Abstract

Ιστορικό

Ο πολυμορφισμός των γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα που μεταβολίζουν το φάρμακο είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αυξημένη ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου. γονιδιακό τόπο UGT1A έχει προταθεί να καθορίσει δραστηριότητα γλυκουρονιδίωση ιστο-ειδικούς. Μειωμένη ικανότητα της γλυκουρονιδίωσης συσχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να εξερευνήσετε πολυμορφισμός του γονιδίου UGTlA σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Νεοπλασματικές και υγιείς ιστούς ελήφθησαν από selectedpatients. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος και μεταγραφές UGTlA mRNA αναλύθηκαν. Γονιδιωματικό DNA παρασκευάστηκε και UGTlA8 αλληλουχίες εξονίου-1 ενισχύθηκαν, εμφανιζόμενα και καθαρίζεται. Το εκχυλισμένο DNA υποκλωνοποιήθηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία. Δίπλευρη ακριβής δοκιμασία Fisher, αναλογίες πιθανοτήτων (OR), διάστημα εμπιστοσύνης (ΠΙ) και Logistics Ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

έκφραση UGTlA mRNA μειώθηκε σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με υγιείς ιστούς από τον ίδιο ασθενή. Η έκφραση UGTlA mRNA του υγιούς ιστού σε ασθενείς της μελέτης ήταν χαμηλότερη από τον έλεγχο. Η έκφραση του mRNA του καρκινικού ιστού ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε UGTlAl, 1Α3, 1Α4, LA6, 1Α9 και επάνω ρυθμισμένη σε UGTlA8 και UGTlAl0 UGT1A5 και UGT1A7 δεν εκφράστηκαν σε κολικό ιστό είτε ομάδα. Η συχνότητα αλληλόμορφου του WT UGTlA8 * 1 ήταν υψηλότερη (ρ = 0.000), η συχνότητα των UGTlA8 * 3 μειώθηκε στην ομάδα ελέγχου (ρ = 0.000). Η έκφραση της ομόζυγη UGTlA8 * 1 ήταν υψηλότερη στην ομάδα ελέγχου (p = 0.000). Υψηλότερη συχνότητα τόσο ετερόζυγη UGTlA8 * 1 /* 3 και UGTlA8 * 2 /* 3 βρέθηκαν στην ομάδα μελέτης (p = 0.000? P = 0.000). Η εμφάνιση του καρκίνου του παχέος εντέρου ήταν κυρίως σχετίζονται με την παρουσία των πολυμορφικών UGTlA8 * 3 αλληλόμορφα (p = 0.000).

Συμπέρασμα

Ο κανονισμός των γονιδίων του ανθρώπου UGT1A είναι ιστο-ειδική. Ατομική διακύμανση σε πολυμορφική εκφράσεις γονιδιακού τόπου UGTlA σημειώθηκε σε όλους τους τύπους των κολικού ιστού που δοκιμάστηκαν, ενώ η έκφραση ηπατικού ιστού ήταν ομοιόμορφη. Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης του πολυμορφισμού UGTlA8 υπάρχει σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο. UGTlA8 * 1 αλληλόμορφο είναι ένας προστατευτικός παράγοντας και UGTlA8 * 3 αλληλόμορφο είναι ένας παράγοντας κινδύνου

Παράθεση:. Wang Μ, Sun D-F, Wang S, Qing Υ, Τσεν S, Wu D, et al. (2013) Πολυμορφικό Έκφραση των UDP-γλυκουρονοσυλοτρανσφεράσης UGTlA Gene Ανθρώπων ορθοκολικού καρκίνου. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10.1371 /journal.pone.0057045

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 16, Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 16 του Ιανουαρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Επιστήμης και Τεχνολογίας βασικό έργο της επαρχίας Shandong (No.2006GG3202050), Επιστήμη ταμεία Μπόνους για Νέους επιστήμονες της επαρχίας Shandong (NO.2007BS03017, καμία σύνδεση URL), και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong (No.Y2008C115, κανένας σύνδεσμος URL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου παγκοσμίως. Με βάση τα δεδομένα από το Διεθνές Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC), ορθοκολικό καρκίνο λογαριασμών για το 9,4% του συνόλου

de novo

καρκίνους διάγνωση 2007.Compare με τα στοιχεία, το 2000, πρόσφατα διαγνωστεί καρκίνο του παχέος εντέρου το 2007 είχε αυξηθεί κατά 27%, και το ποσοστό θνησιμότητας αυξήθηκε κατά 28%? η οποία αντιπροσωπεύει μια ετήσια αύξηση κατά 3,9% και 4,0%, αντίστοιχα. [1]

Αν και η αιτιολογία του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχει πλήρως κατανοηθεί, πολυμορφισμός των γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα που μεταβολίζουν το φάρμακο είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε αυξημένη ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου [2]. Μια μυριάδα των ενζύμων που εμπλέκονται στη φάση Ι και φάσης ΙΙ μεταβολικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων των μελών του κυτοχρώματος P450 (P450) και UDP-γλυκουρονοσυλοτρανσφεράσης (UGT) superfamilies. UGTs καταλύουν αντίδραση γλυκουρονιδίωσης, η οποία είναι σημαντική για ξενοβιοτικών μεταβολισμό. Η γλυκουρονιδίωση επιτρέπει την χρησιμοποίηση ορισμένων θρεπτικών καθώς αποτοξίνωσης και απέκκριση των δυνητικά επιβλαβών ενώσεων και των μεταβολιτών, όπως στεροειδή, χολερυθρίνες, εξωγενές φάρμακα, τοξικές χημικές ουσίες και τις μεταλλαξιογόνες ουσίες [3]. Πάνω από 50 τύποι UGTs είχαν ταυτοποιηθεί σε πολλά όργανα και ιστούς των ζώων και του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος, εντερικού βλεννογόνου, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο, τον πλακούντα και μήτρα [4] – [8]. Τα ανθρώπινα UGTs διαιρέθηκε σε UGT1, 2, 3 και 8 πολυγονιδιακής οικογένειες με βάση τις εξελικτική απόκλιση [4]. Μέχρι σήμερα, έχουν 21 διαφορετικές UGTs [9] έχουν βρεθεί σε ανθρώπους. Ο τόπος του γονιδίου UGT1A ανθρώπινης βρίσκεται στο χρωμόσωμα II. Αποτελείται από δεκατρία διαφορετικά πρώτα εξόνια στο 5 ‘άκρο συνδέονται, με εναλλακτικό μάτισμα, σε τέσσερις διαφορετικές κοινές εξόνια στο 3’ άκρο. γονιδιακό τόπο UGT1A κωδικοποιεί τουλάχιστον εννέα λειτουργικές πρωτεΐνες (UGT1A1, UGT1A3-UGT1A10) και τέσσερα ψευδογονίδια (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].

