Αφηρημένο

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία θανάτου στον καρκίνο σχετίζονται με την ανθρώπινη θάνατο . θεραπευτική παρέμβαση της απαιτεί ανώτερη αποτελεσματικό μόριο (α), όπως γίνεται συχνά ανθεκτικά για να παρουσιάσει τις επιλογές της χημειοθεραπείας. Εδώ αναφέρουμε ότι ατμών πτητικών ενώσεων έλαιο που λαμβάνεται από το

Litsea cubeba

σπόρους σκότωσε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC, Α549, μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου σύλληψης. Ατμός που παράγεται από τον συνδυασμό των ελαίων (VCO) απενεργοποιείται Akt, ένα βασικό παράγοντα στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Ενδιαφέρον VCO αποφωσφορυλιώθηκε Akt τόσο σε Ser

473 και Thr

308? μέσω της καταστολής της mTOR και pPDK1 αντίστοιχα. Ως συνέπεια αυτού, μειωμένη φωσφορυλίωση της Bad εμφανίστηκε μαζί με την μειωμένη έκφραση Bcl-XL. Αυτό εν συνεχεία ενισχυμένα επίπεδα Βαχ που επιτρέπουν την έκλυση των μιτοχονδριακών κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα που ταυτόχρονα ενεργοποιημένη κασπάση 9 και κασπάσης 3 που προκύπτει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Απομείωση της ενεργοποίησης της Akt από VCO απενεργοποιείται επίσης Mdm2 που πραγματοποιείται υπερέκφραση της p53 η οποία με τη σειρά της υπερέκφραση του p21. Αυτό προκαλεί ενισχυμένη δέσμευση με κυκλίνη D1, που σταμάτησε G1 έως την εξέλιξη της φάσης S ρ21. Στο σύνολό τους, VCO παράγει δύο αποτελέσματα προεξοχή για τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, επάγει την απόπτωση και μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο συνέβη λόγω της απενεργοποίησης της Akt. Επιπλέον, έχει ένα άλλο κρίσιμο πλεονέκτημα: VCO θα μπορούσε να παραδοθεί άμεσα σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα μέσω της εισπνοής

Παράθεση:. Seal S, Chatterjee P, Bhattacharya S, D Pal, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) Vapor των πτητικών ελαίων από το

Litsea cubeba

Seed επάγει την απόπτωση και προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10.1371 /journal.pone.0047014

Επιμέλεια: Gobardhan Das, Διεθνές Κέντρο Γενετικής Μηχανικής και Βιοτεχνολογίας, Ινδία

Ελήφθη: 28 του Ιούνη 2012? Αποδεκτές: 11 Σεπτέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2012 |

Copyright: © Seal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα εργασία υποστηρίχθηκε οικονομικά από την επιχορήγηση από CSIR-NEEP έργου (HCP-005). Οι συγγραφείς SS και το PC είναι ευγνώμων στο Τμήμα Επιστήμης & amp? Τεχνολογία, Govt. της Ινδίας, Νέο Δελχί? Sushmita Bhattacharya, ΑΣ και RK είναι χρεωμένες σε Συμβουλίου της Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), Νέο Δελχί, για την ανάθεση των ερευνητικών υποτροφιών. SD είναι ευγνώμων για την UGC για το Δρ Δ Σ Kothari PDF & amp? CSIR-NEIST για qhf? και Samir Bhattacharya στην Εθνική Ακαδημία Επιστημών ινδική για τη θέση του INSA Senior Scientist. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συν-συγγραφέας καθηγητής Samir Bhattacharya είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο διαδεδομένες καρκίνους και μια σημαντική αιτία του καρκίνου σε όλο τον κόσμο σχετικών το θάνατο σε περίπου 1,4 εκατομμύρια ασθενείς κάθε χρόνο [1]. Μεταξύ καρκίνο του πνεύμονα, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αποτελείται από περίπου 80% και εντός του οποίου adrenocarcinoma είναι σημαντικά υψηλή σε ποσοστό εμφάνισης και θνησιμότητας [2]. Χημειοθεραπεία ή /και ακτινοβολία συνήθως αποτυγχάνει, επειδή τα κύτταρα NSCLC είναι εγγενώς ανθεκτικά σε τέτοιες θεραπείες, άλλωστε πρόγνωση του NSCLC είναι κυρίως φτωχοί [3], [4]. Όλα αυτά επηρεάζονται πολύ περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές για τον καρκίνο του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, υπάρχει επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη ενός στόχου ειδικών χημειο-παρέμβαση για να επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου ή για να επάγει απόπτωση ή και τα δύο για τη διαχείριση του προβλήματος των NSCLC.

