Αφηρημένο

Στόχος

Για να αξιολογήσει τις αλλαγές του πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β (NF-κΒ) κατά τη διάρκεια ραδιενεργό ιώδιο 131 (

131I) θεραπεία και αν η αναστολή του NF-κΒ θα μπορούσε να ενισχύσει

131I-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς (DTC) κατά συνεργικό τρόπο.

Μέθοδοι

χρησιμοποιήθηκαν τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές DTC. αναστολή ΝΡ-κΒ επιτεύχθηκε με τη χρήση ενός αναστολέα του ΝΡ-κΒ (Bay 11-7082) ή με ρ65 μορφομετατροπή siRNA. δοκιμασία μεθυλ-θειαζολυλ-τετραζόλιο διεξήχθη για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. δοκιμασία δέσμευσης DNA, δοκιμασία λουσιφεράσης, και κηλίδα Western εγκρίθηκαν για τον προσδιορισμό της λειτουργίας και την έκφραση αλλαγές NF-κΒ. Στη συνέχεια, ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται αντι-αποπτωτικών παραγόντων ΧΙΑΡ, cIAP1, και Bcl-xL μετρήθηκαν. Η απόπτωση αναλύθηκε με κηλίδα Western για κασπάσης 3 και PARP, και με κυτταρομετρία ροής, καθώς και. Μία δοκιμασία πρόσληψης ιωδιούχο εκτελέστηκε για να καθοριστεί εάν η αναστολή του NF-κΒ θα μπορούσε να επηρεάσει την πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου.

Αποτελέσματα

Η δοκιμασία μεθυλ-θειαζολυλ-τετραζόλιο έδειξαν σημαντική μείωση των βιώσιμων κυττάρων με συνδυαστική θεραπεία παρά με μονο-θεραπείες. Η δοκιμασία δοκιμασίας και αναφοράς λουσιφεράσης δέσμευσης DNA έδειξε βελτιωμένη λειτουργία και ρεπόρτερ γονίδιο δραστηριότητες ΝΡ-κΒ λόγω

131I, ακόμη σημαντική καταστολή επιτεύχθηκε με την αναστολή του NF-κΒ. κηλίδα Western αποδείχθηκε

131I θα μπορούσε να αυξήσει τη συγκέντρωση των πυρηνικών ΝΡ-κΒ, ενώ η αναστολή του NF-κΒ μειωμένη συγκέντρωση ΝΡ-κΒ. κηλίδος Western κατέδειξε επίσης σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω του ΧΙΑΡ, cIAP1, και Bcl-xL μετά

θεραπεία 131I. Και η αναστολή του NF-κΒ θα μπορούσε σημαντικά κάτω-ρύθμιση αυτών των παραγόντων. Τέλος, συνέργεια που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία επιδείχθηκε από σημαντικές βελτιώσεις του διασπασμένη κασπάση 3 και PARP από κηλίδα Western, και αννεξίνης V θετικά χρώση από κυτταρομετρία ροής. Η δοκιμασία πρόσληψης ιωδίου δεν δείχνουν σημαντικές αλλαγές κατά τη NF-κΒ ανεστάλη.

Συμπέρασμα

Έχουμε αποδείξει ότι

131I θα μπορούσε να προκαλέσει την ενεργοποίηση του NF-κΒ, η οποία θα μετριάσει

131I αποτελεσματικότητα στην DTC κύτταρα. NF-κΒ αναστολή από τον κόλπο 11-7082 ή p65 επιμόλυνση siRNA ήταν αποτελεσματική στην καταστολή NF-κΒ ρυθμιζόμενη αντι-αποπτωτικών αλλαγές και σε συνδυασμό απόπτωση σχήμα επιτεύχθηκε συνεργικά

Παράθεση:. Meng Z, Lou S, Ταν J, K Xu, Jia Q, W Zheng (2012) Πυρηνική Παράγοντας-Kappa B αναστολή μπορεί να ενισχύσει απόπτωση των διαφοροποιημένων καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων που επάγεται από

