Αφηρημένο

Ιστορικό

Signal Transducer και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) είναι μια ογκογονιδίου, το οποίο προωθεί την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων. Στόχευση σηματοδότηση STAT3 μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για ανθρώπινους καρκίνους. Εδώ, εξετάσαμε τις επιδράσεις της epigallocathechin gallate (EGCG) επί STAT3 σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, και αξιολογείται το θεραπευτικό δυναμικό του EGCG με gemcitabine ή JAK3 CP690550 αναστολέα (Tasocitinib) για τη θεραπεία ή /και πρόληψη του καρκίνου του παγκρέατος.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση μετρήθηκαν με ΧΤΤ δοκιμασία και χρώση TUNEL, αντίστοιχα. Gene και πρωτεΐνη εκφράσεις μετρήθηκαν με qRT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι EGCG ανέστειλε την έκφραση του φωσφο και συνολικής ΙΑΚ3 και STAT3, μεταγραφή STAT3 και ενεργοποίηση, και την έκφραση των γονιδίων STAT3 ρυθμιζόμενων, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας, τη μετανάστευση και την εισβολή, και η επαγωγή της κασπάσης-3 και διάσπαση PARP. Η αναστολή της STAT3 ενίσχυσε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της EGCG επί κυτταρική κινητικότητα και τη βιωσιμότητα. Επιπλέον, γεμσιταμπίνη και CP690550 μόνη ανέστειλε γονιδίων στόχων STAT3 και synergized με EGCG για να αναστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Συμπεράσματα /Σημασία

Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η EGCG καταστέλλει το ανάπτυξη, εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος, και επάγει την απόπτωση με παρέμβαση στην οδό σηματοδότησης STAT3. Επιπλέον, EGCG ενισχυθεί περαιτέρω το θεραπευτικό δυναμικό της γεμσιταβίνης και CP690550 κατά του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Tang SN, Fu J, Shankar S, Srivastava RK (2012) EGCG Ενισχύει τις θεραπευτικές δυνατότητες του γεμσιταβίνη και CP690550 από ανασταλτικός STAT3 μονοπάτι σηματοδότησης στο ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (2): e31067. doi: 10.1371 /journal.pone.0031067

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: May 11, 2011? Αποδεκτές: 1η Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R01CA125262, RO1CA114469 και RO1CA125262-02S1) και το Κάνσας Bioscience Αρχής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεταγωγή σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (STAT) πρωτεϊνών είναι μια οικογένεια κυτταροπλασματικών παράγοντες μεταγραφής οι οποίοι είναι αρχικά παρούσα σε αδρανείς μορφές [1], [2]. Αυτές διεγείρονται από την δέσμευση πεπτιδίων σηματοδότησης, όπως κυτοκίνη, αυξητικούς παράγοντες, και ορμόνη, η οποία οδηγεί σε διμερισμό των ομώνυμων υποδοχέων τους και την ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης όπως Janus κινάση (JAK). Τα ενεργοποιημένα κινάσες τυροσίνης μπορούν στη συνέχεια φωσφορυλιώνει τις κυτταροπλασματικές περιοχές των υποδοχέων για την παροχή θέσεων αναγνώρισης για το μη φωσφορυλιωμένο STATs μονομερή. Μόλις οι STATs φωσφορυλιώνονται με ενεργοποιημένα κινάσες τυροσίνης μετά τη δέσμευση, σχηματίζουν ομο- ή ετερο-διμερή μέσω Src-ομολογίας τους 2 (SH2) περιοχή και ταχέως μεταναστεύουν μέσα στον πυρήνα, όπου τα διμερή δεσμεύονται με αλληλουχίες DNA για δραστική ειδική μεταγραφή γονιδίων [1] , [2].

