PLoS One: Ποσοτικοποίηση των Κανονική κλάσμα κυττάρων και αριθμός Αντιγραφή Ουδέτερη ΑΕ σε κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα Χρησιμοποιώντας SNP Array Δεδομένων


Αφηρημένο

Ιστορικό

Τεχνολογίες βασίζεται σε μικροσυστοιχίες DNA έχουν τη δυνατότητα να παρέχουν λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με γονιδιωματικής εκτροπές στα καρκινικά κύτταρα. Στην πράξη, ένα σημαντικό εμπόδιο για την ποσοτική ανίχνευση των ανωμαλιών είναι η ετερογένεια της κλινικής ιστό του όγκου. Από καρκινικός ιστός περιέχει πάντοτε γενετικά φυσιολογικά στρωματικά κύτταρα, αυτό μπορεί να οδηγήσει σε αποτυχία την ανίχνευση ανωμαλιών στα καρκινικά κύτταρα.

Κύρια εύρεση

Χρησιμοποιώντας δεδομένα array SNP από 44 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα δείγματα έχουμε αναπτύξει μια βιοπληροφορικής αλγόριθμο που με ακρίβεια μοντέλα τα κλάσματα των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε κλινικά δείγματα όγκων. Η αναλογία των φυσιολογικών κυττάρων σε συνδυασμό με τα δεδομένα συστοιχία SNP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων ουδέτερη απώλειας ετεροζυγωτίας (CNNLOH) στα κύτταρα όγκου τόσο στο ακατέργαστο ιστό όγκου και σε δείγματα εμπλουτισμένα για κύτταρα όγκου με σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής.

Συμπέρασμα

Γονιδίωμα-ευρύ ποσοτική ανάλυση των CNNLOH χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CNNLOH Quantifier μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό επαναλαμβανόμενες ανωμαλίες που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του όγκου σε κλινικά δείγματα όγκων. Επιπλέον, το SNP-σειρά με βάση την ανάλυση των CNNLOH μπορεί να γίνει σημαντικό για την ανίχνευση των ανωμαλιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαγνωστικούς και προγνωστικούς σκοπούς

Παράθεση:. Göransson Η, Edlund Κ, Rydåker Μ, Rasmussen Μ, Winquist J, Ekman S, et al. (2009) Ποσοτικοποίηση των Κανονική κλάσμα κυττάρων και αριθμός Αντιγραφή Ουδέτερη ΑΕ σε κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα Χρησιμοποιώντας SNP σειρά δεδομένων. PLoS ONE 4 (6): e6057. doi: 10.1371 /journal.pone.0006057

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 18 Φεβ 2009? Αποδεκτές: 5 του Ιουνίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιουνίου 2009

Copyright: © 2009 Göransson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη ήταν ένα μέρος ενός ανοικτού ερευνητικής συνεργασίας που υποστηρίζονται και χρηματοδοτούνται εν μέρει από την AstraZeneca, Alderley Park, Ηνωμένο Βασίλειο. Το έργο υποστηρίζεται επίσης από τη Σχολή Ιατρικής και Φαρμακευτικής (Πανεπιστήμιο της Ουψάλα), το Uppsala University Hopsital, Akademiska Εργαστήριο, το ίδρυμα Beijer, Wallenberg Κοινοπραξία Βόρεια και Swegene. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, ούτε στην απόφαση να δημοσιεύσει το χειρόγραφο. Andrew P. Thomas, ο οποίος είναι ανώτερος ερευνητής στο AstraZeneca έλαβε μέρος στην αναθεώρηση του πνευματικού περιεχομένου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ο συν-συγγραφέας Andrew P. Thomas απασχολείται από την AstraZeneca. Anders Isaksson και Andrew P. Thomas κρατήσει απόθεμα στο Astra Zeneca.

Εισαγωγή

Bioinformatic αλγόριθμοι έχουν αναπτυχθεί για να χρησιμοποιήσετε το SNP πληροφορίες array για τον εντοπισμό γονιδιωματική εκτροπές όπως τον αριθμό αντιγράφων του DNA αλλαγές και την απώλεια-του -heterozygosity (LOH), δηλαδή τμήματα του DNA με αποκλειστικά ομόζυγο δείκτες [1] – [8]. Ωστόσο, ένα σημαντικό μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι γενετική ετερογένεια σε δείγματα όγκων, που προκαλείται από το μίγμα του καρκίνου και στρωματικά κύτταρα, συχνά δεν λαμβάνεται υπόψη. Κατά συνέπεια εκτροπές συχνά δεν ανιχνεύεται σε δείγματα με ένα μεγάλο ποσοστό των γενετικά φυσιολογικών κυττάρων. Αυτό μπορεί εν μέρει να εξηγήσει γιατί, παρά τη συσσώρευση μεγάλων ποσοτήτων γονιδιωματικής δεδομένα, η κλινική σημασία αυτών των αναλύσεων για διαγνωστικούς σκοπούς είναι ακόμη μικρή. Ιστός όγκου αντιπροσωπεύει ένα μίγμα από καρκινικά κύτταρα και μη όγκου, δηλ φλεγμονώδη κύτταρα, ινοβλάστες στρωματικά κύτταρα και από αίμα και λεμφικών αγγείων [9]. Το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων συχνά υπερβαίνει το κλάσμα των κυττάρων όγκου σε δείγματα ασθενών αποθηκεύονται σε βιοτράπεζες (Σχήμα 1Α). Αυτή η ετερογένεια του δείγματος επηρεάζει σοβαρά την ανάλυση αριθμού αντιγράφων. Στο καλύτερο της γνώσης μας, δεν υπάρχουν εκτιμήσεις για το πώς η ευαισθησία της ανίχνευσης του γενωμικού εκτροπών εξαρτάται από την αναλογία των φυσιολογικών κυττάρων σε κλινικά δείγματα όγκων. Ένας λόγος μπορεί να είναι η δυσκολία για την εκτίμηση του όγκου έναντι κανονικής αναλογίας κυττάρων ιστολογικά με μικροσκοπία σε δείγματα ετερογενή όγκου με διάφορες αναλογίες των φυσιολογικών κυττάρων σε διαφορετικά μέρη του δείγματος. Επιπλέον, υπάρχει έλλειψη συναίνεσης σχετικά με το πώς το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων σε ένα στερεό καρκίνου θα πρέπει να αξιολογούνται και να σχολιάζονται. Έτσι, η απόδοση των σημερινών εργαλείων για την ανίχνευση της γονιδιωματικής εκτροπών σε κλινικά δείγματα όγκων είναι συχνά αβέβαιο.

