Αφηρημένο

Ιστορικό

αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου (ΑΗΚ) είναι μια σπάνια ιάσιμη ασθένεια και αυξάνεται γρήγορα σε όλο τον κόσμο στη συχνότητα εμφάνισης. οισοφάγος Barret του (BE) και υψηλού βαθμού δυσπλασία (HGD) θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για διηθητικό αδενοκαρκίνωμα. Στην παρούσα μελέτη, αμερόληπτη παγκόσμια μεταβολικό προφίλ μέθοδοι εφαρμόστηκαν σε δείγματα ορού από ασθενείς με την ΑΗΚ, BE και HGD και υγιή άτομα, προκειμένου να εντοπιστούν μεταβολίτη βάση βιοδεικτών που σχετίζονται με τα πρώιμα στάδια της ΑΗΚ με στόχο τη βελτίωση πρόγνωση.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Ορός προφίλ του μεταβολίτη από ασθενείς με την ΑΗΚ (n = 67), ΒΕ (n = 3), HGD (n = 9) και υγιείς εθελοντές (n = 34) ήταν λαμβάνεται χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (LC-MS). Δώδεκα μεταβολίτες διέφερε σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) μεταξύ της ΑΗΚ ασθενών και υγιών μαρτύρων. Μια μερική ελαχίστων τετραγώνων διακριτική ανάλυση (PLS-DA) μοντέλο είχε καλή ακρίβεια με την περιοχή κάτω από το δέκτη λειτουργική χαρακτηριστική καμπύλη (AUROC) 0,82. Ωστόσο, όταν τα αποτελέσματα της LC-MS συνδυάστηκαν με 8 μεταβολίτες ανιχνεύεται με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό (NMR) σε προηγούμενη μελέτη, ο συνδυασμός NMR και MS ανιχνεύεται μεταβολίτες παρέχεται μια πολύ ανώτερη απόδοση, με AUROC = 0,95. Περαιτέρω, οι μέσες τιμές των 12 αυτών των μεταβολιτών κυμαινόταν σταθερά από υγιείς ελέγχους στα άτομα υψηλού κινδύνου (BE και οι ασθενείς HGD) και τα θέματα της ΑΗΚ. Altered μεταβολικές οδούς συμπεριλαμβανομένου ενός αριθμού οδών αμινοξέων και το μεταβολισμό της ενέργειας ταυτοποιήθηκαν με βάση την μεταβολή των επιπέδων των πολυάριθμων μεταβολιτών.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Μεταβολικό προφίλ που προέρχονται από τον συνδυασμό των LC-MS και NMR μεθόδους διακρίνουν εύκολα τους ασθενείς ΑΗΚ και ενδεχομένως υπόσχονται σημαντικές διαδρομές για την κατανόηση της καρκινογένεσης και την ανίχνευση του καρκίνου. Οι διαφορές στις μεταβολικές προφίλ μεταξύ των ατόμων υψηλού κινδύνου και η ΑΗΚ αναφέρει τη δυνατότητα προσδιορισμού των ασθενών που κινδυνεύουν πολύ νωρίτερα για την ανάπτυξη του καρκίνου

Παράθεση:. Zhang J, Bowers J, Liu L, Wei S , Γκόβντα GAN, Χάμουντ Ζ, et al. (2012) καρκίνο του οισοφάγου μεταβολίτης Biomarkers Εντοπίστηκε από LC-MS και Μέθοδοι NMR. PLoS ONE 7 (1): e30181. doi: 10.1371 /journal.pone.0030181

Επιμέλεια: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Γαλλία

Ελήφθη: 22, Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 12 Δεκ 2011? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο Purdue Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο και το Κέντρο Ογκολογικό Επιστημών στο Discovery Park στο Purdue. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του οισοφάγου είναι μια θανατηφόρα ασθένεια με περίπου 16.640 νέες περιπτώσεις και 14.500 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2010 [1]. Κατά το έτος 2000 οι αντίστοιχοι αριθμοί ήταν 12.300 και 12.100, αντίστοιχα [2], οι οποίες δείχνουν μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης. Από τους δύο τύπους καρκίνου, αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου (ΑΗΚ) και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, η ΑΗΚ είναι πιο διαδεδομένη στις Ηνωμένες Πολιτείες. Αν και οι παράγοντες κινδύνου που συνδέονται με την ΑΗΚ δεν έχουν ακόμη κατανοηθεί μέχρι σήμερα, του οισοφάγου Barrett (BE) θεωρείται ότι είναι ένας παράγοντας για την καρκινογένεση του οισοφάγου [3]. Επιπλέον, υψηλού βαθμού δυσπλασία (HGD) θεωρείται ως μια άμεση πρόδρομος σε διηθητικό αδενοκαρκίνωμα [4]. Ωστόσο, καμία παρέμβαση υπάρχει σήμερα ότι μπορεί να αποτρέψει την εξέλιξη της ΒΕ ή HGD στην ΑΗΚ [5]. Οι παραδοσιακές μέθοδοι για τη διάγνωση του καρκίνου του οισοφάγου, περιλαμβανομένων ενδοσκόπηση και να τα καταπιούν βάριο, υποφέρουν από κακή εξειδίκευση και ευαισθησία, η οποία συνήθως έχει ως αποτέλεσμα την ανίχνευση της νόσου μόνο σε προχωρημένο στάδιο [6], [7], [8], [9]. Εναλλακτικά, υπάρχει η ελπίδα ότι ένα ορισμένο υποσύνολο των μοριακών βιοδεικτών μπορεί να χαρακτηρίσει το στάδιο της νόσου και να βοηθήσει την εξατομίκευση της θεραπείας [10]. Στο μοριακό επίπεδο, την καρκινογένεση του οισοφάγου πιστεύεται ότι είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλαπλά γενετικές ανωμαλίες και περιβαλλοντικών παραγόντων. Πολυάριθμες μελέτες αναφέρουν συγκεκριμένες μεταβολές σε πρωτεΐνες, γονίδια και μεταβολικές οδούς σε ΑΗΚ που μπορεί να είναι χρήσιμη για να βοηθήσει στη διάγνωση, πρόγνωση και θεραπεία του καρκίνου του οισοφάγου [11], [12], [13], [14]. μελέτες μικροσυστοιχιών έχουν επίσης επικεντρωθεί ανακάλυψη νέων δεικτών με βάση τη γενετική σύνθεση επιμέρους όγκων [15]. Ωστόσο, αξιόπιστες δείκτες, ιδιαίτερα σε ένα πρώιμο και πιθανώς θεραπευτική φάση, είναι ακόμη σε μεγάλη ζήτηση.