Πολυάριθμα πειράματα έχουν δείξει ότι η κανονική σωματική λειτουργίες STATs είναι κρίσιμες στη ρύθμιση πολλές πτυχές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της μετανάστευσης, και την επιβίωση. Μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας STAT, STAT3 είναι η πιο στενά συνδεδεμένη με την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση [3], [4]. Είναι ευρέως εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς και θεωρείται ως πιθανός ογκογονίδιο. STAT3 είναι συχνά ουσιαστικά δραστική σε πολλά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλού μυελώματος, γλοιοβλάστωμα, λευχαιμία, λέμφωμα, καρκίνο του μαστού, τον καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του πνεύμονα, και καρκίνο του λαιμού [5], [6], [7]. STAT3 μπορεί να ενεργοποιηθεί με πολλαπλές κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-6, IL-11, ακτινωτό νευροτροφικό παράγοντα, και ανασταλτικό παράγοντα λευχαιμίας, τα οποία όλα χρησιμοποιούν υποδοχείς gp130-τύπου. Είναι ενδιαφέρον, STAT3 μπορεί να συμβάλει στην απόπτωση είτε ή την επιβίωση σε διάφορα όργανα και κυτταρικούς τύπους. Μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό σε ηπατοκύτταρα [8], νευρώνα κυττάρων [9], και Τ κύτταρα [10], αλλά είναι απαραίτητη για την απόπτωση σε μαστικό [11] και μυελοειδή κύτταρα [12].

STAT3 είναι μια λανθάνουσα παράγοντας μεταγραφής που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Κατά την ενεργοποίηση με φωσφορυλίωση της τυροσίνης, διμερίζεται STAT3, μετατοπίζεται στον πυρήνα και συνδέεται προς το πυρηνικό DNA να διαμορφώνουν μεταγραφή των γονιδίων στόχων. φωσφορυλίωση STAT3 κατά κύριο λόγο μέσω μέσω της ενεργοποίησης του μη-υποδοχέα τυροσίνης πρωτεΐνης κινάση της οικογένειας της JAKs, τα οποία περιλαμβάνουν πολλά μέλη JAK1, JAK2, JAK3 και τυροσίνη κινάση 2 [13], [14]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση STAT3 μπορεί επίσης να προκαλείται από στιχομυθία με c-Src κινάση [13], [14], [15]. Οι κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης σε STAT3 περιλαμβάνουν υπολείμματα τυροσίνης και σερίνης στις θέσεις Tyr

705 και Ser

727, αντίστοιχα, που βρίσκεται στο τομέα διενεργοποίησης. Η ενεργοποίηση των αποτελεσμάτων STAT3 σε έκφραση πολλών γονιδίων στόχων που απαιτούνται για την επιβίωση κυττάρων όγκου (π.χ., Bcl-X

L, Mcl-1 και survivin), πολλαπλασιασμό (π.χ. κυκλίνη D1 και c-myc) και την αγγειογένεση [π.χ. αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF)], καθώς επίσης μετάσταση [16]. Έτσι, STAT3 σηματοδότησης οδού υπήρξε ένα από τα αγαπημένα θεραπευτικό στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων [17], [18].

Γεμσιταβίνη (ένα ανάλογο νουκλεοζίτη) έδειξε πιο κλινικό όφελος σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με τα συμβατικά φάρμακα [19 ]. Ορισμένοι ισχυροί και εκλεκτικοί αναστολείς JAK3, π.χ. CP690550, κατέδειξε σημαντική κλινική δραστικότητα στον καρκίνο [20], [21]. CP690550 αντιπροσωπεύει μόνο ένα σημείο εκκίνησης για την αναζήτηση ενός ασφαλέστερου μικρό ανοσοκατασταλτικό μόριο, και ότι ένας αναστολέας JAK3 ισοενζύμου-εκλεκτικοί προσδιορίζονται από ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων μπορεί να είναι σημαντικά πιο ασφαλή. Τα τελευταία χρόνια, πολλές νέες γνώσεις έχουν αποκτηθεί στην έρευνα για μια ποικιλία καθαρίστηκε ενώσεων από φυσικά προϊόντα. Για παράδειγμα, EGCG είναι το μείζον κατεχίνη από πράσινο τσάι και έχει αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός παράγων χημειοπροληπτικός και ως ρυθμιστές της καρκινικού κυττάρου απόκριση σε χημειοθεραπεία [22], [23], [24]. Έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [25], επάγει απόπτωση [26] σε κύτταρα όγκου, αποτροπή της αγγειογένεσης [27], ρυθμίζουν την εισβολή και τη μετανάστευση των καρκίνων, και παρεμβαίνει με πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του μονοπατιού του πυρηνικού παράγοντα-κΒ σηματοδότηση [28], του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα μονοπάτι μεσολάβηση [29], που μοιάζει με ινσουλίνη μονοπατιού παράγοντα-Ι ανάπτυξης σηματοδότηση [30], που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση εξαρτώμενη από μονοπάτι [31], και πρωτεασώματος οδός αποδόμησης [32].