Ιστός-ειδική έκφραση του τόπου του γονιδίου UGT1A έχει χαρακτηριστεί. Το γονίδιο είχε προταθεί να καθορίσουν δραστικότητα γλυκουρονιδίωση ιστο-ειδικούς στο ανθρώπινο πεπτικό σύστημα. Ηπατική πρωτεΐνες UGT1A (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 και UGT1A9) έχουν μελετηθεί και προσδιορίζονται λεπτομερώς. Οι μελέτες που εξετάζουν ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση τριών εξωηπατικών μεταγραφές UGT1A: UGT1A7, UGT1A8 και UGT1A10 [11], [12]. Χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (RT-PCR), κατώτερο έκφραση γονιδίων UGT1A8 σημειώθηκε στον οισοφάγο [13]. Μια πιο ολοκληρωμένη μελέτη έδειξε καμία ανιχνεύσιμη UGT1A8 RNA στο λεπτό έντερο, αλλά άφθονα επίπεδα του mRNA UGT1A8 στο παχύ έντερο [12]. Επί του παρόντος, τα δεδομένα σχετικά με την έκφραση του UGT1A8 σε ήπαρ ή οποιαδήποτε άλλη ανθρώπινο ιστό έχει σπάνια. Η επιλεκτική έκφραση του UGT1A8 στο παχύ έντερο θα μπορούσε να δείξει ότι UGT1A8 παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ομοιόσταση και τη διάθεση των ενδογενών και εξωγενών ενώσεων. Έχει αναφερθεί ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη UGT1A8 καταλύουν γλυκουρονιδίωση κουμαρινών, φαινολικές ενώσεις, ανθρακινόνες, φλαβονοειδή και μια σειρά των στεροειδών, σε επιμολυσμένα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293 (ΗΕΚ293) κύτταρα [14]. Εξετάστε το γεγονός ότι η άνω και κάτω τελεία περιέχει μια σημαντική ποσότητα πρωτεϊνών UGT1A [12], μια μειωμένη ικανότητα των glucuronidating συγκεκριμένες ουσίες μπορεί να είναι επιζήμια για την ομοιοστατική ισορροπία του παχέος εντέρου.

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, τα δεδομένα του γονότυπου και της αλληλουχίας είχε οδήγησε στην ανακάλυψη του πάνω από 100 παραλλαγές εντός των περιοχών προαγωγού και της κωδικοποιητικής αλληλουχίας των γονιδίων UGT1A. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλές από τις παραλλαγές εμφανίζουν αλληλόμορφο συχνότητες μέχρι και 40-50% στο γενικό πληθυσμό, τα οποία βρίσκονται να είναι σε ανισορροπία σύνδεσης. Όμως, μερικές παραλλαγές είναι επαρκή συχνότητα στο γενικό πληθυσμό να χαρακτηριστεί ως πολυμορφισμοί [15], [16]. Πολυμορφισμός αντιπροσωπεύονται καλύτερα από το γονίδιο UGT1A1, το οποίο είναι γνωστό ότι περιέχει 113 γονότυπους παραλλαγή αλληλόμορφο UGT1A1 (UGT1A1 * 1-UGT1A1 * 113). Πολλά από τα γονίδια UGT1A1 επιδεικνύουν υψηλή αλληλόμορφο συχνότητες [17], [18]. Γενετικός πολυμορφισμός είχε επίσης βρεθεί σε UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], και UGT1A9 [29]. Πολυμορφισμός οδηγεί σε διαφορετικούς βαθμούς μεταγραφικής καθώς και λειτουργικές μεταβολές, οι οποίες μπορεί να μειώσουν UGTs δραστηριότητα και τα αποτελέσματα σε παθολογία των προσβεβλημένων ατόμων. Η ανάλυση μιας μελέτης περίπτωσης ελεγχόμενη αποκάλυψε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) σε άτομα που φέρουν UGT1A1 * 6 και UGT1A7 * 3 παραλλαγές [30]. Η ανάλυση των γενετικών πολυμορφισμών των γονιδίων UGT1A3 (UGT1A3 * 2, UGT1A3 * 3) έδειξε ότι όχι μόνο το επίπεδο δραστηριότητας της εκφρασμένης πρωτεΐνης UGT1A3 είχε αλλάξει, αλλά η ειδικότητα για διαφορετικά υποστρώματα επηρεάστηκε καθώς και [20]. Εκτεταμένες μελέτες είχαν πραγματοποιηθεί στις παραλλαγές του γονιδίου UGT1A7. Με χαμηλό καρκινογόνος του μεταβολισμού δραστηριότητα, γονίδιο UGT1A7 είναι ένας παράγοντας κινδύνου για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) ανάπτυξη στην, Κινεζικά (OR = 3,06) [31], γαλλικά (OR = 3.4) [32], της Ιαπωνίας (OR = 2,33) [33 ], και οι Κορεάτες (OR = 1,45) [34]. Επιπλέον, UGT1A4 * 2 και UGT1A4 * 3 θεωρήθηκε επίσης ως παράγοντας κινδύνου για HCC σε μία μελέτη σύνδεσης αλληλομόρφων [21].

