Αφηρημένο

Ιστορικό

Adrenomedullin (AM) εκφράζεται έντονα σε καρκίνο του παγκρέατος και διεγείρει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε αυξημένη ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. Η παρούσα μελέτη εξετάζει το ρόλο των ειδικών υποδοχέων AM σε καρκινικά κύτταρα και να μοιάζει με το μικροπεριβάλλον του όγκου (ανθρώπινο παγκρεατικό αστεροειδής – HPSC, ανθρώπινη ομφαλική φλέβα – HUVEC και πνεύμονα ποντικού ενδοθηλιακά κύτταρα – MLEC).

Μέθοδοι και Ευρήματα

AM υποδοχείς ADMR και CRLR ήταν παρόντες στην HPSC, HUVEC και τα MLEC ενώ PDAC κύτταρα διέθετε μόνο υποδοχείς ADMR όπως αξιολογείται με RT-PCR και κηλίδωση western. Όλες οι κυτταρικές σειρές που εκφράζεται και εκκρίνεται ΑΜ όπως υποδεικνύεται με ELISA. Η ανάπτυξη του καθενός από τις κυτταρικές σειρές διεγέρθηκε από εξωγενείς ΑΜ και αναστέλλεται από την ΑΜΑ ανταγωνιστή. AM τονωθεί επίσης

in vitro

αγγειογένεσης αξιολογήθηκε με σχηματισμό πολύγωνο των ενδοθηλιακών κυτταρικών σειρών. SiRNA μεσολάβηση αποσιώπηση ADMR, αλλά όχι CRLR, μειωμένη βασική ανάπτυξη όλων των κυττάρων που εξετάστηκαν και μειωμένο σχηματισμό πολύγωνο των ενδοθηλιακών κυττάρων

in vitro

. Ορθοτοπική όγκοι αναπτύχθηκαν με shADMR καρκίνο έδρανο κύτταρα είχαν μειωθεί δραματικά πρωτογενή όγκο του όγκου (& gt? 90%) και του πνεύμονα και του ήπατος μετάσταση σε σύγκριση με κύτταρα που φέρουν shControl. Για την επικύρωση ADMR ως πιθανό θεραπευτικό στόχο, i

n vivo

μελέτες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ουδέτερο nanoliposomes ώστε να παρέχει συστηματικά τα ανθρώπινα siRNA να ADMR να φιμώσουν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και siRNA ποντικιού για να ADMR να φιμώσουν στρωματικά κύτταρα όγκου ποντικού. Συστημική αποσιώπηση τόσο ανθρώπου και ποντικού ADMR δεν είχε προφανή δυσμενή αποτελέσματα, αλλά σε μεγάλο βαθμό μειωμένη ανάπτυξη του όγκου.

Συμπέρασμα

ADMR διαμεσολαβεί τις διεγερτικές επιδράσεις της ΑΜ σε καρκινικά κύτταρα και στα ενδοθηλιακά και τα αστεροειδή κύτταρα εντός της μικροπεριβάλλον του όγκου. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την περαιτέρω ανάπτυξη της ADMR ως χρήσιμη θεραπεία στόχος του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Ramachandran V, Arumugam Τ, Langley R, Hwang RF, Vivas-Mejia P, Sood ΑΚ, et al. (2009) ο υποδοχέας ADMR μεσολαβεί στη δράση της αδρενομεδουλλίνης για τις κυψέλες καρκίνο του παγκρέατος και σε κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. PLoS ONE 4 (10): e7502. doi: 10.1371 /journal.pone.0007502

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 4 Ιουνίου, 2009? Αποδεκτές: 15 Σεπτεμβρίου, 2009? Δημοσιεύθηκε: 22 του Οκτωβρίου, 2009

Copyright: © 2009 Ramachandran et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ DK052067, MD Anderson υποστήριξη πυρήνα CA16672 επιχορήγηση, MD Anderson του παγκρέατος εξειδικευμένα προγράμματα της ερευνητικής αριστείας (SPORE) P20 επιχορήγηση CA101936, και από την Lockton Κληροδότημα και υποστήριξη από το Πρόγραμμα Ανάπτυξης επιχορήγησης του έργου από τον καρκίνο των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες και έχει υπολογιστεί ότι το 2008 περίπου 37.680 Αμερικανοί είχαν διαγνωστεί και 34.290 έχασαν τη ζωή τους από την ασθένεια αυτή [1]. Αν και οι σημαντικές εξελίξεις αρχίζουν να γίνονται στη διαχείριση της νόσου, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών δεν έχει βελτιωθεί κατά τα τελευταία 25 χρόνια [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας οφείλεται στην υψηλή συχνότητα εμφάνισης της μεταστατικής νόσου κατά την αρχική διάγνωση, την επιθετική κλινική πορεία και την αποτυχία των συστηματικών θεραπειών [2]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για καλύτερη κατανόηση της μοριακής βιολογίας της ασθένειας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τον καρκίνο του παγκρέατος.

