έχουν

Αφηρημένο

υποδοχέα της GnRH υψηλής κυτταρικής επιφάνειας (GnRH-R) επιπέδων έχει αποδειχθεί ότι έχουν μια σημαντική επίδραση στην έκταση της GnRH αγωνιστή μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Η ικανότητα της GnRH αγωνιστή οξική λευπρορελίνη (LA) να επάγει μια μετα-μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω του GnRH-R στη μεμβράνη του ανδρογόνου ευαίσθητα (LNCaP) και -insensitive (PC-3) του καρκίνου του προστάτη (PCA) πλασματοκύτταρα έχει προηγουμένως αποδεικνύεται από κηλίδωση Western. Εδώ πραγματοποιήσαμε φασματοσκοπίας δύναμη και μόνο μόριο χρησιμοποιώντας Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM), η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα ισχυρό εργαλείο που επιτρέπει την διερεύνηση της επιφάνειας ζωντανό κύτταρο βιολογικές λειτουργίες, όπως είναι η μέχρι στιγμής ασαφή αλληλεπίδραση αγωνιστή /υποδοχέα της GnRH. Έτσι, στα κύτταρα PC-3 ορμόνη-ευαίσθητη, χαρακτηρίσαμε τη δύναμη της πρόσδεσης LA-υποδοχέα, και την ποσότητα και την κατανομή των λειτουργικών μορίων υποδοχέα στην επιφάνεια των κυττάρων. Το αποτέλεσμα μιας μακράς και συνεχούς θεραπείας (μέχρι και 30 ημέρες) με τον αγωνιστή (10

-11 και 10

-6 Μ) επί ερευνήθηκε επίσης τις ίδιες παραμέτρους. Παρατηρήθηκε μια αύξηση GnRH-R, φθάνοντας το μέγιστο (~ 80%) μετά από 30 ημέρες θεραπείας με την υψηλότερη δόση του LA (10

-6 Μ). Το ανάλογο προκαλούμενη αύξηση των GnRH-R επίσης αποδεικνύεται από κηλίδωση Western. Επιπλέον, δύο διαφορετικές περιεκτικότητες δεσμεύεται υποδοχέα ανιχνεύθηκαν με AFM, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη δύο τάξεων GnRH-R. Μια ομοιογενής κατανομή των λύειν γεγονότων έχει βρεθεί σε μη κατεργασμένα και επιφάνειες των κυττάρων PC-3. Η επιμονή των υψηλών επιπέδων υποδοχέα στη μεμβράνη αυτών των ζωντανών κυττάρων μπορεί να δικαιολογήσει τη διατήρηση της ανταπόκρισης στο Λος Άντζελες και σε ανδρογόνα αδιάφορη του προστάτη. Επιπλέον, ο προσδιορισμός της αντοχής /δεσμού υποδοχέα ρίζας θα μπορούσε να ρίξει φως στη ελάχιστα κατανοητή περίπτωση αλληλεπίδρασης LA /GnRH-R ή /και την αντιμετώπιση των διαρθρωτικών βελτιστοποιήσεις /χημική αγωνιστή

Παράθεση:. Λάμα G, Papi Μ, Angelucci C, Maulucci G, Σίκα G, De Spirito Μ (2013) η οξική λευπρορελίνη μακροχρόνιες επιπτώσεις στην GnRH υποδοχείς των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη: Ένα Ατομικής Δύναμης Μικροσκοπία Μελέτη του αγωνιστή /Receptor αλληλεπίδρασης. PLoS ONE 8 (1): e52530. doi: 10.1371 /journal.pone.0052530

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 29 Δεκ, 2011? Αποδεκτές: 19 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιανουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Λάμα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Takeda Italia Farmaceutici SpA υποστήριξε εν μέρει αυτό το έργο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το 2010, η Takeda Italia Farmaceutici SpA έδωσε στους συγγραφείς μια εθελοντική αιμοδοσία για τη στήριξη της επιστημονικής έρευνας του Ινστιτούτου τους, δεν σχετίζονται ειδικά με αυτό το έργο. Οι συγγραφείς αναφέρεται το όνομα της εταιρείας στη δικαιοσύνη. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Η γοναδοτροπίνη που απελευθερώνει την ορμόνη (GnRH), ένα δεκαπεπτίδιο που εκκρίνεται σε ένα παλμικό τρόπο από υποθαλάμου νευρώνων, ελέγχει τη σύνθεση γοναδοτροπίνης και την απελευθέρωση από την ενεργοποίηση υποδοχέων (τύπου Ι GnRH-R) που εκφράζονται σε κύτταρα πρόσθιας υπόφυσης. Η ρύθμιση προς τα κάτω και απευαισθητοποίηση αυτών υπόφυσης υποδοχέων από συνεχή χορήγηση αγωνιστικής αναλόγων GnRH αντιπροσωπεύουν το σκεπτικό για την κλινική χρήση αυτών των ορμονών στη θεραπεία των καρκίνων ενδοκρινικές σχετίζονται αφού οδηγεί σε γοναδικών στεροειδών καταστολή [1] – [3]. Το εύρημα της έκφρασης GnRH /GnRH-R σε αυτούς τους όγκους, καθώς επίσης και σε μη κακοήθεις ιστούς [4] – [7], αποκαλύπτεται η δυνατότητα για τα κύτταρα του extrapituitary ιστών να επηρεάζεται άμεσα από ανάλογα GnRH. Διάφορες μελέτες κατέδειξαν την ανασταλτική δράση των αγωνιστών GnRH για την ανάπτυξη διαφόρων νεοπλασμάτων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA) κυττάρων [6], [8] – [14]. Παρ ‘όλα αυτά, ορισμένοι συγγραφείς ανέφεραν ότι οι αγωνιστές GnRH είναι αναποτελεσματικά όταν χρησιμοποιούνται μόνα ενώ αντισταθμίζουν ή ακόμη και καταστέλλουν ορμόνες ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παράγοντα διεγείρεται ανάπτυξη [15] – [19]. Επιπλέον, έδειξε ότι αυτές οι ενώσεις είναι ικανές να ρυθμίζουν την έκφραση του PSA, καθώς και την έκφραση αρκετών γονιδίων /πρωτεϊνών που ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση, την απόπτωση ή κυττάρου /προσκόλλησης κυττάρου [20] – [23]. Πιο πρόσφατα, οι επιπτώσεις της GnRH αγωνιστικού αναλόγου οξική λευπρορελίνη (LA) στην έκφραση της GnRH-R ερευνήθηκαν με κηλίδωση Western σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη: τα ανδρογόνα ευαίσθητη, καλά διαφοροποιημένο και χαμηλής επεμβατική κύτταρα LNCaP και το ανδρογόνο -insensitive, χαμηλής διαφοροποίησης και εξαιρετικά επεμβατική PC-3 κύτταρα [24]. Σε αυτά τα δύο μοντέλα, η αναλογική τόσο σε χαμηλές όσο και υψηλές συγκεντρώσεις είναι αποτελεσματική στην επαγωγή μιας μετα-μεταγραφική ενίσχυση της έκφρασης του υποδοχέα στο επίπεδο της μεμβράνης του πλάσματος, μετά από 4, 6 και 12 ημέρες συνεχούς θεραπείας.