Για να αντιμετωπιστεί το θέμα της ανησυχητικής κατάστασης NSCLC, η αρκετές προσπάθειες έχουν γίνονται για να ψάξετε κατάλληλο μοριακοί στόχοι να παρέμβει καρκινικά κύτταρα πρόοδο και την απόπτωση. Σε κύτταρα NSCLC, Akt /ΡΚΒ είναι η ουσιαστικά δραστική κινάση η οποία προωθεί την κυτταρική επιβίωση [5]. Η ενεργοποίηση της Akt συμβαίνει όταν προσλαμβάνεται μέσα στην κυτταρική μεμβράνη μέσω χώρου ΡΗ του και φωσφορυλιωμένη σε Thr

308 και Ser

473 με τη μεσολάβηση της ΡϋΚ1 (εξαρτάται φωσφοϊνοσιτίδη κινάση 1) και mTOR (στόχος της rapamycin στα θηλαστικά) αντίστοιχα [6], [7]. Είναι ενδιαφέρον, παρεκκλίνουσα Akt ενεργοποίηση συμβάλλει σημαντικά στην πνευμονική καρκινογένεση [8]. Η φωσφορυλιωμένη Akt (pAkt) είναι ένα ισχυρό προαγωγό της κυτταρικής επιβίωσης δεδομένου ότι διατηρεί αυτή την οδό ζωντανός προστατεύοντας Bcl-xL και ανταγωνίζονται διάφορα συστατικά των αποπτωτικών καταρρακτών [9]. Παρά το γεγονός ότι έχει παρατηρηθεί αποπτωτική απόκριση που οφείλεται στην αναστολή της Akt σε διάφορους βαθμούς σε διάφορους τύπους καρκίνων [10], [11] θα μπορούσε να είναι ζωτικής σημασίας για τον καρκίνο του πνεύμονα, επειδή ενισχυμένη φωσφορυλιωμένη μορφή της Akt παρατηρείται διαρκώς [12].

Akt ρυθμίζει ρ53, μια πρωτεΐνη καταστολέα όγκων που ελέγχει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, μέσω Mdm2 (μυϊκό διπλό μεταλλάκτη-2), ένα ubiquitin λιγάση. Mdm2 είναι ένα υπόστρωμα της Akt, η φωσφορυλίωση της mdm2 από Akt αποτελέσματα ουμπικουιτίνωση και η υποβάθμιση του πρωτεασώματος της p53 [13]. Ως εκ τούτου, ενεργοποιείται Akt εξαλείφει ένα σημαντικό εμπόδιο για την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων. Μια άλλη σημαντική διάσταση της Akt είναι ανασταλτική επίδρασή της στην αποπτωτική παθολογική οδό. Bad, ένα μέλος της Bcl

2 οικογενειών έχει βρεθεί να είναι η πρώτη πρωτεΐνη που εκκινεί την απόπτωση με τη μετατόπιση Bcl

2 ή Bcl-xL που επιτρέπει Bax να ολιγομερισμό και να δημιουργήσει πόρους στην μιτοχονδριακή μεμβράνη για την απελευθέρωση κυτοχρώματος c σε το κυτταρόπλασμα [14], [15]. Ενεργοποιημένη Akt φωσφορυλιώνει Bad σε Ser136 με αποτέλεσμα να αποσυνδεθεί από Bcl-xL από μιτοχονδριακής μεμβράνης και να συνδεθούν με μια πρωτεΐνη προσαρμογέα 14-3-3 με αποτέλεσμα Bad παγίδευση στο κυτταρόπλασμα [16], [17]. Στόχου βασίζεται βελτίωση από την εξέλιξη NSCLC κυττάρων ή η καταστροφή είναι ακόμα διαθέσιμο και από το Akt είναι μόνιμα ενεργό εδώ και το καλά χαρακτηρισμένο κινάσης που είναι γνωστό ότι υποστηρίζουν την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη, η απενεργοποίηση του θα ήταν η καλύτερη επιλογή για την αντιμετώπιση NSCLC.

στην έκθεση αυτή αποδεικνύει ότι οι πτητικές ενώσεις από το έλαιο που εξάγεται και καθαρίζεται από τους σπόρους του

Litsea cubeba

(Εοιιγ.) Pers. (Lauraceae), ένα φυτό ευρέως διαθέσιμα στην περιοχή βορειοανατολικά της Ινδίας, καταστρέφει τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα μέσω της απενεργοποίησης του Akt. Είναι ενδιαφέρον, είναι ο ατμός των ελαίων που επάγει την απόπτωση και εμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του NSCLC παράγοντας ελαττώματα φωσφορυλίωσης Akt. Ο ατμός των ελαίων κατέδειξε δύο αποτελέσματα οδόντα, δηλαδή, διέγερση αποπτωτικό θάνατο και καθυστέρηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου, και τα δύο συμβαίνει μέσω της απενεργοποίησης του Akt. Ως εκ τούτου, η εν λόγω έκθεση αναμένεται να έχει ιδιαίτερη έλξη που προκαλείται από ατμούς καταστροφή των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα θα έχει σημαντική διάσταση σε σχέση με την παράδοσή της στον ιστό στόχο.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Όλα τα υλικά κυτταρικής καλλιέργειας ελήφθησαν από την Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA. Τα πρωτογενή αντισώματα για pAkt (Thr308? Sc-135650), pAkt1 /2/3 (Ser473? Sc-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241? Sc-101775), Bcl -Χι (sc-7195), ρΒΑϋ (Ser136? sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166? sc-293105), ρ53 (sc-6243), ρ21 (sc-756), η κυκλίνη D1 ( sc-753), το πολυ [ADP-ριβοζύλιον]-πολυμεράσης (PARP) (sc-7150), το κυτόχρωμα c (SC-7159) και β-ακτίνη (SC-130657) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc., Καλιφόρνια, ΗΠΑ και mTOR (# 2983) είχε αγοραστεί από την Cell Signaling Technology Inc., Danvers, ΜΑ, USA. Αλκαλική φωσφατάση και FITC συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα, κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-Cy3, πρωτεΐνη Α αγαρόζης και CHAPS αγοράσθηκαν από την Sigma Aldrich, St. Louis ΜΟ, USA. κιτ δοκιμασίας ΜΤΤ που προμηθεύονται από Milipore, Temecula, CA, USA. Κασπάση-Glo ™ κιτ δοκιμασίας 3/7 αποκτήθηκε από την Promega Corporation, Madison, WI, USA. Mitotracker αγοράστηκε από την Molecular Probes, MD, USA, JC-1 μιτοχονδριακής μεμβράνης kit δυναμικό δοκιμασίας αγοράστηκε από την Cayman Chemical Company (Αηη Harbor, ΜΙ, USA). Αποπτωτικών DNA κιτ σκάλα και επισήμανση BrdU κιτ είχαν αγοραστεί από την Roche Diagnostics (GmbH, Γερμανία).

