Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

Η αλλαγμένη έκφραση των microRNAs (miRNAs) χαρακτηριστικά πολλούς τύπους καρκίνου. Η μελέτη των ενώσεων του προφίλ έκφρασης των miRNAs και φαινότυπο του καρκίνου θα μπορούσε να βοηθήσει στον εντοπισμό των δεσμών μεταξύ απορρύθμιση της έκφρασης των miRNAs και ογκογόνο μονοπάτια.

Μέθοδοι

Η έκφραση των χαρακτηριστικών των 866 ανθρώπινα miRNAs σε 19 παχέος εντέρου και 17 παγκρεατικούς καρκίνους και σε συμφωνημένα παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς διερευνήθηκε. Κλασική paired t-test και τυχαία αναλύσεις δάσος εφαρμόστηκαν για τον εντοπισμό miRNAs που σχετίζεται με όγκους ιστο-ειδικούς. πραγματοποιήθηκε ανάλυση του δικτύου βασίζεται σε μια υπολογιστική προσέγγιση για ενώσεις ορυχείο μεταξύ των τύπων και των miRNAs καρκίνου.

Αποτελέσματα

Η συγχώνευση μεταξύ των δύο στατιστικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται για να τέμνει τα miRNAs που εκφράζονται διαφορικά στο κόλον και του παγκρέατος επέτρεψε την ταυτοποίηση του καρκίνου-ειδικών miRNA αλλοιώσεις. Με ανάλυση miRNA-δίκτυο, εντοπίστηκαν ιστού-ειδικά πρότυπα των miRNA απορρύθμισης: τα miRNAs οδήγησης ήταν

miR-195, miR-1280, miR-140-3p

και

miR-1246

στην όγκων παχέος εντέρου, και

miR-103, miR-23a

και

miR-15b

σε καρκίνους του παγκρέατος.

Συμπέρασμα

προφίλ έκφρασης των miRNAs μπορεί να εντοπίσει τον καρκίνο -ειδικές υπογραφές και δυνητικά χρήσιμο βιοδεικτών για τη διάγνωση του ιστού συγκεκριμένων καρκίνων. Ανάλυση miRNA-δίκτυο βοηθήσει στον εντοπισμό μεταβληθεί miRNA ρυθμιστικών δικτύων που θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στην παθογένεση του όγκου

Παράθεση:. Piepoli Α, Tavano F, Copetti Μ, Mazza Τ, Palumbo O, Πάντσα A, et al. Προφίλ (2012) Έκφραση Mirna Προσδιορίστε Οδηγοί σε παχέος εντέρου και του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10.1371 /journal.pone.0033663

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 17 Νοέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 14 Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Piepoli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Υγείας ιταλικό χορηγεί RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 και RC1102BS45 μέσω Ερευνητική Μονάδα Γαστρεντερολογίας, Ερευνητική Μονάδα Χειρουργικής και Μονάδα Βιοστατιστικής? και το Casa Sollievo della Sofferenza (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Ιταλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά κωδικοποίησης μη πρωτεϊνικά μόρια RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση κυρίως στο επίπεδο της πρωτεϊνοσύνθεσης [1]. Αντιπροσωπεύουν μια εξελικτική εξαιρετικά διατηρημένη σύστημα που ελέγχει κρίσιμο κυτταρικές διαδικασίες, όπως η ανάπτυξη, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό, απόπτωση, και ο μεταβολισμός [2]. Η ανώμαλη έκφραση των miRNAs μπορούν να προκύψουν από τη διαγραφή, μετάλλαξη, και μεθυλίωση των γονιδίων που κωδικοποιούν miRNA-, πολλά από τα οποία βρίσκονται σε γονιδιωματικό εύθραυστο θέσεις ή περιοχές διαγραφεί συχνά ή ενισχύεται σε καρκίνο [3]. Με βάση αυτές τις εγκαταστάσεις, έχουν αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με τους πιθανούς ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [4]. Πολλές miRNAs εκφράζονται σε ένα ιστό-ειδικό τρόπο, με προφίλ εκφράζονται διαφορικά σε είτε φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ιστούς και σε όγκους με διακριτές βιολογικές ιδιότητες. Επιπλέον, ορισμένα αποδεικτικά στοιχεία που δείχνουν προφίλ miRNA να επιτρέψει αξιόπιστη ταυτοποίηση της προέλευσης των κυττάρων-of-όγκων [5].

Κλασικά, η διαφορική έκφραση των miRNAs έχει αξιολογηθεί είτε ως ενιαία εισφορά ή ως έξυπνη υπογραφή [6 ], [7]. Ωστόσο, ένα μεγάλο μέρος της επιστημονικής προσπάθειας δαπανάται επί του παρόντος για τη διαλεύκανση των λειτουργιών τους: τα περισσότερα miRNAs ελέγχου τουλάχιστον ένα mRNA, και οι περισσότερες mRNAs ελέγχεται από περισσότερα από ένα [8] miRNA. Η πολυπλοκότητα πίσω από αυτό το περίπλοκο μηχανισμό μπορεί να μετριαστεί εν μέρει από τη γνώση των επιπέδων διατήρηση κάθε miRNA. Πράγματι, υψηλή προστασία σε όλη την ευρεία φυλογενετικές αποστάσεις βοηθάει περιορίζοντας το φάσμα των λειτουργιών που μπορεί να παίξει ένα miRNA να ρυθμίσει τον έλεγχο της ανάπτυξης των ειδών και της φυσιολογίας.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε πρότυπα έκφρασης των miRNAs σε ορθοκολικό (CRC) και τον καρκίνο του παγκρέατος (PC) με σκοπό να προσδιορίσει miRNA ρυθμιστικά δίκτυα πιθανόν εμπλέκονται στην ογκογόνο οδούς αξιολογώντας ειδική για τον καρκίνο υπογραφών μέσω της ανάλυσης της σχέσης μεταξύ miRNA προφίλ έκφρασης και του καρκίνου γραμμώσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα Επιλογή και RNA Extraction