Η καταλυτική αποτελεσματικότητα του UGT1A8 * 3 (C277Y) και UGT1A9 * 3 (M33T ) αλλοενζυμικών προς μυκοφαινολικό οξύ μειωθεί δραστικά [29]. παραλλαγή Αλληλόμορφο σε ένα από τα πολλά UGT τόπους μπορούν οδηγεί σε σημαντικές βιοχημικές μεταβολές στο δυναμικό που μεταβολίζουν το φάρμακο. Αυτές οι UGT ένζυμα είναι γνωστό ότι υποβαθμίζουν καρκινογόνες ουσίες? η έλλειψη λειτουργίας μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία της καρκινογένεσης επεισοδίου όπως του ορθοκολικού καρκίνου.

Για να επιτευχθεί μια καλύτερη κατανόηση του ρόλου του UGT1A στο γαστρεντερικό σωλήνα, η τρέχουσα μελέτη είχε επικεντρωθεί στην UGT1A8 σε της γαστρεντερικής οδού. Με βάση τις προηγούμενες εκθέσεις [35], αναγνωρίσαμε τις αλλαγές της έκφρασης και λειτουργίας του UGT1A8 μπορεί να είναι ένας παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάστηκε πολυμορφική έκφραση γονιδίων UGT1A. Δοκιμάσαμε γονότυπου UGTlA8 σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του πολυμορφισμού των γονιδίων UGTlA8 και του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Κλινική υλικό

(1) παχέος ομάδα του καρκίνου, 150 ασθενείς (90 γυναίκες και 60 άνδρες, μέσης ηλικίας 56,8 ± 11,3 χρόνια) ελέγχθηκαν στην Γενική μας Κλινική, Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong, επαρχία Shandong, Κίνα. Αυτοί οι ασθενείς επελέγησαν σύμφωνα με το πρότυπο του Άμστερνταμ II [36], αποκλείοντας κληρονομικό μη-πολυποειδούς ορθοκολικού καρκίνου (HNPCC) και οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (FAP). Επιλεξιμότητα προσδιορίστηκε αν πρωτογενή διάγνωση συνέβησαν μέχρι έξι μήνες πριν από την εγγραφή στη μελέτη, με τελική διάγνωση επιβεβαιώνεται μέσω του Τμήματος Παθολογίας.

Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή βιοθεραπεία πριν από τη συλλογή δειγμάτων. 120 φυσιολογικά άτομα (48 γυναίκες και 72 άνδρες, μέσης ηλικίας 57,2 ± 11,9 χρόνια) ελέγχθηκαν από το Τμήμα Επεμβατικής Γαστρεντερολογίας στο Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong. 72 δείγματα φυσιολογικού ηπατικού ιστού από εθελοντές (30 γυναίκες και 42 άνδρες, μέσης ηλικίας 56,5 ± 10,2 χρόνια) ελήφθησαν μέσω Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong. Serial δεικτών του ιού της ηπατίτιδας ορού ήταν αρνητικά σε αυτά τα 72 άτομα. Δέκα άτομα παραπέμφθηκαν για ηπατική αιμαγγειώματος και δεκατέσσερα παραπέμφθηκαν για ηπατική κύστη. Αναθεώρηση των ιατρικών αρχείων σε όλα τα προαναφερθέντα θέματα έδειξε την απουσία χρόνιας τη λήψη του φαρμάκου συμπεριφορές, καθώς και την απουσία του καπνίσματος και κατάχρησης αλκοόλ. ελήφθησαν μέτρα ομαλοποίηση πρόσθετο δείγμα, συμπεριλαμβανομένων διακοπή του καπνίσματος 6 μήνες πριν από τη συλλογή του δείγματος του ιστού, και η νηστεία τουλάχιστον 12 ώρες πριν από την χειρουργική διαδικασίες και συλλογή ιστών.

(2) 327 ασθενείς (123 γυναίκες και 204 άνδρες , μέσης ηλικίας 56,4 ± 11,0 χρόνια) με καρκίνο του παχέος εντέρου ελέγχθηκαν στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής και Τμήμα Γαστρεντερολογίας, Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong. Αυτοί οι ασθενείς επιλέχθηκαν με βάση τα πρότυπα των κριτηρίων Άμστερνταμ II όπως και πριν [36]. Στην ομάδα ελέγχου, υπήρχαν 327 εθελοντές φύλο συμφωνημένα (μέσος όρος ηλικίας 54,2 ± 10,3 χρόνια). Κατά μέσο όρο, οι εθελοντές ήταν δύο χρόνια νεότερος από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (p & lt? 0,05). Όλα τα άτομα ήταν Han άνθρωποι που έρχονται από την κοινή περιοχή της επαρχίας Shandong στην Κίνα, χωρίς consanguinous σχέση. Ερωτηματολόγια χορηγήθηκαν από ειδικά εκπαιδευμένους νοσηλευτές για να μελετήσει θέματα σε άτομο. Το ερωτηματολόγιο συλλέγονται πληροφορίες σχετικά με τους παράγοντες του τρόπου ζωής, όπως η σωματική δραστηριότητα? το αλκοόλ και τον καπνό χρήση? ιατρική, την οικογένεια και την ιστορία της εργασίας? και η χρήση του over-the-counter φάρμακα. Επιπλέον, προκειμένου να διατηρηθεί η επιδημιολογική αρχεία και να αξιολογήσει ατομική έκθεση σε διαιτητικά καρκινογόνα, λεπτομερές ερωτηματολόγιο χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της μέσης διατροφικής πρόσληψης ενός έτους πριν από τη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, ή ένα έτος πριν από την ημερομηνία της επιλογής για τους ελέγχους. Δεν υπήρχαν άλλες σημαντικές διαφορές (π.χ., από την ηλικία, το οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου, το κάπνισμα, η συνολική πρόσληψη κρέατος, το επίπεδο εκπαίδευσης ή εσόδων) μεταξύ των ατόμων που παρέχεται δείγμα αίματος και γενικού πληθυσμού. Λήφθηκε ενυπόγραφη συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Shandong.