Εξόρυξη και καθαρισμός των αιθέριων ελαίων από το

Litsea cubeba

σπόρους

Περίπου 250 gm φρέσκα ώριμα σπέρματα του

Litsea cubeba

, τα οποία συλλέγονται κατά τους μήνες Αύγουστος – Οκτώβριος 2009-2011 από CSIR-NEIST πειραματικό αγρόκτημα, Jorhat, Assam ήταν εμποτισμένο σε απεσταγμένο νερό και εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας μια συσκευή Clavenger για 6 ώρες. Το αιθέριο έλαιο εναποτίθεται πάνω από το στρώμα του νερού διαχωρίζεται χρησιμοποιώντας ένα χωνί διαχωρισμού και ξηραίνεται πάνω από άνυδρο θειικό νάτριο (ουδέτερο) και διηθήθηκε για να δώσει έλαιο (6.25 gm, 2.5% απόδοση). Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας του ακατέργαστου πετρελαίου έδειξε την παρουσία τεσσάρων διακριτών κηλίδων. Το ακατέργαστο έλαιο (1 gm) υποβλήθηκε σε χρωματογραφικό καθαρισμό σε γέλη πυριτίου (20 gm, 100-200 mesh, Rankem) στήλης (1 ίντσα διάμετρος & amp? 50 cm μήκος) συσκευασμένη σε εξάνιο. 30 ml κλάσματα συλλέχθηκαν με την ακόλουθη σειρά: τα κλάσματα 1-10 (εξάνιο), 11-20 (1% οξικό αιθυλεστέρα σε εξάνιο), 21-35 (2% οξικό αιθυλεστέρα σε εξάνιο), 36-60 (3% οξικό αιθυλεστέρα σε εξάνιο), και το κλάσμα 61-μέχρι την ολοκλήρωση της εκλούσεως των ενώσεων (4% οξικό αιθυλεστέρα σε εξάνιο). Τα κλάσματα 11-20 περιέχουν 1 (εφεξής ως ένωση 1 ή C1) (TLC) συνδυάστηκαν και συμπυκνώθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα για να δώσει ένα έλαιο (100 mg) και αυτό ταυτοποιήθηκε ως κιτρονελλάλης από σύγκριση με αυθεντικό υλικό (TLC, IR, NMR, MS). Τα κλάσματα 23-35 περιέχουν 2 (εφεξής αναφέρεται ως ένωση 2 ή C2) (TLC) συνδυάστηκαν και συμπυκνώθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα για να δώσει ένα ελαιώδες ουσία (86 mg) και ταυτοποιήθηκε ως νεο-ισοπουλεγκόλη με σύγκριση της της

1 φάσμα NMR με αυτό που αναφέρεται στη βιβλιογραφία [18]. Τα κλάσματα 40-60 περιέχουν την ένωση 3 (εφεξής ως ένωση 3 ή C3) (TLC) συνδυάστηκαν και συμπυκνώθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα όπως εξηγήθηκε προηγουμένως για να δώσει ένα ελαιώδες υπόλειμμα (120 mg) και αυτό αναγνωρίστηκε ως ισοπουλεγκόλη με άμεση σύγκριση με το

1Η NMR φάσμα με ότι αναφέρεται στη βιβλιογραφία [18]. Τα κλάσματα 64-76 περιέχουν την ένωση 4 (εφεξής αναφέρεται ως η ένωση 4 ή C4) (TLC) συνδυάστηκαν και συμπυκνώθηκαν για να δώσουν ένα παχύ έλαιο (55 mg), το οποίο ταυτοποιήθηκε ως κιτρονελλόλη από τη σύγκριση των

φάσμα της 1Η NMR με αυθεντικό δείγμα .

Η ένωση 1 (C1):

IR (ΟΗΟ

3): υ 2925, 1724, 1457, 1437, 1219, 1040, 772 εκατοστά

-1?

1 NMR (ΟϋΟ

3, 300 MHz): δ 0,96 (d,

J

= 6,6 Hz, 3Η, -CH

Me

), 1,30 – 138 (m , 2Η, -CHMeC

H

2

CH

2-), 1,68 (s, 3Η, = C

Me

), 1.98 (s, 3Η, = C

Me

), 1.98-2.06 9m, 3Η, = C

CH

2

– & amp? -C

H

Me-), 2,24 (dd,

J

= 7,9, 2,6 Hz, 1Η, -C

H

HCHO), 2.37 (dd,

J

= 5,4, 1,6 Hz, 1Η, -CH

H

CHO), 5,06 (t,

J

= 7,0 Hz, 1Η, -C

H

= CMe

2), 9.75 (s, 1Η, -C

H

O). MS (ESI): 155 (Μ

++ 1)? bp 206 ° C (βιβλ 207 ° C)

Η ένωση 2 (C2):.