131I. PLoS ONE 7 (3): e33597. doi: 10.1371 /journal.pone.0033597

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 7 Οκτώβρη του 2011? Αποδεκτές: 12η Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση Κίνα Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών 30900376, βασικό έργο της Tianjin Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Επιτροπή χορηγεί 10JCZDJC19000, Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο Επιστημονικής Έρευνας χορηγήσει 2008KY20, και Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο New Century εξαιρετικό πρόγραμμα ταλέντο (απονέμεται σε ΖΜ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

θυρεοειδούς όζος είναι ένα πολύ κοινό κλινικό πρόβλημα και ο καρκίνος του θυρεοειδούς είναι όλο και πιο διαδεδομένη στις μέρες μας [1]. Διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς (DTC), περιλαμβανομένου του θηλώδους και θυλακιώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, περιλαμβάνει την πλειονότητα όλων των καρκίνων του θυρεοειδούς. Αν και η γενική πρόγνωση για το DTC είναι καλό, αν ολική θυρεοειδεκτομή και ραδιενεργό ιώδιο 131 (

131I) εφαρμόζονται θεραπείες [2], οι ασθενείς με

131I-πυρίμαχων μεταστάσεις θα μπορούσε να επιτύχει μόνο ένα ποσοστό επιβίωσης 10 ετών 10% [3] , [4]. Και για ορισμένες περιπτώσεις, ακόμα και

131I-άπληστος βλάβες δεν μπορούσε να ελεγχθεί με επιτυχία από

θεραπεία 131I και μόνο [5]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων μεθόδων για την καταπολέμηση του καρκίνου είναι επειγόντως αναγκαία για τον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Τα τελευταία χρόνια, ένας αριθμός ένοχος μοριακών στόχων έχουν ταυτοποιηθεί στην καρκινογένεση DTC [6], [7], [8]. Μεταξύ αυτών, μια αναδυόμενη σώμα του στοιχεία δείχνουν ότι πυρηνικό παράγοντα-κάπα Β (ΝΡ-κΒ) παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον καρκίνο του θυρεοειδούς, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου [6], [7], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Είναι, επίσης, αποδειχθεί ότι ΝΡ-κΒ επαγωγής με χημειοθεραπεία ή ραδιοθεραπεία θα μπορούσαν να εξασθενήσουν θεραπευτικές αποτελεσματικότητες. Και η αναστολή του ΝΡ-κΒ θα μπορούσε να προωθήσει την απόπτωση του θυρεοειδούς των καρκινικών κυττάρων, και να επιτευχθεί συνεργιστικά αποτελέσματα [8], [9], [10], [11], [12]. Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχει υπάρξει καμία μελέτη που διερεύνησε τη σχέση μεταξύ του NF-κΒ και

θεραπεία 131I στο DTC, παρά τη σημασία της

θεραπεία 131I στο DTC διαχείρισης.

Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν να αξιολογήσει τις αλλαγές του NF-κΒ κατά τη διάρκεια

θεραπεία 131I. Και έχουμε ως στόχο επίσης να καθοριστεί αν συνδυασμό με έναν αναστολέα του ΝΡ-κΒ ή μία μικρή παρεμβολή RNA (siRNA) την επιμόλυνση θα μπορούσε να ενισχύσει

131I-επαγόμενη απόπτωση σε DTC κατά συνεργικό τρόπο.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Οι ανθρώπινες κυτταρικές θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς γραμμές KTC-1, TPC-1 και θυλακιώδη κύτταρα καρκίνωμα του θυρεοειδούς γραμμή WRO ευγενικά από τον Dr. Shunichi Yamashita και ο Δρ Norisato Mitsutake (Τμήμα Μοριακής Ιατρικής , Atomic Bomb Ινστιτούτο Νόσων, Πανεπιστήμιο του Ναγκασάκι Graduate School Βιοϊατρικών Επιστημών, Ναγκασάκι, Ιαπωνία). κύτταρα DTC αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο απαραίτητο μέσο Dulbecco (GIBCO BRL, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 5% εμβρυϊκό βόειο ορό (GIBCO BRL, ΝΥ, USA), 1% (w /v) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) και 1 mU /mL θυρεοτροπίνης (Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C.