Μεταβολομική, επίσης γνωστό ως μεταβολικό προφίλ και μεταβονομικής, είναι μια ταχέως αναπτυσσόμενη τομέα στη βιολογία συστημάτων και προσφέρει μια ισχυρή και πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τον εντοπισμό βιοδείκτες που σχετίζονται με τον καρκίνο και άλλες ασθένειες. Μεταβολομική επικεντρώνεται στην εξαγωγή των συγκεντρώσεων και των ροών των μεταβολιτών χαμηλού μοριακού βάρους (& lt? ~ 1 kDa) σε Biofluids ή ιστό, τα οποία παρέχουν λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τα βιολογικά συστήματα και την τρέχουσα κατάστασή τους [16], [17]. Η φασματομετρία μάζας (MS) και μαγνητικού συντονισμού φασματοσκοπία πυρηνικού (NMR) είναι οι δύο πιο ισχυρά και χρησιμοποιούνται συνήθως αναλυτικών μεθόδων για μεταβολική αποτυπωμάτων [17], [18]. Οι δύο μέθοδοι είναι συμπληρωματικές? ενώ η MS είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη, NMR είναι εξαιρετικά ποσοτική και να αναπαραχθούν. Αξιοποίηση των δύο μεθόδων MS και NMR οδηγεί στην ανάλυση ρουτίνας πάνω από 1000 μεταβολιτών.

Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών μεταβολισμική έχουν αναφερθεί για την ανίχνευση διαφόρων μορφών καρκίνου [19], [20], [21], [22 ], [23]. Ωστόσο, οι μελέτες που επικεντρώνονται στην ΑΗΚ εξακολουθούν να είναι σχετικά μικρό σε αριθμό. Πρόσφατα, δύο έγγραφα που αναφέρονται στην ανάλυση των μεταβολιτών ιστού χρησιμοποιώντας μαγεία γωνία περιστροφής (MAS) NMR και αέρια χρωματογραφία (GC) MS καθένα σε συνδυασμό με στατιστικές μεθόδους πολλών μεταβλητών [24], [25]. Και τα δύο έργα ανέφεραν μια σειρά από στατιστικά σημαντική διακριτικά μεταβολίτες. Μια άλλη μελέτη

1 NMR διερευνηθεί ανθρώπινο πλάσμα και εντοπίζονται διαφοροποιήσεις στις διάφορες μεταβολίτη συγκεντρώσεις που σχετίζονται με την ΑΗΚ, που διέφεραν μεταξύ των εθνοτικών ομάδων [26]. Οι προσπάθειες στο εργαστήριό μας έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη εργαλείων μεταβολισμική και οι υποψήφιοι βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση της ΑΗΚ και για τον εντοπισμό των ασθενών που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο ανάπτυξης της ΑΗΚ. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα μεταβολισμική με βάση τις έρευνες της ΑΗΚ με τη χρήση φασματοσκοπίας

1 NMR και έδειξε ότι οκτώ μεταβολίτες ορού διαφοροποιούνται ΑΗΚ από υγιείς ελέγχους [27]. Έχουμε στοχευμένες επίσης έναν αριθμό νουκλεοσιδίων σε ορό χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία-τριπλό τετραπλό (LC-QQQ) MS και έδειξε πολύ σημαντικές διακυμάνσεις σε έναν αριθμό φυσιολογικών και μεθυλιωμένων νουκλεοσιδίων σε EAC [28]. Με στόχο την ενίσχυση της ευαισθησίας και της ειδικότητας της κατάταξης των ασθενών, καθώς και τον εντοπισμό των ατόμων που διατρέχουν κίνδυνο ανάπτυξης του καρκίνου, σε αυτή τη μελέτη θα εφαρμοστεί συνολική προσέγγιση μεταβολικό προφίλ με τα δείγματα ορού από την ΑΗΚ, BE και οι ασθενείς HGD και υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιώντας εξαιρετικά ευαίσθητο και επιλυθεί φασματομετρία μάζας χρόνου-πτήσης σε συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία (LC-TOF) MS. Μεταβολικό προφίλ αναλύθηκαν ξεχωριστά και σε συνδυασμό με προηγουμένως προέρχεται δείκτες μεταβολίτη χρησιμοποιώντας μεθόδους NMR [27]. Αξιολογήσαμε το συνδυασμό των δεδομένων NMR και MS ως προς τις επιδόσεις τους στην ταξινόμηση ΑΗΚ ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, σε σύγκριση με τις επιδόσεις του, είτε MS ή NMR δεδομένα μόνο. Εξετάστηκε η ικανότητα των μεταβολικών προφίλ να διακρίνουν τα άτομα υψηλού κινδύνου (BE και οι ασθενείς HGD) από την ΑΗΚ, καθώς και υγιείς μάρτυρες. Μπορούμε επίσης να εντοπίζονται μια σειρά από μεταβολίτες που ενήργησε ως trending δείκτες, το γεγονός ότι τα μέσα επίπεδα τους αυξάνεται /μειώνεται συνεχώς από υγιείς ελέγχους σε άτομα υψηλού κινδύνου και στη συνέχεια ΑΗΚ ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικές ουσίες

Το οξείδιο του δευτερίου (99,9% D) αγοράστηκε από την Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, ΜΑ). Trimethylsilylpropionic οξύ-d

4 άλας νατρίου (TSP), τριδεκανοϊκό οξύ, χλωροφαινυλαλανίνη, γαλακτικό οξύ, βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, μεθειονίνη, καρνιτίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη, μυριστικό οξύ, μαργαρικό οξύ, λινολενικό οξύ, λινελαϊκό οξύ και πυρογλουταμικού οξέος αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (αναλυτικού βαθμού, St. Louis, ΜΟ). 5-υδροξυτρυπτοφάνη αγοράστηκε από την Alfa-Aesar (αναλυτικού βαθμού, Ward Hill, ΜΑ). HPLC-grade μεθανόλη και οξικό οξύ αγοράστηκαν από την Fisher Scientific (Pittsburgh, ΡΑ). Απιονισμένο νερό ελήφθη από ένα EASYpure σύστημα καθαρισμού του νερού ΙΙ UV (Barnstead International, Dubuque, ΙΑ).

συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων ορού

Η νηστεία δείγματα αίματος από ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένη ΑΗΚ (n = 67), HGD (n = 9) και ΒΕ (n = 3) συλλέχθηκαν στο Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). Οι λεπτομερείς κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά της ΑΗΚ ασθενείς που περιγράφεται στο προηγούμενο έγγραφό μας [27], καθώς και περίληψη φαίνεται στον Πίνακα S1. Χρησιμοποιήσαμε 68 ΑΗΚ, δείγματα 11 HGD και 5 να είναι στην προηγούμενη μελέτη NMR. Ωστόσο, λόγω των περιορισμένων ποσοτήτων μερικά δείγματα, απομακρύναμε 1 ΑΗΚ, 2 HGD και 2, τα δείγματα για τα πειράματα LC-MS και περαιτέρω ανάλυση σε αυτό το έργο? τα αντίστοιχα δεδομένα NMR ήταν εξαιρούνται επίσης από την συνδυασμένη ανάλυση και συζήτηση. Τα δείγματα αίματος από υγιείς εθελοντές (n = 34) ελήφθησαν υπό συνθήκες νηστείας. Κάθε δείγμα αίματος αφήνεται να πήξει για 45 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 rpm για 10 λεπτά. Ο ορός συλλέχθηκε, κλασματοποιήθηκε σε ένα ξεχωριστό φιαλίδιο, κατεψυγμένα, και αποστέλλονται σε ξηρό πάγο στο Πανεπιστήμιο Purdue (West Lafayette, ΙΝ), όπου είχαν αποθηκευθεί στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Όλα τα δείγματα που συλλέγονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από Indiana University School of Medicine και το Πανεπιστήμιο Purdue Institutional Review Boards. Όλα τα άτομα που περιλαμβάνονται στη μελέτη που προβλέπεται γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες.

Η προετοιμασία των δειγμάτων και την απόκτηση δεδομένων

Για την ανάλυση LC-MS, κατεψυγμένα δείγματα ορού αποψύχθηκαν, και η πρωτεΐνη καταβυθίστηκε με ανάμιξη 100 μL ορού και 200 ​​μL ψυχρή μεθανόλη. Δύο εσωτερικά πρότυπα, δεκατριανοϊκό οξύ και χλωροφαινυλαλανίνη συμπεριλήφθηκαν επίσης στην παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της εκχύλισης. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 13.200 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο διάλυμα που λαμβάνεται μετά την απομάκρυνση της πρωτεΐνης ξηραίνεται υπό κενό και το ληφθέν υπόλειμμα ανασυστάθηκε σε 15 μL μεθανόλης /νερού (1:01) διάλυμα. Το προκύπτον διάλυμα και πάλι σε φυγοκέντρηση σε 13,200 rpm για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα σωματίδια, εάν υπάρχουν, και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα φιαλίδιο LC. Ξεχωριστά, ένα συγκεντρωμένο δείγμα ελήφθη με ανάμιξη μαζί 20 μί από κάθε ένα από 20 δείγματα ανθρώπινου ορού που επιλέγονται τυχαία από όλα τα δείγματα, και οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία όπως παραπάνω. Αυτό ενοποιημένο δείγμα, που αναφέρεται ως το δείγμα μήτρα ελέγχου ποιότητας (QC), υποβλήθηκε σε ανάλυση περιοδικά μεταξύ κάθε 10 δείγματα. δείγμα δεδομένων QC υπηρέτησε επίσης ως τεχνική επαναλήψεις σε όλα τα δεδομένα που να αξιολογούν την αναπαραγωγιμότητα της διαδικασίας. Η ανάλυση LC-MS εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Agilent LC-QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) που αποτελείται από ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας SL Agilent 1200 συζευχθεί απευθείας με ένα φασματόμετρο μάζας Agilent 6520 χρόνο-πτήσης. Ένα κλάσμα 3 μL ανασυσταθέντος δείγμα εγχύθηκε επάνω σε ένα 2,1 Χ 50 mm Agilent Zorbax Extend-C18 1,8 στήλη μm σωματιδίων με ένα Agilent Zorbax SB-C8 3.5 μπι προστήλη σωματιδίων 2,1 × 30 mm, το οποίο ήταν και οι δύο θερμαίνεται στους 60 ° C. μεταβολίτες ορού βαθμίδας εκλούστηκαν σε 600 μL /λεπτό χρησιμοποιώντας κινητή φάση Α: 0.2% οξικό οξύ σε νερό και κινητή φάση Β: 0,2% οξικό οξύ σε μεθανόλη (2% έως 98% Β σε 13 min, 98% Β για 6 λεπτά ). Ηλεκτροψεκασμού ιονισμού (ESI) χρησιμοποιήθηκε σε θετικό τρόπο. Το τριχοειδές διεπαφή MS διατηρήθηκε στους 325 ° C, με ροή αερίου περίβλημα 9 λίτρα /λεπτό. Η τάση σπρέι για τη θετική ένεση ιόντων ήταν 4,0 kV. Ο αναλυτής μάζας σαρώθηκε σε ένα εύρος 50-1000

m

/

z

. λογισμικού QTOF Απόκτηση (B.02.01) Agilent MassHunter Workstation LC-TOF και χρησιμοποιήθηκε για την αυτόματη ανίχνευση αιχμής και μάζας αποσυνέλιξη φάσματος.