στην παρούσα εργασία, εξετάσαμε τις επιδράσεις της EGCG στην σηματοδότηση STAT3 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, καθώς επίσης και αξιολόγησε τα διαδραστικά αποτελέσματα της EGCG με γεμσιταβίνη ή αναστολέα JAK3 CP690550 στο θεραπευτικό δυναμικό τους. Βρήκαμε ότι EGCG ανέστειλε την έκφραση του JAK3 και STAT3 (φωσφο και σύνολο), μεταγραφή STAT και ενεργοποίηση, και την έκφραση των γονιδίων STAT3 ρυθμιζόμενων, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας, τη μετανάστευση και την εισβολή, και η επαγωγή της κασπάσης-3 και διασπάσεις PARP. Αναστολή της STAT3 με shRNA σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ενισχύει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της EGCG στην κυτταρική μετανάστευση και την κινητικότητα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης STAT3 είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων και δείχνουν ότι EGCG στόχευση σηματοδότηση STAT3 μπορεί να είναι μια πιθανή θεραπευτική παρέμβαση για τον καρκίνο του παγκρέατος. Επιπλέον, ο συνδυασμός του EGCG με gemcitabine ή CP690550 είχε προσθετικό /συνεργιστικά αποτελέσματα σχετικά με τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές AsPC-1 και PANC-1 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Thermo Scientific) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen) σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2.

επιμόλυνση κυττάρων

STAT3 τα siRNAs σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας BLOCK-it ™ RNAi Designer (Invitrogen) .Το αριθμός πρόσβασης λήφθηκε από την τράπεζα γονιδίων. Οι αλληλουχίες των STAT3 Τα siRNAs (αριθμός πρόσβασης: NM_139276) είναι αντιστοιχούν στις περιοχές κωδικοποίησης 398-416 (5′-CCA CTT TGG TGT TTC ΑΤΑ A-3 ‘), 1070-1088 (5′-CCCGTCAACAAATTAAGAA-3′), 1.448 -1466 (5’-GCC TCT CTG CAG ΑΑΤ TCA Α-3 ‘) και 1935-1953 (5′-GGA CAA ΤΑΤ CAT TGA ΚΔ Τ-3’) νουκλεοτίδια. AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μίγμα Τα siRNAs χρησιμοποιώντας Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση κυτταρικής βιωσιμότητας, δοκιμασία μηδέν, qRT-PCR και κηλίδωση Western.

ΧΤΤ Δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

4 σε 200 μΙ μέσου καλλιέργειας ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων (επίπεδος πυθμένας), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς φάρμακα και επωάζονται για διάφορα χρονικά σημεία στους 37 ° C και 5% CO

2. Πριν από το τέλος του πειράματος, 50 μΙ μίγμα επισήμανσης ΧΤΤ (τελική συγκέντρωση, 125 μΜ ΧΤΤ (νάτριο 2,3-δις (2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξανιλιδο εσωτερικό άλας) και 25 μΜ PMS (φαιναζίνη μεθοθειικό) ανά φρεάτιο προστέθηκαν και οι πλάκες επωάστηκαν για περαιτέρω 4 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2. Η φασματοφωτομετρική απορρόφηση του δείγματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία πλάκα μικροτιτλοδότησης (ELISA) αναγνώστη. το μήκος κύματος για τη μέτρηση της απορρόφησης του προϊόντος φορμαζόνης ήταν 450 nm, και το μήκος κύματος αναφοράς ήταν 650 nm.

κασπάσης-3/7 Δοκιμασία

Cells (3 × 10

4 ανά πηγάδι ) σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων με 200 μΙ μέσου καλλιέργειας. Περίπου 16 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις των 3 Casapse-/7 δραστηριότητα EGCG. μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen).

ξυστό δοκιμασία

AsPC-1 κωδικοποιημένα και τα κύτταρα STAT3 shRNA σπάρθηκαν σε 6 πιάτα καλά. Όταν όλοι οι πολιτισμοί ήταν 50% συρροή, ένας σταυρός σημειώνεται στο κέντρο κάθε πιάτου, χρησιμοποιώντας μια άκρη 10 μl. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο. Οι εικόνες γρατσουνιά ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε 0, 24 και 48 ώρες για τις ίδιες θέσεις αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG.