Πρωτοβάθμια όγκου και των γειτονικών μη ογκογόνους ιστούς ελήφθησαν από δύο ομάδες κατάρτισης των 19 ασθενών CRC και 17 ασθενείς PC, καθώς και από δύο ομάδες επικύρωσης της 14ης CRC και 21 ασθενείς PC .. Η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση των επιτροπών επιστημονικής και ηθική του IRCCS «Casa Sollievo della Sofferenza» Ινστιτούτο, San Giovanni Rotondo, FG (Ιταλία). Οι ασθενείς έδωσαν ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με την ιταλική νομοθεσία για την προστασία της ιδιωτικής ζωής (που προβλέπει την προστασία των προσωπικών δεδομένων), έτσι ώστε τα άτομα δεν μπορούν να προσδιοριστούν από τα δεδομένα ή τις εικόνες που περιλαμβάνονται σε αυτή την έκδοση, και έχουν εγκριθεί από τις επιτροπές επιστημονική και ηθική του IRCCS » Casa Sollievo della Sofferenza «Ινστιτούτο. Όλες οι κλινικές έρευνες έχουν διεξαχθεί σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Τα ασθενούς κλινικά δεδομένα, τη θέση του όγκου, και στάσης φαίνεται στον Πίνακα S1. δείγματα ιστού φλας καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων. Περίπου 150-200 mg φρέσκου κατεψυγμένου ιστοί χρησιμοποιήθηκαν για να απομονωθεί ολικό RNA με εκχύλιση φαινόλης (αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα ελέγχεται από Νάνο Drop Specthophotometer. Η Agilent 2100 Bioanalyzer χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ποσότητα, την ακεραιότητα και την καθαρότητα των μικρών RNA και το συνολικό RNA, και μόνο μη υποβαθμισμένη RNA χαρακτηρίζονται από μια σειρά ακεραιότητα RNA & gt? 7 χωρίς σημάδια μόλυνσης DNA υπέστη επεξεργασία

miRNA. μικροσυστοιχίες

προφίλ έκφρασης των miRNAs προσδιορίστηκε με τη χρήση GeneChip® miRNA Array (www.affymetrix.com). Αυτή η συστοιχία περιέχει 46.228 ανιχνευτές που περιλαμβάνουν 7.815 σύνολα ανιχνευτή, συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων, και καλύπτει το 71 οργανισμούς όπως ανθρώπου, ποντικού, αρουραίου και σκύλου. Το περιεχόμενο προέρχεται από το V.11 βάση δεδομένων Sanger miRBase miRNA (15 Απριλίου, 2008 https://microrna.sanger.ac.uk). Τα σύνολα Probe στόχευση ανθρώπινη snoRNAs και scaRNAs προέρχεται από το snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) και οι Ensembl (www.ensembl.org/biomart/martview) αρχεία, Εν συντομία, 1.5 μg ολικού RNA σημάνθηκε χρησιμοποιώντας την Array Detection 3DNA FlashTag ™ RNA Labeling Kit (https://www.genisphere.com), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Πρώτον, το πολυ (Α) ουράς πραγματοποιήθηκε στους 37 ° C για 15 λεπτά σε έναν όγκο 15 ml μίγματος αντίδρασης, το οποίο περιείχε 1Χ Ρυθμιστικό Αντίδρασης, 1,5 ml MgCl2 [25 mM], 1 μΐ ΑΤΡ Mix αραιωμένο 1:500 και 1 μl ένζυμο PAP. Δεύτερον, Flash Tag Η σύνδεση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά με την προσθήκη 4 μΙ 5Χ Flash Tag Απολίνωση Mix Βιοτίνη και 2 μΐ Τ4 DNA λιγκάσης σε 15 μΙ μείγμα αντίδρασης. Για να σταματήσει η αντίδραση, προστέθηκε 2,5 μl διαλύματος τερματισμού. Τα δείγματα υβριδοποιήθηκαν, πλύθηκαν και σαρώνεται με ένα σαρωτή Affymetrix.

Όλα τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό και ο ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε ArrayExpress (αριθμός πρόσβασης E-mtab-752 για τα προφίλ έκφρασης καρκίνο του παχέος εντέρου και miRNA Ε- mtab-753 για τον καρκίνο του παγκρέατος προφίλ έκφρασης των miRNAs).

Ποσοτική εκτίμηση των miRNA με αντίστροφη μεταγραφή real-Time PCR

δοκιμασία

Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) των miRNAs πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Δοκιμασία TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) με ΑΒΙ PRISM-7700 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας. Ένα πρωτόκολλο δύο σταδίων απαιτεί αντίστροφη μεταγραφή με ένα miRNA-ειδικό εκκινητή, ακολουθούμενη από μια PCR πραγματικού χρόνου με ανιχνευτές TaqMan. Οι δοκιμασίες στοχεύουν μόνο ώριμη miRNAs, δεν προδρόμων τους. Εν συντομία, η αντίστροφη αντιδράσεις μεταγραφάσης περιείχε 10 ng των δειγμάτων RNA, 50 nM stemloop RT εκκινητή, ρυθμιστικό 10Χ RT, 0.25 mM καθένα από τα dNTPs, 3,33 U /μl MultiScribe RT και 0,25 U /μl αναστολέα RNase (όλα αγοράζονται από cDNA Αρχείο κιτ της Applied Biosystems) διεξήχθησαν σε τελικό όγκο 15 μΐ και επωάστηκαν σε θερμικής ανακυκλωτή για 30 λεπτά στους 16 ° C, 30 λεπτά στους 42 ° C, 5 λεπτά στους 85 ° C και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C. Το 20 μΙ μείγμα αντίδρασης PCR περιλαμβάνεται 1,3 μl προϊόν RT (1:15 του διαλύματος,), 10 μΐ TaqMan 2Χ καθολική PCR Master Mix (NoUmpErase UNG) και 1 μΙ TaqMan Δοκιμασία 20Χ microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε 96 φρεατίων οπτική πλάκα στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 10 λεπτά. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

αρχικά χαρακτηριστικά των ασθενών αναφέρθηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) ή συχνότητες και τα ποσοστά για τη συνεχή και κατηγορικές μεταβλητές, αντίστοιχα.

