτελεσμάτων μας, που έδειξαν έλλειψη συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων του PPAR (mRNA και πρωτεΐνη μετά τη θεραπεία TZD, διερευνήσαμε τις αλλαγές στην ενεργοποίηση ενός PPAR (ρεπόρτερ ως δείκτης του PPAR (δραστικότητα μετά από έκθεση TZD. Παραδόξως, PPAR (δραστικότητα δεν διεγείρεται από οποιαδήποτε από τις 4 TZDs μετά από 24 ώρες θεραπεία, σε αντίθεση με προηγούμενες αναφορές σε άλλες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών που 50 mM του CGZ αυξημένη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του ρεπόρτερ PPRE από 18 ώρες [21]. Με βάση αυτή την προηγούμενη έκθεση, θα εικάζουν ότι η ενεργοποίηση εργολήπτης θα μπορούσε να συμβαίνει σε προηγούμενα ή μεταγενέστερα χρονικά σημεία. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την επίδραση της TZDs επί της δραστικότητας προαγωγού σε 4, 8, 24 και 32 ώρες. Υπήρχαν μικρές αυξήσεις στη δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα κατεργασμένα με CGZ στις 8 και 32 ώρες (τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα οποία ήταν ανεπαρκής για να λαμβάνονται υπόψη οι μεταβολές της PPAR (έκφραση. ασυμφωνία μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης και PPAR (δραστηριότητα έχει προηγουμένως παρατηρηθεί στο μητρικό καρκινικά κύτταρα αλλά ο ακριβής μηχανισμός στηρίζεται αυτή η διαφορά παραμένει άγνωστος [34]. Ωστόσο, μια τέτοια παρατήρηση υποδεικνύει ότι η ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης μόνο PPARγ μπορεί εσφαλμένα να χρησιμοποιηθούν για να αποδώσουν κυτταρικά αποτελέσματα ή αποκρισιμότητα σε θεραπείες.

η TZDs έκανε δεν αυξάνουν την ενδογενή δραστικότητα PPAR σε αυτά τα κύτταρα, ωστόσο, η θεραπεία αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης ΤΖϋ όταν PPARγ υπερεκφράστηκε σε κύτταρα Ovcar3. Αυτό δείχνει ότι αυτά τα κύτταρα ιδιοσυστατικώς ενεργοποιούν PPARγ και, όταν ο υποδοχέας είναι ιδιαίτερα άφθονη, περαιτέρω ενεργοποίηση είναι δυνατή. η ενεργοποίηση αυτή δεν είναι