Οι λεπτομερείς διαδικασίες για την προετοιμασία του δείγματος και τα πειράματα NMR έγιναν πρόσφατα δημοσιευμένη αλλού [27]. Εν συντομία, κατεψυγμένα δείγματα ορού αποψύχθηκαν, και 200 ​​μL αναμίχθηκε με 350 μι D

2O. Τα προκύπτοντα διαλύματα μεταφέρθηκαν σε σωλήνες NMR 5 mm. Ένα διάλυμα 60 μι TSP (0.12 mg /mL) σε σφραγισμένο τριχοειδή χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο, το οποίο ενήργησε ως αναφορά χημικής μετατόπισης (δ = 0,00). Όλα

πειράματα 1Η NMR διεξήχθησαν στους 25 ° C σε ένα DRX-500 φασματόμετρο Bruker εφοδιασμένο με μία τριπλή αντήχηση

1 Η αντίστροφη ανιχνευτής με τριπλό άξονα κλίσεις μαγνητικού πεδίου.

φάσματα 1Η NMR αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας την τυπική ακολουθία παλμών μονοδιάστατη CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) με προκορεσμός σήμα νερό. Κάθε σύνολο δεδομένων ήταν κατά μέσο όρο πάνω από 64 μεταβατικά χρησιμοποιώντας 16 Κ σημεία στο πεδίο του χρόνου. Τα δεδομένα Fourier μετατραπεί μετά από πολλαπλασιασμό με μια εκθετική συνάρτηση παράθυρο με μια γραμμή διεύρυνση του 1 Hz, και τα φάσματα ήταν φάσης και την έναρξη διορθωθεί χρησιμοποιώντας το λογισμικό topspin Bruker (έκδοση 3.0).

Η ανάλυση των δεδομένων

LC-MS υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό MassHunter ποιοτική ανάλυση της Agilent (έκδοση B.03.01) για ένωση ταυτοποίηση. Ο κατάλογος των εντάσεων ιόντων για κάθε ανιχνεύθηκε κορυφή δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας δείκτη ένα χρόνο κατακράτησης (RT) και δεδομένα m /z ως αναγνωριστικά για κάθε ιόν. Agilent MassHunter Workstation Μαζικής Profiler Professional λογισμικό (έκδοση B.02.00) στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την ένωση κορυφή ευθυγράμμιση. Ένα φίλτρο ορίστηκε για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε σήματα μεταβολίτη που είχαν λείπει κορυφές (ένταση ιόν = 1) σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων σε κάθε ομάδα. Κορυφές από τα εσωτερικά πρότυπα και αφαιρείται. Τέλος, ο τύπος βάσης δεδομένων Agilent (Agilent, 2010) χρησιμοποιήθηκε για την ένωση ταυτοποίησης που ταιριάζουν με το ακριβές φάσμα μάζας σε μια βάση δεδομένων των ενώσεων μεταβολίτη. Αταίριαστα Φοιτητών

t-test

ανάλυση των δεδομένων έγινε για την αξιολόγηση των διαφορών των ανιχνεύθηκε ένωσης εντάσεις μεταξύ της ΑΗΚ, BE και τα δείγματα HGD και υγιείς μάρτυρες. Μεταβολίτες με χαμηλή

p-τιμές

(& lt? 0.05) επιλέχθηκαν ως πιθανοί υποψήφιοι βιοδεικτών και επαληθεύονται από τα φάσματα μάζας και RTs των αυθεντικών εμπορικών ενώσεων τρέξει ξεχωριστά. Η πολλαπλή μεταβολή (FC) για κάθε μεταβολίτη ήταν υπολογίζονται για τον προσδιορισμό παραλλαγή του μεταβολίτη μεταξύ των ομάδων.

NMR φασματικές περιοχές είχαν ομαδοποιημένων σε 4 Κ κουβάδες ίσο πλάτος (1,5 Hz) για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων που οφείλονται σε τυχόν διακυμάνσεις των χημικών μετατοπίσεις που προκύπτουν από το pH ή ιόντων παραλλαγές συγκέντρωση. Κάθε φάσμα ήταν ευθυγραμμισμένα στην κορυφή μεθυλίου της αλανίνης σε 1,48 ppm, και κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας το ενσωματωμένο σήμα TSP. Φασματικές περιοχές από 0,3 έως 10,0 ppm χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση μετά τη διαγραφή των σημάτων νερό και ουρίας (4,5 έως 6,0 ppm). Μονοπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας το αταίριαστο του Student

t-test

να εντοπίσει σημαντικά διαφορετική φασματική κάδους μεταξύ ΑΗΚ, BE και οι ασθενείς HGD και υγιείς μάρτυρες. Κάδους που έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων ασθενών /ελέγχει ομάδες στη συνέχεια αποδίδονται στις αντίστοιχες μεταβολίτες συγκρίνοντας χημικές μετατοπίσεις και πολλαπλότητες των κορυφών με τη βιβλιογραφία ή σε απευθείας σύνδεση βάσεις δεδομένων [29], [30], [31]. Οι χαρακτηριστικές φασματικές περιοχές για κάθε μεταβολίτη ήταν ολοκληρωμένη, και

υπολογίστηκαν σ

-τιμές και διπλώστε τις αλλαγές μεταξύ των διαφορετικών ομάδων.