Η αύξηση της διαθεσιμότητας του υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια θα μπορούσε να είναι μια σχετική θεραπευτική ζήτημα δεδομένου ότι μπορεί να δικαιολογούν τη διατήρηση της απόκρισης στη θεραπεία αγωνιστή [25]. Επιπλέον, μπορεί να επιτρέψει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών, οι οποίες είναι ιδιαίτερα σημαντικό για αυτούς τους όγκους που είτε αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν ή να αναπτύξουν ανθεκτικότητα σε ενδοκρινική θεραπεία. Στην πραγματικότητα, ακόμη και αν είναι απολύτως δύσκολο να προβλέψει τη συμπεριφορά των κυττάρων του προστάτη

in vivo

, είναι πιθανός ότι, ακόμη και σε ορμόνες αποκρίνεται PCa, η χορήγηση αγωνιστή μπορεί να παρέχει ένα ωφέλιμο αποτέλεσμα και λόγω του άμεσου αποτελέσματος .

στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήσαμε φασματοσκοπία δύναμη ενιαίο μόριο μέσω Ατομικής δύναμης Μικροσκοπία (AFM), με στόχο την χαρακτηρίζουν την αντοχή της σύνδεσης LA-υποδοχέα, και την ποσότητα και την κατανομή του λειτουργικού υποδοχέα μορίων στην επιφάνεια PC-3 κυττάρου ανδρογόνο ανταποκρίνεται. Δείξαμε επίσης την επίδραση μιας μακράς και συνεχούς θεραπείας με τον αγωνιστή για τις ίδιες παραμέτρους. AFM επιτρέπει πράγματι για την ανίχνευση δυναμικών μεταβολών στις μηχανικές ιδιότητες των επιφανειακών ζωντανού κυττάρου [26], [27], καθώς και μετρήσεις στον αέρα ή ρευστό από μη χρωματισμένων και μη επικαλυμμένα βιολογικά δείγματα σε ελεγχόμενα περιβάλλοντα και σε μια ανάλυση νανοκλίμακα [28] – [31], χωρίς την απαίτηση οποιασδήποτε ειδικής θεραπείας που μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή των κυττάρων ή αλλοίωση. Επιπλέον, μόνο μόριο φασματοσκοπία δύναμης προσφέρει μια μοναδική ευκαιρία για τον εντοπισμό μοριακής αναγνώρισης μεταξύ των μεμονωμένων συνδετήρων και υποδοχέων. Δεδομένου ότι η διατήρηση των υψηλών επιπέδων υποδοχέα στη μεμβράνη του πλάσματος μετά από μια σχετικά μακρά και συνεχή θεραπεία με GnRH αγωνιστή μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα του LA σε ανδρογόνα αδιάφορη PCa, διερευνήσαμε την επίδραση του αγωνιστή σε χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις σε κύτταρα PC-3 για έως και 30 ημέρες. Ενδιαφέρον πληροφορίες σχετικά με το μέτρο ασαφής αλληλεπίδραση αγωνιστή-υποδοχέα της GnRH μπορεί να προκύψει από τη μελέτη της δύναμης με την οποία λαμβάνει χώρα τέτοια σύνδεση και αντιμετώπιση των διαρθρωτικών /χημική βελτιστοποιήσεις της αναλογικής.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές και συνθήκες καλλιέργειας

Οι ανθρώπινες ορμόνες αναίσθητη κύτταρα PC-3 [32] ήταν ευγενική δωρεά από τον καθηγητή F. Labrie (Πανεπιστήμιο Laval, Quebec, Καναδάς). Τα κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε 25-cm

2 φιάλες καλλιέργειας κυττάρων σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, EuroClone SpA, Μιλάνο, Ιταλία), συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS, EuroClone), αντιβιοτικά (100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, EuroClone), 10 mM Hepes ρυθμιστικό διάλυμα (EuroClone), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (EuroClone) και 2 mM L-γλουταμίνη (EuroClone).

Τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ293 ) δεν εκφράζουν κάποια ενδογενή GnRH-R ευγενώς από τον Καθ RP Millar (Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας Ανθρωπίνων Αναπαραγωγική Επιστημών Μονάδα, Ερευνητικό Ινστιτούτο της Βασίλισσας Ιατρική, Εδιμβούργο, Ηνωμένο Βασίλειο), που έχουν ληφθεί από την American Type Tissue Culture Collection. ΗΕΚ293 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με GnRH-R (ΗΕΚ293

[SCL60]) ήταν ένα δώρο από τον Καθηγητή R. Ρ Millar και παρήχθησαν στο εργαστήριο του [33].