Transwell δοκιμασία μετανάστευσης

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της EGCG επί κυτταρική μετανάστευση, AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 απλώθηκαν στην κορυφή του θαλάμου επάνω στο μη επικαλυμμένη μεμβράνη (24-φρεατίων ένθετο? μέγεθος πόρων, 8 μm? Corning Costar) σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /καλά σε μέσο RPMI που περιείχε 1% FBS και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο. EGCG προστέθηκε στα δύο θαλάμους για να επιτευχθεί η συγκέντρωση των 0, 20, 40, 60 μΜ, αντίστοιχα. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα μεταναστεύσει κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (τέσσερα τυχαία πεδία ανά φρεάτιο).

Transwell δοκιμασία εισβολής

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της EGCG επί του κυτταρικού εισβολή, AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 απλώθηκαν στην κορυφή του θαλάμου επί του Matrigel επικαλυμμένη μεμβράνη (ένθετο 24-φρεατίων? μέγεθος πόρων, 8 μm? Corning Costar) σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο RPMI που περιείχε 1% FBS, και επιτρέπεται να εισβάλλουν προς μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο. EGCG προστέθηκε στα δύο θαλάμους για να επιτευχθεί η συγκέντρωση των 0, 20, 40, 60 μΜ, αντίστοιχα. Μετά από 48 ώρες επώασης μη εισέβαλαν κύτταρα απομακρύνθηκαν με μπατονέτα, και εισέβαλαν κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (τέσσερα τυχαία πεδία ανά φρεάτιο).

Παροδική επιμόλυνση και STAT3 ρεπόρτερ

AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 100 mm και διαμολύνθηκαν σε 70% συρροή με pGreenfire1-STAT3 πλασμίδιο ανταποκριτή χρησιμοποιώντας Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (0-80 μΜ). Μετά από επώαση 24 h, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter (Promega), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε αναγνώστη πλακός multilabel (Wallac Victor, Perkin-Elmer).

απομόνωση RNA και πραγματική -Time RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Nano Drop 2000 Φασματοφωτόμετρο. cDNA συνετέθη και οι αντιδράσεις RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SuperScript II (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στο Applied Biosystems 7300 πραγματικού χρόνου PCR System, χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Εκκινητές PCR αγοράστηκαν από Realtimeprimers.com. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και η σχετική έκφραση του mRNA στόχου σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε με εκείνη της μέσης GAPDH

PCR πριμοδότες αλληλουχίες:. GAPDH, προς τα εμπρός αρχικό τεμάχιο 5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT – 3 ‘? ανάστροφο εκκινητή 5’-TTG ΑΤΤ TTG GAG GGA TCT CG-3 ‘? STAT3, προς τα εμπρός εκκινητή 5’-ΚΔ TTG ACA TGG AGT TGA CC-3 ‘? ανάστροφο εκκινητή 5’-ΤΑΑ ΑΑΟ TGC CCA GAT TGC TC-3 ‘? Κυκλίνη D1, προς τα εμπρός εκκινητή 5’-TTC ΑΑΑ TGT ΟΤΟ CAG Α.Ε.Ε. GA -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-GGG ATG GTC TCC TTC ATC ΤΤ -3′? c-myc, πρόσθιο εκκινητή 5’-CGA CGA GAC CTT CAT CAA ΑΑ -3 ‘, ανάστροφο εκκινητή 5′-TGC TGT CGT TGA GAG GGT AG -3′? Survivin, προς τα εμπρός εκκινητή 5’-TCC CTG GCT ΚΔ CTA CTG TT -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-TGT CTC CTC ATC CAC CTG ΑΑ -3′? VEGF, προς τα εμπρός εκκινητή 5’-AGA CAC ACC CAC CCA CAT AC-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-TGC CAG AGT CTC TCA TCT CC-3’? ΒεΙΧ

L πρόσθιο εκκινητή 5′-GCT CTC ACT CCC AGT CCA ΑΑ -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-GCT GAG GCC ΑΤΑ AAC AGC TC-3’.

χρώση ανοσοφθορισμού

AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGCG (0, 40, 60 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με αντισώματα έναντι STAT3 (μονοκλωνικά IgG1 ποντικού? Cell Signaling) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι επωάζονται με δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού-ΡΙΤΟ (Sigma) μαζί με DAPI (0,5 μg /ml). Χρωματισμένο πλάκες τοποθετημένα με μέσο στερέωσης και οπτικοποιούνται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Για την καλύτερη οπτικότητα, το χρώμα του ϋΑΡΙ άλλαξε από μπλε σε κόκκινο. Το πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει την έκφραση του STAT3.

