Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη περιγράφει το μηχανισμό ευαισθητοποίησης για την θερμική καταπόνηση από τους αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών (HDACIs) σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και δείχνει ότι Ku70, με βάση την κατάσταση ακετυλίωση του, μεσολαβεί για την προστασία από καρκίνο του πνεύμονα από υπερθερμία ( 42,5 ° C, 1-6 ώρες). Κιι70 ρυθμίζει την απόπτωση μέσω απομόνωσης προ-αποπτωτική Βαχ. Ωστόσο, ο ρόλος του στην θερμική καταπόνηση δεν είναι πλήρως κατανοητός. Τα ευρήματα έδειξαν ότι, προ-θεραπεία των πνευμόνων καρκινικά κύτταρα με HDACIs, νικοτιναμίδη (NM) ή τριχοστατίνη Α (TSA) ή και τα δύο σημαντικά ενισχυμένη υπερθερμία που προκαλείται από Bax-εξαρτώμενη απόπτωση σε PC-10 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η υπερθερμία επάγει Sirt-1, Sirtuin, προς τα πάνω ρύθμιση αλλά όχι HDAC6 ή SIRT-3, επομένως επιμόλυνση με κυρίαρχο αρνητικό Sirt-1 (Y /H) εξαλείφεται επίσης την προστασία και οδήγησε σε περισσότερες κυτταρικό θάνατο από υπερθερμία, σε Η1299 κυττάρων μέσω Βαχ ενεργοποίησης. Υπερθερμία και μόνο γεμάτοι με καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα σε απόπτωση χωρίς εξέχοντα θάνατο. Μετά υπερθερμίας Βαχ ρυθμίζεται αυξητικά, Bcl-2 ρυθμίζεται προς τα κάτω, ο λόγος Βαχ /Bcl-2 αντιστρέφεται και Bax /Bcl-2 ετεροδιμερές διαχωρίστηκε. Αν και υπερθερμία δεν επηρεάζουν το συνολικό επίπεδο έκφρασης Ku70, τόνωσε Ku70 αποακετυλίωση, το οποίο με τη σειρά του θα μπορούσε να δεσμεύσει περισσότερα Bax στα PC-10 κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ένα μηχανισμό διαφυγής από υπερθερμία που προκαλείται Βαχ ενεργοποίησης. Για να επαληθεύσετε το ρόλο της Ku70 σε αυτόν τον μηχανισμό προστασίας, Ku70 σίγησε με siRNA. Κιι70 σίγηση ευαισθητοποιημένα σημαντικά τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε υπερθερμία. Τα κύτταρα Κιι70 KD υποβλήθηκαν σε κυτταροτοξική G1 σύλληψη και κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε σύγκριση με κωδικοποιημένα προϊόντα επιμόλυνσης η οποία έδειξε μόνο G2 /M κυτταροστατική σύλληψης στις κυτταρικές γραμμές που ερευνήθηκαν, υποδηλώνοντας μια πρόσθετη κυτταρικό κύκλο που εξαρτάται, μυθιστόρημα, ο ρόλος των Κιι70 σε προστασία από υπερθερμία. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν Κιι70 εξαρτώμενη μηχανισμός προστασίας από υπερθερμία. Στόχευση Ku70 ή /και ακετυλίωση του κατά τη διάρκεια υπερθερμία μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για τον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Hassan MK, Watari Η, Salah-Eldin Α-Ε, Σουλτάνος ​​AS, Μοχάμεντ Ζ, Fujioka Y, et al. (2014) Αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης Καρκίνο ευαισθητοποιήσει κύτταρα του πνεύμονα σε υπερθερμία: Συμμετοχή της Ku70 /SIRT-1 στην Θέρμο-Προστασία. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10.1371 /journal.pone.0094213

Επιμέλεια: Sue Cotterill Αγίου Γεωργίου, του Πανεπιστημίου του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 30 του Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 14, Μαρτίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Hassan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-βοήθειας HW για την Επιστημονική Έρευνα (C 22591844 και 20659255) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένα μακροχρόνιο ερευνητικό ενδιαφέρον έχει γίνει στόχος των συγκεκριμένων μηχανισμών που ευθύνονται για την ανάπτυξη αντοχής των καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικές θεραπείες. Στόχευση αυτούς τους μηχανισμούς μπορεί να ενισχύσει την ειδική καταστροφή των καρκινικών κυττάρων. Υπερθερμία είναι ένα τροπικότητα χρησιμοποιούνται σε κλινικό περιβάλλον, για τη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου? συνήθως χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία και /ή χημειοθεραπεία [1], [2]. Ωστόσο, ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματικότητα της υπερθερμίας είναι η ανάπτυξη κυτταρικών αντίστασης, η οποία εμποδίζει αποπτωτικά σηματοδότηση και ενισχύει την κυτταρική επιβίωση [3], [4]. Αυτή η αντίσταση προκαλεί περιορισμό της απόπτωσης μετά υπερθερμίας [5], [6]. Έτσι, η ταυτοποίηση των μηχανισμών που ευθύνονται για την ανάπτυξη των θερμο-αντοχής σε καρκινικά κύτταρα, θα μπορούσε να συμβάλει στη βελτίωση της ειδική στόχευση για να ενισχύσει τα αποτελέσματα της θεραπείας κυτταρική ευαισθησία στην υπερθερμία. Αντοχή σε απόπτωση είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων [3], [7]. Η απόπτωση επάγεται από, εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια [8]. Η πρόσδεση των προσδεμάτων σε υποδοχέα θανάτου ενεργοποιεί την εξωγενή οδό? η ενδογενής οδός ενεργοποιείται από κύτταρο στρες, όπως βλάβη του DNA. Η οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2 ρυθμίζει την ενδογενή οδό? επηρεάζει τη διαπερατότητα της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης [9]. Τα μέλη της οικογένειας Bcl-2 διαιρείται σε προαποπτωτικά πρωτεΐνες όπως Βαχ, Bak, και Bok, και αντιαποπτωτικά πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων Bcl-2, Bcl-xL, Βοΐ-νν, και Mcl-1 [10] – [13].