Για κάθε μία από τις δύο ομάδες κατάρτισης, τα δεδομένα τσιπ microRNA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Στιβαρή αλγόριθμο Multi-array Μέση (RMA) [9]. Για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ ζεύγη φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, ακολουθήθηκαν δύο προσεγγίσεις. Πρώτον, μια κλασική paired t-test έλεγχο για ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (fdr) επέτρεψε την κατάταξη miRNAs σύμφωνα με p-τιμές τους. Δεύτερον, τυχαία δάσος (RF) ανάλυση [10] εφαρμόστηκε για την ανίχνευση miRNAs με την καλύτερη ικανότητα σε διακρίσεις όγκου από ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς. Ένα RF είναι ένας ταξινομητής αποτελείται από ένα σύνολο δέντρο-δομημένο ταξινομητές. Σύμφωνα με αυτή την τεχνική, 100.000 δέντρα κατασκευαστεί για να ταξινομήσει ιστούς. Το σύνολο εκμάθησης που χρησιμοποιείται για να αυξηθεί κάθε δέντρο ήταν μια .632+ εκκίνησης αναδειγματοληψία των παρατηρήσεων. Δέντρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες μέγεθος τους, χωρίς κλάδεμα. Η καλύτερη διάσπαση σε κάθε κόμβο επιλέχθηκε από ένα τυχαίο υποσύνολο των miRNAs. Τα αριστερά-out παρατηρήσεις (δηλαδή, «από την τσάντα» παρατηρήσεις) ήταν τότε προβλέπεται να αποκτήσει το ποσοστό σφάλματος κατάταξη της εξεταζόμενης δέντρο. Προβλεπτική ικανότητα του ταξινομητή εκτιμήθηκε άθροιση των ενιαία ποσοστά σφάλματος δέντρο. Επιπλέον, η τυχαία πλαισίου για τα δάση μας επέτρεψε να εκτιμήσουμε τη σημασία μιας μεταβλητής, εξετάζοντας πόσο η κατάταξη αυξήσεις λάθους, όταν «από την τσάντα» δεδομένα για τη συγκεκριμένη μεταβλητή είναι permuted, ενώ όλοι οι άλλοι μένουν αμετάβλητες. Η μετρική σημασία που χρησιμοποιήθηκε ήταν η μείωση Mean σε Ακρίβεια (MDA). Το MDA είναι κατασκευασμένο από μετάθεση των τιμών κάθε μεταβλητής του συνόλου δοκιμής, καταγράφοντας την πρόβλεψη και να συγκρίνεται με το σύνολο ελέγχου πρόβλεψης un-permuted της μεταβλητής. Ως εκ τούτου, είναι η αύξηση του ποσοστού των φορές ένα σύνολο δοκιμής που ταξινομούνται λανθασμένα όταν η μεταβλητή με ιονανταλλαγή. Ακολουθήσαμε Στρομπλ et al. [11] για να αποφευχθούν πιθανές μεροληψία στην μεταβλητή επιλογής: μεμονωμένα δέντρα ταξινόμησης χτίστηκαν χρησιμοποιώντας subsampling χωρίς αντικατάσταση και την έγκριση υπό όρους σύστημα μετάθεση [12]. Λάβαμε ένα miRNAs κατάταξη σύμφωνα με τη μεταβλητή μέτρο σημασίας. Τέλος, οι δύο miRNA κατάταξη, μία από την κλασική ανάλυση και μία από την ανάλυση RF, συγχωνεύτηκαν για να πάρετε μια λίστα των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης των miRNAs εκτιμήθηκαν με τη χρήση συντελεστή Spearman. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε για στατιστική σημαντικότητα. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SAS Release 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA) και R για τυχαία δάσος αναλύσεις (

randomForest

πακέτο).

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τις εξωτερικές ομάδες επικύρωσης για την επιβεβαίωση microRNA αποτελέσματα συστοιχία, η οποία αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις του ορίου μέθοδο και προεπιλογή Συγκριτική κύκλο όριο (CT). Σχετική εκφράσεις των miRNA υπολογίστηκαν από 2

-ΔΔCt τύπο [13] χρησιμοποιώντας U6 μικρό πυρηνικό RNA (RNU6B) ως έλεγχος εξομάλυνση. Από την 2

-ΔΔCt μετατραπεί τιμές δεν είχαν κανονική κατανομή, οι συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το μη-παραμετρικό Wilcoxon signed rank test, προκειμένου να αξιολογηθεί η στατιστική σημαντικότητα του επάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση. Για τις αναλύσεις η επικύρωση qPCR, θεωρήσαμε ένα μέγεθος δείγματος 14 ατόμων για να παρέχει μια δύναμη του 90% (με μια διπλής όψεως άλφα = 0,05) για την ανίχνευση ενός πάνω ρύθμιση τουλάχιστον 2 ή μία ρύθμιση προς τα κάτω το πολύ 0,5 του έκφραση κάθε miRNA από την άποψη των 2

-ΔΔCt χρησιμοποιώντας το μη-παραμετρικό Wilcoxon signed rank test και 1 ως μηδενική υπόθεση.