κηλίδωση Western ανάλυση

Για την ανίχνευση διαφορετικών πρωτεϊνών, AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ) πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (40 μg) διαχωρίστηκαν σε 12,5% SDS-PAGE. Μεταφέρθηκε μεμβράνες αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας 5% άπαχο ξηρό γάλα και επωάστηκαν για μία νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε 1:1,000 αραιώσεις σε TBS, ακολουθούμενη από δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού στο 1:5,000 αραιώσεις σε TBS-Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ECL υποστρώματος. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με φιλμ ακτίνων Χ χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας.

Στατιστική ανάλυση

Ο μέσος όρος και SD υπολογίστηκαν για κάθε πειραματική ομάδα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με ένα ή δύο τρόπος ANOVA χρησιμοποιώντας λογισμικό PRISM στατιστική ανάλυση (GrafPad Software, Inc., San Diego, CA). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων υπολογίστηκαν σε P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

EGCG αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, και προκαλεί δραστηριότητα caspase3

Έχει αποδειχθεί ότι η STAT3 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής κίνησης ελέγχοντας κυτταροσκελετού αναδιοργάνωση και ιδιότητες προσκόλλησης κυττάρου [33]. Λόγω της συσχέτισης μεταξύ STAT3 και την κίνηση των κυττάρων, εξετάσαμε τις επιδράσεις της EGCG για τη μετανάστευση και την εισβολή των AsPC-1 και PANC-1. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή του θαλάμου επάνω στο μη επικαλυμμένη μεμβράνη και επιστρωμένο με Matrigel μεμβράνη για τη μετανάστευση και την ανίχνευση εισβολής, αντίστοιχα. Μετά τις θεραπείες του EGCG, οι μετανάστευσαν και εισέβαλαν κύτταρα βάφτηκαν και μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μετανάστευσαν και εισέβαλαν παγκρεατικών κυττάρων μειώνεται σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Α και Β). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι EGCG μπορεί να αναστείλει τη μετανάστευση και εισβολή των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

(Α), δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο του transwell και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στο κατώτερο θάλαμο σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. δοκιμασία εισβολής (Β) Matrigel. AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν επί του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη στην κορυφή θάλαμο του transwell και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ) για 48 ώρες. Κύτταρα εισέβαλαν στον κάτω θάλαμο σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (C), Κασπάση-3 δραστικότητα. AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGCG (0-40 μΜ) για 48 ώρες, και η δραστικότητα κασπάσης-3 μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (D), AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ), με ή χωρίς γεμσιταβίνη (0,5 μΜ) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η ανάλυση της κηλίδος Western διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση της PARP και κασπάσης-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. αντίσωμα PARP αναγνωρίζει διασπασμένης ΡΑΚΡ, και της κασπάσης-3 αντίσωμα αναγνωρίζει διασπασμένης /δραστική κασπάση-3.

Η

Caspase-3 είναι ένα μέλος της (κασπάσης) οικογένειας πρωτεασών κυστεΐνης-ασπαρτικού οξέος και ενεργοποιείται στην αποπτωτική κυττάρων τόσο από εξωγενείς (συνδέτη θανάτου) και ενδογενής (μιτοχονδριακή) οδών [34]. EGCG επαγόμενη δραστικότητα της κασπάσης-3 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και στα δύο κύτταρα AsPC-1 και PANC-1, όπως μετράται με φθορομετρική δοκιμασία (Σχ. 1 C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι EGCG μπορεί να επάγει την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3.