Α) με αιματοξυλίνη-Eosin βάφονται κατεψυγμένα τμήμα μιας αντιπροσωπευτική περίπτωση NSCLC αναλύονται σε αυτή τη μελέτη (αρχική μεγέθυνση 40 ×) . Το δείγμα όγκου αποτελείται από ένα μείγμα κυττάρων όγκου λευκό βέλος, στρώμα με ένα αιμοφόρο αγγείο μαύρο βέλος, φλεγμονώδη κύτταρα, δηλ λεμφοκύτταρα κόκκινο βέλος, και ένα υπόλοιπο κυψελίδα του πνεύμονα γεμίζουν με μακροφάγα πράσινο βέλος. Β) Διαγραφή ΑΕ. Τα φυσιολογικά κύτταρα υποδεικνύονται με οβάλ σχήμα κύτταρο. Η διαγραμμένη περιοχή στα κύτταρα του όγκου (ορθογώνιο σχήμα κύτταρο) υποδεικνύεται με λευκά κύκλους. Σχηματική ζεύγη χρωμοσωμάτων με μόνο πληροφοριακό δείκτες Α για το μαύρο και το Β για το κόκκινο chromosme. Κάτω από κάθε χρωμόσωμα υποδεικνύεται ο γονότυπος στην περιοχή της διαγραφής. Τα κύτταρα με αριθμό διαφορετικών αντίγραφο γονότυπους επισημαίνονται Ν

κανονικό, Τ

2Ν, Τ

1Ν, και Τ

0N. Ν υποδεικνύει ότι το κύτταρο είναι κανονικό και Τ ότι sis ένα κύτταρο όγκου. Οι δείκτες για τα κύτταρα του όγκου αναφέρουν την περιεκτικότητα σε DNA στην περιοχή με διαγραφή. Δεδομένου ότι αυτά είναι όλα τα είδη κυττάρων του δείγματος οι αναλογίες συνοψίσω σε μία. Γ) Αντίγραφο ουδέτερο ΑΕ. Στην περίπτωση αυτή, τα καρκινικά κύτταρα έχουν όλα 2Ν περιεχόμενο DNA. Ωστόσο, ορισμένα κύτταρα όγκου είναι ομόζυγα (στην προκειμένη περίπτωση ΒΒ) για την περιοχή ενδιαφέροντος (T

hom) και το άλλο είδος είναι ετερόζυγο ΑΒ (Τ

het). Το άθροισμα των κλασμάτων των κυττάρων ισούται με ένα.

Η

Μια που αναπτύχθηκε πρόσφατα εργαλείο παίρνει δείγμα ετερογένεια υπόψη για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων μελών [10]. Είναι σχεδιασμένο για μελέτες με ζευγαρωμένα δείγματα (όγκου και κανονικό). Στην πράξη, ωστόσο, σε συνδυασμό δείγματα συχνά δεν είναι διαθέσιμα για τις μεγαλύτερες ομάδες ασθενών.

Σε μια άλλη μελέτη Nancarrow et al απεικονίσει τον αναμενόμενο ρυθμό συχνότητες αλληλόμορφου ανάλογα με διάφορες αναλογίες των φυσιολογικών κυττάρων στο δείγμα του όγκου χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις [11 ].

ένα άλλο πολλά υποσχόμενο εργαλείο ανάλυσης, AsCNAR, είναι σε θέση να προσδιορίσει ΑΕ, ακόμη και όταν ένα από τα δύο μικτών κυτταρικών σειρών υπάρχει μόνο σε ένα ποσοστό της τάξης του 20% [12]. Πρόσφατα Assie et al περιγράφεται έναν αλγόριθμο που λαμβάνει η ετερογένεια των όγκων υπόψη για τον προσδιορισμό γονιδιωματικής εκτροπές σε δείγματα με 40-75% των κυττάρων του όγκου [13].

Οι μελέτες δείχνουν ότι ο αριθμός αντιγράφων ουδέτερο ΑΕ μπορεί να είναι ένας μηχανισμός για την αδρανοποίηση του ογκοκατασταλτικών γονιδίων [14]. Αρκετές μελέτες και τα δικά μας δεδομένα δείχνουν ότι CNNLOH είναι πιο συχνή από ό, τι εθεωρείτο μέχρι σήμερα [15], [16]. Λαμβανόμενα μαζί αυτό υποδηλώνει ότι CNNLOH μπορεί να είναι σημαντική για τον καθορισμό ορισμένων φαινοτύπους καρκίνου. Για την ανάλυση CNNLOH με κλίμακα γονιδίωμα επίπεδο κατά τα καρκινικά κύτταρα σε ετερογενή δείγματα εστιάσαμε 1) την ανάπτυξη ενός αλγορίθμου για την ποσοτικοποίηση της αναλογίας των φυσιολογικών κυττάρων στο δείγμα και 2) για την ποσοτικοποίηση CNNLOH σε όλο το γονιδίωμα των κυττάρων του όγκου. Τέτοια ποσοτική ανάλυση έχει τη δυνατότητα να γίνει ένα σημαντικό εργαλείο για τη διάγνωση του καρκίνου του μοριακού.

Αποτελέσματα

Μια στρατηγική για την ποσοτικοποίηση των CNNLOH σε δείγματα ετερογενή όγκου

Για την ποσοτικοποίηση CNNLOH σε ετερογενή δείγματα όγκων η συνεισφορά σήματος αλληλόμορφο-ειδική από διαφορετικούς τύπους κυττάρων θα πρέπει να εκτιμηθεί. Το Σχήμα 1 απεικονίζει ένα τυπικό μίγμα κυττάρων σε κατεψυγμένες τομές ενός μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δείγμα όγκου και παρέχει μια σχηματική αναπαράσταση των διαφορετικών τύπων κυττάρων και γονότυπων που θα μπορούσε να υπάρχει σε περίπτωση γονιδιωματικών διαγραφή ή CNNLOH. Άλλες γονιδιωματικής εκτροπών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δημιουργούν υψηλότερα εκτροπές πλοειδία, μπορεί επίσης να εμφανιστεί στον ίδιο τόπο ως τη διαγραφή ή CNNLOH, περιπλέκοντας ακόμη περισσότερο την εικόνα. Ωστόσο, η πιθανότητα τέτοιων γεγονότων μπορεί να αναμένεται να είναι χαμηλή και στην παρούσα μελέτη έχουν υποτίθεται ότι είναι αμελητέα σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των διαγραφών και CNNLOH.