η συσσώρευση του Bcl-2 και Bcl-xL μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από την απόπτωση, προάγουν επιβίωση κυττάρου και να επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου μέσω απομόνωσης προ-αποπτωτική Βαχ. Κιι70 είναι ένα άλλο αντι-αποπτωτικό μόριο? δεσμεύει φυσικά Βαχ, απομόνωσης αυτό την ενεργοποίηση ή μιτοχονδριακή μετατόπιση σε μη τεταμένη κύτταρα [14], [15]. Κιι70 είναι ένα από τα συστατικά του ετεροδιμερούς Κυ70 /Κυ80 που εμπλέκεται στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA [16]. Ακετυλίωση δύο κρίσιμες λυσίνες, στο καρβοξυλο άκρο της Κιι70, ρυθμίζει τη δέσμευση /διάστασης προς Βαχ και αυτό επηρεάζει την επακόλουθη ευαισθησία του κυττάρου σε αποπτωτικά ερεθίσματα [14]. Μόνο αποακετυλιωμένη Κιι70 μπορεί να προσδεθεί σε Βαχ. Υψηλή έκφραση του Κιι70 σε καρκινικά κύτταρα θα ενισχύσουν την ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA και τη μείωση Bax απόπτωση που διαμεσολαβείται? Ως εκ τούτου, θα μπορούσε να Κιι70 παίζουν ρόλο στην αντίσταση θεραπεία. Η δραστηριότητα σχετική με απόπτωση των Κιι70 είναι ανεξάρτητη από το ρόλο της στην επιδιόρθωση του DNA [17]. Ο κύκλος ακετυλίωση /αποακετυλίωσης Ku70 ρυθμίζεται από τρανσφεράσες των ιστονών ακετυλο και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs). Ku70 είναι ένας στόχος ορισμένων μελών της κατηγορίας Ι /ΙΙ και ΙΙΙ HDAC HDAC κατηγορίας [18], [19]. Η οικογένεια των πρωτεϊνών HDAC διαιρείται σε δύο κατηγορίες: εξαρτώμενη από ψευδάργυρο ενζύμων (HDAC1-11), υποδιαιρείται σε τάξης Ι και τάξης II, τα οποία αναστέλλονται από Τριχοστατίνη Α (TSA) και NAD

+ – εξαρτώμενη ένζυμα (κατηγορία III? SIRT1-7), η οποία αναστέλλεται από νικοτινιμιδίου (NAM). Πιο συγκεκριμένα, SIRT-1, ένα μέλος των HDACs κατηγορίας III, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην Κιι70 αποακετυλίωση, το οποίο ενισχύει την προστασία των κυττάρων από Bax κατά την διάρκεια θερμιδικού περιορισμού [19]. Η πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων υπερ-εκφράζουν SIRT1 [20]. Έτσι, με στόχο την Κιι70 εξαρτώμενη προστασία από την απόπτωση, από αναστολείς HDAC που αναστέλλουν Sirt-1, θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την ευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικές θεραπείες. Σε αυτή τη μελέτη, το μοντέλο μας είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα θανατώνονται σημαντικά από υπερθερμία όταν προεπεξεργασία με HDACIs σε σύγκριση με μόνο υπερθερμία. Sirt-1 και το στόχο της, Κιι70, είναι κεντρικής σημασίας για την μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να διαφύγει θερμική θάνατο που προκαλείται. Αλλαγές στην δραστικότητα του Βαχ, Κιι70 ακετυλίωση και του κυτταρικού κύκλου μελετήθηκαν κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε υπερθερμία. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα της αλληλουχίας ειδική στόχευση των Κιι70, χρησιμοποιώντας siRNA, μελετήθηκαν επίσης σε σχέση με τον καρκίνο του πνεύμονα ευαισθητοποίηση των κυττάρων σε υπερθερμία. Ku70 φαίνεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων από υπερθερμία πιθανότατα από δεσμεύοντας πάνω-ρυθμίζονται Bax.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Δύο ανθρώπινα, μη μικρό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος πνεύμονα: PC-10 [21], και Η1299, αγοράστηκαν (American Type Culture Collection, ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό ( Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) (πλήρες μέσο) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Το καλλιεργημένο μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο κάθε τρεις ημέρες.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Αντι-ανθρώπινου Bax πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (pAb) και αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα Κιι70 ποντικού (mAb) ήταν αγοράστηκε από την BD Bioscience (Erembodegem, Belgium)? ένα άλλο αντι-ανθρώπινου Κιι70 ποντικού mAb για ανοσοκαταβύθιση, αντι-ανθρώπινο HDAC-6 και αντι-ανθρώπινο Sirt-3 κουνελιού (pAb) αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, UK)? αντι-ανθρώπινου Κυ80 ποντικού mAb από Signal Transduction (USA), αντι ανθρώπινο Sirt-1 και αντι παν-K (ακετυλιωμένη λυσίνη) από την Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ, USA)? mAb αντι ανθρώπινο Bcl-2 ποντικού αγοράστηκε από την Dako (Glostrup, Δανία). Ανίχνευση με ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με HRP (Dako) αραιωμένο σε 1: 2000. χρώση ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC δευτερογενή αντισώματα (Dako) αραιωμένο σε 1:. 50. αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACIs), νικοτιναμιδίου (ΝΑΜ) και τριχοστατίνη (TSA) αγοράστηκαν από την Wako Chemicals, Ιαπωνία

HDACi βελτιστοποίηση της θεραπείας

χρησιμοποιείται

Κάθε HDACi προβλήθηκε για την υπο-θανατηφόρα δόση του σε ένα πιλοτικό πείραμα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, με ή χωρίς μόνο DMSO και την προσθήκη διαφορετικών δόσεων του καθενός από τα HDACIs? 300 ηΜ TSA και 20 mM του ΝΑΜ επιλέχθηκαν ως μη-τοξικές δόσεις και περαιτέρω χρησιμοποιήθηκαν στα επόμενα πειράματα.