EGCG αυξάνει γεμσιταβίνης-επαγόμενη διάσπαση του caspase3 και PARP σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

PARP κανονικά εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA, τη σταθερότητα του DNA , και άλλα κυτταρικά γεγονότα, και διασπάται από τα μέλη της οικογένειας κασπάσης κατά την πρώιμη απόπτωση? Ως εκ τούτου, είναι ένα υπόστρωμα για δραστικότητα κασπάσης και ένας αξιόπιστος δείκτης της απόπτωσης [35]. Στη συνέχεια εξετάσαμε το εάν EGCG και gemcitabine αλληλεπιδρούν μεταξύ τους για να διασπάσει κασπάσης-3 και PARP σε AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα. EGCG και gemcitabine μόνη επαγόμενη διάσπαση της κασπάσης-3 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, ο συνδυασμός του EGCG με γεμσιταβίνη επάγεται σημαντικά περισσότερο κασπάσης-3 διάσπαση από μόνο παράγοντα μόνο (Σχ. 1D). EGCG και gemcitabine μόνη έδειξαν διάσπαση PARP σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. Συγκριτικά, ο συνδυασμός του EGCG με γεμσιταβίνη είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη διάσπαση PARP. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η EGCG μπορεί να επάγει την απόπτωση μέσω της κασπάσης-3 ενεργοποίησης και διάσπαση PARP.

EGCG αναστέλλει JAK3 /STAT3 μονοπάτι στον παγκρεατικό καρκίνο

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της EGCG στην έκφραση των STAT3, φωσφορυλίωση STAT3 και ΙΑΚ3, και πυρηνική έκφραση του φωσφο-STAT3 σε AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα. Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της EGCG επί της έκφρασης STAT3, εκτελέσαμε ανάλυση qRT-PCR (Σχ. 2Α).

(Α), AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ) για 48 ώρες, και την έκφραση της STAT3 μετρήθηκε με Q-RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (Β), AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (0-60 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση των STAT3, ρ-STAT3, JAK3 και ρ-ΙΑΚ3 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C), Έκφραση STAT3 σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGCG (0-60 μΜ) για 48 ώρες. Μετά την επώαση, η έκφραση του STAT3 μετρήθηκε με immunoflurescence. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Για την καλύτερη οπτικότητα, το χρώμα του ϋΑΡΙ άλλαξε από μπλε σε κόκκινο. Το πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει την έκφραση του STAT3. Κόκκινο χρώμα = πυρήνες.

Η

EGCG ανέστειλε την έκφραση του mRNA STAT3 και στα δύο κύτταρα AsPC-1 και PANC-1. Είμαστε δίπλα μέτρησε την έκφραση της ολικής και φωσφορυλιωμένης JAK3 και STAT3 με ανάλυση κηλίδος Western (Εικ. 2Β). EGCG ανέστειλε την φωσφορυλίωση τόσο JAK3 και STAT3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. Παραδόξως, η έκφραση και των δύο JAK3 και STAT3 επίσης αναστέλλεται από EGCG. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι EGCG μπορεί να αναστέλλει την έκφραση ΙΑΚ3 και STAT3, καθώς και τροποποίηση μετά τη μετάφρασή τους.

Από STAT3 είναι συστατικώς δραστική σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε έπειτα τη EGCG επιδράσεις στην έκφραση STAT3 με ανοσοφθορισμό . Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, EGCG ανέστειλε την έκφραση του STAT3 (παρουσία του πράσινου χρώματος) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η αναστολή της απόπτωσης από EGCG συνδέεται με την καταστολή της JAK3 οδού /STAT3.

EGCG αναστέλλει τη μεταγραφή STAT3 και έκφραση γονιδίων ρυθμιζόμενων STAT3

STAT3 θεωρείται ως ένα ογκογονίδιο, διότι συσχετίζεται με την ογκογένεση [7]. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να προσδιοριστεί η επίδραση της EGCG επί STAT μεταγραφική δραστηριότητα. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGreen fire1-STAT3 πλασμίδιο ανταποκριτή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGCG (0-80 μΜ). Μετά από επώαση 24 h, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με δοκιμασία ανταποκριτή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, EGCG ανέστειλε STAT3 μεταγραφική δραστικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος AsPC-1 και PANC-1.

(Α), δραστικότητα STAT3. AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν με pGreenfire1-STAT3 πλασμίδιο ανταποκριτής. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGCG (0-80 μΜ). Μετά από επώαση 24 ωρών, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε αναγνώστη πλακός multilabel. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (Β), VEGF, Bcl-X

L, C-Myc, Survivin και Κυκλίνη D1 ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου, Ρ & lt?. 0.05

Η

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η STAT3 μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση πολλών γονιδιακών προϊόντων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, κυτταρική επιβίωση, αγγειογένεση και αντι-απόπτωση [7] . Για παράδειγμα, VEGF, Bcl-X

L, C-Myc, Survivin και Κυκλίνη D1 ρυθμίζονται από την ενεργοποίηση STAT3 [17], [36]. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 3Β, STAT3-ρυθμιζόμενα γονίδια, c-myc, Survivin και Κυκλίνη D1 ανεστάλησαν με EGCG σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. EGCG μείωσε επίσης την έκφραση του VEGF στα κύτταρα AsPC-1 και Bcl-X

L σε κύτταρα PANC-1. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι EGCG μπορεί να αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων STAT3 ρυθμιζόμενων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι STAT-3 γονιδίων-στόχων έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και την αγγειογένεση.