Το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων μπορεί για ορισμένους τύπους όγκοι να μετρηθεί με απλό τρόπο. Σε αιματολογικούς όγκους το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων μπορεί να μετρηθεί χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιεί πληροφοριακοί δείκτες επιφάνειας. Ωστόσο, εναιωρήματα μονών κυττάρων για κυτταρομετρία ροής είναι δύσκολο να αποκτηθούν από συμπαγείς όγκους. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτοματοποιημένα ή χειροκίνητο μέσο προσδιορισμού φυσιολογικών κυττάρων μετρώντας τους

in situ

βασίζονται σε μοριακούς δείκτες ή μορφολογία. Αυτές οι μέθοδοι απαιτούν προηγμένες τεχνικές απεικόνισης ή χρονοβόρα εργασία για έναν εκπαιδευμένο ιστοπαθολόγου. Σε αυτή την εργασία χρησιμοποιούμε τις εντάσεις σήματος των δύο SNP αλλήλια να εκτιμηθεί το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων και να χρησιμοποιήσει αυτές τις πληροφορίες για να εκτιμηθεί το ποσοστό των κυττάρων του όγκου με CNNLOH.

Ποσοτικοποίηση της αναλογίας των φυσιολογικών κυττάρων από SNP γονοτυποποίηση δεδομένα array

σε δείγματα όπου το ποσοστό των φυσιολογικών κυττάρων είναι δύσκολο να επιτευχθεί με άλλα μέσα, που έθεσε ως στόχο να εκτιμήσει το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων από μόνο δεδομένα SNP. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β το κλάσμα των κυττάρων με 2Ν DNA (C

2Ν) σε περιοχές με διαγραφές είναι το άθροισμα των φυσιολογικών κυττάρων (Ν

κανονικό) και τα καρκινικά κύτταρα με 2Ν DNA (Τ

2Ν). Η βάση για τη μέθοδο CNNLOH Quantifier είναι να χρησιμοποιηθεί το αλληλόμορφο-ειδικά σήματα Α και Β για κάθε θέση για να ληφθεί η πειραματική συχνότητα Αλληλόμορφο Β (ABF), ως κανονικοποιημένη αναλογία Β /(Α + Β) βλέπε Μέθοδοι. Μια παραγωγή και μια γραφική απεικόνιση είναι διαθέσιμα αλλού [17]. Οι ABfs ετερόζυγων πληροφοριακοί δείκτες σε σύνθετα δείγματα όγκων εξαρτάται από τον αριθμό αντιγράφων και την κυτταρική σύσταση του δείγματος. Σε ένα πρώτο στάδιο μας ήταν να προσδιοριστεί η αναλογία των κυττάρων C

2Ν με τη σύγκριση των πειραματικών ABfs σε ένα παράθυρο διαδοχικών SNPs σε περιοχές με μονο-αλληλικές εξαλείψεις με προσομοίωση δεδομένων. Οι προσομοιώσεις λαμβάνουν παράγοντες υπόψη, όπως η μέση ετεροζυγωτία, αριθμό αντιγράφων των καρκινικών κυττάρων, πειραματικές παραλλαγή και τη σύνθεση των διπλοειδή κύτταρα και τα κύτταρα του όγκου. Το Σχήμα 2 απεικονίζει το πώς οι ιστογράμματα των παρατηρούμενων ABfs σύγκριση με προσομοιωμένο ιστογράμματα με ποικίλες κλάσματα C

2Ν χρησιμοποιώντας την Ευκλείδεια απόσταση. Το ιστόγραμμα με τη μικρότερη απόσταση από την παρατηρούμενη ιστόγραμμα προσδιορίζει την αντίστοιχη C

2Ν (βλέπε Εικ. 2 και Μέθοδοι).

Δύο παραδείγματα των παρατηρούμενων τιμών ABF κατά μήκος των χρωμοσωμάτων. Παράθυρα από τουλάχιστον 140 συνεχόμενη SNP δείκτες χρησιμοποιούνται για να συγκεντρώσουν αλληλόμορφο-ειδικές πληροφορίες κατά μήκος του χρωμοσώματος. Οι τιμές ABF σε κάθε παράθυρο που απεικονίζεται ως παρατηρείται ιστόγραμμα. Στο επόμενο βήμα η παρατηρούμενη ιστόγραμμα συγκρίνεται με εκατοντάδες προσομοιωμένων ιστογράμματα όπου το κλάσμα των ετερόζυγων κυττάρων έχει μεταβληθεί. Η προσομοίωση ιστόγραμμα με τη μικρότερη Ευκλείδεια απόσταση στην παρατηρούμενη ιστόγραμμα προσδιορίζει την πιο πιθανή αναλογία των ετερόζυγων κυττάρων στο δείγμα (X%). Η σύγκριση των ιστογραμμάτων χρησιμοποιείται τόσο για την εκτίμηση του ποσοστού των διπλοειδή κύτταρα (C

2Ν) σε περιοχές όπου τα καρκινικά κύτταρα έχουν διαγραφές και την αναλογία των ετερόζυγα κύτταρα (C

het) σε περιοχές του γονιδιώματος με καρκινικά κύτταρα 2Ν. C

2Ν και C

het στη συνέχεια χρησιμοποιούν για την εκτίμηση του κλάσματος των φυσιολογικών κυττάρων και η ποσοτικοποίηση των CNNLOH.