Θερμική επεξεργασία

Τα κύτταρα συνδέονται με το κάτω μέρος των δίσκων καλλιέργειας, ήταν προ-καλλιέργεια για 48 ώρες, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 είτε 37.0 ° C (έλεγχος) ή 42,5 ° C για 1-9 ώρες.

κυτταρομετρία ροής, ανάλυση του κύκλου των κυττάρων και χρώση αννεξίνης V

Μετά την έκθεση σε υπερθερμία, τα κύτταρα επανα-επωάστηκαν στους 37 ° C για 0 ​​ώρες, 24 ώρες, ή 48 ώρες. Στη συνέχεια, οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν. Εν συντομία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση με Ca

2 +-Mg

2 + -δωρεάν PBS Dulbecco, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,1 mg /ml ΚΝάσης (Τύπος ΙΑ? Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 100 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ? Sigma), στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Μετά τη διέλευση μέσω ενός νάιλον πλέγματος 40 nm, τα δείγματα διατηρούνται σε πάγο μέχρι μετρήσεις. Ελήφθησαν τα στοιχεία, χρησιμοποιώντας το βαθμονομητή FACS, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των αναλογίες του κυτταρικού κύκλου φάση με το λογισμικό ModFit. Ένα κλάσμα των κυττάρων του DNA, κάτω από το υπο-G0 /G1 κορυφή, που υποδεικνύεται αποπτωτικά κύτταρα? ιστογράμματα DNA χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση τους.

Για τη χρώση αννεξίνης V, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με απευθείας ΡΙ και αννεξίνης-ν Flous (Roche) για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης. Τα κύτταρα ταυτοποιούνται με βαθμονομητή FACS μετά τη ρύθμιση της τάσης χρησιμοποιώντας μη κατεργασμένα κύτταρα χρωματίζονται ελέγχου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest και ταξινομούνται σε τέσσερις διαφορετικές φάσεις: βάφτηκε ζωντανά κύτταρα, πρώιμη ηλικία αποπτωτικά κύτταρα χρωματίστηκαν μόνο με Annexin-V, μέση ηλικία τα κύτταρα αποπτωτικά διπλά χρωματισμένο, και αργά ηλικία αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων χρωματίστηκαν με ΡΙ μόνο

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα (5 × 10

6 /πιάτο) πλύθηκαν με κρύο PBS, λύθηκαν σε πάγο σε RIPA ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris, ρΗ 7, 150 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο και 0.1% ΝΡ-40) (NP-40? Nacalai Teque, Kyoto, Japan) ή CHAPS ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, ρΗ 7.4, 1% CHAPS) [22] που έχει συμπληρωθεί με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) για 1 ώρα, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 15.000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο αναμίχθηκε με πρωτεΐνη A-Sepharose (για pAb) ή πρωτεΐνη G-Sepharose (για mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), προ-διογκώθηκε σε PBS και προ-επικαλυμμένα με το επιθυμητό αντίσωμα έναντι Βαχ, Κιι70, ακετυλιωμένο λυσίνη ή SIRT-1 με ήπια ανακίνηση για 1 ώρα στους 4 ° C και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στις 3000 rpm. Μετά από έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, η ανοσοσύμπλοκο κλασματώθηκε με SDS-PAGE (10-12% τζελ) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western.

Ανάλυση Western Blot

Μετά την SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Amersham, Buckinghamshire, UK). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 4 ° C όλη τη νύχτα με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού. Η μεμβράνη επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με την επιθυμητή Ab. Μετά από πλύση τρεις φορές με TPBS, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με δευτερογενή Ab, σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από τρεις πλύσεις με TPBS. Η μεμβράνη αναπτύχθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίων ECL (Amersham). Η χημειοφωταύγεια οπτικοποιήθηκε με μια φωτογραφική μηχανή polaroid (Amersham Pharmacia) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πυκνομετρία.

σχεδιασμό siRNA και διαμόλυνση

siRNA ολιγομερή κατά Κιι70 mRNA (Κυ70-siRNA) και μία αλληλουχία ελέγχου που δεν ταιριάζει με οποιαδήποτε αλληλουχία γονιδίου (Cont-siRNA) είτε αγοράζονται ως μια επικυρωμένη ένα (Ambion, USA? Κιι70-siRNA-2 και cont-siRNA-2, αντίστοιχα) ή να σχεδιάζονται από τους ερευνητές και έπειτα συντίθεται με Ambion σύμφωνα με την ακόλουθη αλληλουχία : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Κυ70-siRNA-1) και 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5? Cont-siRNA, 5_GCG ΚΕΔ UUU GUA GGA UUC GdTdT_3 και 3_dTdTCGCGCG ΑΑΑ CAU CCU AAG C_5 (συν-siRNA-1). Αυτή η ακολουθία στόχευση είχε επικυρωθεί [23]. siRNA ολιγομερή κατά Bax mRNA (Bax-σι) αγοράστηκε από Qiagene (Cat Νο SI04948202). Το Bax-σι, το Κιι70-siRNAs ή cont-siRNAs επιμολύνθηκαν μέσα στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (10

5 κύτταρα /60-mm δίσκο) χρησιμοποιώντας SiPORT

Neofex

(Ambion? USA) σε μια τελική συγκέντρωση 200 ηΜ, δύο φορές. Μία ημέρα μετά την τελευταία επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία 60 mm (50.000 κύτταρα ανά δίσκο) εις τριπλούν. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία στα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, ανάλογα με το σχεδιασμό του πειράματος. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές για επαναληψιμότητα και στατιστικού υπολογισμού.