Αναστολή της STAT3 ενισχύει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της EGCG επί κυτταρική κινητικότητα και τη βιωσιμότητα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

σε αυτό το έργο, STAT3 shRNA χρησιμοποιήθηκε για να φιμώσουν την έκφραση του γονιδίου STAT3 στο AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. STAT3 shRNA ανέστειλε την έκφραση των STAT3 και στα δύο κύτταρα AsPC-1 και PANC-1, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση κηλίδος Western (Σχ. 4Α). Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της EGCG επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, το μηδέν και προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας και τα δύο κωδικοποιημένα και STAT3 shRNA κύτταρα. Σε δοκιμασία το μηδέν, οι ανασταλτικές επιδράσεις της EGCG για τη μετανάστευση των κυττάρων AsPC-1 ενισχύεται από την αναστολή της έκφρασης γονιδίου STAT3 (Εικ. 4Β). EGCG και STAT3 shRNA μόνο μείωσε τοις εκατό βιώσιμων AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα ανασταλτικά αποτελέσματα της EGCG επί της βιωσιμότητας των κυττάρων ενισχύθηκαν περαιτέρω με STAT3 shRNA τόσο τις κυτταρικές γραμμές.

(Α), AsPC-1 και PANC-1 επιμολύνθηκαν με STAT3 shRNA. Η έκφραση του STAT3 διεξήχθη με κηλίδωση Western. (Β), AsPC-1 δοκιμασία μηδέν. AsPC-1 κωδικοποιημένα και τα κύτταρα STAT3 shRNA καλλιεργήθηκαν σε 6 πιάτα καλά. Το μηδέν σημαδεύτηκε όταν τα πιάτα ήταν 50% συρροή. Εικόνες ελήφθησαν αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG και επωάζονται για 0, 24 και 48 ώρες. (C), κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας. AsPC-1 και PANC-1 (κωδικοποιημένα και STAT3 shRNA) κύτταρα σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGCG (0, 20, 40, 60 μΜ). Μετά από 72 ώρες αγωγής, η βιωσιμότητα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με ΧΤΤ δοκιμασία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της STAT3 shRNA για τη ρύθμιση των γονιδίων STAT3-στόχο με EGCG. EGCG ανέστειλε την έκφραση του STAT3-ρυθμιζόμενο γονίδιο Κυκλίνη D1 τόσο AsPC-1 /κωδικοποιημένα και PANC-1 /κωδικοποιημένο κύτταρα (Σχ. 5 και Β). STAT3 shRNA ανέστειλε πλήρως την έκφραση της κυκλίνης D1 σε αμφότερες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με την παρουσία ή απουσία EGCG. EGCG ανέστειλε επίσης ότι η έκφραση του Bcl-X

L και C-Myc σε PANC-1 /κωδικοποιημένα κύτταρα. Bcl-X

L και C-Myc επίσης αναστέλλεται PANC-1 /STAT3 shRNA κυττάρων σε σύγκριση με PANC-1 /Κωδικοποιημένα κύτταρα. Ωστόσο, δεν ήταν σε θέση EGCG για να αναστείλει περαιτέρω την έκφραση του Bcl-X

L και C-Myc σε PANC-1 /κυττάρων STAT3 shRNA. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι EGCG μπορεί να ρυθμίσει παγκρεατικό καρκίνο κινητικότητα και βιωσιμότητα κυττάρου οι οποίες σχετίζονται με μονοπάτι STAT3.