Η

N

φυσιολογικό να μην λαμβάνεται απευθείας από την εκτίμηση της C

2Ν. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να αναμένεται να έχει δύο από κάθε αυτοσωμικό συμβολή τους στην ABF αναμένεται να είναι εξίσου μεγάλη για όλες αυτοσωμικά, ενώ η συμπληρωματική συνεισφορά του Τ

κύτταρα 2Ν μπορεί να ποικίλει ανάλογα με την ετερογένεια του όγκου για κάθε χρωμόσωμα . Έτσι, σε δείγματα όπου ανιχνεύεται η απώλεια του αριθμού αντιγράφων σε διάφορα χρωμοσώματα τη χαμηλότερη εκτίμηση της C

2Ν για ένα χρωμόσωμα έχει τη μικρότερη συνεισφορά από τα καρκινικά κύτταρα 2Ν. Σε πολλές περιπτώσεις όπου η διαγραφή έχει προκαλέσει πλεονέκτημα πολλαπλασιασμό της συνεισφοράς της στον μικρότερο C

2Ν από τα καρκινικά κύτταρα 2Ν θα με τον καιρό να είναι κοντά στο μηδέν. Ως εκ τούτου, στις περιπτώσεις όπου οι πληροφορίες από διάφορα χρωμοσώματα είναι διαθέσιμο, μπορεί να δικαιολογηθεί για την εκτίμηση Ν

κανονική ως το μικρότερο C

2Ν.

Η επικύρωση του πίνακα SNP με βάση εκτιμήσεις σε σύγκριση με χειροκίνητη καταμέτρηση των φυσιολογικών κυττάρων

Εφαρμόσαμε τη μέθοδο για 60 μη-μικρά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (βλέπε ΜΕΘΟΔΟΣ). Σαράντα τέσσερα από τα εξήντα δείγματα (73%) πληρούσαν τα αυθαίρετα κριτήρια που τουλάχιστον δύο περιοχές σε δύο διαφορετικά χρωμοσώματα ποικίλλουν όχι περισσότερο από 5% σε C

εκτιμήσεις 2Ν τους και ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να παρέχει μια εκτίμηση της Ν

φυσιολογική (βλέπε μεθόδους). Τα κριτήρια που να λαμβάνουν υπόψη την πιθανή επίδραση της συστατικής αλληλομόρφων μοτίβα που μοιάζουν με CNNLOH. Οι περισσότερες από τις 16 περιπτώσεις για τις οποίες θα μπορούσε να ληφθεί καμία εκτίμηση δεν έχει δύο διαγραφές.

Για να επικυρώνει τις εκτιμήσεις της κανονικής κλάσμα των κυττάρων με βάση τα στοιχεία SNP, ένα τυχαίο υποσύνολο των δειγμάτων 60 NSCLC ήταν επιλέγονται για την προσεκτική και εκτεταμένη μικροσκοπική καταμέτρηση των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε κατεψυγμένες τομές (βλέπε μεθόδους). Επτά από αυτές τις περιπτώσεις επικαλύπτονται με τις 44 περιπτώσεις όπου N

κανονικό μπορούσε να εκτιμηθεί, ο Πίνακας 1 δείχνει τις εκτιμήσεις του κλάσματος των φυσιολογικών κυττάρων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας δεδομένα συστοιχίας SNP και χειροκίνητη καταμέτρηση με βάση τη μορφολογία για αυτά τα δείγματα. Υπάρχει καλή συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με τις δύο μεθόδους, το οποίο δείχνει ότι η μέθοδος που βασίζεται SNP παρέχει ακριβείς πληροφορίες σχετικά με το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων σε δείγματα όγκων.

Η

Η ποσοτικοποίηση του αριθμού αντιγράφων ουδέτερο ΑΕ σε πνεύμονα δείγματα καρκίνος

είναι απαραίτητο να ποσοτικοποιηθεί το κλάσμα των κανονικών κυττάρων που υπάρχουν σε ένα δείγμα όγκου πριν από την ανάλυση των πληροφοριών συστοιχία SNP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του κλάσματος των κυττάρων του όγκου με 2Ν DNA που έχει LOH, δηλαδή CNNLOH. CNNLOH = T

hom /(Τ

Hom + T

het). (Βλέπε Σχ. 1Β). Σε αυτή την περίπτωση είναι ο κύτταρα ετερόζυγη όγκου Τ

het που μαζί με τα φυσιολογικά κύτταρα θα τροποποιήσουν τη συχνότητα Αλληλόμορφο Β των ομόζυγων κυττάρων όγκου με LOH. Για CNNLOH η συχνότητα Αλληλόμορφο Β των πληροφοριακοί δείκτες εξαρτάται από τα ετερόζυγα κύτταρα C

het. Προσομοιωμένη ιστογράμματα λαμβάνοντας ποικίλες κλάσματα ετερόζυγα κύτταρα υπόψη συγκρίθηκαν με τα ιστογράμματα που βασίζεται σε αξίες ABF από ένα κινούμενο παράθυρο με ένα σταθερό αριθμό δεικτών (βλέπε Σχ. 2 και Μέθοδοι). Η προσομοίωση ιστόγραμμα πιο παρόμοια με την παρατηρούμενη ιστόγραμμα, που προσδιορίζονται το αντίστοιχο κλάσμα ετερόζυγα κύτταρα, C

het. Αν το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων N

κανονικό είναι γνωστό, CNNLOH μπορεί να υπολογιστεί, από την 1η = Ν

κανονικό + T

hom + T

het. Να αποδείξει την αξία της μεθόδου CNNLOH Quantifier μπορούμε να εφαρμόζεται σε ένα σύνολο δειγμάτων NSCLC (βλέπε μεθόδους). Οι Genome ολόκληρη ποσοτικές μετρήσεις CNNLOH φαίνεται στο Σχ. 3. Μπορεί να σημειωθεί ότι υπάρχουν επαναλαμβανόμενες περιοχές με υψηλούς βαθμούς αριθμού αντιγράφων ουδέτερο ΑΕ. Ένα παράδειγμα στο χρωμόσωμα 11 δείχνεται στο Σχ. 3. Η μελλοντική εργασία θα επικεντρωθεί στη διευκρίνιση της σημασίας του αριθμού αντιγράφων ουδέτερο ΑΕ σε αυτές τις περιοχές για την ανάπτυξη των όγκων. Για σύγκριση CNNLOH αναλύθηκε επίσης σε 60 φυσιολογικά δείγματα αναφοράς (βλ. Σχ S1).