προηγουμένως έδειξαν ότι αδρενομεδουλλίνη (AM) υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος και έχει ισχυρή αυτοκρινή ρόλο σε αυτή τη νόσο [3]. AM είναι ένα πεπτίδιο 52 αμινοξέων που απομονώθηκε αρχικά από τα ανθρώπινα φαιοχρωμοκύττωμα [4] που δρα ως ένα πολυλειτουργικό ρυθμιστική πεπτίδιο [5]. Ένα θέμα με ΑΜ ως στόχος για θεραπεία του καρκίνου είναι ότι πμ έχει αρκετές φυσιολογικές λειτουργίες των οποίων η αναστολή μπορεί να είναι επιβλαβής. AM εκφράζεται σε φυσιολογικό κύτταρα νησιδίων του παγκρέατος, με κυρίαρχη έκφραση στα κύτταρα F, τα οποία περιέχουν επίσης παγκρεατικό πολυπεπτίδιο [6]. AM μειώνει την έκκριση ινσουλίνης σε φυσιολογικές συνθήκες [6]. AM έχει επίσης σημαντικές συνέπειες σε κυτταρική βιολογία αγγειακού όπου ρυθμίζει αγγειακό τόνο και διαπερατότητα και προάγει την αγγειοδιαστολή [7] – [11]. AM είναι επίσης ένας ισχυρός αγγειογόνος μόριο, ιδιαίτερα σε υποξία, η οποία επάγει AM [10]. Οι αγγειογενετικές επιδράσεις του ΑΜ είναι πιθανόν προκαλούνται μέσω άμεσης διέγερσης του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων [12] και την προστασία των ενδοθηλιακών κυττάρων από απόπτωση [13]. Αδρενομεδουλλίνη σηματοδότηση είναι απαραίτητη για λεμφικού αγγειακή ανάπτυξη του ποντικού [14]. Τα ποντίκια στα οποία AM έχει γενετικά διαγραφεί αναπτύξει δερματικό οίδημα και midgestational θνησιμότητα λόγω ελαττώματος στο λεμφικό ανάπτυξη των πλοίων και καρδιοαγγειακή ανωμαλία [15]. Στον καρκίνο, ΑΜ φαίνεται να έχει έναν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση, καθώς και ένα επιπλέον τροφική επίδραση κατευθείαν επί των καρκινικών κυττάρων [16] – [18].

am δρα ως ένα πεπτίδιο συνδέτη που ενεργοποιεί τους υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια . Παγκρεατικά βήτα κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς που είναι γνωστό ότι ανταποκρίνεται στην AM συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα αδρενομεδουλλίνη (ADMR, επίσης γνωστή ως L1-R) και την καλσιτονίνη-υποδοχέα σαν-υποδοχέα (CRLR) [6], [19], [20]. προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν μόνο ADMR, ενώ και οι δύο υποδοχείς είναι παρόντες σε κύτταρα που βρίσκονται μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων παγκρεατικών αστεροειδή κύτταρα (HPSCs) και ενδοθηλιακά κύτταρα. Ωστόσο, οι ρόλοι των ειδικών υποδοχέων σε επιδράσεις AM για καρκίνο του παγκρέατος, HPSCs και ενδοθηλιακά κύτταρα είναι προς το παρόν άγνωστη.

Η τρέχουσα μελέτη εξετάζει τις επιδράσεις της ΑΜ σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, HPSCs και ενδοθηλιακά κύτταρα και ερευνά το υποδοχείς που εμπλέκονται σε αυτές τις επιδράσεις. Εμείς σιγήσει κάθε έναν από τους υποδοχείς

in vitro

χρήση siRNA και διαπίστωσε ότι ADMR ήταν ο κύριος υπεύθυνος για τις βιολογικές επιδράσεις της ΑΜ σε κάθε ένα από αυτούς τους τύπους κυττάρων. Στη συνέχεια εξέτασαν τις επιδράσεις της φίμωσης ADMR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και παρατηρείται μια σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

. Για να αναλυθεί το δυναμικό των ADMR ως στόχος της θεραπείας του καρκίνου, αξιολογήσαμε τότε τα αποτελέσματα των φίμωση ADMR στα δύο κύτταρα ποντικού που απαρτίζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση nanoliposomes DOPC να παραδώσει συγκεκριμένο είδος siRNAs. Αυτή η συστηματική αποσιώπηση των ADMR δεν έχουν προφανείς επιβλαβείς επιδράσεις σε υγιή ποντίκια, αλλά μειώνεται σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Ως εκ τούτου, ADMR θα πρέπει να είναι ένας σημαντικός στόχος για τη μελλοντική ανάπτυξη των μικρών θεραπευτικών μορίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και AM πεπτίδια

παγκρεατικά κύτταρα καρκίνου BxPC3 και HUVEC κυττάρων γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). MPanc96 κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος αρχικά ιδρύθηκε από τον Δρ Timothy J. Eberlein (St. Louis, ΜΟ) [21]. Τα MLEC είναι μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα από πρωτογενείς καλλιέργειες λαμβάνονται από τους πνεύμονες των ποντικών των οποίων ιστών λιμάνι ένα ευαίσθητο στη θερμοκρασία SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο [22]. Όταν καλλιεργείται υπό επιτρεπτές θερμοκρασίες (33 ° C), κυτταρικές σειρές που εμφανίζεται φορές συνεπής με τα ενδοθηλιακά κύτταρα που διαθέτουν αγγειογενετική φαινότυπο διπλασιασμού. Η μεταφορά αυτών των ενδοθηλιακών κυττάρων σε μη επιτρεπτές θερμοκρασίες (37 ° C) είχε ως αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την επαγωγή του κατάσταση ηρεμίας. Τα MLEC καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS σε DMEM. BxPC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS σε μέσα RPMI, τα κύτταρα MPanc96 καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS σε μέσα DMEM και ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) καλλιεργήθηκαν σε 15% FBS σε ΜΕΜ. Όλα τα μέσα περιείχαν 1% αντιβιοτικό. Ανθρώπινα παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (HPSCs) απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο έκφυση από δείγματα παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή και καλλιεργήθηκαν σε 15% FBS σε DMEM [3], [23]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. κυτταρικές σειρές BxPC3 και MPanc96 σταθερά φέρουν shControl ή shADMR φορείς και την λουσιφεράσης γονίδιο που αναπτύχθηκε σε μια παλαιότερη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν επίσης [3]. Αδρενομεδουλλίνη (ΑΜ 52) και ανταγωνιστή αδρενομεδουλλίνη (AMA (ΑΜ 22-52)) αγοράστηκαν από την Sigma, (St. Louis, ΜΟ).