ανάλυση δικτύου

Για κάθε μία από τις δύο ομάδες ασθενών κατάρτισης αποτελεί μη κατευθυνόμενο και σταθμισμένη δικτύου χτίστηκε, όπου οι κόμβοι και οι ακμές αντιπροσωπεύουν miRNAs και οι συσχετίσεις τους (όταν σημαντική), αντίστοιχα. Έτσι, οι άκρες δεν προσανατολίζονται από το συσχετισμό είναι συμμετρική, και σταθμίζονται με συντελεστή Spearman. Το πάχος των ακμών αντικατοπτρίζει το μέγεθος των βαρών. Για να σκάψει κρίσιμη κόμβους από δύο δίκτυα CRC και PC, έχουμε δανειστεί κάποιες μεθόδους από τις κοινωνικές επιστήμες, και αξιολογούνται τα εξής

κεντρικότητα

μέτρα:

βαθμό

,

betweenness

και

συντελεστή ομαδοποίησης

[14], [15] για κάθε δίκτυο. Τέλος, έχουν miRNAs έχουν ταξινομηθεί αναλόγως.

Όλα αυτά τα μέτρα (ή μετρήσεις) με βάση την καταμέτρηση των συνδέσμων ή συντομότερα μονοπάτια. Σε λεπτομέρειες, ας καθορίσει μια πορεία από το να, με το σύνολο των κόμβων, ως μια εναλλασσόμενη ακολουθία των κόμβων και των ακμών, ξεκινώντας με και τελειώνει με, έτσι ώστε κάθε ακμή συνδέει τους προηγείται με επιτυχία την κορυφή του. Θέτουμε το μήκος μιας διαδρομής ώστε να είναι το άθροισμα των αντίστροφη βαρών των ακμών του. Η ιδέα είναι ότι η υψηλή συσχέτιση miRNAs ελαχιστοποιούν την απόσταση μεταξύ των κόμβων ή, από μια άλλη σκοπιά, οι πιο κοντά δύο κόμβοι είναι τόσο περισσότερο συσχετίζονται. Ως εκ τούτου, υπολογίζουμε την απόσταση μεταξύ δύο κόμβων και, γράφεται, καθώς το ελάχιστο μήκος οποιασδήποτε διαδρομής που συνδέει και. Εξ ορισμού, για κάθε.

Βαθμός

κεντρικότητα βασίζεται στην ιδέα ότι σημαντικό κόμβοι είναι εκείνες με το μεγαλύτερο αριθμό των δεσμών με άλλους κόμβους στο γράφημα. Είναι συχνά ερμηνεύεται από την άποψη της άμεσης εμπλοκής των κόμβων σε σχέσεις που δημιουργήθηκαν μέσω του δικτύου. Ας είναι το βάρος της ακμής, το οποίο συνδέει τον κόμβο με τον κόμβο, η κεντρικότητα βαθμός ενός κόμβου είναι, με το σύνολο των ακμών, σύμφωνα με την οποία η υψηλότερη είναι η τιμή βαθμό, το πιο σημαντικό (συνολικά συσχετίζονται) είναι ο κόμβος .

Betweenness

κεντρικότητα μετρά την επίδραση ένας κόμβος έχει πάνω από την έμμεση συσχέτιση μεταξύ δεν κόμβων γείτονα. Betweenness, στη βασική του έκδοση, υπολογίζεται ως το κλάσμα των συντομότερα μονοπάτια μεταξύ των ζευγών κόμβων που περνούν μέσα από τον κόμβο του ενδιαφέροντος. μαθηματική έκφραση του είναι, όπου είναι ο αριθμός των συντομότερα μονοπάτια από έως, και είναι ο αριθμός των συντομότερων μονοπατιών από με εκείνη που διέρχεται από την κορυφή. Κορυφές που συμβαίνουν σε πολλές συντομότερα μονοπάτια μεταξύ άλλων κορυφές έχουν υψηλότερη betweenness, και στη συνέχεια υψηλότερα ενδιαφέρον σε έμμεσες συσχετίσεις.

Το

συντελεστής Clustering

είναι ένα μέτρο του βαθμού στον οποίο οι κόμβοι σε ένα γράφημα τείνουν να σύμπλεγμα μαζί, ή με άλλα λόγια, να ποσοτικοποιεί κόμβους λόγω του βαθμού στον οποίο οι γείτονές τους είναι να είναι ένα

κλίκα

(πλήρες γράφημα) με αυτό. Ο συντελεστής ομαδοποίησης ενός κόμβου στη συνέχεια δίνεται από την αναλογία των συνδέσεων μεταξύ των κόμβων μέσα σε γειτονιά του διαιρείται με τον αριθμό των links που θα μπορούσε ενδεχομένως να υπάρχουν μεταξύ τους. Επιγραμματικά, εκφράζεται ως, όπου ορίζονται οι άμεσα συνδεδεμένη γείτονες που και. «Σταθμισμένη» σύνθεση της βασίζεται στα βάρη του

τρίγωνα

επικεντρώνεται στους κόμβους του δικτύου. Καθορίζεται από Horvath και Zhang [16], όπως όταν είναι το βάρος πάνω από την άκρη, και έτσι το προϊόν των βαρών των ακμών που σχηματίζουν ένα κλειστό τρίγωνο των κόμβων. Ξεκινώντας από την τοπική ορισμό του συντελεστή ομαδοποίησης, αναφέρουμε κατά μέσο όρο διατύπωση της από Schank και Wagner [17] για ολόκληρο το δίκτυο ως η αναλογία μεταξύ του αθροίσματος των προϊόντων των συντελεστών ομαδοποίησης και μια γενική λειτουργία του βάρους, και της ίδιας της λειτουργίας βάρος , δηλαδή όταν είναι η γενική λειτουργία του βάρους. Η λειτουργία του βάρους συνήθως επιλέγεται μεταξύ των μετρήσεων που συλλαμβάνει καλύτερα την τοπολογία του δικτύου υπό εξέταση. Ένα χαμηλότερο

Μέση Σταθμισμένη Ομαδοποίηση Συντελεστής

μέτρο δείχνει μια πιο σημαντικό κόμβο σε σχέση με την ευρωστία του δικτύου.