[SCL60] κύτταρα ΗΕΚ293 και ΗΕΚ293 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός και θετικός έλεγχος για έκφραση GnRH-R, αντίστοιχα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM, συμπληρωμένο με 10% FBS, αντιβιοτικά (100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη), ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM Hepes, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 4 mM L-γλουταμίνη.

Όλες οι κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2-95% αέρα στους 37 ° C.

κύτταρα θεραπείες

τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 25.000 κύτταρα /ml πρότυπου μέσου καλλιέργειας σε 40-mm πιάτα TPP (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Ελβετία). Μόλις επικολλάται στις πλάκες καλλιέργειας (μετά από 24 ώρες), το μέσο ανανεώθηκε με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 5% ξυλάνθρακα επεξεργασμένο FBS (CH-FBS) και 10

-6 Μ ή 10

-11 M LA ( ευγενική δωρεά από την Takeda Pharmaceutical Company Limited, Οζάκα, Ιαπωνία).

Το μέσο αλλάζεται κάθε 48 ώρες, ενώ LA προστέθηκε καθημερινά στις καλλιέργειες. κύτταρα PC-3 εκτέθηκαν σε ανάλογη για 6, 12, 18, 24 και 30 ημέρες.

Κάθε έξι ημέρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, σπάρθηκαν (25.000 κύτταρα /ml) σε πιάτα 40-mm ΤΡΡ και , από τη στιγμή που προσκολλάται στις πλάκες καλλιέργειας, επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω για περαιτέρω χρονική περίοδο 6 ημερών. Στο τέλος της κάθε περιόδου θεραπείας, τα κύτταρα αναλύθηκαν με AFM. Σε όλα τα πειράματα, οι καλλιέργειες ελέγχου λειτουργούν παράλληλα.

Ατομικής Δύναμης Μικροσκοπία (AFM)

Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός μικροσκόπιο ατομικής δύναμης

Nanowizard II

( JPK Instruments, Βερολίνο, Γερμανία) σε συνδυασμό με ένα οπτικό μικροσκόπιο

Axio Παρατηρήστε

(Zeiss, Oberkochen, Γερμανία). Όλες οι εξαγορές εκπληρώθηκαν σε διάλυμα PBS (pH = 7,4), υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία 37 ° C.

Προετοιμασία AFM Probe

Για να διερευνήσουν συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ Λος Άντζελες και GnRH- R επί της επιφανείας του PC-3 κύτταρα, τα αναλογικά μόρια ακινητοποιήθηκαν επάνω σε AFM συμβουλές. Ορθογώνιο μαλακό microcantilevers νιτρίδιο του πυριτίου με UltraSharp κωνικές άκρες με μια ακτίνα περίπου 10 nm με επικάλυψη και στις δύο πλευρές με χρυσό (CSC16, MicroMash, San Jose, CA) και βαθμονομηθεί όπως αναφέρθηκε από Papi et al. [34] χρησιμοποιήθηκαν.

Πριν από την ακινητοποίηση, microcantilevers πλύθηκαν σε χλωροφόρμιο για να απομακρυνθούν έλαια και το ακαθάριστο προσμείξεις και, στη συνέχεια, εκτέθηκαν για 20 λεπτά σε ένα καθαρότερο UV-όζοντος με σκοπό την απομάκρυνση οργανικών και άλλες ρυπαντικές ουσίες οξειδώσιμες επιφάνεια.

Η διαδικασία ακινητοποίησης αναλόγου μόριο, μια μέθοδος που χρησιμοποιείται συχνά για λειτουργοποίηση άκρη με ένα μόριο συνδέτη [35], βασίζεται στη χρήση ενός 8 nm μακρύ εύκαμπτο σταυροειδών δεσμών (πυριδυλ-διθειο Πολυαιθυλενογλυκόλη-ηλεκτριμιδύλιο, PDP -PEG-NHS, Polypure). Το καθαρό πρόβολος αμέσως εμβαπτίζεται σε ένα διάλυμα PDP-PEG-NHS /χλωροφόρμιο για 3 ώρες (συγκέντρωση συνδετήρα: 2 mg /ml) και, στη συνέχεια, μετά από δύο ξέπλυμα βήματα σε χλωροφόρμιο και μία σε PBS, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μία σταγόνα διαλύματος LA ( 2 mg /ml) όλη τη νύκτα.

Μετά την λειτουργοποίηση, πρόβολοι είχαν επιμελώς πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα και στη συνέχεια αποθηκεύονται στους 4 ° C υπό στείρες συνθήκες για περαιτέρω χρήση στα πειράματα. χρόνος αποθήκευσης ήταν πάντα & lt? 1 εβδομάδα. Κάθε σημαντική αλλαγή στην αλληλεπίδραση LA /GnRH-R παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Πριν από τη χρήση τους, η σταθερά ελατηρίου του κάθε προβόλου ήταν διακριβώνεται με τη χρήση της θερμικής μεθόδου [36].