IR (ΟΗΟ

3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 εκατοστά

-1?

1 NMR (ΟϋΟ

3, 300 MHz): δ 0,87 (d,

J

= 6,6 Hz, 3Η, -CH

Me

), 0,92 – 0,95 (m , 1Η), 1.8 – 1.12 (t,

J

= 6,6 Hz, 1Η), 1,47 – 1,54 (m, 1Η), 1,68-1,75 (m, 3Η), 1,79 (s, 3Η,

Me

C = CH

2), 1,95-1,99 (m, 2Η), 3.98 (m, 1Η, C

H

ΟΗ), 4.78 (s, 1Η, = C

H

2), 4.95 (s, 1Η, = C

H

2)? MS (ESI):. 154 (Μ

+)

Η ένωση 3 (C3):

IR (ΟΗΟ

3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 εκατοστά

-1?

1 NMR (ΟϋΟ

3, 300 MHz): δ 0,90 – 1,03 (m, 2Η), 0,95 (d,

J

= 6,6 Hz, 3Η, -CH

Me

), 1,30 – 1,35 (m, 1Η), 1,47 – 1,54 (m, 1Η), 1,63 – 1,65 (m, 1Η), 1,69 (d,

J

= 1,5 Hz, 3Η,

Me

C = CH

2), 1,87 – 1,89 (m, 1Η), 2.3 – 2.6 (m, 2Η), 3,50 (dt, 1Η,

J

= 10,4, 4,2 Hz , C

H

ΟΗ), 4,85 (s, 1Η, = C

H

2), 4,89 (s, 1Η, = C

H

2)? MS (ESI): 154 (Μ

+)? bp 213 ° C (βιβλ 212 ° C)

Η ένωση 4 (C4):.

IR (ΟΗΟ

3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 εκατοστά

-1?

1 NMR (ΟϋΟ

3, 300 MHz): δ 0,91 (d,

J

= 6,6 Hz, 3Η, -CH

Me

), 1,15 – 129 (m , 2Η, -CHMeC

H

2

CH

2), 1,33-1,45 (m, 2Η, -C

H

2

CH

2ΟΗ ), 1,51 – 1,53 (m, 1Η, -C

H

Me-), 1,60 (s, 3Η, = C

Me

), 1,68 (s, 3Η, = C

Me

), 1.96-2.01 (m, 3Η, = C

CH

2

– & amp? O

Η

), 3,61-3,74 (m, 2Η, – C

Η

2ΟΗ), 5,07 (t,

J

= 7,0 Hz, 1Η, -C

H

= CMe

2)? MS (ESI): 157 (Μ

++ 1)? bp 223 ° C (βιβλ 222 ° C).

κυτταρικής καλλιέργειας και θεραπείες

Το Α549 πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή, ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Partha Π Banerjee (Georgetown University Medical Κέντρο, Washington DC, USA), που έλαβε από την American Type Culture Collection (ATCC), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει άλατα Earle και μη ουσιώδη αμινοξέα συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) σε υγροποιημένη 95% O

2/5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Συρρέοντα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν με θρυψινοποίηση και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 6 φρεατίων που περιέχουν DMEM με αιθέρια συμπληρώματα.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα έξι διατήρηση ενός καλά άνευ κυττάρων. Όταν έφθασε συρροή, το αργό πετρέλαιο ή κάθε μεμονωμένη ένωση ή VCO αραιώθηκαν σε ϋΜΕΜ και εφαρμόζονται στο άδειο φρεάτιο της πλάκας γεμάτοι για θεραπεία. VCO που περιέχουν μέσα αναπληρώθηκε κάθε 24 ώρες κατά τη διάρκεια του πειράματος. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε διαφορετικές χρονικές περιόδους με διάφορες αραιώσεις του VCO, όπως αναφέρεται κάτω από τα σχήματα. Τα κύτταρα μάρτυρες κρατήθηκαν σε ένα χωριστό επωαστήρα να αποφευχθεί οποιαδήποτε έκθεση από VCO. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα λύθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 10.000 g στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του υπερκείμενου προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του Lowry et al. [19]. Κωδικοποιημένα ή ρ53 siRNA ή Sp1 siRNA επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ΜΤΤ βιωσιμότητα κυττάρου δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρήση κιτ δοκιμασίας ΜΤΤ (Milipore, Temecula, CA, USA) οδηγίες παρακάτω κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και εξετέθησαν σε ποικίλες αραιώσεις του αργού πετρελαίου ή ατμών ελαίων για 72 ώρες ή VCO για διαφορετικές χρονικές περιόδους. 10 μΐ 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2-5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 4 ώρες στους 37 ° C. Μετά διαλυτοποίηση σε 100 μΐ 1 (Ν) ισοπροπανόλης /0.04 (Ν) HCl, απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Electron Corporation Θέρμο, ΜΑ, USA).