Στατιστική

αξιολόγηση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Minitab Τύπου (Ver.12). Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± S.E.M. Ένας τρόπος ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η στατιστική σημασία μεταξύ των μέσων. Οι διαφορές μεταξύ των μέσων θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ-τιμές μικρότερες από 0.05.

Αποτελέσματα

HDACIs διευκολύνεται σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο με υπερθερμία

Ως γεγονός, SIRT-1, μια ανθρώπινη δεακετυλάσης, είχε ως στόχο ειδικά από μικρά μόρια γνωστά ως HDACIs, για παράδειγμα ΝΑΜ. Επιπλέον, Ku70 αποακετυλίωση ανεστάλη από τα μόρια αναστολέα που στοχεύουν στην κατηγορία I /II HDAC? για παράδειγμα TSA. Πρέπει πρώτα προ-αγωγή των PC-10 κύτταρα με διαφορετικές HDACIs, ΝΑΜ (20 mM), TSA (300 ηΜ) ή και τα δύο, για 4 ώρες ακριβώς πριν την έκθεση σε υπερθερμία. Αυτή η συνδυασμένη θεραπεία αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση, περισσότερες από δύο πτυχώσεις, σε σύγκριση με τη θεραπεία υπερθερμία και μόνο, όπως παρατηρείται με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Σχήμα. 1Α) και αννεξίνης V χρώση (Σχήμα. 1 Β). Το πρότυπο έκφρασης Bax αναλύθηκε σε κυτταρολύματα ολόκληρο από επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα PC-10 κύτταρα. έκφραση Bax (21 kDa) αυξήθηκε από υπερθερμία. Είναι ενδιαφέρον, HDACIs (ΝΑΜ και TSA) αύξησε την παραγωγή του 18 kDa Βαχ, το οποίο είναι γνωστό ότι είναι ένας Ν-άκρο κολοβωμένη μορφή του Βαχ. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση Ββχ προκαλείται είτε από την έκθεση Ν-τελικό άκρο από διαμορφωτική αλλαγή (αναστρέψιμη αλλαγή) ή Ν-τερματικό ακρωτηριασμό (αμετάκλητη αλλαγή), τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αειφόρος αυξημένη απόπτωση με υπερθερμία και HDACIs είναι Bax-εξαρτώμενη και αυτό απόπτωση μπορεί να εξαρτάται για ρύθμιση προς τα πάνω του Βαχ ή την απελευθέρωση του Bax από αντιαποπτωτικών πρωτεΐνη (ες) για την προώθηση της απόπτωσης (Εικόνα. 1 C). Σημαντικά, η θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με HDACIs, μόνο σε επιλεγμένες δόσεις, δεν είχε καμία αξιοσημείωτη τοξική επίδραση. Παρόμοιες επιδράσεις του HDACIs παρατηρήθηκαν στα κύτταρα Η1299 (Σχήμα. S1 και S2). Απροσδόκητα, ο τριπλός συνδυασμός της ΝΑΜ, TSA και υπερθερμία ήταν λιγότερο αποτελεσματική στην Η1299 από διπλού συνδυασμού. Αν και ο ακριβής μοριακός μηχανισμός αυτού του φαινομένου παραμένει ασαφής, ένας πιθανός λόγος είναι ότι ο τριπλός συνδυασμός μπορεί να ενισχύσει την διαίρεση των κυττάρων που επιβιώνουν ξεφύγει από την πρόκληση της τριπλής θεραπείας, η οποία μπορεί να αποδώσει την παραγωγή νέων θυγατρικών κυττάρων εντός του 48 ώρες μετά τη θεραπεία ( πριν από την ανίχνευση χρώση αννεξίνης V) και να προκαλέσει τη μείωση του ποσοστού χρώσης αννεξίνης V τελικά. Για να βεβαιωθείτε ότι Bax παίζει τον κύριο ρόλο στην υπερθερμία που προκαλείται από απόπτωση μετά τη στόχευση Κιι70 αποακετυλίωσης, Βαχ έγινε στόχος ειδικών siRNA σε PC-10 κύτταρα (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Bax ήταν δεκτική στο siRNA επιμόλυνση (Bax-si), σε σύγκριση με τον έλεγχο ομελέτα ολίγο siRNA (συν-σι) όπως ανιχνεύεται με ανάλυση Western blot (Σχήμα 1D?. Πάνω πίνακα). Και πάλι, όταν Bax-χτυπηθεί κάτω PC-10 κύτταρα κατεργάστηκαν με υπερθερμία για 6 ώρες με την παρουσία HDACIs, η υπερθερμία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο ανεστάλη σημαντικά (Σχήμα 1 D?. Κάτω πίνακας). Εν τω μεταξύ, ο κυτταρικός θάνατος δεν ήταν εντελώς αποκλεισμένη υπό θεραπεία υπερθερμία και μόνο (Σχήμα 1D?. Κάτω πίνακα και το σχήμα S3.). Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να υποδεικνύει τη συμμετοχή άλλων προ-αποπτωτικών μορίων σε περιορισμένο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από υπερθερμία.