2.2 δείγματα ιστών και τα αντιδραστήρια

(1) Σε ορθοκολικό καρκίνο ομάδα, 150 ζεύγη δειγμάτων (1 cm × 1 cm × 1 cm) συλλέχθηκαν με τη λειτουργία τους χειρουργούς από 150 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου κατά τη μερική κολεκτομή. Τα δείγματα στη συνέχεια ψύχθηκαν σε αλατούχο διάλυμα 0 ° C. Κάθε ζεύγη δείγμα αποτελείτο από κακοήθη ιστό και περιβάλλοντα υγιή ιστό. Υγιή ιστό συλλέχθηκε σε απόσταση μεγαλύτερη των 5 cm από το περιθώριο εκτομή του καρκίνου του παχέος εντέρου. 120 υγιή δείγματα του βλεννογόνου του παχέος εντέρου από την ομάδα ελέγχου συλλέχθηκαν μέσω ηλεκτρικών εντεροσκόπιο. Μακροσκοπική εξέταση του υγιούς βλεννογόνου από την ομάδα μελέτης και θέματα ελέγχου δεν έδειξε σημάδια φθοράς, όπως νέκρωση. Μικροσκοπική εξέταση με οπτικό μικροσκόπιο τεκμηριωμένη φυσιολογική ιστολογία. Οι ιστοί ήταν ελεύθερα όγκου και οποιαδήποτε ανιχνεύσιμη ταυτόχρονη ασθένεια όπως η κολίτιδα, δυσπλασία. Κολονικό βλεννογόνο αποκόπηκε και για να ληφθούν δείγματα ιστών χωρίς muscularis κόλον και το μεγαλύτερο μέρος του υποβλεννογόνου. Αυτό επέτρεψε την άμεση σύγκριση με ηπατική επιθήλιο με ελαχιστοποίηση της παρουσίας μη επιθηλιακά κυτταρικών τύπων. 72 ηπατική δείγματα ιστού των εθελοντών ελήφθησαν μέσω λαπαροσκοπίου σε απόσταση μεγαλύτερη των 5 cm από την άκρη της χειρουργικής εκτομής. Τα δείγματα επελέγησαν για την απουσία ιστολογικά εμφανή νόσο όπως η ηπατίτιδα, και κίρρωση του ήπατος για να ελαχιστοποιηθεί δείγμα προκατάληψη. Αφού έγκλειστα σε αλουμινόχαρτο περιτύλιγμα και επισημαίνονται, όλα τα δείγματα ιστού ξεπλύθηκαν σε κρύο 0,9% NaCl, και αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο εντός 10 λεπτών από τη χειρουργική αφαίρεση και συνεχώς αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

η αντίστροφη μεταγραφάση MMLV αγοράστηκε από την Sigma Chemical Co. TaqDNA πολυμεράση αγοράστηκε από την Shanghai Shengong Co. αντιδραστήρια που χρειάζονται σε συστήματα αντιδράσεως της αντίστροφης μεταγραφής (RT) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) που παρέχονται από Tumor Immunityand Genetic Engineering Key Laboratories. kit UGTlA αγοράστηκε από την Gentest Corp.

(2) 5 ml περιφερικού φλεβικού δείγματα ολικού αίματος συλλέχθηκε από 327 ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου και 327 περιπτώσεις από υγιείς ενήλικες. Αμφότερες οι ομάδες παρέμειναν νηστικοί τουλάχιστον 12 ώρες πριν από τη συλλογή του δείγματος. Κιτρικό οξύ δεξτρόζη (ACD) χρησιμοποιήθηκε για την πρόληψη σχηματιστεί αίμα μέχρι την ανάλυση. Αντιδραστήρια των ερυθροκυττάρων λύμα, λύμα λευκοκυττάρων, η καθίζηση των πρωτεϊνών και του DNA ενυδάτωση δόθηκαν από Ιατρικής Γενετικής Ινστιτούτο Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Shandong. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται σε συστήματα αντίδραση RT-PCR και TaqDNA ενδονουκλεάση αγοράστηκαν από την Promega CO. PCR προϊόντα kit ζελατίνη ανάκτηση αγοράστηκε από BioTek CO. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ελήφθησαν από εμπορικές πηγές και είναι αναλυτικής καθαρότητας.

2.3 Ανίχνευση της έκφρασης UGTlA mRNA σε διάφορους ιστούς

Η παρουσία μεταγράφων UGT1A σε ολικό RNA ιστού αναλύθηκε με ενίσχυση PCR, εκτελείται ως ένα διπλό RT-PCR συν-ενίσχυσης με β-ακτίνης cDNA ως έλεγχος. ανίχνευση RT-PCR όλων των μεταγράφων UGT1A προβλέπεται από τον ανθρώπινο τόπο UGT1A εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το εξώνιο 1 εκκινητές ειδικούς με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες, που βρίσκεται μέσα εξώνια 2-5 ή μέσα σε ένα κοινό τμήμα του 3 ‘άκρου του πρώτου εξόνια. Όλα τα αρχικά τεμάχια βιοσυντίθενται από Shenggong CO., Σαγκάη, μετά την ανάκτηση σε γονιδιωματική εργαστήριο, όπως φαίνεται στον Πίνακα S1.