ELISA για AM

AM ανιχνεύθηκε σε συσκευασμένα μέσων από HPSC, HUVEC και τα MLEC χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό ELISA. Για τη συλλογή των ρυθμισμένων μέσων, κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε αντίστοιχα μέσα χωρίς ορό τους. Media συλλέχθηκε και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας συσκευές Centricon ΥΜ-3 φίλτρου (Millipore Corporation, Chicago, IL). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ανταγωνιστική ELISA κατόπιν διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης ΑΜ (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA? Cat # EK-010-01) ακολουθώντας το πρωτόκολλο που προτείνεται από τον κατασκευαστή. Αντίστοιχες συμπυκνώνεται μέσα ελεύθερα ορού χρησίμευσαν ως έλεγχος αντιδραστήριο και οι τιμές OD ελέγχου αφαιρέθηκαν από εκείνες όλων των άλλων δειγμάτων. Οι υπολογισμοί της συγκέντρωσης AM χρησιμοποιείται η πρότυπη καμπύλη που περιλαμβάνεται στο κιτ και διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Η παροδική επιμόλυνση των siRNA

Σίγαση ADMR και CRLR επιτεύχθηκε σε HPSC, HUVEC και τα MLEC (2 × 10

4 κύτταρα) χρησιμοποιώντας παροδική διαμόλυνση siRNAs. Ανθρώπου και ποντικού siRNA που το καθένα κατά τον έλεγχο, ADMR και CRLR (siRNAs ID # 4611, 46184, 42272, Ambion Inc. Austin, TX και custom made ποντίκι siRNAs ID # Ελέγχου – 1129089, 1129090? ADMR – 1129085, 1129086? CRLR – 1129087, 1129088 από την Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, ΜΟ) επιμολύνθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 5 ηΜ ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Αναλύσαμε επίσης τις συνέπειες της siADMR σε καρκινικά κύτταρα MPanc96. διαμόλυνση siRNA διεξήχθη με αντιδραστήριο Hiperfect διαμόλυνσης (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Western Blotting

MPanc96, HPSC, HUVEC και MLEC κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με siRNA ελέγχου ή siRNAs κατά ADMR ή CRLR και μετά από 72 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με το αντιδραστήριο BioRad. Πρωτεΐνη (50 μg) φορτώθηκε επί 10% πηκτών SDS-PAGE και κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι ADMR (cat # LS-Α4048 MBL International Corporation, Woburn, ΜΑ) σε αραίωση 1: 1000 και χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές αντίσωμα κατά CRLR (cat # sc-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε αραίωση 1: 100. Η ίδια κηλίδα εκ νέου ανιχνεύθηκαν για β-ακτίνη (1:200 αραίωση? Cat # A2066 Sigma, St.Louis, ΜΟ)., Η οποία χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης

RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από HPSC, HUVEC και MLEC κύτταρα με ή χωρίς siRNA επιμόλυνση και από πάγκρεας ποντικού. DNase χρησιμοποιήθηκε για να αφαιρέσει μολυσματικό γονιδιωματικό DNA μετά τον καθαρισμό του RNA. Η ακεραιότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με τρέξιμο σε ένα πήκτωμα μετουσίωσης, και παρατηρώντας σαφείς ζώνες 28S και 18S rRNA. Ένα μη αντίστροφη μεταγραφή έλεγχος διεξήχθη για να εξασφαλιστεί ότι δεν γονιδιωματικό DNA ενισχύθηκε. RT-PCR διεξήχθη με τους εκκινητές ανθρώπου και ποντικού AM /ADMR /CRLR για τον προσδιορισμό της έκφρασης και τα επίπεδα του σιγαστήρα τους. Αντίστροφη μεταγραφή ακολουθούμενη από 35 κύκλους PCR πρότυπο (1-min μετουσίωση στους 94 ° C, 1 min-ανόπτηση στους 63 ° C, και 1 λεπτού επέκταση στους 72 ° C). Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για την ανθρώπινη AM (Genebank: NM_001124) ήταν: προς τα εμπρός 5’CGG GAT CCA TGA AGC TGG ΤΤΤ CCG TC 3 ‘και να αντιστραφεί, 5’ CGG ΑΑΤ TCC ΤΑΑ AGA ΑΑΟ ΤΟΟ GGA GC 3 ‘. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για την ανθρώπινη ADMR (Genebank: NM_007264) ήταν: προς τα εμπρός 5 ‘CAT CGC GGA ΚΔ GGG CAT TGT 3’ και να αντιστραφεί, 5 ‘TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3’. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για την ανθρώπινη CRLR (Genebank: NM_005795) ήταν: διαβιβάσει 5’TGC TCT ΟΤΟ AAG GCA ΤΤΤ AC 3 ‘και να αντιστραφεί, 5’ CAG ΑΑΤ TGC TTG AAC CTC TC 3 ‘. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για AM ποντίκι (Genebank: NM_009627) ήταν: προς τα εμπρός 5 ‘CCA GGG TTC CCG CAG CAA 3’ και να αντιστραφεί, 5 ‘CTA ΤΑΤ ΚΔ ΑΑΑ GAG TCT GG 3’. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για ADMR ποντίκι (Genebank: NM_007412) ήταν: προς τα εμπρός 5 ‘CCG ΤΤΑ ΚΔ TCC CAA GGA 3’ και να αντιστραφεί, 5 ‘ΤΤΑ GCT GGC TAC AGA ΑΤΤ GCA 3’. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν για CRLR ποντίκι (Genebank: NM_018782) ήταν: προς τα εμπρός 5 ‘ΤΟΟ CTT TTC CCA CTC TGA Τ 3’ και να αντιστραφεί, 5 ‘TCA CAT CAC TAG ATC ΑΤΑ CGT 3’. 18S εκκινητές υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης για τα RT-PCR αντιδράσεις. Τα ενισχυμένα προϊόντα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1.5% και κατέστησαν ορατά με βρωμιούχο αιθίδιο.