Αηηβχίην-Cy3 δοκιμασία ανίχνευσης

Αηηβχίην-Cy3 κιτ ανίχνευσης απόπτωσης, που αγοράστηκε από την Sigma Aldrich, St. Louis ΜΟ, USA χρησιμοποιήθηκε για τη διαφοροποίηση μεταξύ ζώντων (πράσινο φθορισμό), νεκρωτικές (ερυθρός φθορισμός) και αποπτωτικά κύτταρα (πράσινο και κόκκινο φθορισμό). Κύτταρα Α549 επωάζονται με ή χωρίς VCO του αραίωσης (2 × 10

3) για 36 ώρες πλύθηκαν επισταμένως με PBS, συλλέχθηκαν και 50 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος κηλιδώθηκε επί πολυ L-λυσίνης επικαλυμμένων γυάλινο πλακίδιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και βάφτηκαν με διάλυμα χρώσης διπλή επισήμανση (αννεξίνη V-Cy3 και 6 καρβοξυ φθορεσκεΐνη Δι-Οξεική (CFDA) για 10 λεπτά. Η περίσσεια του παράγοντος επισημάνσεως απομακρύνθηκε με έκπλυση των κυττάρων τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και η κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axio Πεδίο Α1, Carl Zeiss, Gottingen, Germany).

JC-1 δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης Δοκιμασία

χρώση JC-1 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας JC- 1 δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης κιτ δοκιμασίας, Cayman Chemical Company, (Αηη Arbor, ΜΙ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, ο έλεγχος και VCO (2 × 10

3 αραίωση) επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε JC-1 κηλίδα (10 μg /ml) για 20 λεπτά στους 37 ° C. Η μετατόπιση του φθορισμού λόγω της θεραπείας VCO παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axio Πεδίο Α1, Carl Zeiss, Gottingen, Γερμανία).

προσδιορισμού του κατακερματισμού του DNA

DNA χαμηλού μοριακού βάρους εξήχθη από 1 × 10

6 έλεγχο ή VCO (2 × 10

3dilution) επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ σκάλα αποπτωτικά το DNA από τη Roche Diagnostics, (GmbH, Γερμανία) μετά την τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα DNA Εκλούεται στη συνέχεια φορτώθηκαν σε βρωμιούχο αιθίδιο χρώση 1,5% πηκτή αγαρόζης και η εικόνα συνελήφθη από Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA, χρησιμοποιώντας λογισμικό Image Lab.

Ηλεκτροφόρηση και ανοσοκηλίδωση

60 μg πρωτεΐνης από τον έλεγχο ή κατεργασμένα προϊόντα λύσης κυττάρου αναλύθηκαν σε 10% ή 12,5% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Bedford, ΜΑ) με τη βοήθεια της Συσκευή trans κηλίδος Semi-Dry (TE77 Semi-Dry μονάδα μεταφοράς GE υγειονομική περίθαλψη, CA, USA). Οι μεμβράνες πρώτα επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με διαφορετικές πρωτογενή αντισώματα σε 1:500 αραιώσεις που ακολουθείται από αντίστοιχη αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα σε 1:2000 αραιώσεις σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση 5-bromro 4-χλωρο 3-ινδολύλιο /νιτροτετραζολίου (ΒΟΙΡ /ΝΒΤ). Ένταση των ζωνών εκτιμήθηκε από το λογισμικό Image Lab (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA).

ανοσοφθορισμού μελέτη του κυτοχρώματος c

κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε αποστειρωμένο μη επικαλυμμένων καλυπτρίδες από γυαλί. Αμφότερες ελέγχου και VCO (2 × 10

3 αραίωση) επεξεργασμένα κύτταρα βάφτηκαν με Mitotracker (Molecular Probes, MD, USA) σε 1:10,000 αραιώσεις (σε ϋΜΕΜ) για 15 λεπτά. Τα κύτταρα περαιτέρω πλύθηκαν με DMEM και υποβάλλονται σε επεξεργασία για στερέωση. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-c κυτοχρώματος (1:100) για 2 ώρες που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (1:50) για άλλη 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πάγκο βάφονται και τοποθετείται με μέσο στερέωσης DAPI και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axio Πεδίο Α1, Carl Zeiss, Gottingen, Γερμανία).

κασπάσης-Glo 3/7 δοκιμασία

κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων και επωάζονται με ή χωρίς VCO του αραίωσης (2 × 10

3) για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Με τη λήξη της επωάσεων, δραστικότητα κασπάσης μετρήθηκε με τη χρήση της κασπάσης-Glo ™ 3/7, Promega Corporation, Madison, WI, USA, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η φωταύγεια μετρήθηκε σε έναν ανιχνευτή πολύτροπες DTX-800 (Beckman Coulter, CA, USA).

ενσωμάτωσης BrdU δοκιμασία

σύνθεση DNA παρακολουθήθηκε με μέτρηση της ενσωμάτωσης του αναλόγου θυμιδίνης 5-βρωμο-2 ‘ δεοξυουριδίνη (BrdU) σε αναπτυσσόμενα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση επισήμανσης BrdU και κιτ ανίχνευσης. (2 × 10

3 αραίωση) επεξεργασμένα κύτταρα Α549 ελέγχου και VCO ήταν αναπληρώνεται με πλήρες μέσο που περιέχει αντιδραστήριο σήμανσης BrdU και επωάστηκαν για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν καλά με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και στερεώθηκαν με στερεωτικό αιθανόλη για 20 λεπτά στους -20 ° C. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με διάλυμα αντι-BrdU αντίσωμα που ακολουθείται από διάλυμα αντι-ποντικού Ig φλουορεσκεΐνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετούνται σε γυάλινες πλάκες και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axio Πεδίο Α1, Carl Zeiss, Gottingen, Γερμανία).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία

δοκιμασία ChIP διεξήχθη με τη χρήση ένα κιτ δοκιμασίας πλινθίου (Upstate, Temecula, CA, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ρ53. Εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση γνωστό στοιχείο απόκρισης ρ53 με υποκινητή ρ21 και αυτές είναι – RE1: προς τα εμπρός: 5′-CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-3 ‘και αντίστροφη: 5′-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3′? RE2: προς τα εμπρός: 5’-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 ‘και να αντιστραφεί: 5′-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3’ [20] και τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε βρωμιούχο αιθίδιο βάφονται 2% πηκτή αγαρόζης και η εικόνα συνελήφθη από την Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA χρησιμοποιώντας λογισμικό Image Lab.