Φασματοσκοπία Ατομικής Δύναμης

Για να εξερευνήσετε μόνο μοριακές αλληλεπιδράσεις, η διαδικασία διαχωρισμού ενός tip- δεσμευμένου συνδέτη από μία κυτταρική επιφάνεια συνδεδεμένο υποδοχέα μελετήθηκε με την εφαρμογή μιας ελκτικής δύναμης με το σύμπλοκο συνδετήρα-υποδοχέα μέχρις ότου η δέσμευση μεταξύ συνδέτη και του υποδοχέα έσπασε. δυνάμεις αλληλεπίδρασης συνδεσμικών tip-δεσμεύεται και επιφάνεια ακινητοποιημένα υποδοχείς μετρήθηκαν σε κύκλους βίας αποστάσεων. Σε μία σταθερή θέση, το άκρο πλησίασε στην κυτταρική επιφάνεια και στη συνέχεια αποσύρθηκε μετά από ένα καθορισμένο χρονικό διάστημα (0,5 s), ενώ παρατηρήθηκε η κάμψη του προβόλου. Κατά τη διάρκεια αυτού του κύκλου, η κάμψη του προβόλου, η οποία είναι ανάλογη προς τη δύναμη, μετρήθηκε συνεχώς και χαράσσεται έναντι διαχωρισμού tip-επιφάνειας (δηλ απόσταση). Δύο αντιπροσωπευτικές καμπύλες δύναμης-απόστασης αναφερόμενη στο Σχ. 1, όταν δεν ανιχνεύονται αλληλεπιδράσεις συνδέτη /υποδοχέα (μαύρο τετράγωνο) και όταν η αλληλεπίδραση συνδέτη /υποδοχέα ανιχνεύεται (κόκκινοι κύκλοι). Κατά την έναρξη της προσέγγισης tip-επιφάνεια, η εκτροπή προβόλου παραμένει μηδενική. Κατά την επαφή άκρη της επιφάνειας, ο πρόβολος λυγίζει προς τα πάνω, σύμφωνα με μια απωθητική δύναμη που αυξάνεται με την εσοχή. Μεταγενέστερες συστολής tip-επιφάνεια (Εικ. 1) οδηγεί πρώτα σε χαλάρωση της κάμψης προβόλου μέχρι η απωθητική δύναμη πέφτει στο μηδέν. Μετά από περαιτέρω σύμπτυξης, εάν συμβεί η αλληλεπίδραση μεταξύ του συνδέτη και του υποδοχέα, ο πρόβολος κάμπτεται προοδευτικά προς τα κάτω, αντανακλώντας μια ελκυστική δύναμη που αυξάνεται με την αύξηση της διαχωρισμού tip-επιφάνεια (Σχ. 1, κόκκινους κύκλους). Σε κάθε πείραμα, για κάθε χρονικό σημείο, πραγματοποιήθηκαν περίπου 1000 ισχύει αποστάσεις καμπύλες.

Δύο χαρακτηριστικές καμπύλες δύναμης-απόστασης όταν οι αλληλεπιδράσεις δεν ανιχνεύονται (μαύρο τετράγωνο) και όταν οι αλληλεπιδράσεις ανιχνεύονται (κόκκινος κύκλος). Η λύειν περίπτωση (ή το σημείο ρήξης) τονίζεται με τη βοήθεια του πράσινου βέλους.

Η

ανάλυση Western blot

κλάσματα μεμβρανών εμπλουτισμένα πλάσματος παρασκευάστηκαν από 6 ημερών σε καλλιέργεια PC-3 , ΗΕΚ293 και ΗΕΚ293

[SCL60] κύτταρα, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που αναφέρθηκαν από Limonta et al. [37]. Η ίδια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε στο PC-3 κύτταρα μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με LA (10

-6 Μ ή 10

-11 Μ) για 6, 12, 18, 24 και 30 ημέρες. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν σε 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6) ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 1 mM διθειοθρεϊτόλη σε πάγο. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν δυο φορές για 10 λεπτά κάθε φορά στους 800

g

να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και τα προκύπτοντα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 18,000

g

να σφαιροποιηθούν κάτω των κλασμάτων μεμβράνης. Οι σβώλοι διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,7), 150 mM NaCl, 0,8% Triton Χ-100, 0.8% δεοξυχολικό νάτριο, 0,08% SDS, 10 mM EDTA, 100 μΜ Ν &

3νο

4, 50 mM NaF, 0.3 mM PMSF, και 5 mM ιωδοοξικό οξύ]. Δείγματα πρωτεΐνης (100 μg /λωρίδα) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Immobilon Ρ, Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) η οποία ανιχνεύθηκε (όλη τη νύκτα, 4 ° C) με το αντι-GnRH-Κ μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) (1:100) σε TBS που περιέχει 0.02% Tween 20 (TBS-T) και 5% άπαχο ξηρό γάλα (ρυθμιστικό αποκλεισμού). Η κηλίδα στη συνέχεια επιστρώθηκε με την HRP-σημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (Vector, Burlingame, CA, USA? 1:5,000) για 40 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham, Buckinghamshire, UK) και οπτικοποιήθηκαν σε Hyperfilm ECL (Amersham). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι με ένα αντι β-ακτίνης mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA? 1:10,000) ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Τα σήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία (Chemi Doc Τεκμηρίωση Συστήματος /Ποσότητα λογισμικού Ένα ποσοτικό, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Η πυκνομετρική μονάδες της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος στη συνέχεια διορθώθηκαν για τις πυκνομετρική μονάδες β-ακτίνης. Η ειδική αναλογία πρωτεΐνης /β-ακτίνης από κάθε δείγμα κατεργάζεται διαιρέθηκε με την τιμή που λαμβάνεται υπό συνθήκες ελέγχου για να ληφθεί η φορές αλλαγή στο επίπεδο GnRH-R.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθήθηκε από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GnRH-R ποσοτικοποίηση και τη δύναμη δεσμευτικός ως προς όλα τα μη επεξεργασμένα κύτταρα PC-3

Στο Σχ.. 2Α μια αντιπροσωπευτική κατανομή του λύειν εκδηλώσεις (κύκλοι περίπου 1000 δύναμη αποστάσεις με ρυθμό 2 μm /s) που ελήφθη στο PC-3 κύτταρα χωρίς θεραπεία μετά από 6 μέρες φαίνεται. Η δίτροπη κατανομή χαρακτηρίζεται από την παρουσία δύο, καλά εμφανείς κορυφές, το καθένα ανακτάται με μια Gaussian τακτοποίηση. Η πρώτη κορυφή (μωβ γραμμή) ανιχνεύθηκε σε χαμηλότερη ισχύ (f~37 PN), ενώ ο δεύτερος (πράσινη γραμμή) σε μια υψηλότερη δύναμη (f~65 PN). Η παρουσία αυτών των δύο κορυφές υποδηλώνει την ύπαρξη δύο διακριτών αλληλεπιδράσεων. Από την κατανομή κατά δύο τρόπους, μια συνολική λύειν πιθανότητα (δηλαδή η πιθανότητα να καταγράψει ένα λύειν περίπτωση από μια ενιαία καμπύλη δύναμης-απόστασης) περίπου 13% λήφθηκε (Εικ. 2Α, μπλε γραμμή). Η δίτροπη κατανομή μαζί με το λύειν πιθανότητα δεν άλλαξε για μέχρι 30 ημέρες (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Κατανομή λύειν εκδηλώσεις που λαμβάνεται σε ένα ρυθμό φόρτωσης του 2 μm /s σε αγωγή (Α) και LA ( 10