Τα δεδομένα MS /NMR των επιλεγμένων στατιστικά σημαντική μεταβολίτες (με

σ

& lt? 0,05) εισήχθησαν σε Matlab (R2008a, Mathworks, Natick, ΜΑ) με εγκατεστημένη μια εργαλειοθήκη PLS (έκδοση 4.1, ιδιοδιάνυσμα Research, Inc., Γουενάτσι) για PLS-DA αναλύσεις. Η μήτρα Χ, που αποτελείται από τα φασματικά δεδομένα MS /NMR, ήταν autoscaled πριν από όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Ανάλογα με την ομάδα, το κάθε υποκείμενο τοποθετήθηκε ένα «0» (δηλαδή ασθενών) και «1», (δηλαδή, υγιή έλεγχος) για να χρησιμεύσει ως (μονοδιάστατη) μήτρα Υ. Αφήστε-one-out cross επικύρωση (CV) επιλέχθηκε, καθώς και τον αριθμό των παρατηρούμενων μεταβλητών (LVs) επιλέχθηκε σύμφωνα με την ελάχιστη ρίζα του μέσου τετραγωνικού σφάλματος της διαδικασίας CV. Οι προβλέψεις έγιναν οπτικά χρησιμοποιώντας ένα Υ-προέβλεψε διάγραμμα διασποράς με μια τιμή αποκοπής επιλέγεται για να ελαχιστοποιηθούν τα λάθη στη σύνθεση των μελών της κατηγορίας. Το R στατιστικό πακέτο (έκδοση 2.8.0) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία λειτουργικών χαρακτηριστικών δέκτη (ROC) καμπύλη, υπολογίζει και συγκρίνει την ευαισθησία, την ειδικότητα και την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC).

Αποτελέσματα

το φάσμα LC-MS για κάθε δείγμα ορού αποτελούνταν από περισσότερα από 5000 χαρακτηριστικά των οποίων σχεδόν 1.400 κορυφές αποδόθηκαν σε μεταβολίτες που χρησιμοποιούν τη βάση δεδομένων Agilent. Οι κορυφές από τα φάσματα που έλειπαν σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων από κάθε ομάδα παραλήφθηκαν από περαιτέρω ανάλυση. Η χρήση αυτού του φίλτρου και τη χημική βιβλιοθήκη Agilent οδήγησε σε ένα σύνολο περίπου 200 αταξινόμητους μεταβολίτες πιο κοινή σε όλες τις ομάδες. Περαιτέρω, για τον εντοπισμό συγκεκριμένων μεταβολιτών που συσχετίζονταν καλύτερα με τις διαφορές στην βιολογική κατάσταση για τις διάφορες συγκρίσεις, η βιβλιοθήκη-γνωστούς μεταβολίτες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονοπαραγοντική ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 40 μεταβολίτες ποικίλλει σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) μεταξύ είτε της ΑΗΚ και των υγιών μαρτύρων, ΑΗΚ και οι ασθενείς υψηλού κινδύνου (BE και ασθενείς HGD), ή σε ασθενείς υψηλού κινδύνου και των υγιών μαρτύρων. Δεκατρείς από αυτούς τους μεταβολίτες ήταν δυνατό να επαληθευτεί από τα φάσματα μάζας και τους χρόνους κατακράτησης των αυθεντικών εμπορικών ενώσεων. Πίνακας S2 εμφανίζει τη λίστα των εξακριβωμένων μεταβολιτών από LC-MS μαζί με τύπους, οι μάζες τους και οι χρόνοι κατακράτησης. Ομοίως, όπως φαίνεται στον πίνακα S3, δεκαπέντε ασθενή-class διαφοροποίηση των μεταβολιτών με χαμηλή

σ

-τιμές (

σ

& lt? 0,05) που λαμβάνεται με την ενσωμάτωση των σχετικών NMR κορυφές επιβεβαιώθηκαν με το ταίριασμα η παρατηρούμενη χημικές μετατοπίσεις και πολλαπλότητες με το παρελθόν αναφερθεί δεδομένων [29], [30], [31]

Η σύνοψη των υποψηφίων μεταβολίτη βιοδεικτών από LC-MS και NMR με τους

σ

. – οι αξίες και διπλώστε τις αλλαγές φαίνονται στον πίνακα 1. ANOVA πραγματοποιήθηκε επίσης, με τα αποτελέσματα που παραλληλίζεται στενά εκείνων που προέρχονται από το

t-test

(Πίνακας S4). Ωστόσο, δεδομένου ότι ήμασταν ενδιαφέρονται για τον προσδιορισμό επιμέρους δείκτες που διακρίνονται κάθε μία από τις τρεις ομάδες ασθενών ξεχωριστά, χρησιμοποιήσαμε τις

t-test

δεδομένα για τον προσδιορισμό των δεικτών για το μοντέλο του κτιρίου. Η ευαισθησία, η ειδικότητα και οι τιμές AUROC από τα μοντέλα PLS-DA κάθε σύγκρισης παρατίθενται στον Πίνακα 2. Σύγκριση της MS και NMR δεδομένα χρησιμοποιώντας το

t-test

, ξεχωριστά, δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές λόγω φύλου, την ηλικία ή το στάδιο του καρκίνου (

σ

& gt? 0,05) μεταξύ της ΑΗΚ και των ελέγχων (Πίνακας S5)

Η

Συγκρίνοντας το μεταβολικό προφίλ μεταξύ ΑΗΚ ασθενών και υγιών μαρτύρων

Όπως φαίνεται στον πίνακα 1, οι υποψήφιοι δείκτης δώδεκα μεταβολίτης που ανιχνεύθηκε με LC-MS διαφοροποιούνται EAC ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, και η ταυτότητά τους επιβεβαιώθηκε με αυθεντικά ενώσεις. Σχήμα S1 δείχνει τα οικόπεδα box-και-μουστακιού για τις εντάσεις κορυφής των 12 διαφοροποίησης των υποψηφίων βιοδεικτών. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και το Σχήμα S1, τα επίπεδα του γαλακτικού οξέος, καρνιτίνη και μαργαρικό οξύ ήταν υψηλότερες, και εκείνων της βαλίνη, λευκίνη /ισολευκίνη (αυτά τα δομικά ισομερή δεν μπορούσε να διαχωριστεί με την παρούσα μέθοδο LC), μεθειονίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη , 5-υδροξυτρυπτοφάνη, μυριστικό οξύ, λινολενικό οξύ και το λινελαϊκό οξύ ήταν χαμηλότερες στην ΑΗΚ ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες.

Οι υποψήφιοι δείκτη από

ανάλυση 1Η NMR έχουν αναφερθεί σε προηγούμενη μελέτη μας [27]. Εν συντομία, ένα σύνολο 8 μεταβολιτών, συμπεριλαμβανομένων των β-υδροξυβουτυρικό, λυσίνη, γλουταμίνη, κιτρικό, κρεατινίνη, γαλακτικό, γλυκόζη και ένα άγνωστο μόριο ήταν στατιστικά σημαντικές (

ρ

& lt? 0,05), και τα υψηλότερα επίπεδα του καθενός από αυτοί οι μεταβολίτες στα δείγματα ΑΗΚ παρατηρήθηκαν (Πίνακας 1).

