Abstract

Καθώς η pentaspan δείκτης βλαστικών κυττάρων CD133 δείχθηκε ότι δεσμεύεται χοληστερόλη και να εντοπίζεται σε προεξοχές μεμβράνη πλάσματος, ερευνήσαμε μια πιθανή λειτουργία για CD133 ενδοκυττάρωση. Χρήση του CD133 siRNA knockdown στρατηγική και μη διαφοροποιημένο καρκίνο του κόλου ανθρώπου Caco-2 κύτταρα τα οποία συστατικώς υπερ-εκφράζεται CD133, παρέχουμε για πρώτη φορά άμεση απόδειξη για ένα ρόλο του CD133 στην ενδοκυτταρική συσσώρευση των σημασμένων με φθορισμό εξωκυτταρικών ενώσεων. Αξιολογήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος AC133, CD133 νοκ ντάουν φάνηκε να βελτιώσει Alexa488-τρανσφερίνης (Tf) πρόσληψη σε κύτταρα Caco-2, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στις FITC-δεξτράνη ή FITC-χολέρας τοξίνη. Απουσία της επίδρασης του νοκ ντάουν CD133 για την ανακύκλωση Tf συσταθεί ένα ρόλο για CD133 στην αναστολή ενδοκύτωση Tf και όχι για την τόνωση της Tf εξωκυπάρωσης. Χρήση έχουν εντοπιστεί στο παρελθόν αναστολείς των γνωστών ενδοκυτταρικά μονοπάτια και τη θετική επίδραση της CD133 νοκ ντάουν στην κυτταρική πρόσληψη των συνθετικών νανοκαψουλών λιπιδίων clathrin-ενδοκυτταρώνεται υποστήριξε ότι CD133 αντίκτυπο στην ενδοκύττωση ήταν κατά κύριο λόγο αποδίδεται στην οδό clathrin. Επίσης, εκχύλιση της χοληστερόλης με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνης up ρυθμιζόμενη πρόσληψη Tf σε μεγαλύτερη ένταση στο CD133

υψηλή κατάσταση από ό, τι κατά τη χαμηλή κατάσταση CD133

, υποδηλώνοντας έτσι έναν ρόλο για χοληστερόλης στο ανασταλτικό αποτέλεσμα του CD133 επί ενδοκυττάρωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία των κυττάρων με το αντίσωμα AC133 ρυθμίζεται κάτω πρόσληψη Tf, αποδεικνύοντας έτσι ότι η άμεση σύνδεση προς CD133 εξωκυτταρικό θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενδοκυττάρωση. Επιπλέον, κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή μικροσκοπία διαπιστώθηκε ότι κάτω ρύθμιση του CD133 βελτίωσε τη δυνατότητα πρόσβασης στο TfR από τον εξωκυττάριο χώρο, παρέχοντας ένα μηχανισμό με τον οποίο CD133 ανέστειλε την πρόσληψη Tf. Όπως Tf εμπλέκεται στην παροχή σιδήρου στο κύτταρο, διερευνήθηκαν επιπτώσεις των συμπληρωμάτων σιδήρου και στέρηση για έκφραση CD133 /AC133. Τόσο επέδειξε μια ρύθμιση δοσοεξαρτώμενη εδώ κάτω συζητούνται στο φως της μεταγραφικής και μετα-μεταγραφικό επιδράσεις. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά να επεκτείνει τις γνώσεις μας για τη λειτουργία του CD133 και υπογραμμίζουν το ενδιαφέρον για περαιτέρω διερεύνηση του δικτύου CD133-Tf-σιδήρου

Παράθεση:. Bourseau-Guilmain Ε, Griveau Α, Benoit JP, Garcion Ε ( 2011) Η σημασία της βλαστικών κυττάρων δείκτης προμινίνη-1 /CD133 στην πρόσληψη της τρανσφερίνης και σιδήρου μεταβολισμού στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου Caco-2 κύτταρα. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10.1371 /journal.pone.0025515

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Μάρτη 2011? Δεκτές: 7 του Σεπτεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Bourseau-Guilmain et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το «Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale», το «τσεκούρι Cellules Souches et Cancer» στο «Cancéropôle Μεγάλο-Ouest» και «La Ligue Contre Καρκίνου le» μέσω «Equipe Labellisée 2007″ επιχορήγηση . Erika Bourseau αρχικά ήταν υπότροφος διδακτορικό με το «Conseil Général de Maine-et-Loire» και, στη συνέχεια, ένας συνεργάτης διδακτορικό με την «Comité Νομαρχιακή de Maine-et-Loire de La Ligue Contre le Cancer». Audrey Griveau ήταν υπότροφος διδακτορικό με το «Conseil Général de Maine-et-Loire». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μετά την χρήση των νέων μονοκλωνικών αντισωμάτων εγείρονται έναντι νευροεπιθηλιακών και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, CD133, επίσης γνωστή σε ανθρώπους και τρωκτικά ως προμινίνη-1, ήταν πρώτα απομονώθηκε και κλωνοποιήθηκε το 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη πέντε-τομέα, που αποτελείται από ένα Ν-τερματικό εξωκυτταρικό ουρά, δύο μικρά κυτταροπλασματικά βρόχους, δύο μεγάλες εξωκυτταρικούς βρόχους που περιέχει επτά πιθανές θέσεις γλυκοζυλίωσης και μια σύντομη Οτελική ενδοκυτταρική ουρά που μπορεί να εναλλακτικά ματισμένες [4] ή φωσφορυλιωμένη [5].