-6 Μ) κατεργασμένους (Β) κύτταρα PC-3 κύτταρα μετά από 30 ημέρες καλλιέργειας και σε ΗΕΚ293

[SCL60] (C). Συχνότητα αντιστοιχεί στον αριθμό των γεγονότων. Σε αμφότερες τις μη επεξεργασμένα και LA-αγωγή κύτταρα PC-3 α διτροπική κατανομή (μπλε γραμμή) είναι σαφώς ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά με τη βοήθεια δύο Gaussian καμπυλών κατανομής (μοβ και πράσινο διακεκομμένες γραμμές). Η πρώτη κορυφή ανιχνεύθηκε σε χαμηλότερη δύναμη (f~37 PN) ενώ το δεύτερο σε υψηλότερη δύναμη (f~65 ΡΝ). Σε ΗΕΚ293

[SCL60] κύτταρα λύειν εκδηλώσεις σε υψηλότερες δυνάμεις είναι λιγότερο συχνές.

Η

Για να αξιολογηθεί η ποσότητα των πιθανών μη ειδικών λύειν γεγονότα που συμβαίνουν λόγω της ειδικής διαδικασίας άκρη χαρακτηριστικής και την ευαισθησία της προσέγγισή μας, πραγματοποιήσαμε τα ίδια πειράματα φασματοσκοπίας ισχύει ΗΕΚ293 και ΗΕΚ293

[SCL60] κύτταρα. Όπως αναμένεται, σε κύτταρα ΗΕΚ293 φυσικού τύπου πολύ λίγες αλληλεπιδράσεις άκρη /δείγμα βρέθηκαν (~ 3%). Αντιθέτως, στην GnRH-R που εκφράζουν ΗΕΚ293

[SCL60] κύτταρα αρκετές αλληλεπιδράσεις άκρη /δείγμα ανιχνεύθηκαν (~59%). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αυτά τα κύτταρα η διτροπική κατανομή του λύειν δυνάμεις δεν ήταν εμφανής, δεδομένου ότι οι λύειν εκδηλώσεις σε υψηλότερες δυνάμεις (-65 ΡΝ) είναι σαφώς λιγότερο πιθανό σε σύγκριση με τις πιο συχνές λύειν εκδηλώσεις σε χαμηλότερες δυνάμεις ~37 ΡΝ (Σχ. 2C).

GnRH-R ποσοτικοποίηση και δεσμευτική δύναμη στα επεξεργασμένα κύτταρα PC-3

Μια αύξηση των αγωνιστών /GnRH-R λύειν εκδηλώσεις παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC-3 κατά την διάρκεια 30 ημερών από την έκθεση σε LA (10

-6 Μ ή 10

-11 M) (Εικ. 3Α). Η βελτίωση ήταν ανιχνεύσιμο σε όλα τα χρονικά διαστήματα θεωρείται (από το 6

ου με το 30

ης ημέρας? P & lt? 0.001) και έφτασε τη μέγιστη τιμή των περίπου 80% σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά από 30 ημέρες θεραπείας με η υψηλότερη δόση του αναλόγου. Μια στατιστικά σημαντική διαφορά ήταν πάντα βρίσκονται στην επίδραση που προκλήθηκε από τις δύο συγκεντρώσεις του φαρμάκου, με την υψηλότερη δόση να είναι πιο αποτελεσματική στην προώθηση της αύξησης.

(Α) ιστογράμματα των LA /GnRH-R λύειν εκδηλώσεις στην LA- κατεργάζεται PC-3 κύτταρα. Σε κάθε μέτρηση, εκτελείται κάθε 6 ημέρες, η καταμέτρηση κανονικοποιείται με αυτό που λαμβάνεται με μη επεξεργασμένα κύτταρα (ελέγχου) ορίζεται σε 1. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. * P & lt? 0.001

vs έλεγχο

,

• p & lt? 0.001

vs

10

-6 Μ LA (one-way ANOVA και τεστ πολλαπλής σύγκρισης Tukey του). (Β) Μοντελοποίηση της έκφρασης ποσοστό GnRH-R. Η ποσότητα του λύειν εκδηλώσεις ανιχνεύθηκε σε κύτταρα PC-3 σε επεξεργασία με 10

-6 Μ LA (μπλε διαμάντια) ή 10

-11 M LA (κόκκινο τετράγωνα) κανονικοποιήθηκε προς την ποσότητα του λύειν εκδηλώσεις σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ( ελέγχου) οριστεί σε 1. Η καμπύλη Gompertz προσαρμόστηκε τόσο τα πειραματικά δεδομένα (μπλε ή κόκκινο διακεκομμένες γραμμές). Τα ποσοστά αύξησης GnRH-R ήταν σαφώς διαφορετική [(9,3 ± 0,1) ημέρα

-1 για 10

-6 Μ LA και (6.1 ± 0.1) ημέρα

-1 για 10

-11 M LA], αλλά έτειναν προς την ίδια τιμή (1,9 ± 0,1) στους μεγάλους χρόνους (πέραν του 30

ης ημέρας). Τα δεδομένα δίδονται ως μέση τιμή ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Το ίδιο διτροπική κατανομή (με μία επιλογή στο f~37 Pn και άλλο σε f~65 PN) ανιχνεύθηκε σε κύτταρα PC-3 χωρίς θεραπεία ήταν παρατηρήθηκαν σε LA-κατεργασμένα κύτταρα συναρτήσει του χρόνου (από την 6

ο έως τον 30

ης ημέρας), ανεξάρτητα από τη μεταχείριση που χορηγείται στα κύτταρα. Στο Σχ. 2Β, μια αντιπροσωπευτική κατανομή των λύειν εκδηλώσεις που λαμβάνονται σε ποσοστό 2 m /s στο PC-3 κύτταρα υποβάλλονται σε θεραπεία για 30 ημέρες με 10

-6 Μ LA είναι εικονογραφημένα. Η μπλε καμπύλη δείχνει την κατανομή κατά δύο τρόπους των λύειν εκδηλώσεις και μια συνολική λύειν πιθανότητα περίπου 22%.