Τα δίκτυα έχουν συνταχθεί και αναλύονται από ένα εργαλείο προσαρμοσμένο αυτόνομο γραμμένο σε C # και χτίστηκε πάνω από τη βιβλιοθήκη NodeXL 1.0.1.174 [18].

Αποτελέσματα

Η αλλαγμένη έκφραση των miRNAs σε ασθενείς με CRC και PC

σύγκριση προφίλ miRNA των 36 ζεύγη των συμπαγών όγκων και των παρακείμενων ιστών nontumorous στις ομάδες εκπαίδευσης (19 CRC και 17 PC) μέσω των μικροσυστοιχιών microRNA. Ανθρώπινα miRNAs (

έχει-ΜΙΚ

) και οι ιστοί ομαδοποιήθηκαν με ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (Σχήμα 1). Κάθε απεικονίζονται ανιχνευτής ήταν χρωματικά κωδικοποιημένα για να εξισώσουν το επίπεδο έκφρασης του miRNA σε σχέση με το μέσο επίπεδο έκφρασης της σε δείγματα ολόκληρου του ιστού που (μπλε, χαμηλή? Κόκκινο, υψηλή). (Εικόνα 1)

προφίλ miRNA 36 ζεύγη δειγμάτων ιστών από 19 ορθοκολικό καρκίνο (πορτοκαλί κουτί) και 17 καρκίνο του παγκρέατος (green box) ασθενείς ήταν συγκεντρωμένα. Τα 36 ζεύγη δειγμάτων είναι σε σειρές (έγχρωμες γραμμές) και οι 866 miRNAs είναι σε στήλες. Τ, καρκινικό ιστό? . Ν, παρακείμενο φυσιολογικό ιστό

Η

διαφορικά εκφράζονται miRNA στην CRC και PC

Για να προσδιορίσει miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε ζεύγη φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, ακολουθήθηκαν δύο προσεγγίσεις: μια κλασική Paired t-test έλεγχο για ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (fdr) και ανάλυση RF. Με την πρώτη ανάλυση, 42 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά σε CRC (Πίνακας 1). Είκοσι πέντε από αυτούς υπερεκφράζεται, με

HSA-miR1246

δείχνει την υψηλότερη τιμή πολλαπλάσια μεταβολή (12,0 φορές). Σε PC, 128 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά (βλέπε πίνακα S2). Πιο συγκεκριμένα, από 34 miRNAs με p & lt? 0,01, 30 έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε ιστό του όγκου, με το

HSA-miR-23a

εμφανίζει την υψηλότερη τιμή πολλαπλάσια μεταβολή (9,3 φορές), ενώ 4 ακόμα miRNAs ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας 2).

η

για να εξακριβώσει την ενδεχόμενη ύπαρξη ορθόλογα σε άλλα είδη, και να τα χρησιμοποιήσει ως εσωτερική μεθοδολογική ελέγχου, τα ανθρώπινα miRNAs βρίσκονται αλλαγμένη σε δύο στερεά όγκοι ελέγχθηκαν σε 71 άλλους οργανισμούς που υπάρχουν στο array: όλα απορυθμισμένη ορθόλογα του ανθρώπινου miRNAs (από τώρα και στο εξής,

έχει-ΜΙΚ

θα αναφέρεται ως

ΜΙΚ

) έδειξε μια σημαντική διαφορική έκφραση με παρόμοια φορές αλλαγή σε αυτούς τους οργανισμούς (Πίνακας S3).

Για να ελέγξετε την ακρίβεια του RF, παραστάσεις κατάταξη σε διακρίσεις όγκου από τον φυσιολογικό ιστό αναφέρθηκαν σε πολυδιάστατη κλιμάκωση των εκτιμώμενων οικόπεδα μήτρα εγγύτητας (Σχήμα 2) εμφανίζουν ομοιότητες ή διαφορές στα δεδομένα. Για κάθε τύπο όγκου, από τις τάξεις των σημαντικότερων miRNAs, σύμφωνα με την MDA, προήλθαν (Σχήμα 3, πάνελ Α και Β).

μήτρες Εγγύτητα από τυχαία ανάλυση δάσος, όπου

χ

και

γ-

άξονες είναι συντονίζει η πολυδιάστατη κλιμάκωση. Τα άτομα με παρόμοιες εκφράσεις miRNA αντιπροσωπεύονται από τα σημεία κοντά το ένα στο άλλο, ενώ οι ασθενείς με ανόμοια εκφράσεις miRNA αντιπροσωπεύεται από ξεχωριστά σημεία. Κόκκινο = ιστό του όγκου, Μαύρο = παρακείμενο φυσιολογικό ιστό.

Η

Μέση μείωση της ακρίβειας (MDA) ως μέτρο της miRNA σημασία για την ταξινόμηση ιστούς όγκων από τα φυσιολογικά αυτά εκτιμάται με τυχαία ανάλυση των δασών. Τα πρώτα 42 πιο σημαντικά miRNAs σε ορθοκολικό καρκίνο (πλαίσιο Α) και 50 miRNAs σε παγκρεατικό καρκίνο (πλαίσιο Β) που φαίνεται.