Παρά τις συνεχείς προσπάθειες έρευνας, η βιολογική λειτουργία του CD133 παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Μεταξύ διαβόητη φαινότυποι, έχει δειχθεί ότι μία κολοβωμένη CD133, η οποία δεν μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη, οδηγεί σε ανθρώπινο εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς [6]. Υπογραμμίζοντας τη σημαντική αυτή την παρατήρηση, την ανάλυση μιας γενιάς CD133-ανεπαρκή ποντίκια αποκάλυψε ότι, ενώ εκφράζεται πολύ νωρίς κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς, CD133 ενήργησε ως βασικός ρυθμιστής της μορφογένεσης στο δίσκο και ότι η απώλεια του CD133 προκάλεσε φωτοϋποδοχέων εκφυλισμό και τύφλωση [7]. Επιπλέον, AC133, μία γλυκοζυλιωμένη επίτοπο CD133 πρωτεΐνη αρχικά συνδέονται με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [8] και μία ποικιλία σωματικών βλαστικών κυττάρων, εκτεταμένα περιγραφεί ως ένα υποθετικό κυτταρικό δείκτη καρκινικά βλαστικά στο αίμα, εγκέφαλο, κόλον, προστάτη, πνεύμονα, μαστού , καρκίνους του ήπατος, και το δέρμα [9], [10]. Άλλες έρευνες αποκάλυψαν ότι CD133 συνδέεται με το μεταβολισμό των κυττάρων ως αποκρίνεται γονίδιο γλυκόζης σε μυοσωληνάρια [11], καθώς και την παροχή αποδεικτικών στοιχείων για βιοενεργητική στρες [12] και της μη έκθεσης σε υψηλή τάση οξυγόνου σε γλοιώματα (Bourseau-Guilmain et al. , η οποία υποβλήθηκε).

στο υποκυτταρικό επίπεδο, CD133 κατά προτίμηση εντοπίζεται σε προεξοχές πλασματική μεμβράνη και μικρολάχνες [13]. Από εκεί, CD133 μπορεί να συνδεθεί με χοληστερόλη [14] και να αλληλεπιδρούν με γαγγλιοσίδες [15]. Όπως προεξοχές μεμβράνη και μικρολάχνες η δυνατότητα επέκτασης της επιφάνειας της μεμβράνης, προκειμένου να αυξήσουν την έκθεση κυττάρου στο εξωκυτταρικό χώρο, αυτές οι παρατηρήσεις παρέχουν σημαντικές ενδείξεις για την ταυτοποίηση της μοριακής ρόλος του CD133, κυρίως με την εξέταση κυτταρικών ανταλλαγές με το μικροπεριβάλλον. Πράγματι, CD133 βρέθηκε σε κυστίδια μεμβράνης διαφορετική από εξωσώματα που κυκλοφόρησαν από τα επιθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης [16].

Παράλληλα με αυτά τα έξω-in σήματα, χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια διαχωρίζονται σε μικροεπικράτειες λιπιδική μεμβράνη σχεδία εμπλακεί στα εσωτερικά -out σηματοδότηση και ενδοκυττάρωση [17], [18]. Λαμβάνοντας υπόψη τη στενή σχέση μεταξύ CD133 και της χοληστερόλης, καθώς και πιθανή σύνδεση της με σφιγγολιπίδια και την έκθεση στον εξωκυττάριο χώρο, υποθέσαμε ότι CD133 εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση: μια θεμελιώδη διαδικασία με την οποία οι ενώσεις εξωκυττάρια εσωτερικεύεται και θα διανεμηθεί σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα

στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας τη στρατηγική RNA παρεμβολές και αδιαφοροποίητη ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου Caco-2 κύτταρα τα οποία συστατικώς υπερεκφράζεται CD133 /AC133, παρέχουμε για πρώτη φορά αποδείξεις για έναν ρόλο της CD133 στην ενδοκυτταρική συσσώρευση εξωκυτταρικής ενώσεων , κυρίως παραδειγματικά με τρανσφερίνης (Tf). Εκτός από τα στοιχεία που καθιερώνουν ένα ρόλο για CD133 ενδοκυττάρωση, αποδεικνύουμε επίσης ότι η ίδια CD133 ρυθμίζεται από σίδηρο, υποστηρίζοντας έτσι την ύπαρξη ενός δικτύου Tf-CD133-σιδήρου. Αυτές οι νέες παρατηρήσεις συζητηθεί υπό το φως του προτύπου CD133 της έκφρασης και της τρέχουσας γνώσης στον τομέα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Μη διαφοροποιημένες ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου Caco- 2 κύτταρα (American Type συλλογή καλλιέργειας: ΗΤΒ-37 ™) καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM? Lonza, Levallois-Perret, Γαλλία) που περιέχει 4.5 g /L γλυκόζη και L-γλουταμίνη. Το μέσο προστέθηκε με 10% ορού εμβρύου μόσχου (FBS? Lonza, Verviers, Βέλγιο), 1% αντιβιοτικά (10 μονάδες /mL πενικιλίνη, 10 mg /mL στρεπτομυκίνη, 25 μg /mL αμφοτερικίνη Β? Sigma-Aldrich, Saint- Louis, USA, ΜΟ) και 1% του μη-ουσιώδη αμινοξέα (ΝΕΑΑ? Lonza, Verviers, Βέλγιο). Όταν τα κύτταρα έφθασαν το 80% συρροή, είχαν διαχωριστεί σε 0,5% θρυψίνη χοίρου και 0,2 g /mL EDTA (Lonza, Verviers, Βέλγιο) πριν από την εκ νέου επένδυση σε μη επικαλυμμένες πλαστικές φιάλες σε 15 × 10