Προσομοίωση του GnRH-R έκφραση ρυθμό στο PC-3 κύτταρα

Για να ρίξει φως σε η ειδική δυναμική που περιγράφει την αύξηση των εκτεθειμένα υποδοχείς, συγκρίναμε την διαφορετική ποσότητα των υποδοχέων που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια του χρόνου της θεραπείας στις δύο αναλογικές συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (Σχ. 3Β). Τα ποσοστά αύξησης ήταν σαφώς διαφορετική, αλλά έτειναν προς την ίδια τιμή σε μεγάλους χρόνους (πέραν του 30

ης ημέρας). Αυτή η συμπεριφορά μπορεί να παραλληλιστεί με εκείνες που παρατηρούνται σε κύτταρα όγκου, όπου η ανάπτυξη τους περιορίζεται από το πεπερασμένο διάστημα στο οποίο τα κύτταρα περιορίζονται και από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών ουσιών, όπως διαμορφώνεται από την καμπύλη Gompertz [38]: όπου Χ (t) αντιπροσωπεύει τον αριθμό της GnRH-R, X (0) ο αριθμός των υποδοχέων κατά τη χρονική στιγμή παρατήρησης έναρξης (εδώ κανονικοποιημένη σε ένα), Κ ο μέγιστος αριθμός των υποδοχέων που μπορούν να εκφραστούν στην κυτταρική επιφάνεια και α μια σταθερά που χαρακτηρίζει τον ρυθμό αύξησης του GnRH-R .

Σχήμα 3Β δείχνει τα καλύτερα προσαρμογής καμπυλών με τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν για το PC-3 κύτταρα που εκτέθηκαν σε 10

-6 M (κόκκινη γραμμή) ή 10

-11 Μ (μπλε γραμμή) ΛΑ. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η αξιοσημείωτη ποιότητα της προσαρμογής επιτρέπει την ανάκτηση του ρυθμού αύξησης του υποδοχέα και οροπέδιο αξίες. Η τιμή πλατώ (K = 1,9 ± 0,1) ήταν η ίδια και στις δύο συγκεντρώσεις LA χρησιμοποιείται. Δεδομένου Κ τέθηκε σε 1 για μη επεξεργασμένα δείγματα, η τιμή πλατώ που ελήφθη δεικνύει ότι στο LA-αγωγή PC-3 κύτταρα, ο αριθμός των υποδοχέων μπορεί να αυξηθεί έως 90% σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, ανεξάρτητα της συγκέντρωσης αγωνιστή που χρησιμοποιείται. Από την άλλη πλευρά, ο ρυθμός αύξησης επηρεάζεται έντονα από τη συγκέντρωση LA [α = (9,3 ± 0,1) ημέρα

-1 για 10

-6 Μ LA και α = (6,1 ± 0,1) ημέρα

– 1 για 10

-11 Μ LA], έτσι όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση τόσο πιο γρήγορα η έκφραση GnRH-R.

τοπογραφικές κατανομή των θέσεων δέσμευσης

Μια δισδιάστατη χάρτης του λύειν εκδηλώσεις πραγματοποιήθηκαν πάνω από την επιφάνεια του κυττάρου προσκομίζει σαφή οπτικοποίηση του GnRH-R χωρική κατανομή (Εικ. 4). Λύειν γεγονότα που συμβαίνουν σε ισχύ & lt? 50 ΡΝ (. Που αντιστοιχεί στην πρώτη κορυφή της δικόρυφη κατανομή στο σχήμα 2Α) που αντιπροσωπεύεται στο μπλε, ενώ εκείνοι στην περιοχή από 50-100 ΡΝ (που αντιστοιχεί στη δεύτερη κορυφή του Σχήματος 2Α). , με κόκκινο χρώμα. Η χωρική κατανομή των GnRH-R πάνω στην επιφάνεια των κυττάρων PC-3 εμφανίζεται ομοιογενής. Θεραπείες με τον αγωνιστή δεν επηρέασε τον υποδοχέα χωρική κατανομή (Εικ. 5), καθώς και τα χρονικά διαστήματα, αλλά αύξησε το επίπεδο του υποδοχέα. Σπάνια βρέθηκαν μερικές συστάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(α) έναν εκπρόσωπο υψηλής ανάλυσης εικόνα του PC-3 επιφάνεια των κυττάρων θεωρείται για τη χαρτογράφηση των υποδοχέων. (Β) Ένας εκπρόσωπος LA /GnRH-R χάρτη λύειν δύναμη που λαμβάνεται στο PC-3 κύτταρα υποβάλλονται σε θεραπεία για 30 ημέρες με 10

-6 Μ LA. Σε μπλε εκπροσωπούνται λύειν γεγονότα που συμβαίνουν σε ισχύ & lt? 50 ΡΝ ενώ με κόκκινο αυτές της βίας στην περιοχή των 50-100 pN

Η

Η ομοιογενής κατανομή των μορίων υποδοχέα που δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία. με το ανάλογο (10

-6 Μ) και δεν διέφερε ανάλογα με τα χρονικά διαστήματα. Σε μπλε εκπροσωπούνται λύειν γεγονότα που συμβαίνουν σε ισχύ & lt? 50 ΡΝ ενώ με κόκκινο αυτές της βίας στην περιοχή των 50-100 pN