μελέτες κυτταρικής ανάπτυξης

HPSC, HUVEC και τα MLEC (1000 κύτταρα) απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 0.5% ορό που περιέχουν μέσα με ή χωρίς ΑΜ (0-200 ηΜ) ή ΑΜΑ (1 μΜ), τα οποία ανανεώνονται καθημερινά, και οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν μετά από 48 ώρες για HPSC και τα κύτταρα HUVEC και μετά από 96 ώρες για τα MLEC με δοκιμασία MTS. Για τις μελέτες siRNA, HPSC, HUVEC και τα MLEC (1000 κύτταρα) απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και τα αντίστοιχα ανθρώπινα και ποντικού siControl /siADMR /siCRLR επιμολύνθηκαν και οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν μετά από 48 ώρες για τα HPSC και HUVEC κύτταρα και μετά από 96 ώρες για το Τα MLEC. Η ανάπτυξη των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο MTS προστίθεται μία ώρα πριν τη λήψη του φασματοφωτομετρικής ανάγνωσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI).

In vitro

αγγειογένεση δοκιμασία

HUVEC και MLEC (1 × 10

4) κύτταρα σπάρθηκαν πάνω στην επιφάνεια του πολυμερισμένου ECMatrix που παρασκευάζεται όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Cat # ECM625? Chemicon Intl, Millipore Corp, Billerica, ΜΑ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΜ (200 ηΜ) ή ΑΜΑ (1 μΜ) πεπτίδια και μετά τον σχηματισμό του σωλήνα 6 ωρών αξιολογήθηκε υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Κέντρο Valley, ΡΑ). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διατηρημένα με απλή ψύξη, με συζευγμένο φορτίο κάμερα της συσκευής (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) και το λογισμικό SmartCapture (Digital Scientific, Cambridge, UK). Εικόνες περαιτέρω επεξεργασία με το λογισμικό Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Για την ποσοτικοποίηση των αγγειογενετικών γεγονότα, τα πρότυπα ανάπτυξης των κυττάρων σε 10 τυχαία πεδία σε 100 × μεγέθυνση αξιολογήθηκε σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή και βαθμολογούνται ως εξής: Ατομική κύτταρα, και χωρίζονται -0? Κύτταρα μετανάστευσαν και ευθυγραμμίζονται -1? Τριχοειδείς σωλήνες ορατό, δεν βλάστησης -2? Βλάστησης των τριχοειδών σωλήνων -3? Κλειστά πολύγωνα σχηματίζονται – 4? και πολύπλοκες πλέγμα-όπως δομές που αναπτύχθηκε -5

Η ανοσοϊστοχημική χρώση -. CD31 /VEGF

Μη προετοιμασμένο τομές 4 μm ιστού από siControl ή siADMR ποντίκια που έλαβαν αγωγή αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με αιθανόλη. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε θέσεις πρόσδεσης μεθανόλη και μη ειδικής αποκλείστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού πρωτεΐνη (5% κανονικό άλογο και 1% φυσιολογικό ορό κατσίκας). Πρωτογενές αντίσωμα κατά του CD31 (1: 800 αραίωση? Cat # 01951A? BD Pharmingen, San Diego CA) /VEGF (1:100 αραίωση? Cat # sc-152? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) προστέθηκε και τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερογενής αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα πλακίδια αναπτύχθηκαν με 3,3-διαμινοβενζιδίνη (DAB) υπόστρωμα με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη, μονιμοποιήθηκαν με ξυλόλιο και τοποθετήθηκαν. Ανοσοϊστοχημεία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Κέντρο Valley, PA). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διατηρημένα με απλή ψύξη, με συζευγμένο φορτίο κάμερα της συσκευής (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) και το λογισμικό SmartCapture (Digital Scientific, Cambridge, UK). Εικόνες περαιτέρω επεξεργασία με το λογισμικό Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Διαφάνειες τυφλώθηκαν και αναλύθηκαν με πυρήνα IHC στο Τμήμα Βιολογίας του Καρκίνου, UT MDACC.

DOPC nanoliposome συνδυασμό siRNAs.