Α) Ποσοτικά στοιχεία σχετικά όγκου ΑΕ κυμαίνονται από μαύρο 0% σε κόκκινο 100% για τις 22 αυτοσωμικά για 43 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του δείγματα καρκίνου του πνεύμονα το καθένα αντιπροσωπεύει μια σειρά. διαγραφή από πράσινο και ενισχύσεις σε μπλε χρώμα. Περιοχές στις οποίες περισσότερο από το 10% των δειγμάτων σε μια κανονική σειρά αναφοράς έπρεπε CNNLOH υψηλότερη από 0.5 αφαιρέθηκε από το οικόπεδο (βλέπε μεθόδους). Μαύρο βέλος δείχνει ένα παράδειγμα μιας περιοχής στο χρωμόσωμα 11 με υψηλότερη συχνότητα αριθμού αντιγράφων ουδέτερο ΑΕ (52%) από την μέγιστη συχνότητα 10% στην κανονική σειρά αναφοράς

Η

Η ποσοτικοποίηση των CNNLOH. – σύγκριση μεταξύ FISH και SNP

δεδομένων

για να μελετήσουμε την ακρίβεια της ποσοτικοποίησης των CNNLOH θέλαμε να συγκρίνουν τα αποτελέσματα με εκείνα που λαμβάνονται με ανεξάρτητο τρόπο. Gunnarsson et al έχουν μετρήσει την παρουσία μικρές διαγραφές στο 13q14 σε παρασκευάσματα κυττάρου όγκου από ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (CLL) χρησιμοποιώντας φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) [18]. Σε δύο περιπτώσεις τα καρκινικά κύτταρα είχαν αποκτήσει δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος 13 με μια εσωτερική 13q14 διαγραφή. Έτσι, σε αυτές τις περιπτώσεις η αναλογία των κυττάρων CLL με το σήμα μηδέν και ένα ψάρι αντιπροσωπεύουν τις ομόζυγα και ετερόζυγα κύτταρα του όγκου, αντίστοιχα. Μια εκτίμηση της CNNLOH στο χρωμόσωμα 13 εκτός της περιοχής διαγράφεται επί 13q14 μπορεί να ληφθεί ως το ποσοστό των κυττάρων με μηδενικό σήμα σε 13q14 δια του αθροίσματος των αναλογιών με μηδέν και ένα σήμα. Λόγω πολύ λίγες περιοχές με διαγραφές δεν μπορούσαν να ληφθούν το ποσοστό των φυσιολογικών κυττάρων από τα δεδομένα SNP. Αντ ‘αυτού κυτταρομετρία ροής δεδομένων από Gunnarsson et al 2008 παρείχε την πληροφορία αυτή. Έτσι, η αναλογία των φυσιολογικών κυττάρων από κυτταρομετρία ροής και τα δεδομένα συστοιχία SNP για τα δύο δείγματα χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση CNNLOH. Ο Πίνακας 2 δείχνει τις εκτιμήσεις των CNNLOH που λαμβάνονται με τις δύο μεθόδους. Μπορεί να σημειωθεί ότι οι εκτιμήσεις διαφέρουν μόνο κατά 4 και 6% στα δύο δείγματα, γεγονός που δείχνει ότι η μέτρηση της CNNLOH είναι ακριβής.

Η

Η ποσοτικοποίηση των CNNLOH είναι ανθεκτικό σε διακυμάνσεις της καθαρότητας του δείγματος

Μια σημαντική προϋπόθεση για την ποσοτικοποίηση των CNNLOH είναι ότι η μέθοδος θα πρέπει να είναι ισχυρή και να μην επηρεάζεται από το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων στο δείγμα. Για να δοκιμαστεί η απόδοση του αλγορίθμου που μεταβάλλεται το κλάσμα των κανονικών κυττάρων σε ένα δείγμα όγκου από τον εμπλουτισμό για κύτταρα όγκου. Σε πέντε περιπτώσεις επιλέξει 6 000-10 000 καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροδιατομής λέιζερ (βλέπε μεθόδους). Τυπική ανάλυση συστοιχίας Affymetrix SNP εκτελέστηκε σε DNA από αυτά τα παρασκευάσματα όγκων εμπλουτισμένο. Το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων και LOH όγκου για αριθμό αντιγράφων ουδέτερες περιοχές ποσοτικοποιήθηκε και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα από δείγματα ακατέργαστου όγκου (Σχ. 4). Οι μετρήσεις των CNNLOH στα ακατέργαστα δείγματα φαίνεται να είναι ιδιαίτερα συνεπείς με εκείνες των μικροδιατομή δείγματα. Προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί η απόδοση ανίχνευσης CNNLOH επιλέξαμε να μετρήσει τον αριθμό των χρωμοσωμικών τμημάτων στο Σχ. 4 που είχε LOH όγκου μεγαλύτερο από ένα αυθαίρετα οριστεί όριο, σε αυτή την περίπτωση 0.5 και στα δύο δείγματα. Αυτή η διαδικασία παρέχει μια κατά προσέγγιση εκτίμηση της ικανότητας για την ανίχνευση CNNLOH. Ο Πίνακας 3 δείχνει την αναλογία του αριθμού των τμημάτων που ανιχνεύθηκαν στο δείγμα μικροδιατομή σε σύγκριση με το σύνολο του δείγματος. Η αναλογία είναι κοντά σε ένα για όλα τα δείγματα που δείχνουν ότι οι περίπου οι ίδιοι αριθμοί των τμημάτων ανιχνεύεται ανεξάρτητα από κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων που κυμαινόταν μεταξύ 1% και 26%. Θα μπορούσε να υποστηριχθεί ότι το κλάσμα των φυσιολογικών κυττάρων είναι τόσο χαμηλή ώστε να είναι δύσκολο να παρατηρηθούν οποιαδήποτε διαφορά μεταξύ των ζευγών των δειγμάτων. Ωστόσο, μελετώντας την ευρωστία ανίχνευσης αριθμού αντιγράφων, μπορεί να σημειωθεί ότι σε τρία ζεύγη δειγμάτων (13Α, 296Α και 319Α), υπήρξε μια δραματική μείωση (μέχρι 122 φορές) του αριθμού των τμημάτων ανιχνεύεται ως φέρει αριθμό αντιγράφων εκτροπές σε το σύνολο του δείγματος (βλέπε πίνακα 3). Συνοπτικά, η ανάλυση των CNNLOH φαίνεται να είναι ισχυρή, ενώ η ανίχνευση αριθμού αντιγράφων μπορεί να επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό ακόμη και από ένα μέρος των φυσιολογικών κυττάρων στο εύρος 1-26%, η οποία είναι μέτρια για πολλούς τύπους δειγμάτων κλινικής όγκου.