το σχήμα 1 δείχνει τη σύγκριση των επιδόσεων των 3 προφίλ του μεταβολισμού μεταξύ της ΑΗΚ ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Ένα μοντέλο PLS-DA χρησιμοποιώντας το δώδεκα LC-MS προέρχεται μεταβολιτών (και αφήστε-one-out cross αποτίμησης) παρέχεται 77% ευαισθησία και 86% ειδικότητα με μια AUROC 0,82. Παρόμοια ανάλυση με τη χρήση των οκτώ NMR προέρχονται μεταβολίτες παρέχεται 82% ευαισθησία και 88% ειδικότητα με AUROC του 0,86. Ωστόσο, όταν αναλύθηκαν τα δεδομένα μεταβολίτη συνδυάζοντας το 12 LC-MS και τα 8 NMR ανιχνεύονται μεταβολίτες, το μοντέλο παρέχεται πολύ ανώτερες επιδόσεις τόσο με ευαισθησία και ειδικότητα 91%, και μια AUROC 0,95.

(Α ) αριστερά, αποτέλεσμα του μοντέλου PLS-DA, χρησιμοποιώντας 12 δείκτες μεταβολίτη από LC-MS αναλύσεις? μέση, καμπύλη ROC χρησιμοποιώντας τις προβλεπόμενες τιμές cross-επικυρωμένη τάξη (AUROC = 0,82)? πρόβλεψη δεξιά, PLS-DA για την ΒΕ και δείγματα HGD από το μοντέλο LC-MS σύγκριση ΑΗΚ και υγιείς μάρτυρες. (Β) Το ίδιο με (Α) εκτός του ότι χρησιμοποιούνται 8 δείκτες μεταβολίτη από αναλύσεις NMR, (AUROC = 0,86)? (Γ) Το ίδιο με (Α), εκτός από τη χρήση του συνδυασμού LC-MS και NMR ανιχνευθεί δείκτες μεταβολίτη, (AUROC = 0,95).

Η

Για να αξιολογηθεί η ΒΕ και δείγματα HGD, οι ίδιες PLS-DA μοντέλο εφαρμόστηκε, και το αποτέλεσμα είναι επίσης φαίνεται στο Σχήμα 1 (στα δεξιά). BE δείγματα έδωσε ένα μικτό αποτέλεσμα, και όχι αυτοπεποίθηση συμπέρασμα θα μπορούσε να γίνει λόγω του μικρού αριθμού των δειγμάτων. Ωστόσο, τα περισσότερα από τα δείγματα HGD είχαν προβλεφθεί ως ΑΗΚ σε αυτή την περίπτωση. Το μοντέλο PLS-DA βασίζεται σε NMR ανιχνεύονται μεταβολίτες, και το μοντέλο που βασίζεται στο συνδυασμό LC-MS και NMR ανιχνεύονται οι μεταβολίτες και οι δύο έδειξαν ότι 7 από τους 9 ασθενείς HGD υποδείχθηκαν ως παρόμοια με τα δείγματα της ΑΗΚ.

Συγκρίνοντας το μεταβολικό προφίλ της ΑΗΚ και των ασθενών υψηλού κινδύνου

Τα στοιχεία για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου (BE και οι ασθενείς HGD) συνδυάστηκαν για την ανάλυση λόγω του μικρού αριθμού του δείγματος τους. Μονοπαραγοντική ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι το 7 LC-MS και NMR 8 ανιχνεύονται μεταβολίτες ποικίλει σημαντικά μεταξύ ΑΗΚ και τους ασθενείς υψηλού κινδύνου, η οποία μαζί με το

p-τιμές

και διπλώστε οι αλλαγές φαίνονται στον Πίνακα 1.

PLS-DA μοντέλα στη συνέχεια να κατασκευαστεί χρησιμοποιώντας την LC-MS και NMR προέρχονται σήματα μεταβολίτη, χωριστά και σε συνδυασμό, για να ελεγχθεί η ακρίβεια ταξινόμησης για τις δύο ομάδες ασθενών, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. η LC -MS προέρχονται μεταβολίτες παρέχεται ευαισθησία και ειδικότητα 83% και 80%, αντίστοιχα, με μια AUROC του 0,87, και NMR προέρχονται μεταβολιτών παρέχονται τόσο ευαισθησία και ειδικότητα 77% με μια AUROC 0,72. Όταν αναλύθηκαν τα δεδομένα συνδυάζοντας τα LC-MS και NMR προέρχονται μεταβολίτες, μια ευαισθησία και ειδικότητα 67% και 97% ελήφθησαν, αντίστοιχα, με μια AUROC 0,82. Εδώ, αν και οι επιδόσεις του μοντέλου από τη συνδυασμένη δεδομένα ήταν ελαφρώς καλύτερη από ότι από τα δεδομένα NMR και μόνο, το μοντέλο που προέρχεται από την LC-MS ανιχνεύεται μεταβολίτες παρουσίασαν τις καλύτερες επιδόσεις. Κατά τις δοκιμές τους ελέγχους, χρησιμοποιώντας τα ίδια μοντέλα PLS-DA προέρχεται από το ανιχνεύεται LC-MS, NMR ανιχνεύθηκε και σε συνδυασμό μεταβολίτες, 22, 12 και 22 από 34 μάρτυρες ήταν πάνω από την τιμή αποκοπής, αντίστοιχα, και ως εκ τούτου κατατάσσονται ως μη παρόμοια με την ΑΗΚ ασθενείς

(Α) αριστερά, αποτέλεσμα του μοντέλου PLS-DA χρησιμοποιώντας 7 δείκτες μεταβολίτη από LC-MS αναλύσεις.? μέση, καμπύλη ROC χρησιμοποιώντας τις προβλεπόμενες τιμές cross-επικυρωμένη τάξη (AUROC = 0,87)? δεξιά, πρόβλεψη PLS-DA για τους υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιώντας το μοντέλο που αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας LC-MS μεταβολίτες συγκρίνοντας ασθενείς ΑΗΚ και υψηλού κινδύνου. (Β) Το ίδιο με (Α) εκτός του ότι χρησιμοποιούνται τα 8 δείκτες μεταβολίτη από αναλύσεις NMR, (AUROC = 0,72). (C) Όμοια με (Α) με τη διαφορά τη χρήση του συνδυασμού LC-MS και NMR ανιχνευθεί σημειωτές μεταβολίτη, (AUROC = 0,82).