Η επιμόλυνση με siRNA

SMARTpool NF -κB siRNAs p65 ήταν εμπορικά σχεδιάστηκε από Dharmacon (Dallas, TX, USA). Η πισίνα του siRNAs περιείχε τα p65-ειδικές αλληλουχίες. Κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια (AATTCTCCGAACGTGTCACGT ακολουθίας) συντέθηκαν χημικά με SBS Genetech (Πεκίνο, Κίνα) και αναλύθηκε σε μια αναζήτηση BLAST να αποκλείσει ομολογία με p65 ή άλλα γονίδια [15]. Όταν τα κύτταρα DTC ήταν στο 50% -60% συρροή, η επιμόλυνση του ρ65 SMARTpool siRNAs (100 nmol /L), κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια (100 nmol /L) ή καθόλου ολιγονουκλεοτίδιο (έλεγχος) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για 6 ώρες στους 37 ° C σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε νέα μέσα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή να συλλέγεται όπως υποδεικνύεται.

μεθυλ-θειαζολυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ)

DTC κύτταρα (100 μΐ, 6.000 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 48 ώρες πριν από κάθε θεραπεία. Στη συνέχεια, νέα μέσα άλλαξαν, και

131I (Πεκίνο Atom Hightech, Πεκίνο, Κίνα) ή κόλπο 11-7082 (Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) προστέθηκαν προκειμένου να επιτευχθεί η τελική

συγκεντρώσεις ραδιενέργειας 131I 5, 10, 20, 50, 100 και 200 ​​MBq /ml ή τελικές Bay 11-7082 συγκεντρώσεις 1, 2, 5, 10 και 20 mmol /L σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε θεραπείες για 48 ώρες, και 6 επαναλήψεις χρησιμοποιήθηκαν για κάθε συγκέντρωση είτε του φαρμάκου. Στις κοιλότητες ελέγχου DMSO προστέθηκε, και τελική συγκέντρωση του DMSO δεν υπερέβαινε το 0,2% σε οποιαδήποτε καλά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΜΤΤ (50 μg /φρεάτιο, Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) για 1 ώρα στους 37 ° C. Η παραγόμενη φορμαζάνη διαλύθηκε με 150 μΙ /φρεάτιο DMSO, και μετρήθηκαν οι οπτικές πυκνότητες των φρεατίων στα 450 nm με Αναγνώστη Πλακός Multiskan MS (Labsystems, Helsinki, Finland).

Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών DTC μετά την επιμόλυνση siRNA μετρήθηκε επίσης με προσδιορισμό ΜΤΤ. Μετά την επιμόλυνση με p65 siRNA, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή κανένας έλεγχος ολιγονουκλεοτιδίου, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν ως 6 αντιγράφεται σε πλάκες 96-φρεατίων σε συγκέντρωση 6000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 MBq /ml του

131I για 48 ώρες. Στη συνέχεια ΜΤΤ διεξήχθη ως ανωτέρω.

Παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων

Μετά διάφορες θεραπείες, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής περιεκτικότητας άλατος [9]. Για συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης, που συγκομίζονται κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X, 50 mM NaF, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM νάτριο ορθοβαναδικό και 2 mM phenylmethyisulfonylfluoride) για 20 λεπτά επί πάγου. Στη συνέχεια, προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε επί 15 λεπτά στις 14.000 rpm, και το υπερκείμενο αποθηκεύθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Για πυρηνική πρωτεΐνη, συγκομίζονται κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 400 μΙ ρυθμιστικού λύσης (10 mM HEPES ρΗ 7.9, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 0.5 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,5 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο και 0,1% Nonidet Ρ-40) για 20 λεπτά επί πάγου. Στη συνέχεια λύμα φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 14.000 rpm. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 40 μι ρυθμιστικού πυρηνικού εκχυλίσματος (20 mM HEPES ρΗ 7,9, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο και 20% γλυκερίνη) για 20 λεπτά σε πάγος. Μετά φυγοκέντρησης για 15 λεπτά στις 14.000 rpm, το υπερκείμενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με κιτ δοκιμασίας αντιδραστήριο δικιγχονινικού οξέος (Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA).