Co-ανοσοκαταβύθιση (Co-ΙΡ) δοκιμασία

200 μg πρωτεΐνης από τον έλεγχο ή κύτταρα επεξεργασμένα VCO επωάστηκαν όλη τη νύκτα με 2 μα αντι-ρ21 και αντι β-ακτίνης αντίσωμα σε 4 ° C με συνεχή ανάδευση. Η πρωτεΐνη στη συνέχεια προστέθηκε Α αγαρόζη και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 4 ° C. σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 10.000 rpm για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το σφαιρίδιο πλύθηκε 3 φορές για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε μη συνδεδεμένο πρωτεΐνη και βράζεται με 4 Χ δείγμα ρυθμιστικού για 5 λεπτά σε λουτρό ζέοντος ύδατος. Το δείγμα φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο φορτώθηκε σε 10% SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με αντισώματα αντι-κυκλίνης D1 ή αντι-β-ακτίνης.

κυτταρομετρίας ροής Ανάλυση

Για κυτταρικού κύκλου ανάλυση, τον έλεγχο και την VCO (2 × 10

3dilution) επεξεργασμένα κύτταρα Α549 υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 24 ώρες πριν από την ανάλυση του DNA. Μετά την απομάκρυνση της αιθανόλης με φυγοκέντριση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με RNase (100 μg /ml) για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ-5 μg /ml) για 15 λεπτά. Ο φθορισμός των κυττάρων που κατεργάστηκαν ΡΙ μετρήθηκε με κυτταρόμετρο ροής (BD FACSAria ™ II). Τα ποσοστά των G1, S, G2 και κύτταρα-M προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Λογισμικό Diva FACS.

Πρωτογενής καλλιέργεια των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα

Τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα απομονώθηκαν από αρσενικούς αρουραίους Sprague Dawley εξής Phan et al. [21], εν συντομία, φυσιολογικά υγιή αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν και οι πνεύμονες ακολούθως διαποτίστηκαν με αποστειρωμένο αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), μέσω της δεξιάς κοιλίας έως ότου ήταν χλωμό. Στη συνέχεια, οι πνεύμονες απομακρύνθηκαν, κιμά και χωνεύεται σε PBS που περιέχει 0.5% τρυψίνη για 45 λεπτά στους 37 ° C. Υποστεί πέψη κύτταρα διαχωρίστηκαν από άπεπτα ιστό και συντρίμματα με διήθηση μέσω νάιλον πλέγματος. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοοειδών και αντιβιοτικά, και τελικά επαναιωρήθηκαν στο μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε πλάκα έξι διατήρηση ενός καλά άνευ κυττάρων και επωάζονται σε υγροποιημένη 95% O

2/5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Μετά από 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 × 10

3 αραίωση του C2 ή C3 ή C4 ή VCO για 12 ώρες. Τα κύτταρα μάρτυρες κρατήθηκαν σε ένα χωριστό επωαστήρα να αποφεύγεται η παρουσία του ατμού. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα λύθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 10.000 g στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του υπερκείμενου προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του Lowry et al. [19].

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα που προέρχονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), όπου η τιμή F υποδεικνύεται σημασία, μέσα συγκρίθηκαν με μια post hoc δοκιμασία πολλαπλού εύρους. Όλες οι τιμές βρίσκονταν μέσα ± SEM.

Αποτελέσματα

Η βιολογική δράση καθοδηγείται απομόνωση και τον καθαρισμό των ελαίων από το σπόρο του

Litsea cubeba

Η

Το εξάγεται ατμών του αργού πετρελαίου από

Litsea cubeba

σπόρους εξετάστηκε για αντικαρκινική δράση σε Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα. Αρκετές αραιώσεις από το αργό πετρέλαιο παρασκευάστηκαν και κάθε αραίωση προστέθηκαν σε ένα από τα 6 φρεατίων των πλακών καλλιέργειας ενώ άλλα 5 φρεάτια περιείχαν Α549 κύτταρα NSCLC. Ο ατμός που παράγεται από κάθε αραίωση αναμενόταν να εξαπλώνεται σε όλη την πλάκα και να φτάσει τα καρκινικά κύτταρα. δοσοεξαρτώμενη έκθεση του ατμού μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 σημαντικά σε 72 ώρες με [10

3] και [10

2] αραιώσεις ενώ μέχρι [10

4] αραιώσεις ο ατμός δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων (Εικ. 1Α). Χρωματογραφικός καθαρισμός του

Litsea cubeba

σπόρων αιθέρια έλαια οδήγησε σε τέσσερις τύπους των ενώσεων, που προσδιορίζονται μέσω μάζας και

1 NMR φάσματος με αυθεντικά ενώσεις και τη χημική τους φύση ανιχνεύθηκε ως εξής – C1: κιτρονελλάλης? C2: νεο-ισοπουλεγκόλη? Γ3: ισοπουλεγκόλη και C4: κιτρονελλόλη (Εικ. 1Β), το καθένα χωριστά προστίθεται σε αραίωση [2 × 10