Η

GnRH-R ποσοτικοποίηση με ανάλυση κηλίδας Western

ανάλυση στυπώματος Western της GnRH-Κ-κύτταρα που εκφράζουν (ΗΕΚ293

[SCL60]) αποκάλυψε μία σαφή ζώνη στα περίπου 60 kDa, η μοριακή μάζα του τύπου Ι υπόφυσης υποδοχέα που αναφέρεται στη βιβλιογραφία [39]. PC-3 κύτταρα έδειξαν μία λιγότερο έντονη ζώνη στην ίδια θέση. Μία αμελητέα σήμα ανιχνεύθηκε σε κύτταρα μη επιμολυσμένα ΗΕΚ293 (Σχήμα 6Α).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των GnRH-R σε:. PC-3 κύτταρα, κύτταρα ΗΕΚ293 (που δεν εκφράζουν GnRH-R) και ΗΕΚ293

[SCL60] κύτταρα (σταθερά επιμολυσμένα με GnRH-R) μετά από 6 ημέρες καλλιέργειας. (Β) στυπώματα Western που δείχνει την LA-προκάλεσε αύξηση της GnRH-R σε κύτταρα PC-3 θεραπεία για 6-30 ημέρες με την ανάλογη (10

-11 ή 10

-6 Μ). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από δύο ξεχωριστά πειράματα παράγουν παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. (C) έχουν ομαδοποιηθεί πυκνομετρική δεδομένα ανάλυσης Western Blot της GnRH-R. Η ένταση των σημάτων ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρική σάρωση και εξομαλύνθηκαν με εκείνη της β-ακτίνης (που χρησιμοποιείται ως μάρτυρας φόρτωσης). Τα δεδομένα είναι η αναλογία μεταξύ των τιμών των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων (έλεγχος, τιμή 1) και φαίνονται ως μέση τιμή ± SD από 2 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.001

vs

ελέγχου,

• p & lt?. 0,001

vs

10

-6 Μ LA (one-way ANOVA και τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey)

PC-3 κύτταρα, μία θεραπεία 6-30 ημερών με τις δύο συγκεντρώσεις LA (10

-11 και 10

-6 Μ) προκάλεσε μια στατιστικά σημαντική αύξηση (από 70% έως 110 %, p & lt? 0.001) στα επίπεδα του υποδοχέα (Σχήμα 6Β και 6C), που υποστηρίζουν τα δεδομένα από φασματοσκοπία ατομικής δύναμης.. Ακόμη και αν η υψηλότερη δόση LA φάνηκε να είναι πιο αποτελεσματική στην προώθηση της GnRH-R αύξηση, η στατιστική σημαντικότητα δεν ήταν πάντα φτάσει (Εικ. 6C).

Συζήτηση

Οι άμεσες extrapituitary αποτελέσματα των αναλόγων GnRH μπορεί να θεωρηθεί το αποτέλεσμα μιας σύνθετης μωσαϊκό μοριακών γεγονότων που εξαρτώνται κατ ‘ανάγκη από την ποσότητα του GnRH-R μόρια διατίθενται στην επιφάνεια του κυττάρου και του ενεργοποιημένου μονοπάτι σηματοδότησης, και τα δύο εκ των οποίων διαφέρουν μεταξύ τους ιστούς [4], [40].

ανεπαρκεία πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τις επιδράσεις των αναλόγων GnRH σε GnRH-R. Οι περισσότερες από τις δημοσιευμένες μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις των αγωνιστών GnRH στην έκφραση GnRH-R έχουν διεξαχθεί στο

in vitro

και

in vivo μοντέλα

υπόφυσης. Σε αυτές τις μελέτες, οι παρατηρούμενες επιδράσεις φάνηκε να εξαρτάται αυστηρά από την τροπικότητα χορήγηση, όπου μια μικρή ή παλμική έκθεση στον αγωνιστή οδήγησε σε αυξορρύθμιση των επιπέδων υποδοχέα ενώ συνεχής και παρατεταμένη θεραπείες προσδιορίζεται μείωση ή αριστερά τους αμετάβλητα [41] – [43]. Στο προστάτη, έχουν πολύ ετερογενή αποτελέσματα έχουν αναφερθεί. Μια ανοσοϊστοχημική μελέτη περιγράφεται μία μείωση GnRH-R σε δείγματα προστάτη από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε μια μακρά 3-μηνών εισαγωγική ορμονική θεραπεία με λευπρολίδη και το βικαλουταμίδης αντιανδρογόνο, σε σύγκριση με την ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρείται σε δείγματα από χωρίς θεραπεία ασθενών [44]. Το εύρημα αυτό αποδόθηκε από τους συγγραφείς για την πρόσδεση του αναλογικού στα κύτταρα του προστάτη. Επίσης, σε DU-145 ξενομόσχευμα ΠΑΠ, ένας αγωνιστής που προκαλείται ελαφρά μείωση των επιπέδων της GnRH-R περιγράφηκε, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα mRNA του υποδοχέα [45]. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν τα κύτταρα και ινοβλάστες PCa, που απομονώνονται από δείγματα ασθενών, συνκαλλιεργήθηκαν και εκτέθηκαν σε λευπρολίδιο [46]. Από την άλλη πλευρά, μια ισχυρή αύξηση της GnRH-R mRNA περιγράφηκε σε προστάτη αρουραίου μετά από 28 ημέρες θεραπείας με γοσερελίνης [43]. Σε αυτό το πλαίσιο, παρατηρήσαμε με κηλίδωση Western ότι LA ήταν σε θέση να επάγει μια μετα-μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω του μεμβράνη GnRH-R μετά από 4, 6 και 12 ημέρες θεραπείας σε PC-3 κύτταρα ανδρογόνου αναίσθητη, ιδιαίτερα επεμβατική και ελάχιστα διαφοροποιημένη [24 ].