δέσμευσης DNA

δοκιμασίας

Ο πολλαπλών φρεατίων χρωματομετρική δοκιμασία για την ενεργό ΝΡ-κΒ διεξήχθη [9]. Εν συντομία, ίση ποσότητα πυρηνικών εκχυλισμάτων επωάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων επικαλυμμένες με ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει μία θέση σύνδεσης συναινετική NF-κΒ. σύνδεση με το ολιγονουκλεοτίδιο στόχου ΝΡ-κΒ ανιχνεύθηκε με πρωτογενές αντίσωμα ειδικό για ρ65 υπομονάδα και συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστηριότητας, οπτικές πυκνότητες μετρήθηκαν σε 450 nm με μια πλάκα αναγνώστη Multiskan MS.

Λουσιφεράσης δοκιμασία

DTC κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 400 ng του PNF-κΒ-Ιυο (Clontech, Mountain View, CA, USA) και 4 ng του pRL-SV40 (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Το πλασμίδιο pRL-SV40 με ένα cDNA που κωδικοποιεί

Renilla

λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος σε κάθε πείραμα [16]. Τα κύτταρα αναπαύονται επί 12 ώρες μετά την επιμόλυνση, στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς

131I, ή με συνδυασμένη θεραπεία του

131I συν Bay 11-7082 για 6 ώρες. Δραστηριότητες της πυγολαμπίδας και

ΚβηϊΙΙθ

λουσιφεράσεις καθορίστηκαν διαδοχικά από ένα μόνο δείγμα με το σύστημα Dual-λουσιφεράσης Δοκιμασία (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιώντας ένα Lumat LB 9507 φωτόμετρο (Bethold Technologies, Bad Wildbad, Γερμανία ).

DTC κύτταρα συν-επιμολυσμένα με PNF-κΒ-Luc και pRL-SV40 στις 24 ώρες μετά την p65 siRNA ή αγωνίζομαι επιμόλυνση [15]. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 MBq /ml του

131I για 6 ώρες. Στη συνέχεια, οι δραστηριότητες του γονιδίου αναφοράς προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

κηλίδος Western

Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν με SDS-PAGE σε γέλες πολυακρυλαμιδίου 10% ή 15%. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, NJ, USA) με semidry blotting. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα /0.1% Tween 20 (TBST) που περιέχει 5% γάλα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια ανοσο-κηλιδώθηκαν με κατάλληλα αραιωμένα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα κατέστησαν ορατά σε σύστημα απεικόνισης iChemi XR (Syngene, MD, ΗΠΑ) με τη χρήση αντιδραστηρίων χημικής φωταύγειας (Millipore, ΜΑ, USA). Ημι-ποσοτικοποίηση έγινε με Ποσότητα Μία έκδοση λογισμικού 4.6.2 (Bio-Rad, CA, USA). Αντισώματα για ΝΡ-κΒ ρ65, φυλοσύνδετη αναστολέας της απόπτωσης (ΧΙΑΡ), λέμφωμα Β-κυττάρου πολύ μεγάλο (Bcl-XL), διασπασμένη κασπάση 3, πολυ-ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP) και β-ακτίνη ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Αντίσωμα για την κυτταρική αναστολέας της απόπτωσης 1 (cIAP1) ήταν από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). Και αντισώματος για πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) ήταν από BD Transduction Laboratories (San Jose, CA, USA).

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των αποπτωτικών κυττάρων

Μετά από 24 ώρες διαφορετικές θεραπείες, προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και 4 χ 10

5 κύτταρα διπλό χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα Ca

2 + εμπλουτισμένο ρυθμιστικό σύνδεσης (BD Pharmingen, CA , USA) και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ροή FACSAria ™ κυτταρόμετρο (BD Biosciences, CA, USA). FITC και προπίδιο ιωδίδιο των εκπομπών ανιχνεύθηκαν σε FL-1 και FL-3 κανάλια, αντίστοιχα. Η ανάλυση έγινε με το λογισμικό Cell Quest (BD Biosciences, CA, USA).

Ιωδιούχο πρόσληψη δοκιμασία

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή του ΝΡ-κΒ μπορεί να επηρεάσει την πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου, δοκιμασία πρόσληψης ιωδιούχο διεξήχθη όπως που περιγράφεται από τους Weiss et al. [17] με κάποιες τροποποιήσεις. κύτταρα KTC-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 5 μmol /L Bay 11-7082 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 1 mL νέο μέσο ανά φρεάτιο, που περιέχει 37 KBq Na

125I (Πεκίνο Atom Hightech, Πεκίνο, Κίνα), για 1 ώρα. Στη συνέχεια, το

125Ι περιέχον μέσο αποχύθηκε. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επεξεργασία με θρυψίνη για μέτρηση συνολικού αριθμού κυττάρων. Τέλος ραδιενέργεια των κυττάρων μετρήθηκε με ένα μετρητή γ (LKB 1261 Gamma Counter, Wallac, Turku, Φινλανδία).