3] σε ένα από τα πλάκας καλλιέργειας των 6 φρεατίων, άλλες 5 φρεάτια περιείχαν κύτταρα Α549. Οι ατμοί που δημιουργούνται μετά την προσθήκη του ελαίου στο φρεάτιο εκτέθηκαν σε κύτταρα για 72 ώρες. Θα μπορούσε να φανεί από το Σχ. 1C ότι C1 είχε φτωχή δραστηριότητα, C2 και C3 επέδειξαν 3-φορές υψηλότερη δράση σε σύγκριση με C1, ενώ C4 είχε υψηλότερη δραστικότητα, η θνησιμότητα μέχρι στιγμής κύτταρο ανησυχεί.

(Α) Κυτταρική βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων Α549 πνεύμονα μετρήθηκαν όταν εκτίθεται σε ατμούς διαφορετικές αραιώσεις (10

6 έως 10

2) του αργού πετρελαίου για 72 ώρες με τη χρήση ΜΤΤ δοκιμασία και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως% των κυτταρικών επιβίωσης σε σχέση με τον έλεγχο. (Β) Χημικές δομές των τεσσάρων πιο διαθέσιμες ενώσεις (C1-Κιτρονελλάλη? C2-neo-ισοπουλεγκόλη? C3-ισοπουλεγκόλη? C4-κιτρονελλόλη) απομονώθηκε από το

Litsea cubeba

σπόρο αιθέριο έλαιο. (C) ποσοστό των νεκρών κυττάρων παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα Α549 εκτέθηκαν ξεχωριστά με αυτές τις ενώσεις για 72 ώρες. (D) Επίδραση VCO (C2:C3:C4 ως 1:01:01) και C4 επί του κυτταρικού θανάτου σε 72 ώρες παρατηρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία, η οποία οπτικοποιήθηκε με μικροσκοπική εικόνων. (Ε) επιβιωσιμότητα κυττάρων μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48, 72 ώρες) με έκθεση VCO σε κύτταρα Α549. (F) στύπωμα Western της φωσφορυλίωσης Akt σε Thr

308, Ser

473 και ολική Akt σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία χωρίς (Con) με C1, C2, C3, C4 και VCO για 36 ώρες. β-ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± SEM από 3 μεμονωμένα πειράματα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου και # p & lt?. 0,05 έναντι C4

Η

Είμαστε σε συνδυασμό C2, C3 και C4 σε 1:01:01 αναλογία να παρατηρήσει αν ο ατμός από αυτοί οι συνδυασμοί θα μπορούσαν να παράγουν πρόσθετες ή συνεργική επίδραση στο θάνατο των κυττάρων πάνω C4. Ο ατμός από τα συνδυασμένα έλαια (VCO) εμφάνισαν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) μεγαλύτερη δραστικότητα σε θανάτωση κυττάρων Α549 σε σύγκριση με τον ατμό του C4 μόνο του (Σχήμα 1ϋ.) Υποδεικνύοντας ότι C2 και C3 παράγουν πρόσθετα αποτελέσματα έως C4. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ο ατμός από αυτές τις συνδυασμένες έλαια δηλαδή VCO. Όταν VCO εκτέθηκε σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, ο θάνατος των κυττάρων που εμφανίστηκαν γραμμικά συναρτήσει του χρόνου (Σχ. 1Ε), υποδεικνύοντας δυνατότητα επαγωγής απόπτωσης από VCO. Έχουμε εκτελέσει πειράματα για να εξεταστεί η δυνατότητα της C1, C2, C3, C4 ένωσης με προσδιορισμό της αναστολής της ενεργοποίησης Akt. Δεδομένου ότι σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα pAkt εκφράζεται ιδιοσυστατικά, η φωσφορυλίωση της Akt λήφθηκε ως δείκτης για να αξιολογηθεί η αντικαρκινική δράση. C4 έδειξε μεγαλύτερη ανασταλτική δράση σε σύγκριση με άλλες ενώσεις (C1, C2, C3,), αλλά VCO η οποία είναι ένας συνδυασμός των C2, C3, C4 και παράγονται σημαντικά υψηλότερη ανασταλτική δράση σε σύγκριση με C4 (Εικ. 1 F). Σε αυτό το σημείο αν VCO παράγει κυτταροτοξική δράση στα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα θα ήταν μια σχετική ερώτηση. Για να παρατηρήσουμε αυτό, ατμών C2, C3, C4 και ατομικά VCO εκτέθηκε σε πρωτογενή καλλιέργεια από κύτταρα πνεύμονα που παρασκευάστηκε από αρουραίο. Ατμών από τα έλαια και VCO δεν παράγει κανένα αρνητικές επιπτώσεις στη μορφολογία των κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, έχουμε επίσης προσδιορίστηκε η αναστολή της pAkt λόγω VCO σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα και διαπίστωσε ότι δεν υπήρχε μεταβολή στην pAkt (Εικ. S1 Α και Β). Όλα αυτά δείχνουν ότι σε αυτή τη δόση του VCO, φυσιολογικούς πνεύμονες κύτταρα δεν επηρεάζονται, ενώ ίδια δόση πραγματοποιηθεί σημαντική θνησιμότητα από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων.