απομόνωση RNA παρασκευάστηκε σύμφωνα με μεθόδους ισοθειοκυανικού γουανιδινίου. Περίπου 200 mg του κατεψυγμένου ιστού κονιοποιήθηκε σε ένα γουδί που γεμίζουν με υγρό άζωτο. σκόνη ιστός αμέσως λύονται σε όξινο διάλυμα ισοθειοκυανικού γουανιδινίου φαινόλης-. UGT1A cDNA συν-των εκ της συνθέσεως με β-ακτίνης cDNA σε σωλήνες Eppendorf που περιέχει 1 μg RNA, 1 μΙ MMLV, 7 μλ σύστημα RT-PCR, 1 μ1 κατάντη εκκινητές .UGT1A cDNA συν-ενισχύεται με cDNA β-ακτίνης σε όγκο εκκινήσεως 98 μΐ που περιέχουν 20 μΙ αντίστροφης μεταγραφής προϊόντα, 19 μΙ σύστημα PCR, 1 μΙ ανοδικά εναύσματα, 58 μΙ υπερ-καθαρό νερό. Μετά από επώαση στους 94 ° C για 3 λεπτά, κύκλος PCR ξεκίνησε με την προσθήκη 2 μΐ TaqDNA πολυμεράσης που ακολουθείται από φυγοκέντρηση. Ένα σύνολο τριάντα πέντε κύκλοι διεξήχθη. Κάθε κύκλος PCR αποτελείται από αντιδράσεις ενίσχυσης στους 94 για 1 λεπτό, 58 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από αντιδράσεις επιμήκυνσης με παρατεταμένο χρόνο επιμήκυνση 7 λεπτών στους 72 ° C. αναλυτική ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης διεξήχθη για να προσδιορίσει τα προϊόντα PCR. Kodak Σύστημα Ανάλυσης ζελατίνης χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της έντασης της έκφρασης του UGT1A και UGT1A ισομορφές σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με πολλαπλά επίπεδα των ελέγχων, συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων χωρίς cDNA, αστάρια, ή θερμόφιλων πολυμεράση. Ιδιαιτερότητα αυτής της δοκιμασίας προσδιορίστηκε με PCR χρησιμοποιώντας όλα τα ζεύγη εκκινητών σε κάθε κλωνοποιημένο cDNA εκμαγείο για να αποκλείσει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Για να επιβεβαιωθεί η ανίχνευση ειδικών cDNA UGT1A χρήση αυτής της δοκιμασίας, τα προϊόντα της PCR ήταν μερικώς αλληλουχείται για να τεκμηριώσει την ταυτότητα αυτών των ειδικών γονιδιακών προϊόντων.

Απομόνωση

2.4 DNA από δείγματα ολικού αίματος

300 μΙ δείγματα αίματος εγχύθηκαν σε 1,5 mL σωλήνες Eppendorf. 900 μΙ προϊόντος λύσης ερυθροκυττάρων προστέθηκαν στο δείγμα. Η πέψη αφέθηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το δείγμα μετά υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 12,000 g για 20 δευτερόλεπτα και το διαυγές υπερκείμενα απομακρύνθηκαν. 50 μΙ λύματος ερυθροκυττάρων και 300 μΙ υλικού λύσεως λευκοκυττάρων προστέθηκε σε επαναιώρηση του σφαιριδίου, που ακολουθείται από 30 λεπτά πέψης σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτεΐνη καταβυθίζεται με την προσθήκη 100 μΙ καταβύθισης πρωτεΐνης και το δείγμα μετά υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 12,000 g για 20 δευτερόλεπτα. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα Eppendorf 1.5 ml, ακολουθούμενη από βραδεία ενστάλαξη με διπλό Volumed προ-ψύξη αφυδατωμένη αιθανόλη. Το δείγμα ταλαντεύονταν ελαφρά μέχρις ότου η καθίζηση του DNA. Το δείγμα στη συνέχεια φυγοκέντρηση στα 9000 g για 1 λεπτό και το διαυγές υπερκείμενα απομακρύνθηκαν. 500 μΐ 75% αιθανόλης προστέθηκε στο ίζημα, που ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση στα 9000 g για 1 λεπτό, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και το DNA ίζημα αφέθηκε να στεγνώσει στον αέρα. DNA ενυδάτωσης προστέθηκε η ενυδάτωση των DNA και αραιό διάλυμα DNA σε συγκέντρωση 20 mg /L για περαιτέρω χρήση, μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA από το υπεριώδες φασματοφωτόμετρο. DNA επανενυδατώθηκε με καθαρό νερό σε συγκέντρωση 20 mg /L. Η συγκέντρωση ελέγχθηκε με υπεριώδες φασματοφωτόμετρο πριν από την περαιτέρω χρήση.

2.5 Ενίσχυση του UGT1A8 εξονίου-1 με PCR

εξόνιο-1, που βρίσκεται στο 5′-άκρο της ανθρώπινης UGT1A8, παρουσιάζει μεμονωμένες παραλλαγή στον κανονισμό του. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με βάση την σειρά του τόπου γονιδίου UGT1A (αριθμός πρόσβασης AF297093). Πρόσθιο εκκινητή (prlA8F, bases34175-34198): 5′-ΤΟΟ GGT CAG Γ.Ο.Σ. TTG TGC CTG TAG-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής (prlA8F, βάσεις 35175 έως 35.208): 5’-GAA ΑΤΤ GTC ΑΑΑ TCA CAA TTC AGT ΑΑΟ ΟΑΑ TCT -3 ‘. Η προϋπόθεση της αντίδρασης ρυθμίστηκε σε 4 μι 5 χ PCR αντίδραση, 4 μΐ 5 χ dNTP, 0.5 μλ πρόσθιου εκκινητή, 0.5 μΐ αντίστροφου εκκινητή, 5 μι Taq DNA ενδονουκλεάση, 2 μι προτύπου DNA, και συμπληρωματική οπτική όγκο στείρου τρις ​​απεσταγμένο νερό, το οποίο έκανε ένα συνολικό όγκο 100 μL. 35 κύκλοι αντίδρασης ενίσχυσης εκτελέστηκε. Κάθε κύκλος συνίστατο από μετουσίωση στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση αντίδραση στους 57 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Πριν από την συνολική διάρκεια του κύκλου ήταν από 3 λεπτά επώαση του μίγματος της αντίδρασης στους 95 ° C και ακολούθησε κατά 10 λεπτά επιμήκυνση στους 72 ° C. Η ταυτότητα των PCR προϊόντων επιβεβαιώθηκε με electrophrosis γέλη.