Για να μετρηθεί ιωδιούχο αλλαγές πρόσληψης μετά siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα KTC-1 επιμολυσμένα με p65 siRNA, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή καθόλου έλεγχος ολιγονουκλεοτίδιο μεταφέρθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρούσα του Na

125I για 1 ώρα. Στη συνέχεια, ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε και μετρήθηκε η ραδιενέργεια.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Στατιστικά πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 15.0 (SPSS Inc., IL, USA). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ή ανεξάρτητα δείγματα

T

-δοκιμή. Λιγότερο σημαντική διαφορά δοκιμής (LSD) χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων.

P

αξία δεν υπερβαίνει τα 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση του

131I, Bay 11-7082 και siRNA θεραπείες

ΜΤΤ δοκιμασία έγινε μετά από 48 ώρες από διάφορες θεραπείες, και κυτταρικές βιωσιμότητες υπολογίστηκαν με βάση το συνολικό αριθμό των κυττάρων που αναπτύσσονται χωρίς οποιαδήποτε θεραπευτική παρέμβαση. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, τα ποσοστά επιβίωσης των τριών κυτταρικών γραμμών έδειξε αντίστροφη σχέση προς

συγκεντρώσεις ραδιενέργειας 131I και Bay 11-7082 συγκεντρώσεις δοσολογίας. Για τις ακόλουθες

in vitro

πειράματα,

συγκέντρωσης ραδιενέργειας 131I και Bay 11-7082 συγκέντρωση δόσης προσδιορίστηκαν ως 20 MBq /ml και 5 μmol /L, αντίστοιχα. Το σχήμα 1C έδειξαν ότι, με ANOVA, διαφορετική μεταχείριση προκάλεσε διαφορετικών αυξητικών-ανασταλτικά αποτελέσματα (

P

& lt? 0,01). Και LSD αποκάλυψε σημαντική μείωση των βιώσιμων κυττάρων με συνδυαστική θεραπεία από είτε μονο-θεραπεία (

P

& lt? 0,01).

Μετά από έκθεση σε δεικνυόμενες συγκεντρώσεις Bay 11-7082 (Α), συγκεντρώσεις ραδιενέργειας του

131I (Β) ή συνδυασμένες θεραπείες (C) για 48 ώρες, οι κυτταρικές βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Μετά DTC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς έλεγχο ολιγονουκλεοτίδιο, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή διαμόλυνση ρ65 siRNA, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς

131I (20 MBq /ml) για 48 ώρες, και ΜΤΤ διεξήχθη (D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα

Η

Εικόνα 1Δ έδειξε ότι κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια επιμόλυνση δεν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DTC, ενώ siRNA επιμόλυνση θα μπορούσε να επιτύχει προφανές ανασταλτική δράση (

P

& lt.? 0.05). Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία θα μπορούσε να προκαλέσει σημαντικά ισχυρότερη κυτταρικό θάνατο είτε από

θεραπεία 131I ή siRNA επιμόλυνση (

P

& lt? 0,01).

Επιπτώσεις των διαφόρων θεραπειών για NF-κΒ

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

131I για NF-κΒ, πραγματοποιήσαμε ανάλυση DNA-δέσμευσης χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα από

131I-θεραπεία DTC κύτταρα για 6, 24 και 48 ώρες με μη επεξεργασμένα κύτταρα ως μάρτυρα. λειτουργία του ΝΡ-κΒ αυξάνεται κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της

131I μονο-θεραπεία, φθάνοντας κορυφές σε 24 ώρες χρονικό σημείο για KTC-1 και WRO κύτταρα. Ωστόσο, ο συνδυασμός με Bay 11-7082 μπορούσε σημαντικά μειωμένη λειτουργία του ΝΡ-κΒ (Σχήμα 2Α). Στα παραπάνω τρία χρονικά σημεία, σημαντική αναστολή του NF-κΒ δείχθηκε με