VCO διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Για να εξεταστεί η VCO αποτέλεσμα επί Α549 καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήσαμε χρώση διπλό φθορισμού με 6-CFDA και αννεξίνης V-Cy3 για διαφοροποίηση των ζωντανών, αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. VCO επαγόμενη φωσφατιδυλοσερίνης μετατόπιση από το εσωτερικό προς το εξωτερικό φύλλο της μεμβράνης πλάσματος που αναγνωρίζεται από το φωσφατιδυλοσερίνη πρωτεΐνη δέσμευσης αννεξίνης V συζευγμένη με Cy3. Σε 36 ώρες, τα κύτταρα Α549 μάρτυρες έδειξαν χρώση μόνο με 6-CFDA (πράσινο) ενώ η θεραπεία με VCO αύξησε τον αριθμό των αννεξίνης V-Cy3 (κόκκινο) και 6-CFDA (πράσινο) διπλό-χρώση κύτταρα (Σχ. 2Α) και αυτό αυξήθηκε με τον χρόνο που δείχνει την ενίσχυση των αποπτωτικών κυττάρων (Σχ. 2Β). Να επεκτείνει περαιτέρω την παρατήρηση μας, χρησιμοποιήσαμε JC-1 φθορίζουσα χρωστική ουσία για την εξέταση πιθανών μιτοχονδριακής μεμβράνης. Σε ζωντανά κύτταρα, λόγω του δυναμικού της μεμβράνης φυσιολογικού, JC-1 που συνδέονται με τις μιτοχονδριακής μεμβράνης και μορφή J-συσσωματωμάτων που εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό ενώ αποπολωμένα μιτοχονδριακής μεμβράνης σε αποπτωτικά κύτταρα περιείχαν μονομερούς JC-1 που φθορίζουν πράσινο. Θα μπορούσε να φανεί από το Σχ. 2C ότι τα κύτταρα Α549 που εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό, ενώ VCO επωάζονται κύτταρα που σημειώνονται με πράσινο φθορισμό υποδεικνύοντας κυτταρική απόπτωση. VCO επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα ήταν επίσης εμφανής από σκάλα DNA λόγω ολιγονουκλεοσωματικής κατακερματισμού της χρωματίνης (Σχ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι VCO προκαλεί απόπτωση μόνο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) αννεξίνη-Cy3 (κόκκινο) και 6-CFDA (πράσινο) διπλή χρώση των αποπτωτικών κυττάρων εξετάστηκε με μικροσκοπία φθορισμού όπου VCO επεξεργασμένα κύτταρα Α549 έδειξε τόσο πράσινο και κόκκινο λεκέδες και (μη επεξεργασμένα) κύτταρα ελέγχου βάφονται μόνο πράσινο. (Β) Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων Α549 μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία (0 h, 12 h, 24 h, 36 h) με θεραπείες VCO. (Γ) πιθανή μιτοχονδριακής μεμβράνης παρατηρήθηκε σε έλεγχο και VCO εκτεθεί καρκίνου (36 ώρες) Α549 κύτταρα πνεύμονα με προσδιορισμό χρώσης JC-1. (D) Τα αποπτωτικά DNA κατάτμηση παρατηρήθηκε από VCO αγωγή Α-549 κυττάρων σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5%. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου (0 h). Ράβδος αντιπροσωπεύει 20 μm.

Η

Αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt με VCO επηρεάζει αρνητικά καθοδική σηματοδότηση για την επιβίωση των κυττάρων

πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων, Akt αποτελεί πρωταρχικό επιλογή για τη θεραπευτική παρέμβαση δεδομένου ότι διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην προώθηση της αθανασίας και του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Φωσφορυλίωση της Akt σε Thr

308 και Ser

473 είναι κρίσιμες για τη διατήρηση αυτών των δύο ζωτικής σημασίας χαρακτηριστικά. επεξεργασία VCO μειώθηκε δραματικά Akt φωσφορυλίωση σε Thr

308 και Ser

473 χωρίς καμία αξιοσημείωτη μεταβολή του συνολικού επιπέδου Akt πρωτεΐνη στα καρκινικά κύτταρα Α549 (Εικ. 3Α, Β ανώτερο πλαίσιο). 36 ώρες της θεραπείας VCO μειώνεται pAkt Thr

308 επίπεδο κατά 70% και pAkt Ser

473 επίπεδο κατά 95% σε σύγκριση με 0 h δηλαδή τον έλεγχο του καρκίνου κύτταρα (Εικ. 3Α, Β κάτω πίνακα). Αυτό δείχνει ότι VCO απενεργοποιεί έντονα Akt που επιτρέπει αποπτωτικό μονοπάτι προς την πρόοδο. Η ενεργοποίηση της Akt ρυθμίζεται από δύο διακριτά kinases- mTOR και PDK1, πρώην είναι υπεύθυνη για την φωσφορυλίωση της Akt σε Ser

473, ενώ τελευταία φωσφορυλιώνει σε Thr

308. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση ΡϋΚ1 και έκφραση mTOR σε απάντηση VCO. Υπήρξε σημαντική μείωση της φωσφορυλίωσης ΡϋΚ1 και έκφραση mTOR σε κύτταρα Α549 λόγω της έκθεσης VCO (Σχ. 3C, D). Από Akt διαμεσολαβεί την επίδρασή της στην αναστολή της απόπτωσης μέσω της Bad, η απενεργοποίηση της Akt λόγω VCO θα μπορούσε διακυβεύει σοβαρά με την ενεργοποίηση της Bad.