δείγματα όγκων Πέντε 13Α, 234Α, 296Α, 319Α και 367A αναλύθηκαν για όγκο LOH χρησιμοποιώντας τόσο DNA από κατεψυγμένα τμήματα του όλου όγκου και από λέιζερ μικροδιατομή τμήματα των τμημάτων όγκου με εμπλουτισμένο περιεχόμενο όγκου. Ο βαθμός του όγκου LOH ενδείκνυται για 200 kb chromosmal τμήματα στο χρώμα που κυμαίνεται από μαύρο (0%) σε σκούρο κόκκινο (100%) κατά μήκος των 22 αυτοσωμικά. Τα τμήματα με αριθμό αντιγράφων εκτροπές υποδεικνύεται με διαγραφές (πράσινο) και ενισχύσεις (μπλε). Σημείωση σε μια διευρυμένη τομή του χρωμοσώματος 7 ότι οι μετρήσεις CNNLOH είναι approxiamately ίσοι στα ζεύγη των δειγμάτων ολικού και μικροδιατομή όγκου.

Η

Απόδοση ανίχνευσης CNNLOH επί των προσομοιωμένων δεδομένων από μείγματα φυσιολογικών και καρκινικών κύτταρα

Η μέθοδος CNNLOH Quantifier που παρουσιάζεται εδώ μπορεί να προσδιορίσει και να ποσοτικοποιήσει CNNLOH το κλάσμα του όγκου των κυττάρων που έχει CNNLOH. Η μέθοδος φαίνεται να είναι ανθεκτική στις διακυμάνσεις στην περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου σε κλινικά δείγματα. Ωστόσο, θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να συγκρίνουμε τις επιδόσεις της σε άλλες μεθόδους. Για το σκοπό αυτό τα δεδομένα συστοιχία SNP συλλέχθηκε από καρκινικά κύτταρα σε ένα δείγμα μικροδιατομή καρκίνου του πνεύμονα και από ιστό καρκίνου του πνεύμονα εκτός του όγκου από τον ίδιο ασθενή. Βάσει αυτών των πληροφοριών που προσομοιωθεί δεδομένα από μίγματα φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Για τη μέτρηση των επιδόσεων όσον αφορά την ευαισθησία και την ειδικότητα που χρησιμοποιούνται ΑΕ ανιχνεύεται από ζεύγη ανάλυση του δείγματος όγκου και κανονικό έλεγχο του χρησιμοποιώντας dChip σε αριθμό αντιγράφων περιοχές 2 ως ο χρυσός κανόνας που ορίζεται CNNLOH. Θέλαμε να συγκρίνουν τη μέθοδο CNNLOH Quantifier με άλλες μεθόδους και τη χρήση αλληλόμορφο-συγκεκριμένες πληροφορίες. Αυτές οι μέθοδοι έχουν αποδειχθεί να έχει υψηλές επιδόσεις μεθόδους γονότυπο με βάση [13]. AsCNAR είναι μία τέτοια μέθοδος, αλλά το παρόν διαθέσιμη η εφαρμογή δεν είναι αρκετά ευέλικτο για χρήση σε αυτό το είδος των προσομοιωμένων δεδομένων. Από την άλλη πλευρά, η μέθοδος SOMATICS σχεδιάστηκε για δεδομένα από την πλατφόρμα Illumina SNP, αλλά θα μπορούσε να προσαρμοστεί για να αναλύσει δεδομένα προσομοίωσης με βάση τα στοιχεία από την πλατφόρμα Affymetrix. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε να συγκρίνουμε την απόδοση της μεθόδου CNNLOH Quantifier με SOMATICS (βλέπε μεθόδους για λεπτομέρειες). Η ευαισθησία και η ειδικότητα των μεθόδων για την μεταβολή μείγματα φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων παρουσιάζονται στο σχήμα 5AB. Μπορεί να σημειωθεί ότι CNNLOH Quantifier έχει μια απότομη αύξηση της ευαισθησίας, πάνω από τα καρκινικά κύτταρα του 40%, που οφείλεται στο κατώφλι της CNNLOH κλήσης που αντιστοιχεί σε ένα κλάσμα των κυττάρων όγκου 35%. CNNLOH Quantifier έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από περίπου 90% σε σύγκριση με 60% για SOMATICS για κλάσματα του όγκου μεγαλύτερη από περίπου 50% (βλέπε Σχ. 5Α). Εξειδίκευση είναι γενικά υψηλότερη για CNNLOH Quantifier σύγκριση με SOMATICS (βλέπε Σχ. 5Β). Η ευαισθησία του SOMATICS ήταν χαμηλότερη από ό, τι έχει αναφερθεί προηγουμένως για τα δεδομένα βασίζονται σε δεδομένα SNP συστοιχία από την πλατφόρμα Illumina [13]. Υποθέσαμε ότι ο αλγόριθμος SOMATICS εκτελεί διαφορετικά σε δεδομένα που προκύπτουν από τις δύο πλατφόρμες. Σε Gunnarsson et al τα ίδια παρασκευάσματα DNA από όγκους CLL αναλύθηκαν και στις δύο συστοιχίες 250K από Affymetrix και 317K συστοιχίες από Illumina [18]. Αναλύσαμε τα δύο σύνολα δεδομένων από 9 όγκων CLL με SOMATICS και διαπίστωσε ότι ο αλγόριθμος εντοπίσει περισσότερες CNNLOH χρησιμοποιώντας δεδομένα Affymetrix. Οι αναλογίες του μήκους των ανιχνευόμενων περιοχών CNNLOH με δεδομένα Affymetrix σε σύγκριση με περιοχή δεδομένων Illumina από 1,9 έως 36 (βλέπε Πίνακα S1). Αυτές οι πρόσθετες περιοχές της CNNLOH προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας τα δεδομένα Affymetrix μπορεί σε μεγάλο βαθμό να είναι ψευδώς θετικά λόγω της μεγαλύτερης πειραματικό θόρυβο. Ένα τέτοιο μεγάλο αριθμό των ψευδώς θετικών θα ήταν συνεπής με τη χαμηλή ευαισθησία του SOMATICS στην ανίχνευση των CNNLOH στα προσομοιωμένα δεδομένα βασίζονται σε δεδομένα Affymetrix (βλέπε Σχ. 5Α).