Μια

. αντίθεσης φάσης φωτογραφίες των PC-10 κύτταρα, δύο ημέρες μετά τη θεραπεία με υπερθερμία HDACIs τότε- για 6 ώρες. Η εικόνα έδειξε περιορισμένος αριθμός των ανακτηθέντων κυττάρων, καθώς και τις στρογγυλεμένες και πλωτών αποπτωτικών κυττάρων στις αποικίες προ-αγωγή με HDACIs τότε υπερθερμία.

Β

. Προεπεξεργασία των PC-10 κυττάρων με HDACIs αυξήθηκε σημαντικά υπερθερμία που προκαλείται από απόπτωση. Συγκριτικό cytograms δείχνουν χρώση Annexin V μετά υπερθερμία σε PC-10 κύτταρα προεπεξεργασμένα με Νικοτιναμίδιο (20 mM), Τριχοστατίνη Α (300 ηΜ) ή και τα δύο (άνω πάνελ). Περίληψη του μέσου όρου των αποτελεσμάτων αννεξίνη V συνάπτεται (κάτω πίνακας).

C

. Βαχ επίπεδα έκφρασης, με ανάλυση Western, σε PC-10 κύτταρα μετά από υπερθερμία (6 ώρες) προεπεξεργασία με διαφορετικές HDACIs. Κάτω ζώνη (18 kDa) δείχνει περικοπεί, ενεργό, Bax αυξήθηκε μόνο όταν τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό HDACIs και υπερθερμία.

D

. Ένας εκπρόσωπος Western Blot δείχνει την τροποποίηση της Βαχ για το συγκεκριμένο siRNA που χρησιμοποιείται. PC-10 κύτταρα είτε επιμολυσμένα με Bax-σι ή συν-σι δύο φορές. Η ακτίνη ανοσοστυπώματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (άνω πάνελ). Σημαντική μείωση της χρώσης αννεξίνης V μετά από υπερθερμία και HDACIs σε κύτταρα Bax KD σε σύγκριση με το μάρτυρα (ες) που δείχνει ότι Bax είναι το κλειδί προαποπτωτικής παίκτης στο διπλό απόπτωση θεραπεία που προκαλείται (κάτω πίνακας). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών πειραμάτων? μπαρ δηλώνουν SD? ** Δείχνει διαφορά από επιμόλυνσης έλεγχο σε Ρ & lt? 0,01

Η

Η επίδραση της υπερθερμίας στην έκφραση που σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεϊνών σε PC-10 κύτταρα

Για να διερευνηθεί η επίδραση της υπερθερμίας στην Bax και. μείζονα μόρια πρόσδεσης του, ορισμένες από τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση (Bax, Bcl-2, Κυ70 και Κυ80) μελετήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western σε ένα αντιπροσωπευτικό κυτταρική γραμμή, PC-10. Επειδή τα περισσότερα από τα γονίδια housekeeping αποκρίνονται σε υπερθερμία, έτσι χρώση Ponceau S χρησιμοποιήθηκε για να δείξει ο έλεγχος φόρτωσης. Υπερθερμία (42,5 ° C) για 1-9 ώρες επαγόμενη ποσοτικές μεταβολές σε Βαχ και Bcl-2 έκφραση, χωρίς παρατηρήσιμες μεταβολές στην Bcl-xL, Κυ70 και Κυ80 (Σχήμα. 2Α) έκφραση Bax ήταν ελαφρώς πάνω ρυθμισμένα ενώ Bcl-2 έκφραση ρυθμισμένα προς τα κάτω σε PC-10 κύτταρα. Ο λόγος Bax /Bcl-2 αυξάνεται σταδιακά μετά τη θεραπεία υπερθερμία (Σχήμα. 2Β, άνω φωτογραφία). Ανάλυση κηλίδας Western των Βαχ και Bcl-2, με διαφορετικές ποσότητες φόρτωση πρωτεΐνης (20 μg, 40 μg και 60 μg /λωρίδα), μετά από 0 ώρες και 6 θεραπεία h υπερθερμία επιβεβαίωσε αυξημένη Bax /Bc-L2 αναλογία (Σχήμα. 2Β , κάτω πίνακας) όπως επαληθεύεται denstimetrically (χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image Scion). Παρόμοιες παρατηρήσεις ελήφθησαν επίσης σε Η1299 κύτταρα (Σχήμα. S4). Ως εκ τούτου, θα είχε πολύ ενδιαφέρον να απαντήσει στο ερώτημα γιατί τα καρκινικά κύτταρα, με άγριου τύπου Bax, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω, δεν έδειξε εξέχοντα απόπτωση μετά από υπερθερμία, εκτός εάν προστίθενται DHACIs. Αισθητά, με ανοσοκυτταροχημεία Βαχ και Bcl-2 έδειξε κυρίως κυτοσολικό εντοπισμού στις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν (σχ. S5). Ως εκ τούτου, κινηθήκαμε για να μελετήσει Bax διμερισμό.

Μια

εκχυλίσματα κυττάρων .Whole παρασκευάστηκαν σε υποδεικνύεται περιόδους μετά από 42,5 ° C υπερθερμία και Bax, Κιι70, Ku80 και Bcl-2 αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση . Ελαφρά αύξηση του Bax μόνο μετά από 6 και 9 ώρες υπερθερμία και περιορισμένη Βαχ ενεργοποίηση μετά από 9 ώρες είναι παρατηρήσιμα. Υπερθερμία μειωμένη Bcl-2, ενώ Bcl-xL και Ku70 δεν είχε επηρεαστεί σαφώς. Αριθμού χαρακτηριστικών διεξήχθη με τον ίδιο κηλίδα έτσι ώστε κάθε πρωτεΐνη εργάστηκε ως έλεγχος φόρτωσης για το άλλο. Ένας εκπρόσωπος χρώση Ponceau S της μεμβράνης έδειξε να επαληθεύσει την εξομάλυνση επειδή τα περισσότερα από τα βασικά γονίδια σπίτι διατήρησης (π.χ.: ακτίνης και τουμπουλίνης) ανταποκρίνονται σε υπερθερμία.