Για τα πειράματα για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα του

in vivo

θεραπευτική στόχευση των ADMR σε ορθοτοπική όγκων σε ποντικούς, ουδέτερα λιποσώματα που περιέχουν siRNAs παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, siRNA ολιγονουκλεοτίδια (χωρίς φουρκέτες) για να ADMR στοχεύουν αλληλουχίες (ανθρώπινη siADMR (αίσθηση – 5 ‘rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3’)? Ποντίκι siRNA αλληλουχία αίσθηση – 5 ‘rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3’) ή αλληλουχίες ελέγχου (έλεγχος siRNA νόημα αλληλουχία – 5 ‘UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3’ ) (παραγγελία ανθρώπου και ποντικού ολίγο cat # Ανθρώπου siADMR – 1150080, 1150081? Mouse siADMR – 1129085-Η, 1129086-H? Control – 1129089, 1129090 από την Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, ΜΟ) αναμίχθηκαν με 1,2-διολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλχολίνη (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) σε αναλογία 10:01 (w /w) ϋΟΡΟ /siRNA και λυοφιλοποιήθηκε. Αμέσως πριν από

in vivo

χορήγηση, λυοφιλισμένα παρασκευάσματα ενυδατώθηκαν σε 0,9% αλατούχο διάλυμα σε συγκέντρωση 10 μg siRNA ανά 200 μΐ και καθαρίστηκαν με διαχωρισμό της ελεύθερης siRNA από τα λιποσώματα με μονάδες φίλτρου με όριο αποκλεισμού μεγέθους 30.000 daltons (Millipore Corp, Billerica, ΜΑ).

δοκιμασία ανοχής γλυκόζης.

Για την ανοχή στη γλυκόζη, τα ποντίκια ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 1.5 mg γλυκόζης /g σωματικού βάρους στις 9:00 π.μ., μετά από ένα 16-h γρήγορα. Η γλυκόζη του αίματος καθορίστηκε στα υποδεικνυόμενα φορές με δείγματα αίματος από την ουρά που λαμβάνονται με τη χρήση του glucometer Ascensia CONTOUR αίματος (Bayer Health Care, πόλη πίσσας, NY).

In vivo

μελέτες.

Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται αυστηρά σύμφωνα με τις ορθές πρακτικές των ζώων, όπως ορίζεται από τους αρμόδιους φορείς σε εθνικό ή /και τοπικό καλή διαβίωση των ζώων, καθώς και η εργασία των ζώων εγκρίθηκε από την αρμόδια επιτροπή (IACUC – 09-04-08832).

ορθοτοπική μοντέλο όγκου.

Κύτταρα MPanc96 και BxPC3 φέρουν shADMR ή shControl αναπτύχθηκαν όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενο [3] δημοσίευση. Αυτά τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα περαιτέρω τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν σταθερά το γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας με φακοϊό διαμόλυνση να διευκολυνθεί

in vivo

την παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου [25]. Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή, συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /50 μΙ κυττάρων MPanc96 και 2 × 10

6 κύτταρα /50 ul κυττάρων BxPC3 σε στείρο PBS και εγχέεται στο πάγκρεας των τεσσάρων εβδομάδων αρσενικών

αθυμικά γυμνά

ποντικών (n = 5). Η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας στο τέλος των τεσσάρων εβδομάδων.

πνεύμονα και μοντέλα μετάσταση στο ήπαρ.

Οι συγκρίσεις έγιναν μεταξύ των πνευμόνων και μετάσταση στο ήπαρ σε κύτταρα MPanc96 κυττάρων που φέρουν shADMR ή shControl χρησιμοποιώντας καθιερωμένες μοντέλα μετάστασης. Lung μεταστάσεις αναπτύχθηκαν με ένεση στη φλέβα της ουράς του 1 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ (n = 9) και ηπατικές μεταστάσεις από σπληνικά ένεση 1 × 10

6 κύτταρα /50 μΙ (n = 7) έως

αθυμικά γυμνά

ποντίκια και αξιολογούνται από την απεικόνιση βιοφωταύγεια. Μετά από έξι εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα όργανα αποκόπηκαν και αποθηκεύονται σε σταθεροποιητικό διάλυμα Bouin.

Παράδοση nanoliposome DOPC συνδυασμό siRNAs.

Για την αξιολόγηση της πιθανής τοξικότητας, τα πειράματα διεξήχθησαν nanoliposome παράδοση DOPC συνδυασμό siControl ή siADMR (ποντίκι) για να

αθυμικά γυμνά

ποντίκια (10 μg ανά ip ζώο δύο φορές εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες). Νερό και την πρόσληψη τροφής, το σωματικό βάρος και τα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα μετρήθηκαν. Τα ζώα θυσιάστηκαν μετά από τέσσερις εβδομάδες, το πάγκρεας απομονώθηκε και ολικό RNA εκχυλίστηκε. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η αποσιώπηση της ADMR, ενώ 18S χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος. Ορθοτοπική όγκοι αναπτύχθηκαν σε