με στόχο την απόκτηση εικόνα για τις λειτουργικές ιδιότητες της GnRH-R εκτεθειμένο στην επιφάνεια των κυττάρων, και ως εκ τούτου συμμετέχει ενεργά στη σηματοδότηση αγωνιστή-υποδοχέα, ένα AFM βασίζεται σε προσέγγιση για τις συνθήκες διαβίωσης κύτταρα PC-3 ήταν που εγκρίθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματα της μια μακρά και συνεχή θεραπεία με LA σε κρίσιμες πτυχές της μεμβράνης GnRH-R (δηλαδή η ποσότητα των λύειν εκδηλώσεις, τη δύναμη της δέσμευσης αναλογικό δέκτη και διανομή υποδοχέα) ερευνήθηκαν.

Με την ανίχνευση του ποσό και η ισχύς της αλληλεπίδρασης, έχουμε αποδείξει την ικανότητά της ορμόνης για την αύξηση της έκφρασης /διαθεσιμότητα της GnRH-R στην επιφάνεια PC-3 κυττάρων, όταν χορηγείται συνεχώς στα κύτταρα, με μέγιστη αύξηση του -80% μετά από 30 ημέρες θεραπείας με την υψηλότερη δόση του LA.

σε αυτό το πλαίσιο, μελετήσαμε επίσης την κινητική της έκθεσης GnRH-R σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις υψηλές και χαμηλές αγωνιστή. Κινητική αναλύθηκε με την τοποθέτηση της καμπύλης Gompertz, μια λογιστική καμπύλη υιοθετηθεί ευρέως για να περιγράψει την αύξηση του πληθυσμού σε διάφορα βιολογικά συστήματα. Η καμπύλη Gompertz καλά ανακτά τη χρονικά εξαρτώμενη αύξηση της GnRH-R στην κυτταρική επιφάνεια. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, ο ρυθμός της έκφρασης της GnRH-R σε LA-επεξεργασμένα κύτταρα εξαρτάται από τη συγκέντρωση αγωνιστή που χρησιμοποιείται, ενώ η ασυμπτωτική τιμή είναι ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση LA και σχετίζονται με τα ειδικά χαρακτηριστικά των κυττάρων και πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται. Αυτά τα στοιχεία, ενώ για την ίδρυση σαφώς την εμφάνιση ενός LA-προκάλεσε μακροχρόνια αυξητική ρύθμιση του δικού της υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια, επιτρέπει την ανίχνευση του μέγιστου ποσού των υποδοχέων που μπορεί να εκφράσει το κύτταρο. Αυτό το τελευταίο εύρημα επιτρέπει τη λεπτή ρύθμιση της αναλογίας δόσης /αποτελέσματος, αλλάζοντας τη συγκέντρωση LA. Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα είναι δεδομένα από την ανάλυση ανοσοστυπώματος μεμβράνης GnRH-R εκτελείται σε PC-3 κύτταρα σε αγωγή για 6-30 ημέρες με την αναλογική, η οποία έδειξε σαφώς την αποτελεσματικότητα LA στην επαγωγή μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα, όπως αποδείχθηκε παλαιότερα από η ίδια τεχνική μέχρι 12 ημέρες θεραπείας [24]. ευρήματα κηλίδα Western συμφωνούν με τα δεδομένα AFM ως η υψηλότερη δόση LA φάνηκε να είναι πιο αποτελεσματική στην προώθηση της GnRH-R αύξηση, αν και η στατιστική σημαντικότητα δεν ήταν πάντα επιτευχθεί. Αυτό μπορεί να οφείλεται στις εγγενείς διαφορές μεταξύ των δύο μεθόδων.

Όσον αφορά τα μηχανισμοί που ευθύνονται για την ενίσχυση αναλόγου επαγόμενη υποδοχέα, διάφορες λειτουργικές παράμετροι μπορεί να εμπλέκονται στον καθορισμό του ποσού των υποδοχέων διατίθενται στην πλασματική μεμβράνη. προηγούμενη μελέτη μας σχετικά με την LA-επαγόμενη αυξητική ρύθμιση του GnRH-R στην κυτταρική επιφάνεια PC-3 έδειξαν ότι τέτοιο αποτέλεσμα σημειώθηκε σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [24]. Έτσι, είναι κατανοητό ότι ο αγωνιστής μπορεί να δράσει αύξηση του ρυθμού μετάφραση του μεταγραφήματος υποδοχέα και /ή την επιβράδυνση αποικοδόμησης πρωτεΐνης. Με βάση βιβλιογραφία, είναι επίσης δυνατό να υποθέσουμε ότι ένας από τους εμπλεκόμενους μηχανισμούς μπορεί να αντιπροσωπεύεται από την ικανότητά αγωνιστή για την προώθηση της εξόδου GnRH-R από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), ως εκ τούτου ευνοώντας τη διακίνηση προχωρητική υποδοχέα, εντός ενδοκυτταρικά κυστίδια μεταφοράς, στη μεμβράνη του πλάσματος. Αυτό θα ήταν σύμφωνο με την παρατήρηση ότι οι άλλοι επτά διαμεμβρανικές (7ΤΜ) υποδοχείς, όπως υποδοχείς πεπτίδιο δ-οπιοειδών, τα οποία είναι ευρέως αποθηκεύονται μέσα ER, αποστέλλεται στην κυτταρική επιφάνεια σε απόκριση στην ενεργοποίηση ενός μικρού υποπληθυσμό των υποδοχέων μεμβράνης [47 ]. Δεδομένου ότι οι υποδοχείς 7ΤΜ υφίστανται επίσης ανάδρομη μεταφορά από την κυτταρική επιφάνεια μέσω ενδοσώματα, μία εναλλακτική πιθανή εξήγηση είναι ότι η ενεργοποίηση GnRH-R θα μπορούσε να αναστείλει την εσωτερικοποίηση του υποδοχέα, δηλαδή για τον τύπο Ι θηλαστικών ΟηΚΗ-R είναι γνωστό ότι συμβαίνει πολύ αργά [48].