Β

. Ποσοτικές αναλύσεις της έκφρασης πρωτεΐνης Bcl-2 και Bax κατά τη διάρκεια της υπερθερμίας. Κάθε μπάντα ποσοτικά densitimetrically. Ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο του λόγου Bax /Bcl-2 εμφανίζεται. Western ανάλυση με διαφορετικό ποσό φόρτωση του PC-10 κύτταρα προϊόντα λύσης μετά από 6 ώρες υπερθερμία επαληθεύει την μεταβολή του λόγου Ββχ /Bcl-2, ενώ η έκφραση Bcl-xL χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης από ίδια κηλίδα.

Η

Διαταραχή του Βαχ ετεροδιμερισμού από υπερθερμία

Σε άτονα κύτταρα, Bax ετεροδιμερίζεται με πολλές, αντι-αποπτωτικά, μόρια συνεργάτης? το ομοδιμερίζεται κάτω από την πίεση για να επάγει απόπτωση. Για να μελετηθεί η επίδραση της υπερθερμίας στην Βαχ διμερισμό, Βαχ ανοσοκαταβυθίστηκε από το προϊόν λύσης PC-10 κυττάρων μετά από 6 ώρες έκθεσης σε υπερθερμία. Figure.3A, δείχνει μειωμένη /Bcl-2 σχηματισμού ετεροδιμερούς Bax? το ετεροδιμερές Bax /Bcl-XL δεν επηρεάστηκε από υπερθερμία, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης της Western blot. Αξίζει να σημειωθεί, ήταν ότι η ποσότητα του Κιι70 συνδέεται με Βαχ αυξήθηκε με την αύξηση του χρόνου έκθεσης σε υπερθερμία. Η ανοσοκατακρήμνιση Ku70 επιβεβαίωσε ενισχυμένη Bax /Ku70 δεσμευτική μετά την έκθεση 6 ώρες σε υπερθερμία, ενώ Ku70 /Ku80 δεσμευτική έδειξε καμία αλλαγή (Σχήμα. 3Β). Παρόμοια παρατήρηση ανιχνεύθηκε όταν ρυθμιστικό CHAPS χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης (Σχήμα. S6)

Μια

. PC-10 κύτταρα επωάστηκαν στους 42,5 ° C για 0, 1, 3 και 6 ώρες. Bax συν-ανοσοκαταβυθίστηκε από ολικής πρωτεΐνης 2 mg και Bcl-XL, Bcl-2 και Κυ70 ανιχνεύθηκαν στο ανοσοκαταβυθιστικό με ανάλυση Western. Υπερθερμία επάγει Bax up-ρύθμιση και Bax αποσύνδεση από Bcl2 και ενισχύει συσχέτιση μεταξύ Bax και Ku70, ενώ καμία επίδραση σχετικά με τη σύνδεση Bax /Bcl-XL. Σε αντίθεση, Κυ70 συν-ανοσοκαταβυθίστηκε από παρόμοια προϊόντα λύσης κυττάρου. Βαχ και Κυ80 εμφανίζονται στην ανοσοκαταβυθιστικό.

Β

. Μετά από υπερθερμία, τα συνολικά επίπεδα Ku70 δεν έδειξε αλλαγές, αλλά η σχέση μεταξύ Ku70 και Bax ενισχύθηκε.

Η

Η υπερθερμία μειωμένη Ku70 ακετυλίωση στα κύτταρα PC-10

ακετυλίωση είτε K539 ή K542 στο Κιι70 C-τερματικό συνδετήρα είναι επαρκής για να εμποδίσει εντελώς Κιι70 καταστολή του Βαχ απόπτωσης που διαμεσολαβείται [14]. Επομένως, οι επιδράσεις της υπερθερμίας στην κατάσταση ακετυλίωσης Κιι70 ερευνήθηκαν με ανίχνευση του στυπώματος του Κιι70 ανοσοκαταβυθιστικό με antiacetylated λυσίνη Ab (Σχήμα 4Α).? Τα αποτελέσματα δείχνουν σημαντική μείωση στην Κιι70 ακετυλίωση μετά από έκθεση 6 ώρες σε υπερθερμία σε PC-10 κύτταρα. Επιπλέον, το ποσό των Κιι70 ανιχνευθεί, στο ακετυλιωμένο πρωτεΐνη ανοσοκαταβυθιστικό, μειωμένη σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα. 4Β).

A

. Κιι70 ανοσοκατακρημνίστηκε από ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (3 mg) από PC-10 κυττάρων μετά lysat υπερθερμία σε υποδεικνυόμενο χρόνο. Κιι70 και ακετυλ λυσίνη ανιχνεύθηκαν στο ανοσοκαταβυθιστικό. Σύνολο Ku70 δεν έδειξε καμία αλλαγή μετά από 6 ώρες υπερθερμία (σε put), αλλά ακετυλιώνεται Ku70 μειώθηκε.

Β

. Όλες οι ακετυλιωμένες πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν, κλασματοποιημένο, στυπώθηκαν και Κυ70 ανιχνεύθηκε στο στύπωμα. Αναφερόμενες ζώνες ακετυλιωμένο Ku70 έγινε πιο αμυδρά με την αύξηση του χρόνου υπερθερμία.

C

. Υπερθερμία ενισχυθεί τόσο Ku70 έκφρασης και Ku70 /SIRT-1 δεσμευτική. Sirt-1 ανοσοκαταβυθίστηκε από το PC-10 μετά υπερθερμία (0-6 ώρες). Blot δείχνει Sirt-1 ρύθμιση προς τα πάνω (σε put? Κατώτερο πάνελ) και την ενισχυμένη δέσμευση σε Κιι70, στην ίδια κηλίδα ρυθμιζόταν up-(άνω πλαίσια).