Η

Σύγκριση των μεθόδων ανίχνευσης υπογραφή miRNA

Όταν τα αποτελέσματα με συγχωνεύθηκαν το t-test και RF, βρέθηκε μια σημαντική επικάλυψη μεταξύ των miRNAs ανιχνεύθηκε στα ΚΕΠ και τους ιστούς PC. Με τέμνουν τις miRNAs με ρ & lt? 0.001 σε ανάλυση t-test (Πίνακας 1) με εκείνους με την υψηλότερη MDA σε RF ανάλυση (Σχήμα 3Α), η έκφραση του 24 miRNAs μεταβλήθηκε σημαντικά σε CRC (Σχήμα 4). Με μία παρόμοια αναλυτική προσέγγιση (Πίνακας S2, και το Σχήμα 3Β), 23 miRNAs ήταν σημαντικά μεταβληθεί σε PC (Σχήμα 4).

Για αμφότερους ιστούς σημαντική επικάλυψη μεταξύ ανιχνεύεται miRNAs βρέθηκε από τη συγχώνευση t-test και RF αποτελέσματα. Μια ομάδα 24 miRNAs, του οποίου η έκφραση ήταν σημαντικά μεταβληθεί σε όγκους παχέος εντέρου, ελήφθησαν τέμνει τη λίστα των πρώτων 42 miRNAs με καλύτερες ρ-τιμές, από την ανάλυση t-test, με εκείνες στο υψηλότερο MDA, από την ανάλυση RF. Κατά τον ίδιο τρόπο, επιλέχθηκαν 23 miRNAs με αλλοιωμένη έκφραση σε παγκρεατικών όγκων. * P & lt? 0.001? § RF & gt? 4.3? ** P & lt? 0,05? # RF & gt?. 0.94

Η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η έκφραση των miRNAs ήταν σε μεγάλο βαθμό ειδικό ιστό? Πράγματι, οι περισσότεροι miRNAs με αλλοιωμένη έκφραση σε CRC δεν differentiallly εκφράζονται σε παγκρεατικό καρκινικό ιστό. Η αλλαγμένη έκφραση μόνο δύο miRNA μοιράστηκε με CRC και PC:

miR-145

εμφανίστηκε 2,2 φορές κάτω-ρυθμιζόμενη (p & lt? 0.001) στο CRC, και 5,7 φορές πάνω ρυθμισμένα (p & lt? 0,01) στο PC, ενώ

miR-1280

ήταν 2,1 φορές πάνω ρυθμισμένα (p & lt? 0.001) και 2,3 φορές κάτω-ρυθμιζόμενη (p & lt? 0,05) στο πρώτο και στο δεύτερο καρκίνους, αντίστοιχα (βλέπε πίνακα 1, Πίνακας 2 και Πίνακας S2).

miRNA συσχετισμούς και τον καρκίνο-miR δίκτυο

στη συνέχεια προσπαθήσαμε να ελέγξει την σχέση μεταξύ των προηγουμένως επιλεγμένων miRNAs που εκφράζονται είτε CRC και PC ιστούς μέσω της Spearman μέθοδος συντελεστής συσχέτισης

για CRC, διαφορετικά

βαθμούς

συσχέτισης αποτελέσματα για τις 24 miRNAs που εμφανίζουν αλλοιωμένη έκφραση:.

miR-106a

δεν ήταν συσχετίζονται καθόλου, ενώ

miR-195

παρουσίασαν το μεγαλύτερο αριθμό των δεσμών και λήφθηκε ως κόμβος ρίζα με 9 άκρες (

βαθμό

15.86)? 8 συνδέσεις εντοπίστηκαν για

miR-28-3p

(

βαθμό

15.66), και 7 συνδέσεις για

miR-1280

(

βαθμό

13.79) ,

miR-1246

(

βαθμό

13,05), και

miR-140-3p

(

βαθμό

12.12) (Σχήμα 5, πίνακας Α) . Τα τελευταία 3 κόμβοι επίσης διασυνδέονται με το

miR-28-3p

, η οποία έδειξε μια υψηλή τιμή betweenness. Γι ‘αυτό το τελευταίο μέτρο, παρατηρήθηκε η υψηλότερη τιμή για το

miR-1246

κόμβο στον οποίο συμβαίνουν πολλά συντομότερα μονοπάτια μεταξύ άλλων κορυφών (Πίνακας S4). Ένα άλλο σημαντικό κόμβο εκπροσωπήθηκε από

miR-18a

με 6 σχέσεις, 3 εκ των οποίων ιδρύθηκε με αρκετές miRNAs που ανήκουν στο

miRNA 17-92a

συμπλέγματος. Όταν μετράται ο βαθμός του κόμβου ομαδοποίησης (γ

-διακόσμησης συντελεστή

), η

miR-378, miR-10b

και

miR-31

φαινόταν να είναι ένα

cliqu

e με Vertice στο

miR-28-3p

. Για να επαληθεύσετε την ευρωστία του δικτύου, υπολογίσαμε το

σταθμισμένο μέσο ομαδοποίησης συντελεστή

, και αξιολογείται η συμβολή ενός miRNA με τη συνολική πυκνότητα του δικτύου. Τα χαμηλότερα ποσοστά παρατηρήθηκαν για

miR-1280, miR-195

και

miR-140-3p

που ήταν οι κορυφές του πλήρους γραφήματος (Εικόνες 5, του πίνακα Α και Πίνακας S4).