(Α), AsPC-1 /κωδικοποιημένα και AsPC-1 κύτταρα /STAT3 shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGCG ( 60 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση της κυκλίνης D1 μετρήθηκε με Q-RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (Β), PANC-1 /κωδικοποιημένα και PANC-1 /κύτταρα STAT3 shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGCG (60 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση της κυκλίνης D1 μετρήθηκε με Q-RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (C), PANC-1 /κωδικοποιημένα και κυττάρων PANC 1 /STAT3 shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGCG (60 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση του Bcl-X

L μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (D), PANC-1 /κωδικοποιημένα και PANC-1 /κύτταρα STAT3 shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGCG (60 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση του c-myc μετρήθηκε με Q-RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt?. 0.05

Η

Γεμσιταβίνη συνεργεί με EGCG για να αναστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Η γεμσιταμπίνη έχει αναδειχθεί ως ένα δημοφιλές χημειοθεραπευτικό παράγοντα στη θεραπεία του προχωρημένου και μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος, και το όφελος αυτού του single-παράγοντας είναι μικρή αλλά σημαντική για τη βελτίωση της διάμεση συνολική επιβίωση [19]. Για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα της γεμσιταβίνης με EGCG στη βιωσιμότητα των κυττάρων, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (0,5 μΜ), με ή χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις EGCG (0-60 μΜ) για 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η βιωσιμότητα των κυττάρων ανεστάλη με EGCG και gemcitabine και μόνο, και οι ανασταλτικές επιδράσεις της γεμσιταβίνης στη βιωσιμότητα των κυττάρων ενισχύεται περαιτέρω με EGCG σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 6Α).

(Α), AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGCG (0, 20, 40, 60 μΜ), με ή χωρίς γεμσιταβίνη (0,5 μΜ) για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΧΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (Β), AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (0, 20, 40, 60 μΜ), με ή χωρίς γεμσιταβίνη (0,5 μΜ) για 72 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με δοκιμασία TUNEL. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt? 0,05. (C), η αναστολή της STAT3 γονιδίων στόχων με EGCG και γεμσιταβίνη. AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGCG (20 μΜ) ή γεμσιταβίνη (0,5 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση του VEGF, c-myc, survivin και κυκλίνης D1was μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε επόμενο τα διαδραστικά αποτελέσματα της EGCG με γεμσιταβίνη στην απόπτωση και στις δύο AsPC-1 και PANC-1 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 6Β.). EGCG επαγόμενη απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ομοίως, gemcitabine επαγόμενη απόπτωση σε δύο κύτταρα AsPC-1 και PANC-1. Όλες οι δόσεις του EGCG ενισχυθεί περαιτέρω τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης στην απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι EGCG μπορεί να συνδυαστεί με gemcitabine για θεραπεία ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Εξετάσαμε επόμενο τις επιδράσεις της EGCG και gemcitabine για την έκφραση του c-myc και κυκλίνη D1 σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1 (Εικ. 6C). EGCG και gemcitabine μόνη ανέστειλε την έκφραση του VEGF, c-myc, survivin και κυκλίνης D1was σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Ο συνδυασμός του EGCG και gemcitabine είχαν προσθετικά αποτελέσματα επί αυτών των γονιδίων-στόχων. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι EGCG μπορεί να ενισχύσει το θεραπευτικό δυναμικό της γεμσιταβίνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με αναστολή STAT3.

αναστολέα JAK3 CP690550 αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

CP690550 είναι ένας νέος αναστολέας JAK3 και αναμένεται να στοχεύσει JAK3, η οποία εκφράζεται γενικά μόνο σε κύτταρα του ανοσοποιητικού και δεσμεύεται μόνο με υποδοχείς κυτοκινών γάμμα αλυσίδα που φέρει εμπλέκονται στην /STAT οδού σηματοδότησης JAK [37]. Εξετάσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της CP690550 στη βιωσιμότητα κυττάρου σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1 (Εικ. 7). CP690550 ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CP690550 μπορεί να είναι ένα δυναμικό αντικαρκινικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

(Α), κύτταρα AsPC-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 4 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και κατεργάζεται με CP690550 (0-15 μΜ) για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΧΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (Β), κύτταρα PANC-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 4 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και κατεργάστηκαν με CP690550 (0-15 μΜ) για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΧΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt?. 0.05

Η

CP690550 συνεργεί με EGCG για να αναστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Από CP690550 απόπτωση που επάγεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, εμείς επόμενο ζητείται για να εξετάσει τα διαδραστικά αποτελέσματα της CP690550 και EGCG στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων (Εικ. 8). Όπως φαίνεται στο Σχ.