D

. Παρόμοια θεραπεία υπερθερμίας στην Η1299. Σύνολο Ku70 καταβυθίστηκε. Κιι70 και Sirt-1 ανιχνεύθηκαν στο ανοσοκαταβυθιστικό με ανάλυση Western. Sirt-1 /Κυ70 δέσμευση αυξήθηκε, υποδηλώνοντας μια ενισχυμένη αποακετυλίωση Κιι70 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα από υπερθερμία.

Η

Sirt-1 μεσολαβεί Κιι70 εξαρτώμενη κυτταροπροστασία από υπερθερμία

Είναι γνωστό ότι Κιι70 ακετυλίωση ειδικά αναστρέφεται από Sirt-1, μια ανθρώπινη δεακετυλάσης, υπό ήπιες στρες (όπως, θερμιδικός περιορισμός)? Κάτω από τέτοιες συνθήκες, Κυ70 απομονώνει περισσότερο Βαχ και προστατεύει τα κύτταρα από Bax απόπτωση που διαμεσολαβείται [19]. Για να διερευνηθεί αν η αναστολή ακετυλίωση, με την έκθεση σε υπερθερμία, οφείλεται στην ενεργοποίηση των Sirt-1, αναλύσαμε την έκφραση Sirt-1 μετά από έκθεση σε υπερθερμία (0-6 ώρες). Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι Sirt-1 έκφραση προκλήθηκε με υπερθερμία σε PC-10 κύτταρα (Σχήμα. 4C). Περαιτέρω, SIRT-1 ανοσοκαταβυθίστηκε από το PC-10 προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western blotting. Το ποσό των Κιι70 ανοσοκαταβυθίστηκαν με Sirt-1 ενισχύεται από την έκθεση σε υπερθερμία (σχήμα. 4C). Παρομοίως, η ποσότητα του SIRT-1 ανοσοκαταβυθίστηκε με Κιι70 ενισχύθηκε επίσης από την έκθεση σε υπερθερμία (0-6 h), επιβεβαιώνοντας ότι Κυ70 /Sirt-1 σύνδεση ενισχύθηκε από υπερθερμία σε PC-10 κύτταρα (Figure.4D). Έχουμε σκεφτεί ότι πάνω ρυθμισμένα Sirt-1, υπό συνθήκες υπερθερμία, δεσμεύεται σε Κιι70 και την αλλάζει από ακετυλιώνεται για να αποακετυλιωμένη μορφή, η οποία επιτρέπει Κιι70 να απομονώσει περισσότερο Βαχ, είτε απελευθερώνεται από Bcl2 ή πρόσφατα προκαλούμενη υπό υπερθερμία, να αναστέλλουν υπερθερμία που προκαλείται απόπτωση τελικά. Αυτά τα αποτελέσματα εξηγούν, τουλάχιστον εν μέρει, γιατί HDACIs, όπως ΝΑΜ, μπορεί να ενισχύσει την απόπτωση από υπερθερμία, πιθανώς με τη στόχευση μερικές HDACs σαν Sirt-1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εκτός αποακετυλασών ιστόνης συμπεριλαμβανομένης HDAC6 και Sirt-3, δεν έδειξε σημαντικές μεταβολές στο προφίλ έκφρασης μετά από έκθεση σε υπερθερμία (Σχήμα. S7). Για την επιβεβαίωση των ανωτέρω αποτελεσμάτων, κύτταρα Η1299 (με σχετικά υψηλή αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης, & gt? 50% όπως προσδιορίζεται με επιμόλυνση Beta gal) διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με άγριου τύπου Sirt-1 ή κυρίαρχο αρνητικό H363Y /Sirt-1. Υπερθερμία απόπτωση ήταν σημαντικά αυξημένη στις H363Y /Sirt-1-μορφομετατραπέντα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα μορφομετατροπείς (Σχήμα 5Α?. Ρ & lt? 0,01). Σημαντικά, οι άγριου τύπου Sirt-1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μικρή αλλά σημαντική (Ρ & lt? 0,05) προστασία από υπερθερμία στα εξεταζόμενα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα του εξωγενούς Sirt-1 είναι σημαντική αλλά περιορισμένη. Αυτό ήταν πιθανόν επειδή ο ενδογενής Sirt-1 είχε ενεργοποιηθεί το μεγαλύτερο μέρος της αυθόρμητης προστασία από hyerthermia όπως υποδεικνύεται από τα πειράματα περιεκτικότητα DNA (Σχήμα. 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από τη χρώση αννεξίνης V? H363Y /Sirt-1 επιμόλυνση σε κύτταρα Η1299 ενισχυθεί σημαντικά την απόπτωση μετά από έκθεση σε υπερθερμία σε σύγκριση με τον κενό φορέα επιμόλυνσης (Σχήμα. 5Β). Αξιοσημείωτα, ούτε άγριου τύπου Sirt-1 ούτε κυρίαρχο αρνητικό H363Y /Sirt-1 διαμόλυνσης έδειξαν μεμονωμένα αξιόλογες αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο.

A

. Sirt-1 εμπλέκεται στην κυτταροπροστασία από υπερθερμία. στυπώματος Western δείχνει το υπερ-εκφράζεται Sirt-1. FACS ανάλυση των κυττάρων Η1299 μετά από παροδική επιμόλυνση είτε με φαρδιά τύπου Sirt-1, κυρίαρχη αρνητική διάνυσμα Sirt-1 ή έκφραση FLAG. H363Y /SIRT-1 σημαντικά ενισχυμένη υπερθερμία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο, ενώ σε επίπεδο τύπου SIRT-1 δεν είχε καμία σημαντική επίδραση (άνω πάνελ).