Πράσινο σημεία απεικονίζουν τους κόμβους που αντιστοιχούν σε 24 miRNAs του δικτύου CRC και 23 miRNAs του δικτύου PC. Οι ακμές χαρακτηρίζουν τις σημαντικές συσχετίσεις, του οποίου το πάχος αντανακλά Spearman συντελεστές συσχέτισης (μπλε και πράσινο άκρα χρησιμοποιούνται για θετικές και αρνητικές συσχετίσεις αντίστοιχα). Στο δίκτυο CRC, όπως φαίνεται στον πίνακα Α, m

iR-195, miR-28-3p, miR-1280, miR-18a

και

miR-1246

παρουσιάζουν το υψηλότερο

σταθμισμένο βαθμό

βαθμό. Κανένας συσχετισμός βρέθηκε για

miR-106a

.

MiR-1246

έχει επίσης το υψηλότερο

betweenness

κατάταξη. Στο δίκτυο υπολογιστή, όπως φαίνεται στον πίνακα Β,

miR-103, miR-23a

και

miR-15b

έχουν το υψηλότερο

βαθμούς

και όλα συνδέονται με

miR-199α-3ρ

καθώς και σε κάθε άλλο σχηματίζοντας ένα τέσσερις κόμβους

κλίκα

. Επιπλέον, η απομάκρυνση αυτών των κόμβων προκαλεί τη βαθύτερη πτώση του μέσου όρου της τάξης συντελεστή ομαδοποίησης.

MiR-384

εμφανίζει το υψηλότερο μέτρο betweenness κεντρικότητα.

Η

Είκοσι από 23 miRNAs με μια σημαντική απορρύθμιση στους ιστούς PC συνδέονταν με άλλους κορυφές του δικτύου από ένα πλήθος των ακμών ποικίλλει από ένα έως πέντε (

πτυχίο

: 8,88 – 1,92)? μόνο 3 miRNAs (δηλαδή

miR-30D *, miR-1280

και

miR-493 *

) δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (

βαθμός

: 0), ( Το Σχήμα 5, πάνελ Β). Ειδικότερα, ο μέγιστος αριθμός των δεσμών βρέθηκε για

miR-103

(

βαθμός

: 8.88),

miR-23a

(

πτυχίο

: 8.84) και

miR-15b

(

βαθμός

: 8,38). Αυτά τα 3 κύρια κόμβοι ήταν όλοι που συνδέονται με

miR-199α-3ρ

(βαθμός: 6,03) και οι τέσσερις αυτοί miRNA εμφανίστηκε μεταξύ διέσχισε να αποτελούν μια κλίκα τέσσερις-κόμβο. Το υψηλότερο μέτρο betweenness κεντρικότητα παρατηρήθηκε για

miR-384

(

betweenness

: 0,31), βρέθηκε να τοποθετείται κριτικά στο μεταξύ (έτσι, υπεύθυνος πολλών) συσχετίσεις μέσου βεληνεκούς. Επαληθεύσαμε τη ουσιαστικότητα των τεσσάρων κόμβο

κλίκα

μετρώντας τη συνολική ευρωστία του δικτύου (σε όρους μονοπάτια πλεονασμού) αφού το αφαιρέσετε. Υπολογίσαμε το

σταθμισμένο μέσο συντελεστή ομαδοποίησης

για ολόκληρο το δίκτυο αφαιρώντας τη σειρά του έναν κόμβο. Ειδικότερα, μετά την αφαίρεση των κόμβων του

κλίκα

(

miR-103, miR-15b, miR-199α-3ρ

και

miR-23a

) τις χαμηλότερες τάξεις , δηλαδή 5,78, 5,85, 6,05 και 6,14 αποκτήθηκαν, αντίστοιχα. Το εύρημα αυτό στοχεύει σε αυτούς τους κόμβους ως λειτουργικά συναφείς και ως σημαντικό συστατικό της συνεκτικότητας του δικτύου (Σχήμα 5, πάνελ Β και στον πίνακα S4).

Επικύρωση qPCR

Μεταξύ σημαντικά απορυθμισμένη miRNAs στην η μελέτη μικροσυστοιχίας, 18 επελέγησαν για περαιτέρω επικύρωση από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR). Επιλογή αυτών των miRNAs βασίστηκε σε δύο κριτήρια: το αποτέλεσμα της ανάλυσης που περιγράφηκε προηγουμένως διασταύρωση, ή /και τη συμμετοχή τους στο παχύ έντερο ή το πάγκρεας ογκογένεση (σύμφωνα με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας). Ποσοτική PCR εφαρμόστηκε για την ανάλυση αλλαγμένη έκφραση των επιλεγμένων miRNAs, καθώς και εκείνη του μάρτυρα RNAU6, στον όγκο και φυσιολογικούς ιστούς που λαμβάνονται από ένα νέο ομάδες επικύρωση των 14 ασθενών με CRC και 21 ασθενείς PC.

σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό με ένα προφίλ έκφρασης κανονικοποιούνται στο 1, σε δείγματα όγκων από τους 14 ασθενείς CRC παρατηρήσαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω για 3 miRNAs (

miR-31, miR-21

και

ΜΙΚ 708

), και σύμφωνα με την έκφραση σε 7 άλλους (

miR-145, miR-139-5p, miR-486-5p, miR-378, miR-140-3p, miR-143

και

miR-30c

) (Πίνακας 3). Τα υπόλοιπα 8 miRNAs (

miR-151-5p, miR-155 *, miR-17, miR-199α-5P, miR-23a, miR-30a-5P, miR-455-3p, και miR-γράμ- 7θ

) δεν παρουσιάζουν σημαντικά αλλοιωμένη έκφραση.

η

στην ομάδα των 21 ασθενών PC, 13 από 18 miRNAs αναλύθηκαν από qPCR σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα. Down-έκφραση παρατηρήθηκε μόνο για

miR-21

, ενώ υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε 12 miRNA (

miR-143, miR-145, miR-151-5p, miR-155 *, miR -199a-5P, miR-23a, miR-30a, miR, 30c, miR-21, miR-455-3p, miR-708

και

miR-ας-7i

) και μόνο δύο ήταν δεν απορυθμισμένη σε στατιστικά σημαντικό τρόπο (

miR-30a και

miR-30c) (Πίνακας 3).