δεδομένα που αντιστοιχούν σε διαφορετικούς κλάσματα φυσιολογικών και καρκινικών κύτταρα προσομοιώθηκε χρησιμοποιώντας στοιχεία από τα φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά μικροτομή κύτταρα από τον ίδιο όγκο του καρκίνου του πνεύμονα. Η απόδοση των δύο αλγορίθμων αξιολογήθηκε ως ευαισθησία (Α) και ειδικότητα (Β) σε σύγκριση με CNNLOH ανιχνεύεται από dChip σε μια αντιστοιχισμένη ανάλυση των SNP δεδομένων συστοιχίας των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων.

Η

Μέθοδοι

ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από το περιφερειακό συμβούλιο της ηθικής δεοντολογίας στις Ουψάλα (αριθμός αναφοράς 2006/325). Η ανάγκη να αποκτήσει ατομική συναίνεση από κάθε ασθενή παραιτήθηκε από το διοικητικό συμβούλιο δεοντολογικού ελέγχου, δεδομένου ότι οι περισσότεροι από τους ασθενείς του πληθυσμού της μελέτης (& gt? 90%) είχαν αποβιώσει κατά την έναρξη του έργου, τα αποτελέσματα της έρευνας δεν συνεπάγεται κανένα ιατρικούς κινδύνους , και τα αποτελέσματα δεν θα μπορούσε να αλλάξει τις πληροφορίες στους ασθενείς, τις οικογένειές τους ή τη διαχείριση της αλλαγής. Η διαδικασία είναι σε πλήρη συμφωνία με τη σουηδική Ηθικές Πράξη Αναθεώρησης.

δείγματα όγκου, η ιστολογική εκτίμηση του περιεχομένου των καρκινικών κυττάρων και την προετοιμασία του DNA

Φρέσκο ​​κατεψυγμένο ανθρώπινο NSCLCs ελήφθησαν από το φρέσκο ​​ιστό Ουψάλα τράπεζα, καθώς και χρησιμοποιείται σύμφωνα με τη σουηδική νομοθεσία βιοτράπεζα. Τα δείγματα όγκου προέρχονταν από ασθενείς από μια ομάδα που ορίζεται από ότι είχαν καταχωρηθεί στην Ουψάλα /Örebro πνεύμονα μητρώου καρκίνου, όπως έχουν NSCLC, είχε ένα δείγμα κατεψυγμένου ιστού στην τράπεζα ιστών και διαγνώστηκαν, ενώ ζωντανός. κατάστασης υπόθεση επαληθεύεται από την ιστοπαθολογική εξέταση και μελέτη των ιατρικών φακέλων. Αιματοξυλίνης-Ηωσίνη χρωματισμένο κρυοτομές (4 μm) παρασκευάστηκαν από τα κατεψυγμένα ΥΧΕ-ενσωματωμένα μπλοκ ιστό όγκου και επανεξετάζονται με μικροσκόπιο με ένα χειρουργικό παθολογοανατόμο. Εξήντα περιπτώσεις με εκτιμώμενη περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου πάνω από το 50% συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Για ένα υποσύνολο αυτών των δειγμάτων (Πίνακας 1) πραγματοποιήσαμε μια προσεκτική χειροκίνητη καταμέτρηση των καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων με μικροσκοπία φωτός χρησιμοποιώντας πλέγματα σε τομείς μεγέθυνση υψηλής ισχύος (HPF). κύτταρα τουλάχιστον 2000 μετρήθηκαν σε 5-10 διαφορετικές περιοχές του κατεψυγμένου τμήματος, ανάλογα με το μέγεθος και ετερογένεια του δείγματος όγκου. Για κάθε δείγμα γονιδιωματικού DNA εκχυλίστηκε από 5-10 κατεψυγμένες τομές ιστού (10 μm) με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Σύλληψη Λέιζερ Microdissecion των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα

μικροανατομίας διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [19]. Από 5 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, 12 μm πάχους κρυοτομές παρασκευάστηκαν, μεταφέρθηκαν σε γυάλινες πλάκες PALM μεμβράνη επικαλυμμένη, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Αμέσως πριν από την μικροδιατομής, τομές αποψύχθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη επί 2 λεπτά ακολουθούμενη από στερέωση σε σταθεροποιητικό ψευδαργύρου για 1 λεπτό και αφυδάτωση για 1 λεπτό σε 70% και 95% αιθανόλη, αντίστοιχα. Αξιοποιώντας το PALM Laser-MicroBeam συστήματος, επιλεγμένες περιοχές του όγκου που περιέχει 6.000 έως 10000 κύτταρα μικροτομή και μεταφέρονται μέσω ενός λέιζερ Puls με 15 μl ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης DNA ATL (Qiagen) στο καπάκι του σωλήνα φυγοκέντρησης. εκχύλιση DNA στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Micro Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Qiagen).

Ανάλυση σε συστοιχίες SNP Affymetrix 250K

πειράματα Array πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις τυποποιημένες πρωτόκολλα για Affymetrix GeneChip ® συστοιχίες Χαρτογράφηση 250K (500K Δοκιμασία Gene Chip Χαρτογράφηση Manual (P /N 701930 Rev2.), Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Εν συντομία, ολικό γονιδιωματικό DNA υποβλήθηκε σε πέψη με ένα ένζυμο περιορισμού (

NSP1

), προσδέθηκε με ένα κατάλληλο προσαρμογέα για το ένζυμο, και υποβλήθηκε σε PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας ένα μόνο εκκινητή. Μετά από πέψη με ϋΝάση Ι, τα προϊόντα PCR επισημαίνονται με ένα βιοτινυλιωμένο ανάλογο νουκλεοτιδίου χρησιμοποιώντας τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης και υβριδοποιήθηκε σε μικροσυστοιχία. Υβριδοποιημένων ανιχνευτών συλλήφθηκαν από συζυγή στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνη και τελικά σαρώθηκαν οι συστοιχίες. QC τον έλεγχο της ποιότητας, γονότυπο καλώντας και τον αριθμό αντιτύπου αναλύσεις έγιναν στο GeneChip® Γονοτυπικές Λογισμικό Ανάλυσης Affymetrix (GTYPE) 4.1. Ο αλγόριθμος Dynamic Model (DM) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει μόνο δείγμα QC. Η προδιαγραφή QC για 250K είναι ένα Call Rate & gt? 93% χρησιμοποιώντας τις προεπιλογές αλγόριθμο. Μετέπειτα ανάλυση αριθμού αντιγράφων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο Hidden Markov διαθέσιμες στο εργαλείο Copy Number Ανάλυση (CNAT) 4.0.1 με τις ακόλουθες ρυθμίσεις παραμέτρων: φθορά μετάβαση 5 Mb, Διάμεση εξομάλυνση και 0,3 Mb παράγοντα εξομάλυνσης. Το σύνολο αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε αποτελείτο από 96 CEU δείγματα από το έργο HapMap (www.hapmap.org/downloads/raw_data/affy500k/).