3 κύτταρα /cm

2. Το ήμισυ το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο κάθε δύο ημέρες.

siRNA knockdown του CD133

κύτταρα Caco-2 απλώθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων με 2.3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 2 mL του παραπάνω μέσου για 24 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 ηΜ ολιγονουκλεοτιδίου RNA διπόλων (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Ν-TER σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma-Aldrich). Ν-TER /σύμπλοκα siRNA στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο Caco-2 για 48 ώρες στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. siRNA στη συνέχεια απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες. Μια αγωνίζομαι ακολουθία χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας: 5′-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 ‘. Η ακολουθία που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της αναστολής παρεμβολή στοχευμένου RNA του CD133 ήταν 5’-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 ‘.

AC133 ανοσοσήμανση

Caco-2 κύτταρα που εκτίθενται σε siRNA συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας Versene (Lonza) . Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μg /mL AC133 αντίσωμα (Miltenyi Biotech, Paris, France) ή IgG1κ ελέγχου ισοτύπου (BD-Biosciences, Le Pont-de-Claix, Γαλλία) για 1 ώρα στους 4 ° C σε PBS που περιέχει 5% FBS και 0.02% αζίδιο νατρίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS που περιέχει 5% FBS και 0,02% αζίδιο του νατρίου, και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG F (ab ‘) 2 θραύσμα πολυκλωνικό αντίσωμα (DakoCytomation, Trappes, Γαλλία) στα 20 μg /mL σε PBS που περιέχει 5% FBS και 0,02% αζίδιο του νατρίου. Μετά από τρεις περισσότερες πλύσεις σε PBS που περιέχει 5% FBS και 0,02% αζίδιο νατρίου, τα κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 2% φορμαλδεΰδη και 0,02% αζίδιο του νατρίου.

Η κυτταρομετρία ροής

A BD FACSCalibur ™ φθορισμού που ενεργοποιείται κυτταρόμετρο ροής και το λογισμικό BD CellQuest ™ (BD-Biosciences) χρησιμοποιήθηκαν για κυτταρομετρία ροής απόκτησης. Ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας WinMDI 2,9 λογισμικού (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA).

Σύνθεση του Νείλου νανοκαψουλών κόκκινο-επισημασμένου λιπιδίου (NR-LNC)

50 nm κόκκινο του Νείλου ( NR) -σημασμένου λιπιδίων νανοκάψουλες (LNC) (NR-LNC) που ενσωματώθηκε την ένωση του φθορισμού NR παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] χρησιμοποιώντας μία διαδικασία αντιστροφής φάσης που ακολουθεί τον σχηματισμό ενός μικρογαλακτώματος ελαίου /ύδατος που περιέχουν τριγλυκερίδια (Labrafac® WL 1349, Gattefossé, Saint-Priest, Γαλλία), ένα μη ιονικό υδρόφιλο επιφανειοδραστικό (Solutol® HS 15, GmbH, Ludwigshafen, Γερμανία) και λεκιθίνες (Lipoid® S75-3, Gmbh). NR διαλύθηκε σε ακετόνη σε 1% (β /β), και το προκύπτον διάλυμα NR ενσωματώθηκε σε Labrafac® στις 1:10 (β /β). Έτσι, 846 mg Solutol®, 75 mg Lipoid®, 1029 mg Labrafac® περιέχουν NR, 89 mg NaCl και 2.975 mg νερού αναμίχθηκαν και θερμάνθηκαν υπό μαγνητική ανάδευση έως 85 ° C. Τρεις κύκλοι προοδευτικής θέρμανσης και ψύξης σε μεταξύ 85 ° C και 60 ° C στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε. Είχαν τελικά ακολουθείται από μία μη αναστρέψιμη σοκ που προκαλείται από αραίωση με 12.5 mL από 0 ° C απιονισμένου νερού προστίθεται στην ζώνη φάση αναστροφής. Αποκλεισμού μεγέθους και υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) προσδιορισμοί έδειξαν μια πλήρη ενθυλάκωση και τη διατήρηση της NR όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως [19]. LNC αναλύθηκαν για κατανομή μεγέθους τους, χρησιμοποιώντας ένα Malvern Zetasizer® Nano Series DTS 1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).

Η εσωτερίκευση του τρανσφερίνης (Tf), δεξτράνη (Dx), τοξίνη χολέρας υπομονάδα Β (CTB ) και νανοκάψουλες λιπιδίων (LNC)

Το μέσο επιμολυσμένων κυττάρων απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε από DMEM συμπληρωμένο με 1% του Ν1 μέσου χωρίς ορό (Sigma Aldrich) για 1 ώρα. Οι ακόλουθες τρεις ενώσεις, Tf-Alexa 488 σε 0.5 και 5 μg /mL (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), DX-FITC σε 0,5 και 5 mg /mL (Sigma Aldrich) και CTB-FITC σε 1 και 10 μg /mL (Invitrogen), ή αντί, NR-LNC σε 1/1000 αραίωση από αρχικό εναιώρημα που αντιστοιχεί έτσι σε μια συγκέντρωση 100 μg /mL, στη συνέχεια προστέθηκαν στο μέσο για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας Versene (Lonza). Για να ενεργοποιήσετε προσδιορισμό του κλάσματος των επισημασμένων μορίων ή σωματιδίων που αποτελεσματικά εσωτερικοποιείται μέσα στα κύτταρα, εξωκυτταρικές φθορισμός σβέσθηκε με τη χρήση 0,4% trypan blue (Sigma Aldrich). Τα κύτταρα μετά πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 2% φορμαλδεΰδη και 0,02% αζίδιο του νατρίου. Η εσωτερίκευση του επισημασμένου με φθορισμό Tf, Dx, CTB και LNC παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής.