2.6 Purication και αλληλούχιση των PCR προϊόντων

Τα προϊόντα PCR υπέστησαν χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο για 15 λεπτά, και απομονωμένος με 20 g /L πηκτής αγαρόζης , σε τάση 120 V για 1 ώρα. Τα ενισχυμένα λουριά DNA αποκόπηκαν κάτω από λαμπτήρα υπεριώδους ακτινοβολίας στα 320 nm και τοποθετήθηκε μέσα σε 1,5 mL σωλήνες Eppendorf. Τετραπλασιάστηκε όγκος ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης προστέθηκε στα λουριά DNA. Μετά την επώαση με λουτρό νερού στους 65 ° C για 7 λεπτά, το μίγμα μεταφέρθηκε σε στήλες και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 1 λεπτό. 300 μΐ ρυθμιστικού δέσμευσης χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό της στήλης μετά την απόρριψη του διαλύματος. Ένα άλλο 750 μl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης DNA προστέθηκε στο δείγμα και φυγοκέντρησης επαναλήφθηκε σε 10,000 g για 1 λεπτό. Το μικτό διάλυμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 12,000 g για 1 λεπτό πριν από την απόρριψη των υπερκειμένων. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου, τα δείγματα μεταφέρθηκαν από σωλήνες Eppendorf 1,5 ml σε στήλη. Στη συνέχεια, 30 μΐ DNA Buffer Προστέθηκε νερό σε στήλη, το μίγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 1 λεπτό. Το διάλυμα συλλέχθηκε για την ποσοτικοποίηση και περαιτέρω ανάλυση. Τα συλλεχθέντα κλάσματα DNA διαφορετικών γονότυπων μεταφέρθηκαν σε ΤΟΡΟ ΤΑ πλασμίδιο Τα δείγματα DNA αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία στην Ιατρική Γενετική Ινστιτούτο Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Shandong με ένα πλήρως αυτόματο sequencer (Prism 377, ΑΒΙ CO., USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε τα ίδια μέτρα ποιοτικού ελέγχου που περιγράφεται από Lesley Μ Butler, et al. [37]. Πρώτον, θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι συμπεριελήφθησαν σε κάθε πείραμα PCR και Taqman. Ομοζυγώτη άγριου τύπου, ετεροζυγώτη, και οι παραλλαγές ομοζυγώτες για κάθε γονότυπο UGT1A8 από γενωμικό DNA δείγματα του UGT1A8 γονότυπο συμπεριλήφθηκαν. Δεύτερον, οι επανειλημμένες αναλύσεις διεξήχθησαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα δείγματα από κάθε πείραμα και υπήρξε 100% συμφωνία. Τρίτον, τρεις επιπλέον τυχαία επιλεγμένα δείγματα επιβεβαιώθηκαν με άμεση αλληλούχιση του DNA. Τέλος, το προσωπικό των εργαστηρίων δεν γνώριζαν την κατάσταση στην περίπτωση των δειγμάτων.

2.7 Στατιστική ανάλυση

πακέτο λογισμικού του SPSS11.0 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων σε αυτή τη μελέτη. Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± την τυπική απόκλιση (χ ± s). Συγκρίσεις μεταξύ των μέσων δύο ομάδες δειγμάτων έγιναν με Μαθητή

t-test

, ενώ πολλαπλά μέσα ομάδας αναλύθηκαν με ANOVA. Τα αποτελέσματα των μελετών περιπτωσιακών ελέγχων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ δύο ουρών Fisher για να προσδιοριστεί η διαφορά διανομή πολλαπλών αλληλομόρφων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Προσαρμοσμένη ΕΑΠ και 95% ΚΠ για καρκίνο του παχέος εντέρου υπολογίστηκαν με τη χρήση λογιστικών μοντέλων παλινδρόμησης. ΠΙ του 95% χρησιμοποιήθηκαν εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Προσαρμοσμένη ΕΑΠ και 95% ΚΠ χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της αλληλόμορφα UGT1A8, γονότυπο, και των δύο φύλων στην ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Μια ρ-τιμή 0,05 ή λιγότερο ορίστηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

3.1 Μεταβολή της έκφρασης της UGT ΙΑ mRNA

Όλες οι μεταγραφές γονίδιο UGT1A ανθρώπινη εμφανίσει ένα μοναδικό 5 ‘άκρο χαρακτηριστικό της κάθε επιμέρους τρανσφεράσης και ένα κοινό 3’ τμήμα που κωδικοποιείται από εξώνια 2-5. περιοχή 3 ‘είναι ίδια σε όλα τα μέλη που κωδικοποιείται από τον τόπο UGT1A και συνεπώς μπορεί να αξιοποιηθεί για να αναλύσει τη συνολική έκφραση UGT1A. Συν-ενίσχυση των 487-bp UGT1A και 317-bp ανθρώπινο β-ακτίνης PCR προϊόντα, που διαχωρίζονται σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο, αποδεικνύεται με τη χρήση καρκινικών ιστών, που περιβάλλουν υγιείς ιστούς του, η κανονική του κόλου ιστούς από ασθενείς ελέγχου , και ηπατικούς ιστούς. Πλάτος και η ένταση της β-ακτίνης (317-bp) σε πάνελ ήταν συνεπή ως αναμενόταν. Το εύρος και η ένταση της UGT1A mRNAs (487-bp) ήταν πολύ πιο μεταβλητή. Ποσοτικοποίηση των προϊόντων DRT-PCR επιτεύχθηκε με τον υπολογισμό της σχετικής συντελεστή χρησιμοποιώντας Kodak σύστημα ανάλυσης ζελατίνη. Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα σταθερής κατάστασης μεταξύ των τριών extrahepatic πηγή και ηπατική ιστούς.

Σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, η έκφραση UGTlA mRNA ήταν σημαντικά μειωμένη σε παθολογικούς ιστούς σε σύγκριση με τις γύρω υγιείς ιστούς που συγκομίζονται μαζί. έκφραση UGT1A mRNA σε υγιή ιστό που συλλέγονται από ασθενείς με καρκίνο του παχέος ήταν σημαντικά χαμηλότερη από υγιείς κολικού ιστού που συλλέγονται από την κανονική ελέγχου. Το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης mRNA UGT1A ανιχνεύθηκε σε ηπατικό ιστό, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από την κανονική του παχέος ιστούς από υγιείς ελέγχους (Ρ & lt? 0,01), (Table.1). γονιδιακή έκφραση του παχέος UGTlA χαρακτηρίζονταν από σημαντικές ατομικές διαφορές, ενώ ηπατική εκφράσεις UGTlA mRNA ήταν πιο ομοιόμορφη.

Η

3.2 Πολυμορφικό έκφραση UGT1A ισομορφών σε διαφορετικούς ιστούς

ήταν

Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης UGT1A εκτελείται στο επίπεδο του mRNA που απασχολούν UGT1A εξόνιο 1-ειδικά DRT-PCR. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ανθρώπινα ηπατικά και του παχέος ιστούς χαρακτηρίζονται από ένα μοναδικό και ιστοειδική διαφορική έκφραση του γενετικού τόπου UGT1A [11], [12]. Προϊόντα του εξονίου 1-ειδικά DRT-PCR ανιχνεύει ειδικά μεταγραφές όλων των γνωστών ισομορφών UGT1A. ιμάντες DNA διαχωρίστηκαν σε 2% αγαρόζη και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο (Σχήμα 1). Της οικογένειας UGT1A ισομορφές αναλύονται, UGT1A5 και 1A7 mRNA δεν ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα ιστού, και ο αριθμός των δειγμάτων που εκφράζονται ισομορφών UGT1A ήταν διαφορετική σε διαφορετικούς ιστούς. Ανάλυση των 150 διαφορετικές μεταγραφές UGT1A των καρκινικών ιστών κατέδειξε τα ακόλουθα: UGT1A1, 1Α8 και 1Α10 mRNA εκφράστηκαν σε 102 δείγματα (Fig.1.a). UGTlAl, 1Α3, 1Α4, LA6, 1Α8, 1Α9 και 1Α10 mRNA εκφράστηκαν σε 54 δείγματα (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 και 1Α10 mRNA εκφράστηκαν σε 66 δείγματα (Fig.1.c). UGTlA3, 1Α4, 1Α8, 1Α9 και 1Α10 mRNA εκφράστηκαν σε 108 δείγματα (Fig.1.d). Η πολυμορφική έκφραση των ισομορφών UGTlA σε διαφορετικούς ιστούς δίδεται στον table.2 και σχ.2. Σε αντίθεση με καρκινικούς ιστούς, UGTlA8 και UGTlAl0 mRNA δεν εκφράστηκαν στα 72 διαφορετικά δείγματα ηπατικού ιστού. Υπήρχε μικρή διακύμανση της αφθονίας των UGTlA ισομορφών μεταγραφημάτων όταν κάθε συγκρίθηκε με τα επίπεδα έκφρασης β-ακτίνης. επίπεδα UGTlAl, 1Α3, 1Α4, LA6 και 1Α9 mRNA ήταν διαφορικά κάτω-ρυθμίζονται στα καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις γύρω φυσιολογικό βλεννογόνο (Ρ & lt? 0,01), ωστόσο, τα επίπεδα UGTlA8 και UGTlAl0 mRNA ήταν πάνω ρυθμισμένα (Ρ & lt? 0,01).

AT: Παχέος καρκινικούς ιστούς? Ν: Γύρω υγιή βλεννογόνο? Μ: Marker

Η

προϊόντα A.PCR της UGTlA8 εξόνιο-1 (1 033 bp). 1,2,3: Τα προϊόντα PCR των UGTlA8? Μ: Marker. B.Sequenced αποτελέσματα της uGTlA8 αλληλόμορφα. α: UGTlA8 * 1? β: UGTlA8 * 2? c: UGTlA8 * 3

Η

Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι ο τόπος UGT1A εκφράζεται στον ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα.. Τα δεδομένα σημειώνουν επίσης πολυμορφικές ρύθμιση και ατομική διακύμανση της UGTl έναν γονιδιακό τόπο στην μεταγραφή του RNA. Επιπλέον, η αναγνώριση του ιστού-ειδική έκφραση του UGT1A8 συνεπάγεται ότι οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί μπορεί να είναι ενδεικτική της εξελικτικής ανάπτυξης και τη βιολογική βάση τον προσδιορισμό επιμέρους παραλλαγές του κινδύνου καρκίνου.