αθυμικά γυμνά ποντίκια

με κύτταρα MPanc96 που φέρουν το γονίδιο της λουσιφεράσης (1 × 10

6 κύτταρα /50 μΙ αποστειρωμένου PBS) και δύο εβδομάδες αργότερα, DOPC nanoliposome συζευγμένο siControl και siADMRs (ανθρώπινη και το ποντίκι σε συνδυασμό) παραδόθηκαν 10 μg ανά ζώο ip δύο φορές την εβδομάδα για έξι εβδομάδες. Βιοφωτισμός απεικόνισης. Η βιοφωταύγεια απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύστημα κρυογονικά ψυχόμενο απεικόνισης συζευγμένο με ένα απόκτηση δεδομένων υπολογιστή που τρέχει το λογισμικό LivingImage (Xenogen Corp., Alameda, CA). Πριν από την απεικόνιση, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν σε ένα ακρυλικό θάλαμο με μείγμα 1,5% ισοφλουράνιο /αέρα και εγχύθηκε ί.ρ. με 40 mg /ml του άλατος καλίου λουσιφερίνης σε PBS σε μία δόση των 150 mg /kg σωματικού βάρους. Μια ψηφιακή κλίμακα του γκρι ζώο εικόνα αποκτήθηκε ακολουθούμενη από την απόκτηση και επικάλυψη μιας εικόνας ψευδοχρωμάτων αντιπροσωπεύει τη χωρική κατανομή των φωτονίων ανιχνεύεται αναδύεται από ενεργό λουσιφεράσης εντός του ζώου. Η ένταση σήματος προσδιορίστηκε ποσοτικά ως το άθροισμα όλων των ανιχνεύεται φωτόνια εντός της περιοχής ενδιαφέροντος ανά δευτερόλεπτο. Μετά την τελική απεικόνιση των όγκων, οι ιστοί απομακρύνθηκαν και τα ζώα επανα-απεικονίστηκαν να απεικονίσει και να μετρήσει τη διάδοση και μεταστάσεις των καρκινικών κυττάρων. Ιστοί και σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη και ιστολογία αξιολογήθηκαν για την επαλήθευση της ακρίβειας των στοιχείων βιοφωταύγεια.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα

in vitro

πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και διενεργείται σε τρεις ή περισσότερες χωριστές περιπτώσεις. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι των τριών ή περισσοτέρων ανεξάρτητων πειραμάτων ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ελέγχων και κατεργασμένων δειγμάτων προσδιορίστηκαν από την T-test δύο ουρών unpaired Student και ορίστηκαν ως * ρ & lt? 0.05. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4 λογισμικού (GraphPad Software, https://www.graphpad.com).

Αποτελέσματα

AM έχει αυτοκρινείς επιδράσεις στην HPSC, HUVEC και MLEC κύτταρα

Προηγουμένως παρατηρήσαμε ότι AM χρησίμευσε ως αυτοκρινής ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος [3]. Για να προσδιορίσετε αν AM επηρεάζεται επίσης HPSC, HUVEC και τα MLEC, εξετάσαμε πρώτα αν εκφράζεται AM και των υποδοχέων της ADMR και CRLR όπως μετράται με RT-PCR. Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν ΑΜ, ADMR και CRLR (Εικ. 1Α). Περαιτέρω, αξιολογήσαμε κατά πόσο αυτά τα κύτταρα εκκρίνεται ΑΜ σε μέσο καλλιέργειας ιστού χρησιμοποιώντας μία ELISA. Όλοι αυτοί οι τύποι κυττάρων που εκκρίνεται AM (Εικ. 1Β), υποστηρίζοντας το ρόλο αυτού του μορίου ως αυτοκρινής ρυθμιστής σε πολλαπλούς τύπους κυττάρων. Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της ΑΜ στη βιολογία αυτών των κυττάρων, εξωγενές AM προστέθηκε σε HPSC (Εικ. 1C), HUVEC (Σχ. 1D) και MLEC (Εικ. 1 Ε) κύτταρα και ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό MTS. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η βέλτιστη συγκέντρωση ήταν 50 AM ηΜ για HPSC και 200 ​​ηΜ για HUVEC και MLEC κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εκτός από AM στις βέλτιστες συγκεντρώσεις τονώσει την ανάπτυξη των HPSCs κατά 29 ± 1,8% (p & lt? 0.05), HUVECs κατά 25 ± 3,7% (p & lt? 0,05) και τα MLEC κατά 33 ± 4,5% (p & lt? 0,05). Επιπλέον, η προσθήκη του ανταγωνιστή ΑΜ, ΑΜΑ (1 μΜ), μείωσε το βασικό ανάπτυξη των HPSCs κατά 21 ± 5,3% (ρ & lt? 0,05), HUVECs κατά 21 ± 0,4% (ρ & lt? 0,05) και τα MLEC κατά 25 ± 5,1% ( p & lt? 0,05) υποστηρίζουν περαιτέρω μια αυτοκρινή ρόλο της ΑΜ σε αυτά τα κύτταρα. Να εξετάσει περαιτέρω τις επιπτώσεις των AM και πραγματοποιήσαμε

in vitro

δοκιμασίες αγγειογένεσης. AM διεγείρεται σχηματισμός πολύγωνο σε HUVECs (Σχ. 1F) και τα MLEC (Εικ. 1G) στις 6 ώρες σε σχέση με τον έλεγχο των πολιτισμών, και AMA μπλοκάρει τις πμ μεσολάβηση συνέπειες του σχηματισμού πολυγώνου.

(Α) RT-PCR που δείχνει την έκφραση του ΑΜ, ADMR, και CRLR επί HPSC, HUVEC και τα MLEC. δοκιμασία (Β) ELISA που δείχνει την έκκριση AM από HPSC, HUVEC και MLEC κύτταρα. Ελεύθερα ορού μέσα ενημέρωσης κολύμβησης αυτά τα κύτταρα συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν και εξετάστηκαν για την παρουσία της AM. Επίπεδα υπολογίστηκαν ως ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή. (C) HPSC, (D) HUVEC, ή (Ε) MLEC κύτταρα (1000 κύτταρα) απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και ΑΜ (50 ηΜ για HPSC και 200 ​​ηΜ για HUVEC και MLEC) ή ΑΜΑ (1 μΜ) προστέθηκαν στις πλάκες καθημερινά και οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν μετά από 48 ώρες για HPSC και τα κύτταρα HUVEC και μετά από 96 ώρες για τα MLEC με δοκιμασία MTS. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου WT, ΑΜ διέγειρε τον πολλαπλασιασμό και των τριών τύπων κυττάρων. Ομοίως, η θεραπεία ΑΜΑ ανέστειλε βασικός πολλαπλασιασμός όλων των κυττάρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσα +/- SEM (* ρ & lt? 0,05).