χρησιμοποιήθηκαν Ανάλυση της απελευθέρωσης του Tf από κύτταρα Caco-2 μετά την εσωτερίκευση

Έλεγχος και CD133-ειδικό siRNA να δημιουργήσει CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή επιμολυσμένα κύτταρα Caco-2, αντίστοιχα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Tf-Alexa 488 για 2 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 πριν το εξωκυτταρικό μέσο απομακρύνθηκε, πλύθηκε και αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο χωρίς από Tf-Alexa 488. Μετά από περαιτέρω επώαση στους 37 ° C /5% CO

2 για 1 ώρα, 2 ώρες και 3 ώρες, το υπόλοιπο ενδοκυτταρική Tf-Alexa 488 φθορισμού, που αντιπροσωπεύει το ποσό του Tf-Alexa 488 που δεν ανακυκλώνεται στο εξωκυτταρικό διαμέρισμα, μετρήθηκε με ημι- ποσοτική κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται παραπάνω.

θεραπεία κυττάρων με χημικοί αναστολείς της ενδοκυττάρωσης και κυτταρική πρόσληψη του Tf

χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως ταυτοποιηθεί χημικών αναστολέων των γνωστών ενδοκύττωσης οδών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20 ], [21]. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα Caco-2 προ-αγωγή με αναστολείς για 1 ώρα στους 37 ° C σε μέσο Ν1. Χλωροπρομαζίνη (10 μg /mL? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει κλαθρίνη μεταφορά μέσω [22], ενώ φιλιπίνη (1 μg /L? Sigma-Aldrich) και dimethylamiloride (DMA, 10 μΜ? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν για να αναστέλλουν μικροσπηλαίων εξαρτώμενη ενδοκυττάρωση [23] και μακροπινοκυττάρωσης [24], αντίστοιχα. εξάντληση χοληστερόλη λήφθηκε από 2 ώρες προκατεργασία με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνης (MβCD, 10 mM? Sigma-Aldrich) με την παρουσία του λοβαστατίνη (1 μg /mL? Sigma-Aldrich) [25], [26]. Στη συνέχεια, κυτταρική πρόσληψη 5 μg /mL Tf-Alexa 488 παρακολουθήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Για την αναστολή της χοληστερόλης, 1 μg /mL λοβαστατίνη διατηρήθηκε επίσης στο μέσο κατά τη διάρκεια της θεραπείας με Tf-Alexa 488.

Ανάλυση της πρόσληψης Tf από κύτταρα Caco-2 μετά την αγωγή με το αντίσωμα AC133

κύτταρα Caco-2 απλώθηκαν σε 2.3 × 10

5 σε πλάκες 24 φρεατίων σε 400 μΐ μέσου που περιέχει ορό. Μετά από μια 24 ώρες αρχική επώαση στους 37 ° C /5% CO

2 το αρχικό μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς N1 ορό πριν την επώαση με είτε 0, 5, ή 10 μg /mL του αντισώματος AC133 ή του ελέγχου ισοτύπου IgG1κ . Tf-Alexa 488 στη συνέχεια προστέθηκε στα 5 μg /mL και επωάστηκαν στους 37 ° C /5% CO

2 για 1 ώρα για να μελετήσει τις επιπτώσεις της θεραπείας ανοσοσφαιρίνης επί Tf-Alexa 488 πρόσληψης. Tf-Alexa 488 πρόσληψη ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται παραπάνω.

αναγνώριση αντισωμάτων του υποδοχέα Tf στην επιφάνεια της Caco-2 κυττάρων ανάλογα με το επίπεδο της έκφρασης CD133

κύτταρα Caco-2 εκτίθενται σε CD133 ή siRNA ελέγχου συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας Versene (Lonza). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μg /mL CD71 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού που αναγνωρίζουν τον υποδοχέα Tf (TfR ή αντιγόνο CD71) (κλώνος Μ-A712, BD-Biosciences) ή με 5 μg /mL IgG2a, κ ελέγχου ισοτύπου (BD-Biosciences) για να προχωρήσει για ανοσοσήμανση και κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται παραπάνω για την αναγνώριση της κυτταρικής επιφάνειας AC133.

Immunocytochemisty συνδυασμό με ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ για τον προσδιορισμό του AC133, CD71 και βαριάς αλυσίδας clathrin εντός των κυττάρων Caco-2