Η

3.3 Αναγνώριση του πίνακα του DNA εκχυλίζεται από δείγματα ολικού αίματος

SeqMan της DNASTAR λογισμικό για Μοριακής Βιολογίας χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των αλληλουχιών των προϊόντων PCR. Εντοπίστηκε αλληλουχίες συγκρίθηκαν με προκαθορισμένα τυποποιημένα κριτήρια με τα ανθρώπινα έργο γονιδιώματος [HGP] να καθορίσει περιοχές του SNP και τη συχνότητα των αλληλομόρφων, μετά συγκεντρωτική ανάλυση των αποτελεσμάτων ακολουθία και διάφορα αποκλεισμοί των κορυφών φάντασμα και κατεστραμμένους τομείς. πληθυσμιακή κατανομή των αλληλομόρφων συναντήθηκαν Hardy-Weinberg ισορροπία με χ2 test (βαθμοί ελευθερίας = αριθμός αλληλόμορφων-1). Το μήκος των PCR προϊόντων ήταν 1,033bp (Fig.2.A). Αλληλουχία αποτελεσμάτων των καθαρίζεται PCR προϊόντων έδειξε ότι υπήρχαν τρεις SNPs στο ζεύγος βάσεων 518 (CG), ζεύγος βάσεων 765 (AG), και το ζεύγος βάσεων 830 (GA) εντός της περιοχής κωδικοποίησης του UGT1A8 εξόνιο-1 (Fig.2.B, Πίνακας S2) .Η μετάλλαξη στο νουκλεοτίδιο 518 οδηγεί σε παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο κωδικόνιο 173, ως εκ τούτου, η αλανίνη, αντικαθίσταται με γλυκίνη. Η μετάλλαξη στο νουκλεοτίδιο 830 έχει σαν αποτέλεσμα υποκατάσταση τυροσίνης για κυστεΐνη κωδικοποιείται από το κωδικόνιο 277. Η μετάλλαξη στο νουκλεοτίδιο 765 είναι σιωπηλή μετάλλαξη. Τα λειτουργικά πολυμορφισμοί φαίνονται στον Πίνακα S2. Για την πλειοψηφία των δειγμάτων με ετερόζυγη μετάλλαξη, μία μόνο μετάλλαξη ήταν παρούσα, υποδηλώνει οι τρεις σημειακές μεταλλάξεις δεν συνδέονται (Πίνακας S2, S3). Για να βελτιωθεί η ακρίβεια, τα συλλεγέντα θραύσματα DNA διαφορετικών γονότυπων μεταφέρθηκαν σε πλασμίδια ΤΟΡΟ ΤΑ κλωνοποίησης. Πολλαπλές κλώνοι από κάθε δείγμα DNA χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα μοτίβα μετάλλαξης ταίριαζε με την ταυτότητα των αλληλόμορφων όπως περιγράφεται στον Πίνακα S2 και Table.S3. Γονότυπος των δειγμάτων μπορεί να ελεγχθεί με τη χρήση ΤΟΡΟ κλωνοποίηση θραυσμάτων DNA, σε αυτή την περίπτωση UGTlA8 * 2 και * 3 UGTlA8 αλληλόμορφα ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κλωνοποίησης ΤΟΡΟ.

3.4 Ανάλυση της συχνότητας των αλληλομόρφων και τον γονότυπο του UGT1A8

Στην ομάδα ελέγχου, η συχνότητα αλληλόμορφο UGTlA8 * 1 (άγριου τύπου) και UGTlA8 * 1α ήταν κυρίαρχη (79%), ακολουθούμενη από 18,8% για UGTlA8 * 2. Η ταυτότητα της UGTlA8 * 3 ήταν πράγματι σπάνιο, με μόνο το 2,3% των ελέγχων που παρατηρήθηκαν να μεταφέρουμε αυτό το γονότυπο (Table.3, Εικόνα 3.). UGTlA8 * La είναι μια σιωπηλή μετάλλαξη και κωδικοποιεί UGTlA8 * l. Ένα ομόζυγο πρότυπο UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1α, UGTIA8 * 1α /* 1α) αντιπροσώπευαν περίπου το 65,21% της κανονικής ενήλικες (Table.4). Διαπιστώθηκε ότι ο γονότυπος του UGTlA8 * 1 /* 2 και UGTlA8 * 1α /* 2 ήταν σε μία συχνότητα 24,64%, γονότυπο UGTlA8 * 1 /* 3 και UGTlA8 * 2 /* 3 ήταν σε συχνότητα 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 ήταν σε μία συχνότητα 5,8% στους μάρτυρες. Είναι ενδιαφέρον, δεν υπήρχε ομόζυγο UGTlA8 * 3. Σε περίπτωση ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, η συχνότητα του αλληλόμορφου UGTlA8 * 1 και * UGTlA8 1α, UGTlA8 * 2, * 3 UGTlA8 αποτελείται από περίπου 61,5%, 22,0% και 16,5% (Εικόνα 3.), αντίστοιχα. Το ετερόζυγο έκφραση του UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8, αποτελούνται από εκείνα με γονότυπο UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8 και UGTlA8 * 1α /* 2 ήταν σε μια συχνότητα από περίπου 18,84%. 28.98% των ατόμων με καρκίνο του παχέος εντέρου εξέφρασε UGTlA8 * 1 /* 3 και UGTlA8 * 2 /* 3. Το ομόζυγο γονότυπο του UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 1, * 2 UGTlA8 /UGTlA8 * 2) που αποτελείται από 46,38%, 4,35% των καρκινικών περιπτώσεις, αντίστοιχα. Μία περίπτωση ομόζυγη UGT1A8 * 3 Σημειώνεται επίσης (Table.3). Υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη συχνότητα των αλληλομόρφων και γονοτύπων μεταξύ της ομάδας μελέτης και της ομάδας ελέγχου. Η άγρια ​​αλληλόμορφο τύπου (UGTlA8 * 1) η συχνότητα ήταν χαμηλότερη μεταξύ της ομάδας μελέτης από την ομάδα ελέγχου [Ρ = 0.000, OR = 0,45, CI (0,28 έως 0,79)]. Η ίδια σημασία θα μπορούσε να σημειωθεί με γονότυπο UGTlA8 * 1 /* l [P = 0.000, OR = 0,28, CI (0,19 έως 0,41)] και UGTlA8 * 2 /* 3 [Ρ = 0.000, OR = 10,58, CI (4.48- 24.98)] (Table.4 και Εικ.4). Τα αντίθετα αποτελέσματα σημειώθηκαν στο αλληλόμορφο UGTlA8 * 3 [Ρ = 0.000, OR = 6,99, CI (3,39 – 14,42)] (Table.3 και Εικ.4) και γονότυπο UGTlA8 * 1 /* 3 [Ρ = 0.000, OR =