In vitro

δοκιμασίες αγγειογένεσης διεξήχθησαν με (F) και HUVEC (G) MLEC κύτταρα. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μήτρα ΕΚ μαζί με ΑΜ (200 ηΜ) μόνο του ή σε συνδυασμό με ΑΜΑ (1 υΜ). Μετά από 6 ώρες το σχηματισμό σωλήνα αξιολογήθηκε μικροσκοπικά ως ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή. Που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά μικρογραφίες. AM διεγερμένα με συνέπεια HUVEC και MLEC κύτταρα να σχηματίζουν σωλήνες, ενώ ΑΜΑ ανέστρεψε τα αποτελέσματα της AM.

Η

Οι επιδράσεις της ΑΜ σε κύτταρα HPSC, HUVEC και MLEC διαμεσολαβούνται μέσω του υποδοχέα ADMR

υπάρχουν δύο πιθανές υποδοχείς που ανταποκρίνονται σε ΑΜ, ADMR και CRLR. Αναφέραμε προηγουμένως ότι τα ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν αποκλειστικά ADMR ενώ HPSC και HUVEC κύτταρα εξέφρασαν τόσο AM υποδοχείς [3]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι τα MLEC εκφράζουν επίσης δύο υποδοχείς. Για να προσδιοριστεί η σχετική σημασία αυτών των υποδοχέων που τους σιγήσει ανεξάρτητα σε αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας τεχνικές siRNA. Η επιμόλυνση με siRNA μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του είτε ADMR ή CRLR επί HPSC (Εικ. 2Α), HUVEC (Εικ. 2Β) και τα MLEC (Σχ. 2C), σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNAs. HPSC, HUVEC και τα MLEC σιγήσει με siRNA είτε ADMR ή CRLR εξετάστηκαν σε δοκιμασίες ανάπτυξης όπου οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο MTS. Αποσιώπηση του ADMR, αλλά όχι CRLR, μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη όλων αυτών των τύπων κυττάρων. Φίμωση της ADMR μείωσε την ανάπτυξη των HPSC κατά 21 ± 3,4% (p & lt? 0,05) (Εικ. 2D), HUVECs κατά 24 ± 1,8% (p & lt? 0,05) (Σχ. 2Ε) και τα MLEC κατά 26 ± 4,3% (p & lt? 0,05) (Σχ. 2F). Φίμωση της ADMR σε HUVECs (Σχ. 2G) και τα MLEC (εικ. 2Η) καταργήθηκε πλήρως ΑΜ μεσολάβηση του σχηματισμού σωλήνα, ενώ η αποσιώπηση των CRLR μερικώς μειωμένο σχηματισμό σωλήνα. Τα δεδομένα αυτά συλλογικά δείχνουν ότι οι αυτοκρινείς επιδράσεις της ΑΜ σε κύτταρα HPSC, HUVEC και MLEC διαμεσολαβείται κυρίως μέσω της ADMR υποδοχέα αν CRLR μπορεί επίσης να έχει κάποιες συνέπειες.

(Α) HPSC και (Β) κύτταρα HUVEC ήταν παροδικά επιμολυσμένα με ανθρώπινο siRNAs και κυττάρων (C) MLEC επιμολύνθηκαν με siRNAs ποντικού (siControl, siADMR, ή siCRLR). Μετά από 72 ώρες τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η πρωτεΐνη ή το RNA εκχυλίστηκε. Κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ανθρώπινα αντισώματα δείχνει την έκταση της αποσιώπησης της ανθρώπινης ADMR και CRLR σε HPSC και τα κύτταρα HUVEC, και RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ποντικιού δείχνει τις επιδράσεις της siADMR ποντικιού και siCRLR για τα MLEC. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για western blotting και 18S εκκινητές χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης για RT-PCR. Οι γέλες Πλήρους μήκους που παρουσιάζονται στο Σχήμα S1. Οι επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού του siRNA μεσολαβεί αποσιώπηση των υποδοχέων φαίνεται στο (D) HPSC, (Ε) HUVEC, και (F) MLEC κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα αντίστοιχα του ανθρώπου ή ποντικού siRNAs τους (siControl, siADMR, ή siCRLR) για 24 ώρες και στη συνέχεια ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS μετά από επιπλέον 48 ώρες για τα HPSC και τα κύτταρα HUVEC και 96 ώρες για τα MLEC. Φίμωση της ADMR αλλά δεν CRLR προκάλεσε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αυτών. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσα +/- SEM (* ρ & lt? 0,05).

In vitro

αγγειογένεση δοκιμασία με (G) HUVEC και (H) MLEC κύτταρα. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε γέλη μήτρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με τις αντίστοιχες ανθρώπου ή ποντικού siRNAs τους (siControl, siADMR, ή siCRLR). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΜ (200 ηΜ) επί 6 ώρες και εξετάζονται μικροσκοπικά. Η έκταση του σχηματισμού σωλήνα αξιολογήθηκε ως ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφίες εμφανίζονται. ADMR φίμωση σχηματισμό εντελώς αποκλεισμένο σωλήνα, ενώ CRLR φίμωση μόνο εν μέρει μειωμένη σχηματισμό σωλήνα.