κύτταρα Caco-2 απλώθηκαν σε 4 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε οκτώ φρεατίων Lab-Tek τμήμα Διαφάνειες (Nunc, Roskilde, Denmark) σε 300 μι ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS για 24 ώρες. Αυτά στη συνέχεια εκτέθηκαν σε CD133 ή τον έλεγχο siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω, πριν να προχωρήσει στην ανοσοκυτταροχημεία. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS (ρΗ 7.4) για 20 λεπτά στους 4 ° C. Μετά πλύσεις σε PBS, τα κύτταρα εκτέθηκαν για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα διάλυμα μπλοκαρίσματος από PBS που περιέχει 4% αλβουμίνης βόειου ορού (Sigma-Aldrich) και 10% του φυσιολογικού ορού κατσίκας (Sigma-Aldrich). Πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα έναντι CD133 (IgG1κ, Miltenyi Biotech), TfR ή CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) ή clathrin βαριά αλυσίδα (CHC) (IgG1, BD-Biosciences) επωάστηκαν σε 5 μg /ml σε PBS /BSA 4% για όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Σημειώστε ότι για CHC ενδοκυτταρική ανοσοσήμανση, Τπίοη® Χ-100 προστέθηκε σε 0,1% κατά τη διάρκεια της διαδικασίας δέσμευσης για την κυτταρική διαπερατότητα. Μετά πλύσεις, ένα αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη αντι-ποντικού δευτερογενούς αλόγου (Vector, Burlingame, CA) εφαρμόστηκε σε 1/100 σε PBS /BSA 4% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από επιπλέον πλύσεις, στρεπταβιδίνη Fluo Probe Alexa 488 (Interchim, Montluçon, Γαλλία), αραιωμένο 1/700, χρησιμοποιήθηκε. Τα κύτταρα τελικά πλένονται και τοποθετημένα κάτω από καλυπτρίδα σε φθορίζοντα μέσο στερέωσης (DakoCytomation). Ομοεστιακή εικόνες μικροσκόπιο λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus Fluoview ™ FU 300 συνεστιακή λέιζερ σύστημα απεικόνισης μικροσκοπία σάρωσης (Παρίσι, Γαλλία).

θεραπείες σιδήρου

κύτταρα Caco-2 επιστρώθηκαν σε έξι-φρεατίων με 2,3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 2 ml για 24 ώρες. Πριν από τη θεραπεία σιδήρου ξεκίνησε, FBS μέσο που περιέχει αντικαταστάθηκε με ελεύθερο ορού μέσο N1 για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις (50-800 μΜ) του τρισθενούς σιδήρου νιτριλοτριοξικό οξύ (Fe-ΝΤΑ) για 72 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2, όπως υποδεικνύεται. Fe-ΝΤΑ (μοριακή αναλογία 1:04) ήταν αυτοσχέδια παρασκευάστηκε σαν στοκ 20 mM από ΝΤΑ και εξαένυδρο χλωριούχου σιδήρου (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα εναλλακτικά σε επεξεργασία με FeSO

4 (Sigma-Aldrich), ένα άλλο δότη σιδήρου [27], [28], είτε 150 ή 300 μΜ για 24 ώρες.

στέρηση σιδήρου και θεραπεία με υποξία μιμητικοί παράγοντες

Ακολουθώντας μία παρόμοια διαδικασία καλλιέργειας όπως πριν από την επεξεργασία του σιδήρου, τα κύτταρα αντί θεραπεία για 24 ώρες με ένα χηλικοποιητή του σιδήρου, επίσης γνωστή ως υποξία-μιμητικό παράγοντα, δεσφερριοξαμίνη (DFO, Sigma-Aldrich) σε 100 και 150 μΜ [29], [30]. Εναλλακτικά, υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με υποξία-μιμητικού παράγοντα που λειτουργεί ανεξάρτητα από στέρηση σιδήρου, διχλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2, Sigma-Aldrich) σε 100 και 150 μΜ [31].

Database , βιοπληροφορική

ακολουθίες

για να αναζητήσετε υποθετικό στοιχείο απόκρισης σιδήρου (IRE) εντός του 3 ‘και 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR) του ανθρώπινου mRNA CD133, οι ακολουθίες που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (μεταξύ των οποίων και

Homo sapiens

προμινίνη 1 μετεγγραφής παραλλαγή 2, NM_001145847.1) ελήφθησαν από την NCBI GenBank. Όλες οι ευθυγραμμίσεις αλληλουχίας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή ClustalW από την EMBL Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Οι προγόνους (που ψάχνουν για IREs) του web server (https://ccbg.imppc.org/sires/) χρησιμοποιήθηκε επίσης για την πρόβλεψη του σιδήρου στοιχεία απόκρισης στο RNA [32].

Η στατιστική ανάλυση

XLSTAT 2006 Έκδοση 2006.3 (Addinsoft Παρίσι, Γαλλία) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Η στατιστική σημαντικότητα της κάθε πείραμα προσδιορίστηκε με δοκιμή ενός Dunnett. Οι δοκιμές θεωρήθηκαν ως σημαντικές με ρ τιμές & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Αντίκτυπος των συγκεκριμένων siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του CD133 για την ενδοκυτταρική συσσώρευση του Tf, Dx και CTB σε μη διαχωριζόμενες Caco -2 κύτταρα