Η

Συγκρίνοντας μεταβολικά προφίλ υγιών ελέγχων και ασθενών υψηλού κινδύνου

Μόνο ένας μεταβολίτης, πυρογλουταμικό οξύ, ανιχνεύεται με LC-MS, και τρεις NMR ανιχνεύονται μεταβολίτες, προλίνη, το γαλακτικό οξύ και ένα άγνωστο μεταβολίτη, διέφερε σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) μεταξύ των υψηλού κινδύνου ασθενείς από υγιείς ελέγχους (Πίνακας 1). Επιπλέον, μία κορυφή που προκύπτει από Ν-ακετυλιωμένη πρωτεΐνη στα φάσματα NMR έδειξαν σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Ενώ τα επίπεδα της πυρογλουταμικό οξύ, προλίνη και γαλακτικό οξύ ήταν υψηλότερη στην ομάδα υψηλού κινδύνου, οι άλλοι ήταν χαμηλότερες.

Τα στοιχεία LC-MS και NMR για τα άτομα υψηλού κινδύνου και των υγιών μαρτύρων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση PLS-DA (Εικόνα S2). Ο μοναχικός διακριτικό μεταβολίτης που ανιχνεύθηκε με LC-MS, πυρογλουταμικό οξύ, είχε ευαισθησία και ειδικότητα 74% και 75%, αντίστοιχα, με μια AUROC του 0,76. Ένα μοντέλο PLS-DA με βάση το NMR ανιχνεύεται μεταβολίτες παρέχεται μία ευαισθησία και ειδικότητα από 68% και 92%, αντίστοιχα, με μια AUROC 0,80. Η συνδυασμένη ανάλυση των δεδομένων από τις δύο αναλυτικές μέθοδοι που παρέχονται αποτελέσματα παρόμοια με εκείνη για NMR και μόνο. Ωστόσο, όλα τα μοντέλα απέτυχαν να δώσει μια σαφή πρόβλεψη των ΑΗΚ ασθενείς που χρησιμοποιούν μόνο το υψηλό κίνδυνο και υγιείς ομάδες, υποδεικνύοντας ότι (όχι απροσδόκητα) Τα δείγματα ΑΗΚ ασθενή που χρειάζεται για να οικοδομήσουμε ένα επιτυχημένο μοντέλο ανίχνευσης.

Τάσεις δείκτες

τα επίπεδα των μεταβολιτών μεταξύ των τριών ομάδων, ΑΗΚ, BE & amp? HGD, και των υγιών μαρτύρων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας οικόπεδα box-και-μουστακιού. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα μέσα επίπεδα για 12 από τους μεταβολίτες, συμπεριλαμβανομένων γαλακτικό οξύ, βαλίνη, λευκίνη /ισολευκίνη, μεθειονίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη, μυριστικό οξύ, λινολεϊκό οξύ, β-υδροξυβουτυρικό, λυσίνη, γλουταμίνη και κιτρικό σταδιακά άλλαξαν με τα μέσα επίπεδα για την BE και οι ασθενείς HGD που εμπίπτουν στις μεταξύ των επιπέδων για υγιείς ελέγχους και ΑΗΚ (Σχήμα 3). Ενώ τα επίπεδα για γαλακτικό οξύ, 3-υδροξυβουτυρικό, λυσίνη, γλουταμίνη και κιτρικό αυξηθεί, τα επίπεδα για βαλίνη, λευκίνη /ισολευκίνη, μεθειονίνη, τυροσίνη, τρυπτοφάνη, μυριστικό οξύ και το λινελαϊκό οξύ μειώθηκε προοδευτικά.

Οριζόντια γραμμή σε το μεσαίο τμήμα του κουτιού, μέση? κάτω και άνω όρια των κιβωτίων, κατώτερο και ανώτερο τεταρτημόριο? μουστάκια, 5ο και 95ο εκατοστημόρια? ανοικτοί κύκλοι, ακραίες τιμές. Τα πρώτα οκτώ δείκτες ανιχνεύθηκαν με LC-MS, και τα υπόλοιπα τέσσερα ανιχνεύθηκαν με NMR.