Η

Σίγαση ADMR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μειωμένη ανάπτυξη και μετάσταση όγκου

in vivo

Η

για την εξέταση των επιπτώσεων της ADMR φίμωση σε καρκινικά κύτταρα, παρατηρήσαμε την ανάπτυξη των όγκων ορθοτοπική σχηματίζεται από δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος επιμολυσμένα με είτε shADMR ή shControl. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν μετά από 4 εβδομάδες με απεικόνιση βιοφωταύγειας. Το μέγεθος του όγκου μειώθηκε κατά 92 ± 0,5% σε ADMR σιγήσει MPanc96 όγκους όταν συγκρίνονται με τον έλεγχο όγκους φορέα που φέρει (ρ & lt? 0,05) (σχήμα 3Α).. Ομοίως, ο όγκος του όγκου BxPC3 μειώθηκε σημαντικά κατά 83 ± 0,6% μετά ADMR σίγασης που σε σύγκριση με τον έλεγχο όγκους (ρ & lt? 0,05) (Σχ 3Β).. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, υπήρχε επίσης μια μείωση στον πνεύμονα και το ήπαρ μετάσταση και τη μείωση των περιτοναϊκή διάχυση. Ωστόσο, επειδή ADMR σίγηση μείωσε τον όγκο του όγκου? οποιαδήποτε μείωση στη μετάσταση μπορεί να οφείλεται στη γενική μείωση στον όγκο του όγκου.

ορθοτοπική όγκοι αναπτύχθηκαν με MPanc96 (Α) ή BxPC3 (Β) κύτταρα σταθερώς σιγήσει με shADMR και εκφράζουν το γονίδιο της λουσιφεράσης. Μετά από 4 εβδομάδες, ο όγκος του όγκου εκτιμήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας και έδειξε μία σημαντική μείωση μεταξύ ADMR και shControl όγκοι φορέα που φέρει από δύο τύπους κυττάρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσα +/- SEM για 10 ζώα ανά ομάδα. (* P & lt? 0,05) βιοφωταύγεια εικόνες του εκπροσώπου ποντίκια παρέχονται επίσης

Η

Σίγαση ADMR σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μειώνεται μετάσταση

in vivo

Η

Για να αξιολογηθεί άμεσα. ο ρόλος των ADMR στον παγκρεατικό καρκίνο του πνεύμονα και μετάσταση στο ήπαρ, πραγματοποιήσαμε ξεχωριστές μελέτες σε

nude

ποντίκια με φλέβα της ουράς και του σπλήνα ένεση, αντίστοιχα. ADMR αποσιώπηση μείωσε τη συχνότητα με μετάσταση στους πνεύμονες (ShControl – 67% Vs ShADMR – 22%), όπως μετράται με βιοφωταύγεια απεικόνισης (Εικόνα 4Α.). Επιπλέον, η παρουσία της μετάστασης ανιχνεύσιμη χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωτισμός αναβλήθηκε από το 2

η εβδομάδα στα ζώα ελέγχου σε 5

ης εβδομάδας στο shADMR κύτταρα που φέρουν. Αποκομμένα πνεύμονες μετά από στερέωση σε διάλυμα Bouin έδειξαν μείωση στον αριθμό των μεταστατικών εστιών πνεύμονα, όπως φαίνεται στην αντιπροσωπευτική εικόνα (Εικ. 4C). Οι επιδράσεις της ADMR φίμωση για μετάσταση στο ήπαρ ήταν παρόμοιες με εκείνες που αφορούν μετάσταση πνεύμονα. ADMR αποσιώπηση μείωσε τη συχνότητα εμφάνισης ηπατικών μεταστάσεων (ShControl – 100% Vs ShADMR – 43%) (Σχήμα 4Β.). Η παρουσία ανιχνεύσιμων μεταστάσεων αναβλήθηκε από το 2

ου εβδομάδα μέχρι το 5

ης εβδομάδας. Μείωση του αριθμού των ηπατικών μεταστατικών εστιών εμφανίζεται ως αντιπροσωπευτική εικόνα (Εικ. 4D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΑΜ μπορεί να λειτουργήσει ως μετάσταση επαγωγέας παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων και αυτών των επιπτώσεων της AM επί καρκινικών κυττάρων διαμεσολαβούνται μέσω του υποδοχέα ADMR.

MPanc96 κύτταρα που φέρουν λουσιφεράσης γονίδιο σταθερώς επιμολυσμένα με κύτταρα shControl ή shADMR ενέθηκαν εντός της φλέβας της ουράς για τη μέτρηση της μετάστασης πνεύμονα και στο σπλήνα για τη μέτρηση της ηπατικής μετάστασης. Τα ζώα που φέρουν ADMR σιγήσει κύτταρα έδειξαν μείωση στη συχνότητα εμφάνισης του πνεύμονα (Α) και ηπατικών μεταστάσεων (Β) όπως μετρήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας. Μετά από 6 εβδομάδες τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο πνεύμονας και το ήπαρ επίσης εκτομή και εξετάστηκαν χονδροειδώς και ιστολογικά. Σταθερό σίγηση του ADMR μείωσε τον αριθμό των μεταστατικών εστιών σε πνεύμονα και ήπαρ σε σύγκριση με shControl. Αντιπροσωπευτικά εικόνες δείχνουν τη μείωση του αριθμού των μεταστατικών εστιών στους πνεύμονες (C) και τα συκώτια (D).

Η

I

n vivo

στόχευση του ADMR χρησιμοποιώντας συστηματική χορήγηση siRNAs είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου

τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ένα ρόλο για ADMR στα αποτελέσματα της ΑΜ σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.