για να προσδιοριστεί η πιθανή επίδραση της CD133 για την ενδοκυτταρική συσσώρευση εξωκυττάριου ενώσεις, μη διαφοροποιημένο καρκίνωμα του ανθρώπινου παχέος εντέρου Caco-2 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν φυσιολογικά υψηλά επίπεδα CD133, χρησιμοποιήθηκαν. Χρησιμοποιώντας είτε siRNA που δεν οδηγεί σε μεταγραφικές κάτω ρύθμιση (έλεγχος siRNA) ή siRNA που δεν ρυθμίζουν προς τα κάτω στοχευμένες CD133 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (CD133 siRNA), δύο καταστάσεις αναλύθηκαν: Κύτταρα Caco-2 που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του CD133, και Caco -2 κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του CD133. Το Σχήμα 1Α δείχνει ότι η θεραπεία των κυττάρων Caco-2 με 30 ηΜ siRNA CD133 οδήγησε αποτελεσματικά στη μείωση του 52 ± 11% στην έκφραση της πρωτεΐνης CD133, αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής ανοσοφθορισμού (αντίσωμα AC133) σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA. Να αναλύσει Caco-2 πινοκυτική ικανότητα των κυττάρων στα CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή καταστάσεις, η ενδοκυτταρική συσσώρευση εξωγενών δεικτών πινοκυτική μονοπατιών στη συνέχεια παρακολουθούνται. Αν και έχουν εναλλακτικές οδούς εσωτερικοποίηση έχουν περιγραφεί, ανάλογα με τους τύπους των κυττάρων και την κατάσταση διαφοροποίησης (για ανασκόπηση βλέπε [33]), Tf-Alexa 488, Dx-FITC και CTB-FITC χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτότυπο δείκτες μεσολάβηση υποδοχέων ενδοκυττάρωσης [34], ρευστή φάση ενδοκυττάρωση [24], [35] και μικροσπηλαίων εξαρτώμενη ενδοκυττάρωση [23], [36], αντίστοιχα. Κυτταρομετρία ροής μέτρηση του ενδοκυτταρικού φθορισμού μετά από 1 ώρα έκθεσης του CD133

υψηλής Caco-2 κύτταρα είτε 0.5 ή 5 mg /mL Dx-FITC, 1 ή 10 μg /mL CTB-FITC και 0,5 ή 5 μg /mL Tf -Alexa 488 επέτρεψε την πρόσληψη 100% για να μετρηθεί σε σύγκριση με το βασικό GEOMEAN ένταση φθορισμού του φορέα μόνο κατεργασμένων κυττάρων που αντιπροσωπεύουν πρόσληψη 0%. Αν και CD133 νοκ ντάουν δεν είχε καμία επίπτωση στην ενδοκυτταρική συσσώρευση του Dx-FITC (Εικόνα 1Β) ή CTB-FITC (Σχήμα 1C), κυτταρική πρόσληψη του TF-Alexa 488 ήταν σημαντικά ενισχυμένο σε CD133

με χαμηλό Caco-2 κύτταρα, ανεξάρτητα από το συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (Εικόνα 1D). Αυτά τα δεδομένα καθορίστηκε έτσι για πρώτη φορά ότι CD133 ενεργεί ως ρυθμιστής του ενδοκυτταρική συσσώρευση εξωγενών ενώσεων.

Α) που σχετίζεται ανοσοφθορισμού ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD133 σε μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 30 ηΜ ελέγχου ή CD133 ειδικά siRNA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της θεραπείας ελέγχου, που αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα GEOMEAN ένταση φθορισμού που λαμβάνεται μετά AC133 ανοσοχρώση των κυττάρων σε επεξεργασία με άσχετο siRNA (CD133

υψηλής κύτταρα Caco-2)? σημειώστε την αποτελεσματική ρύθμιση προς τα κάτω της CD133 όταν χρησιμοποιήθηκε CD133 ειδικά siRNA (CD133

χαμηλή κύτταρα Caco-2). Β-Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ενδοκυτταρική πρόσληψη του Dx-FITC (Β), CTB-FITC (C) και Tf-Alexa 488 (D) μέσα CD133

χαμηλή κύτταρα υψηλό και CD133

Caco-2 μετά την 1 h επώασης στους 37 ° C /5% CO

2. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του ελέγχου, πράγμα που αντιπροσωπεύει τις GEOMEAN επίπεδα έντασης φθορισμού που λαμβάνονται για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται μέση ± s.e.m. που λαμβάνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. τεστ Dunnett: ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

Επίδραση του siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν του CD133 για Tf εξωκυπάρωσης

Εν όψει του γεγονότος ότι CD133 φάνηκε να είναι ένας αναστολέας της κυτταρικής πρόσληψης του Tf ενώ έχουν καμία επίπτωση στην Dx και CTB, έχουμε περαιτέρω επικεντρώθηκε στη σχέση μεταξύ της έκφρασης CD133 και τη συσσώρευση Tf. Η πιθανή επίδραση των siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν του CD133 για Tf-Alexa 488 εξωκυπάρωσης, κατά συνέπεια, διερευνήθηκε. Για το σκοπό αυτό, CD133

υψηλή και CD133

χαμηλές μη-διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 επωάστηκαν με Tf-Alexa 488 για 2 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 πριν απομακρύνθηκε εξωκυτταρικό μέσο , πλύθηκαν και αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο χωρίς από Tf-Alexa 488. Μετά από περαιτέρω επώαση για 1, 2 και 3 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 η ποσότητα του Τί-Alexa 488 που δεν ανακυκλώνεται στο εξωκυτταρικό διαμέρισμα μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 2 διαπιστώνεται ότι ενδοκυτταρικά επίπεδα του Tf-Alexa 488 μειώθηκε με το χρόνο επώασης. Μετά από 1 ώρα επώασης περισσότερο από το 80% του εσωτερικεύονται Tf-Alexa 488 παρέμειναν εντός των κυττάρων και στα δύο CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή κύτταρα που εκφράζουν ενώ μετά από 3 ώρες επώασης, 54 ± 9% και 43 ± 4 % του εσωτερικεύονται Tf-Alexa 488 παρέμειναν εντός CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή κύτταρα που εκφράζουν, αντίστοιχα. Ωστόσο, ανά πάσα στιγμή που μελετήθηκαν, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης CD133 (Σχήμα 2). Αυτές οι παρατηρήσεις τόνισε ότι αν και η ανακύκλωση Τί συνέβη και στις δύο CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2, βραχυπρόθεσμα οι διαφορές στην συσσώρευση ενδοκυτταρικού Tf οφείλονται κυρίως στις επιπτώσεις της CD133 στους μηχανισμούς της ενδοκύττωσης και όχι εξωκυπάρωσης .