Η ποσοτικοποίηση του κλάσματος των φυσιολογικών κυττάρων

Ως πρώτο βήμα γονιδιωματικές περιοχές συναχθεί ότι περιέχει μονο-αλληλόμορφης διαγραφές ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Affymetrix CNA 4.0.1, όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να εκτιμηθεί το κλάσμα των κυττάρων με 2Ν γονιδιωματικό περιεχόμενο, C

2Ν, χρησιμοποιήθηκε αλληλόμορφο-ειδικές πληροφορίες. Τα ακατέργαστα δεδομένα Affymetrix SNP κανονικοποιήθηκε στο λογισμικό dChipSNP χρησιμοποιώντας τη μέθοδο έκφρασης βάσει μοντέλου και μια μέθοδο αφαίρεσης υποβάθρου που χρησιμοποιεί ανιχνευτές αναντιστοιχία (ΡΜ /ΜΜ διαφορά) [6]. Οι κανονικοποιημένες σήματα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό αλληλόμορφων αναλογίες ένταση Ε

i για κάθε SNP (R

i = Β /(Α + Β)). Για να ληφθεί υπόψη το γεγονός ότι ο ίδιος αριθμός των αλληλομόρφων Α και Β μπορεί να παράγουν διαφορετικά σήματα σε δοκιμασία οι αλληλόμορφες αναλογίες κανονικοποιήθηκαν σε συχνότητες αλληλίου Β (ABF) για ένα συγκεκριμένο τόπο SNP σε ένα δεδομένο δείγμα από μια γραμμική παρεμβολή των γνωστών συχνοτήτων αλληλόμορφων για τις τρεις γονότυπους (0, 0,5 και 1,0), όπως απορρέει και απεικονίζονται γραφικά στο Peiffer

κ.ά.

2006 [17]. Εν ολίγοις, το ABF για ένα δεδομένο SNP

i

υπολογίστηκε ως εξής: όπου R

i είναι η αναλογία έντασης αλληλόμορφες και m

ΑΑ, ΑΒ, ΒΒ είναι οι μέσες αλληλικές αναλογίες έντασης για μια αναφορά του πληθυσμού, για το συγκεκριμένο SNP. Το σύνολο αναφοράς ήταν η ίδια όπως περιγράφεται για την ανάλυση αριθμού αντιγράφων παραπάνω. χρησιμοποιήθηκαν μόνο οι SNPs, όπου μια κλήση AB ήταν παρούσα στον πληθυσμό αναφοράς. Για τους SNPs όπου δεν ομόζυγη κλήσεις ήταν διαθέσιμα, η μέση ΑΑ ή ΒΒ σήμα για όλες τις SNPs στα δείγματα στον πληθυσμό αναφοράς χρησιμοποιήθηκε αντί.

Ένα ιστόγραμμα του αλληλόμορφου-συγκεκριμένο αλληλόμορφο Β πληροφορίες συχνότητας για τους δείκτες σε κάθε αυτοσωμικό με την απώλεια αριθμός αντιγράφων υπολογίσθηκε. Η παρατηρούμενη ιστόγραμμα συγκρίθηκε με προσομοίωση ιστογράμματα για διάφορα κλάσματα C

2Ν. Το C

2Ν από τα πιο παρόμοια ιστόγραμμα είναι η μία πιο πιθανό να έχουν δώσει αφορμή για τα παρατηρούμενα δεδομένα (βλέπε Εικ. 2). Οι προσομοιώσεις περιγράφουν την μεταβολή στην ABF λόγω διακύμανση των σημάτων από αλληλόμορφα Α και Β με την κατάρτιση σήματα Α και Β από κανονικές κατανομές εκτιμηθεί από περιοχές με αριθμό αντιγράφων 2. Η μέση τιμή και διακύμανση για τις κατανομές ήταν (0, 0.015) για αλληλόμορφο Α και (0.995, 0.015) για αλληλόμορφο Β Ο μέσος βαθμός ετεροζυγωτίας εκτιμήθηκε από τον αριθμό των περιφερειών αντίγραφο 2 36,7%. Προσομοιωμένη τιμές ABF υπολογίστηκαν σαν το άθροισμα των προσομοιωμένων σημάτων Αλληλόμορφο Β διαιρείται με το άθροισμα των Αλληλόμορφο Α και Β τα σήματα από τα κύτταρα που συνθέτουν το εικονικό δείγμα. Για παράδειγμα, όταν προσομοίωση δείγματα με υψηλότερα κλάσματα των κυττάρων 2Ν, το ποσοστό των προσομοιωμένων κυττάρων με αμφότερα τα Α και Β τα σήματα είναι επίσης αυξημένη. Για να διατηρηθεί ο μέσος βαθμός ετεροζυγωτίας και να αποκτήσουν σταθερή ιστογράμματα που βασίστηκαν στις τιμές ABF από το περιττό αριθμό 14 848 προσομοίωση SNP τόπους (βλέπε πιο λεπτομερή περιγραφή της επιλογής των ρυθμίσεων στο Κείμενο S1). Επιλέγοντας έναν άλλο αρκετά μεγάλο αριθμό των προσομοιωμένων τόπους θα παράγουν πολύ παρόμοια ιστογράμματα. Τα ιστογράμματα κανονικοποιήθηκαν προς μονάδα περιοχής για να αντιπροσωπεύουν το αναμενόμενο πρότυπο για κάθε ένα από τα 200 βήματα που μεταβάλλεται το κλάσμα C

κύτταρα 2Ν μεταξύ 0 και 67%. Η μικρότερη απόσταση Ευκλείδεια μεταξύ της παρατηρούμενης ιστόγραμμα και τα ιστογράμματα με ποικίλες C

2Ν προσδιοριστεί το κλάσμα που είναι πιθανότερο να έχουν δώσει αφορμή για το παρατηρηθέν πρότυπο συχνότητα αλληλόμορφων Β.

You must be logged into post a comment.