Συζήτηση

miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε διάφορες μορφές καρκίνου μπορούν να συμμετέχουν στην κοινή αλλαγμένη ρυθμιστικές οδούς [19]. Έτσι, η γνώση του δικτύου που αλληλεπιδρούν τους μπορεί να προσφέρει μια προοπτική αλλαγμένη miRNAs και το σχέδιο τους της απορρύθμισης (δηλαδή, πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση). Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προφίλ miRNAs σε δύο διαφορετικά στερεά καρκινικούς ιστούς, το CRC και τον υπολογιστή, για να ελέγξετε αν τυχόν εύλογο «υπογραφές» ήταν ανιχνεύσιμη. Για το σκοπό αυτό, αρχικά αναζήτησαν miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε όγκους και κανονικό ιστό των δύο διαφορετικών καταγωγών, και στη συνέχεια προσδιορίζονται «ιστο-ειδική» miRNAs χρησιμοποιώντας μία νέα στατιστική προσέγγιση, δηλ ταξινομητή RF. Για κάθε καρκινικό ιστό ήμασταν σε θέση να δημιουργήσει μια λίστα με τις πιο συγκεκριμένες και σημαντικά απελευθερωθεί miRNAs. Είναι ενδιαφέρον ότι, και στις δύο λίστες μόνο δύο miRNAs επανεμφανίστηκαν αλλά με αντίθετο μοτίβα έκφρασης:

miR-145

και

miR-1280

. Ωστόσο, ενώ τα διαφορετικά πρότυπα της έκφρασης

miR-145

αναγνωρίζονται [20], τίποτα δεν είναι γνωστό για το

miR-1280

και τη συμπεριφορά του σε συμπαγή όγκο.

Μια ολοκληρωμένη ανάλυση των διαδραστικών δικτύων αυτών των miRNAs έδειξε ότι τα πρότυπα απορρύθμιση τους είναι συγκεκριμένο ιστό, όπως παρατηρήθηκαν ανόμοια συνδέσεις (δηλαδή, διαφορετικά πρότυπα συσχέτισης) μεταξύ αυτών των δύο σειρών. Επιπλέον, προσδιορίσαμε τις πιο κρίσιμες miRNAs και επαλήθευσε ότι ήταν διαφορετικές σε CRC και σε δίκτυα PC.

Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς ρύθμισης των miRNAs που συνδέονται με σημαντικές συνδέσεις και στα δύο δίκτυα, πραγματοποιήσαμε μια τριών βημάτων

σε-silico

ανάλυση. Πρώτον, κατατάσσονται κόμβους μέσω των γνωστών δεικτών κεντρικότητας: σταθμισμένος

βαθμό

και

betweenness

. Ενώ ο πρώην δείκτη παρέχονται γνώσεις του άμεσου αποτελέσματος που ασκείται από κάθε κόμβο στη γειτονιά του (στην περίπτωσή μας, η συσχέτισή τους), οι τελευταίες προσδιορίζονται κόμβους απαραίτητη για έμμεσες συσχετίσεις, δηλαδή κόμβους που βρίσκονται σε μονοπάτια της συσχέτισης και ότι συμβάλλει κατά κάποιο τρόπο στην μεγάλη εμβέλεια συσχετίσεις. Ως εκ τούτου, έχουμε κατετάγη κόμβους με το

συντελεστή ομαδοποίησης

δείκτης, προκειμένου να μετρήσει το βαθμό της συνεκτικότητας με τους άμεσους γείτονες. Ο στόχος ήταν να προσδιοριστεί ποσοτικά η ευρωστία των δικτύων, αναζητώντας τους κόμβους που διαφορετικά θα διαταράξει την αρχιτεκτονική των δικτύων όταν δεν λαμβάνονται υπόψη. Για το σκοπό αυτό, υπολογίστηκε ο συντελεστής διασποράς για το σύνολο των δικτύων από κυκλικά την αφαίρεση ενός κόμβου με αντίστοιχες άκρες, και με τη χρήση του

σταθμισμένο βαθμό

ως συνάρτηση του βάρους. Σε γενικές γραμμές, τα δίκτυα λείπει κόμβοι απαραίτητη για τη συνολική ευρωστία παρουσίασαν χαμηλότερες βαθμολογίες.

Ως τελευταίο βήμα, θα επικυρωθεί μας

σε-silico

εκτιμήσεις από το χέρι τον έλεγχο γονιδίων στόχων και των μονοπατιών σηματοδότησης τους. Με αυτές τις προσεγγίσεις, παρατηρήσαμε ότι η πλειοψηφία των miRNAs με παρόμοια μοτίβα απορρύθμιση συνδέθηκαν με κοινά γονίδια-στόχους και /ή ρυθμιστικές οδούς (βλέπε Πίνακα S5). Ειδικότερα, στο CRC βρέθηκαν τρεις κύριους κόμβους:

miR-195, miR-18a

, και

miR-1246

. Ο πρώτος κόμβος είχε μια υψηλή σχέση με miRNAs που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ, όπως φαίνεται

σε-silico

ανάλυση με τη χρήση DIANA-mirPath (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple .php), εκτός από

miR-31 και miR-28-3p

, τα οποία ανήκουν στην οδό ΕΤΠ. Ο δεύτερος κόμβος, η

miR-18a

, περιλαμβάνονται αρκετές miRNAs (

miR-17, miR-19b, miR-92a

) που ανήκουν στο ίδιο σύμπλεγμα: το

miRNA 17- 92a

.