CD133

υψηλή (έλεγχος siRNA) και CD133

χαμηλή (CD133 siRNA) μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 εκτέθηκαν σε Tf-Alexa 488 για 2 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 πριν απομακρύνθηκε εξωκυτταρικό μέσο, ​​πλένεται και αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο χωρίς από Tf-Alexa 488. Ποσότητες Tf-Alexa 488 που δεν είχαν ανακυκλωθεί στο εξωκυτταρικό διαμέρισμα μετρήθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά από περαιτέρω επώαση των κυττάρων σε 37 ° C /5% CO

2 για 1 έως 3 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως% του Tf-Alexa 488 αρχικά εσωτερικεύεται. Αντιπροσωπεύουν μέση ± s.e.m. που λαμβάνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επίδραση χημικών αναστολέων των γνωστών ενδοκυτταρικά μονοπάτια για την πρόσληψη Tf από μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2, ανάλογα με το επίπεδο της έκφρασης CD133 τόνισε τη σημασία της οδού clathrin

Αφού διαπιστώθηκε ότι το επίπεδο της έκφρασης του CD133 είχε αντίκτυπο στην πρόσληψη Tf στα μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2, αλλά δεν ρυθμίζουν την ανακύκλωση Tf, τότε να αντιμετωπιστεί το ζήτημα αν CD133 εμπλέκεται σε συγκεκριμένες πινοκυτική οδών [ ,,,0],33]. Για το σκοπό αυτό, η πρόσληψη του Tf-Alexa 488 εντός CD133

υψηλή και CD133

χαμηλή κύτταρα που εκφράζουν παρακολουθήθηκε μετά τη θεραπεία με προηγουμένως ταυτοποιημένα χημικών αναστολέων των γνωστών ενδοκύττωσης οδών. Χλωροπρομαζίνη χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει clathrin μεσολάβηση μεταφορές [22], φιλιπίνη να αναστέλλουν εξαρτώμενη μικροσπηλαίων ενδοκυττάρωση [23] και DMA να αναστέλλουν μακροπινοκυττάρωσης [24]. Η κυτταρομετρία ροής διαπιστωθεί ότι προεπεξεργασία του ελέγχου CD133

υψηλής κύτταρα Caco-2 με φιλιπίνη, χλωροπρομαζίνη και DMA πριν από την έκθεση σε 5 μg /mL Tf-Alexa 488, οδήγησε σε 30%, 90% και μη σημαντική μείωση της πρόσληψης Tf , αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Η σημαντική επίδραση της χλωροπρομαζίνης σε συνδυασμό με την μικρότερος είναι αποτέλεσμα της φιλιπίνη έτσι τόνισε ότι Tf συσσώρευση στα μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 οφείλεται κυρίως στην clathrin μεσολάβηση των μεταφορών [37]. Η επίδραση φιλιπίνη θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ενδοκυττάρωση του Protopic υποστρώματα για ενδοκύτωσης με υποδοχέα, όπως LDL ή Tf, η οποία συνήθως διαδρομή προς το ενδοκυτταρικό διαμέρισμα μέσω του μονοπατιού κλαθρίνη, θα μπορούσε εναλλακτικά να χρησιμοποιήσει το μικροσπηλαίων μονοπάτι [38], [39] . Επιπλέον, όπως χοληστερίνη έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στον σχηματισμό clathrin επικαλυμμένων ενδοκυτταρικά κυστίδια [26], φιλιπίνη, η οποία sequestrates χοληστερόλη, μπορεί επίσης να έχει έμμεση επίδραση στις κλαθρίνη ενδοκύτωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά την εξέταση CD133 knockdown και CD133

χαμηλής κύτταρα Caco-2, πολύ παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν με φιλιπίνη, χλωροπρομαζίνη και DMA, που οδηγεί σε 18%, 85% και μη σημαντική μείωση στην πρόσληψη Tf, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α) . Έτσι, τα ποσοτικά αποτελέσματα του CD133 για Tf ενδοκύτωση φαίνεται να σχετίζεται κυρίως με την clathrin-εξαρτώμενο μονοπάτι. Παραδόξως, η εξάντληση της χοληστερόλης, που επιτυγχάνεται με τη χρήση MβCD σε συνδυασμό με λοβαστατίνη [25], [26], η οποία έχει ειπωθεί ότι επηρεάζουν clathrin ανεξάρτητες οδούς και σε κάποιο βαθμό clathrin εξαρτώμενη οδών [26], [40], [41], είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική βελτίωση στην Tf-Alexa 488 συσσώρευσης στο CD133

υψηλής κύτταρα Caco-2 (+ 49%, Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον, ο αντίκτυπος της εξάντλησης χοληστερόλης στο Tf-Alexa 488 πρόσληψη εντός CD133