Η

Χρησιμοποιώντας αυτούς τους 12 δείκτες, μοντέλα PLS-DA πάλι κατασκευαστεί χρησιμοποιώντας LC-MS και NMR χωριστά και σε συνδυασμό, για να ελεγχθεί η ακρίβεια ταξινόμησης για κάθε μία από τις δύο συγκρίσεις ομάδας (Σχήμα 4). Το σχήμα 4Α δείχνει το μοντέλο PLS-DA για ΑΗΚ v. Τα υγιή δείγματα αναφοράς και προβλέπει τιμές για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου. Το μοντέλο παρέχεται μία ευαισθησία και ειδικότητα από 89% και 90%, αντίστοιχα, με μια AUROC 0,92, αν και η προγνωστική δοκιμασία για την ΒΕ και HGD δεν βελτιώθηκε έναντι εκείνης χρησιμοποιώντας τις προηγούμενες PLS-DA μοντέλο (Σχήμα 1 Β και C). Το Σχήμα 4Β δείχνει το μοντέλο PLS-DA συγκρίνοντας ΑΗΚ και η ομάδα ασθενών υψηλού κινδύνου, με αποτέλεσμα ένα ευαισθησία, ειδικότητα και AUROC του 76% 70% και 0,78, αντίστοιχα. Στην περίπτωση αυτή, ελήφθη η βελτίωση της πρόβλεψης δοκιμή των ατόμων της ομάδας ελέγχου, με 30 από τους 34 ελέγχους που εμφανίζεται πάνω από τη γραμμή αποκοπής (μη-ΑΗΚ παρόμοια). Ωστόσο, αυτές οι 12 δείκτες δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να δημιουργήσει μια σαφή ταξινόμηση μεταξύ υγιών μαρτύρων και σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με τη χρήση PLS-DA, ως εκ τούτου, δεν είναι δυνατή η χρήση ενός τέτοιου μοντέλου για την πρόβλεψη EAC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) η σύγκριση των επιδόσεων του μεταβολικού προφίλ μεταξύ ΑΗΚ ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, AUROC = 0,92. (Β) η σύγκριση των επιδόσεων του μεταβολικού προφίλ μεταξύ της ΑΗΚ και BE /ασθενείς HGD, AUROC = 0,78.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη επικεντρώνεται στον εντοπισμό διάκριση των μεταβολιτών για την ίδρυση της βελτιωμένης κλινικής βιοδεικτών για την ανίχνευση της ΑΗΚ, για την ανάπτυξη μιας πιο ισχυρής μοντέλο ταξινόμησης, καθώς και γνώσεις σχετικά με τις αλλαγμένες μεταβολικές οδούς στην ΑΗΚ.

τα διαφοροποίηση των μεταβολιτών που προέρχονται από το άτομο LC-MS και αναλύσεις NMR έδειξαν διακριτές διαφορές σε μια σειρά από μεταβολίτες μεταξύ της ΑΗΚ και των ελέγχων και επιτυγχάνεται καλή ακρίβεια ταξινόμησης. Ωστόσο, ο συνδυασμός των μεταβολικών προφίλ από τις δύο μεθόδους επέτρεψε την πρόσβαση σε αυξημένο αριθμό διακρίνει μεταβολιτών. Η προβλεπτική ικανότητα του μοντέλου που προέρχεται από τον συνδυασμό του MS και NMR μεθόδων καλύτερη απόδοση τόσο ευαισθησία και ειδικότητα όταν συγκρίνεται με τα αποτελέσματα από τις μεμονωμένες μεθόδους ανάλυσης. Ο συμπληρωματικός χαρακτήρας της συνδυασμένης μεταβολισμού της πισίνας προέρχεται από τις δύο μεθόδους που συνέβαλαν σε αυτή τη βελτίωση του μοντέλου. Στην πραγματικότητα, το σύνολο των LC-MS ανιχνεύεται υποψηφίων δείκτη μεταβολίτη εκτός του γαλακτικού οξέος είναι διαφορετικά από εκείνα που ανιχνεύθηκαν με NMR. Θα πρέπει, ωστόσο, να τονιστεί ότι, ενώ η βελτίωση στην κατάταξη ήταν πολύ σαφής για τη διάκριση της ΑΗΚ και τους ελέγχους, όταν οι δύο αναλυτικές μέθοδοι συνδυάστηκαν τη βελτιωμένη απόδοση για διακρίσεις υψηλού κινδύνου (BE και HGD) ασθενείς έναντι της ΑΗΚ ήταν λιγότερο αισθητή και μόνο σε οι υψηλές περιοχή ειδικότητα (Σχήματα 1 και 2). Αυτή η επίδραση είναι πιθανόν λόγω του μικρού αριθμού των ασθενών υψηλού κινδύνου και, ενδεχομένως, στη διακύμανση της μεταβολικής αλλοιώσεων σε μεγαλύτερο βαθμό από τον έναν ασθενή στον άλλο, δύο από τα οποία μπορούν να κάνουν πρόβλεψη μοντέλο πιο προκλητική.

Σύγκριση της επιμέρους μεταβολίτες και τα στατιστικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν με τη χρήση των διαφοροποιώντας μεταβολιτών στις τρεις ομάδες έδειξαν ότι το μεταβολικό προφίλ του BE και οι ασθενείς HGD ήταν διαφορετική τόσο από την ΑΗΚ ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Προοδευτικές αλλαγές στα επίπεδα των 12 μεταβολιτών που παράγονται από LC-MS και NMR μέθοδοι δείχνουν την δυνητική χρησιμότητα για τον εντοπισμό BE και οι ασθενείς οι οποίοι HGD μπορεί να αναπτύξουν ΑΗΚ (Σχήμα 3). Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, δεδομένου ότι ΒΕ και HGD είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη της ΑΗΚ. Ταυτοποίηση των μεταβολιτών σε αυτούς τους ασθενείς, οι οποίες είναι δυνητικά προγνωστική της εξέλιξης της ΑΗΚ είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη διαχείριση των ασθενών σε κίνδυνο.

Ταυτοποίηση των μεταβολικών οδών που σχετίζονται με συγκεκριμένες μεταβολίτες εμφανίζουν αλλοιωμένη επίπεδα μπορούν να βελτιώσουν την κατανόηση των η βιολογία και παθολογία στην τροχιά από φυσιολογική έως οισοφαγικής και τελικά καρκίνο. Προηγουμένως, δείξαμε ένα απλουστευμένο χάρτη μονοπάτι με βάση τους δείκτες μεταβολίτη προσδιορίζονται με NMR και σύγκριση των αποτελεσμάτων με άλλο τύπο καρκίνου [27]. Αξιοποιώντας αυτό το μοντέλο, Το Σχήμα 5 δείχνει μια πιο λεπτομερή χάρτη μονοπάτι που συνδέονται με δείκτες μεταβολίτη προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας τόσο μεθόδους MS και NMR. Altered οδοί περιλαμβάνουν αλλαγές στον μεταβολισμό αμινοξέων, βιοσύνθεση και την υποβάθμιση (γλουταμίνη, λυσίνη, καρνιτίνη, βαλίνη, λευκίνη /ισολευκίνη, μεθειονίνη, τρυπτοφάνη, 5-hydroxytrytophan, και τυροσίνη), γλυκόλυση (γαλακτικό και γλυκόζη), σύνθεση κετονικών σωμάτων και της υποβάθμισης (