Β

. Αποτελέσματα της αννεξίνης V χρώση Η1299 κυττάρων, από παρόμοιο πείραμα, επιβεβαιώνοντας ότι H363Y /Sirt-1-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο είναι απόπτωση (κάτω πλαίσιο).

Η

Στόχευση Κιι70 με siRNA ενισχυμένη κυτταρικό θάνατο υπερθερμία που προκαλείται

Για να εξεταστεί αν Κιι70 ήταν βασικός μεσολαβητής στο προαναφερθέν προστασία των κυττάρων από υπερθερμία, Κυ70 mRNA έγινε στόχος αλληλουχία ειδική Κιι70-siRNA-1, -2. Κιι70 mRNA ήταν δεκτικά Ku7-siRNA-1 (προσαρμοσμένο σχέδιο) και στη συνέχεια, το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μειωμένη (δόση? 200 ηΜ) σε PC-10 κύτταρα (Σχήμα 6Α).. Το siRNA ελέγχου (συν-siRNA-1) επιμόλυνση δεν επηρέασε Ku70 έκφρασης. Επιπλέον, Κυ70-siRNA-2 διαμόλυνση (βλέπε υλικά και μέθοδοι) επιβεβαιώθηκε ότι knockdown αποτελεσματικά Κιι70 (Σχήμα. 6Α, κάτω πίνακας). Στη συνέχεια, τόσο ο knockdown Κιι70 (KD) και τα κύτταρα μάρτυρες προκλήθηκαν με την έκθεση σε υπερθερμία. Οι Κιι70 KD PC-10 κύτταρα έδειξαν αυξημένη κυτταρικό θάνατο μετά την έκθεση υπερθερμία σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα. 6Β, Γ) σε σύγκριση με την συν-siRNA μορφομετατροπέα, δύο ημέρες μετά τη θεραπεία, όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση FACS (με τη χρήση Ku70- siRNA-1). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση των Η1299 κυττάρων (χρησιμοποιώντας Κιι70-siRNA-2 και cont-siRNA-2 (Σχήμα. S8)). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ku70 μεσολαβεί κυτταροπροστασία από την έκθεση υπερθερμία και πιθανόν παίζει καθοριστικό ρόλο στην υπερθερμία απόπτωση.

Μια

. Ένας εκπρόσωπος Western Blot δείχνει την τροποποίηση της Ku70 και για τις δύο siRNAs που χρησιμοποιείται. PC-10 κύτταρα και τα κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν με ένα siRNA δύο φορές. Η δυτική αποτέλεσμα δείχνει σημαντική γκρεμίζω από Ku70-siRNA-1, -2 σε σύγκριση με τον συν-siRNA-1, -2, αντίστοιχα. Η ακτίνη ανοσοστυπώματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις ανεξάρτητες φορές για αναπαραγωγιμότητα. PC-10 κύτταρα επιμολύνθηκαν με Κιι70-siRNA-1 ή cont-siRNA-1 (200 ηΜ) δύο φορές. 24 ώρες μετά την τελευταία επιμόλυνση, ίσους κυτταρικούς αριθμούς υποκαλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 24 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με υπερθερμία για υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, και στη συνέχεια εκ νέου καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες (Β) ή 48 ώρες (C) Τα κύτταρα αποκτήθηκαν με αναλυτή FACS για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικό ενός από, τουλάχιστον, τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε χρονικό σημείο (24 ώρες και 48 ώρες).

D

. Ku70 απαιτείται για κυτταροστατικών σύλληψη από υπερθερμία. Ιστογράμματα δείχνουν το διαφορικό συσσώρευση των κυτταρικών πληθυσμών σε G2 /M φάσεις σε κύτταρα με ή χωρίς Κιι70, μία και δύο ημέρες μετά από 0, 1, 3 και 6 της θεραπείας υπερθερμίας h. Οι πληθυσμοί σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, G1, S και G2 /M φάσεις, υπολογίστηκαν με τη χρήση του υπολογιστή μετά τη θεραπεία υπερθερμία. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

E

. Σημαντική αύξηση της χρώσης αννεξίνης V μετά από υπερθερμία στα κύτταρα Ku70 KD σε σύγκριση με τον έλεγχο που δείχνει ότι Ku70 αποσιώπηση με βάση το κυτταρικό θάνατο από υπερθερμία είναι απόπτωση. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών πειραμάτων? μπαρ δηλώνουν SD? * Υποδηλώνει διαφορά από επιμόλυνσης έλεγχο σε Ρ & lt?. 0.001

Η

Ku70 μεσολάβηση υπερθερμία που προκαλείται από G2 /M συσσώρευση

πειράματα Pulse σήμανση με βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdUrd? 20 μΜ) σε PC- 10 κύτταρα έδειξαν ότι η έκθεση σε υπερθερμία που προκαλείται από κυτταροστατικές αλλά όχι κυτταροτοξικό σύλληψης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η υπερθερμία που προκαλείται από διαταραχή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε 24 ώρες και 48 ώρες μετά από 1-6 h ανοιγμάτων σε υπερθερμία. G2 /M υποπληθυσμών αυξήθηκαν σημαντικά 24 ώρες μετά την έκθεση σε υπερθερμία και στη συνέχεια σταδιακά μειώθηκε σε κανονική υποπληθυσμών 48 ώρες μετά την έκθεση σε υπερθερμία (Σχήμα. 6D). Ταυτόχρονα, το ποσοστό των G1 και S φάση υποπληθυσμών μειώθηκαν σταδιακά από 24 ώρες μετά την έκθεση σε υπερθερμία και ανακτώνται 48 ώρες μετά την υπερθερμία αφαίρεση.

Β

.