κύτταρα χαμηλή Caco-2 ήταν λιγότερο έντονη (+ 21%, Σχήμα 3Α). Αυτά τα τελευταία στοιχεία που υποστήριξαν την υπόθεση ότι CD133 αλληλεπίδραση με ενδοκυτταρικής χοληστερόλης έχει επίσης αντίκτυπο στις Tf ενδοκύττωση. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω μια πιθανή σύνδεση μεταξύ CD133 και την clathrin-εξαρτώμενο μονοπάτι ενδοκύτωση, ο αντίκτυπος της CD133 νοκ ντάουν για την πρόσληψη των συνθετικών νανοσωματιδίων (LNC) που περιγράφηκε προηγουμένως για να χρησιμοποιήσετε το μονοπάτι clathrin στο δρόμο προς το ενδοκυτταρικό χώρο των κυττάρων Caco-2 [ ,,,0],21] διερευνήθηκε. Είναι ενδιαφέρον, όπως και για φθορίζοντα Tf, η πρόσληψη του φθοριζόντως ετικέτα LNC (NR-LNC) ήταν σημαντικά υψηλότερη στην CD133

χαμηλής κύτταρα Caco-2 (Control siRNA) σε σύγκριση με CD133

υψηλής κύτταρα Caco-2 (CD133 siRNA) (Εικόνα 3Β).

Α) Συνέπειες της CD133-ειδικών knockdown siRNA για την αποτελεσματικότητα των χημικών ρυθμιστών γνωστών ενδοκύττωσης οδών στη ρύθμιση πρόσληψης Tf από μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. Μετά τη θεραπεία είτε με όχημα μόνο (έλεγχος), φιλιπίνη, χλωροπρομαζίνη, DMA ή MβCD προστεθεί με λοβαστατίνη (MβCD), CD133

υψηλή (έλεγχος siRNA) και CD133

χαμηλή (CD133 siRNA) μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 εκτέθηκαν σε 5 μg /mL Tf-Alexa 488. Κυτταρική εσωτερικοποίηση του Tf-Alexa 488 στη συνέχεια παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως% του Tf-Alexa 488 ποσά που είχαν ενσωματωθεί στο ελέγχου θεραπεία με όχημα. Σημειώστε την απουσία επίδρασης του CD133-siRNA νοκ ντάουν για το μεγάλο αναστολή του TF-πρόσληψης που προκαλείται από χλωροπρομαζίνη. Σημειώστε, επίσης, τη μειωμένη μέχρι και ρυθμιστικό αποτέλεσμα της εξόρυξης χοληστερόλης στο χαμηλό κατάσταση CD133 (MβCD). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται μέση ± s.e.m. από ένα τριπλό λαμβάνεται από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε δύο φορές. Οι συγκρίσεις με τον έλεγχο: τεστ Dunnett, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001? σύγκριση μεταξύ του ελέγχου siRNA και CD133 siRNA: του Dunnett δοκιμής: p & lt? 0,05. Β) Ειδική siRNA μεσολαβεί knockdown του CD133 εντός μη διαχωριζόμενες Caco-2 κύτταρα οδήγησε σε αύξηση των LNC ενδοκυτταρική συσσώρευση. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ενδοκυτταρική πρόσληψη του NR-LNC εντός CD133

υψηλή (Έλεγχος siRNA) και CD133

χαμηλή (CD133 siRNA) Caco-2 κύτταρα μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ° C /5% CO

2. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του ελέγχου, πράγμα που αντιπροσωπεύει τις GEOMEAN επίπεδα έντασης φθορισμού που λαμβάνονται για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται μέση ± s.e.m. που λαμβάνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. τεστ Dunnett:. ** ρ & lt? 0,01

Η

Θεραπεία των μη διαφοροποιημένων κυττάρων Caco-2 με το αντίσωμα AC133 αναγνωρίζει την εξωκυτταρική περιοχή του CD133 ως αποτέλεσμα τη μείωση σε Tf πρόσληψη

αφού διαπιστώθηκε ότι η έκφραση CD133 επηρεάζονται ποσοτικά Tf ενδοκύττωση, τότε να θεωρηθεί ότι μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης CD133 και μηχανημάτων ενδοκυτικό Τί θα έχουν επηρεαστεί από την σύνδεση με CD133 εξωκυτταρικό. Ως εξωκυτταρικό συνδέτη του CD133 δεν είχε ακόμη ταυτοποιηθεί και από μονοκλωνικά αντισώματα έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί ως ενεργοποίηση ή η λειτουργία ανοσοσφαιρίνες αποκλεισμού, για παράδειγμα σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ ιντεγκρινών και εξωκυττάριας μήτρας [42], το αντίσωμα AC133, το οποίο αναγνωρίζει ένα εξωκυτταρικό επίτοπο που σχετίζεται γλυκοζυλίωσης του CD133 [43], στη συνέχεια εξετάστηκε ως πρόσδεμα CD133 σε ζωντανά κύτταρα Caco-2. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ η θεραπεία των μη-διαφοροποιημένων κυττάρων Caco-2 με ένα IgG1κ ανοσοσφαιρίνη ελέγχου ισοτύπου δεν είχε καμία επίδραση στην ενδοκυτταρική συσσώρευση του Tf-Alexa 488 αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 4Α), η θεραπεία με το αντίσωμα AC133 οδήγησε σε σημαντική μείωση των πρόσληψη Tf του 38 ± 8% και 75 ± 1% στα 5 και 10 μg /mL, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α). Τα δεδομένα αυτά απέδειξαν ότι AC133 μπορεί να ασκήσει αποτελεσματικά λειτουργικές επιδράσεις σε ζωντανά κύτταρα εδώ αποδίδεται σε μία αλληλεπίδραση μεταξύ του ίδιου CD133 και μηχανημάτων ενδοκυτταρικού Tf σε μη διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2.

επεξεργασία Α) AC133 αντίσωμα ανέστειλε την πρόσληψη Tf.