T

-δοκιμή στις συνδυασμένες θεραπείες από

131I μονο-θεραπείες και στις τρεις κυτταρικές γραμμές (

P

& lt ? 0,01). κύτταρα DTC επίσης επιμολυνθεί με p65 siRNA, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή χωρίς έλεγχο ολιγονουκλεοτιδίων. Στη συνέχεια τρεις ομάδες όλων των κυτταρικών σειρών εκτέθηκαν σε

131I για 24 ώρες. Παρά το γεγονός ότι η λειτουργία του ΝΡ-κΒ έντονα επάγεται από

131I σε αμφότερες τις ομάδες ελέγχου και σκαρφάλωμα, σημαντική καταστολή θα μπορούσε να ληφθεί με ρ65 siRNA διαμόλυνση (Σχήμα 2Β) σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (

P

& lt? 0,01) .

(Α) DTC κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με

131I (20 MBq /ml) ή σε συνδυασμό με Bay 11-7082 (5 μmol /L) για 6, 24 και 48 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και δοκιμασία πρόσδεσης DNA-έγινε. (Β) DTC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς έλεγχο ολιγονουκλεοτίδιο, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή διαμόλυνση ρ65 siRNA. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε

131I για 24 ώρες, και δοκιμασία πρόσδεσης DNA-εκτελέστηκε. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

δραστικότητα αποκρινόμενο υποκινητή ΝΡ-κΒ διεξήχθη επίσης (Σχήμα 3). Βρήκαμε ότι

131I ενισχυθεί σημαντικά τις δραστηριότητες γονίδιο ανταποκριτή ΝΡ-κΒ, έως περίπου 2.5, 1.7 και 3.0 πτυχώσεις σε KTC-1, κυτταρικές γραμμές WRO TPC-1 και (

P

& lt? 0,05). Παρ ‘όλα αυτά, ο συνδυασμός με Bay 11-7082 θα μπορούσε να αναστείλει τις λειτουργίες του NF-κΒ σε περίπου 0,16, 0,14 και 0,24 πτυχώσεις των προκαλούμενων επίπεδα στο KTC-1, κυτταρικές σειρές WRO TPC-1 και (

P

& lt? 0,01) . Και διαμόλυνση ρ65 siRNA θα μπορούσε να μειώσει τις λειτουργίες του ΝΡ-κΒ σε σχεδόν 0,14, 0,14 και 0,26 πτυχώσεις των προκαλούμενων επίπεδα αντίστοιχα (

P

& lt? 0,01).

(Α) DTC κύτταρα επιμολύνθηκαν με PNF-κΒ-Luc, και pRL-SV40 υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν με

131I (20 MBq /ml), ή σε συνδυασμό με Bay 11-7082 (5 μmol /L) για 6 ώρες. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ ανιχνεύθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. (Β) Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με περιπλεγμένο ολιγονουκλεοτίδια ή ρ65 siRNA, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με PNF-κΒ-Luc και pRL-SV40. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με

131I (20 MBq /ml) για 6 ώρες. Στη συνέχεια, προσδιορισμός λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα επίπεδα πυρηνικής πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ 6 ώρες μετά διαφορετικές θεραπείες με στύπωμα Western (Σχήμα 4). Οι ποσότητες των p65 αυξήθηκε σε

ομάδες 131I σε όλες τις κυτταρικές σειρές, αλλά καταστέλλεται προφανώς όταν Bay 11-7082 προστέθηκε στη θεραπεία συνδυασμού. Τα παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με επιμόλυνση p65 siRNA, ενώ κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια διαμόλυνσης δεν θα μπορούσε να επιτύχει τέτοια αποτελέσματα.

DTC κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως μάρτυρες (Α), ή επεξεργασία με 20 MBq /ml

131I (Β ) ή σε συνδυασμό με 5 μmol /L Bay 11-7082 (C) για 6 ώρες. Στη συνέχεια, τα εκχυλίσματα πυρηνική πρωτεΐνη εξετάστηκαν για ΝΡ-κΒ ρ65 με κηλίδα Western. Στο δεύτερο σύνολο πειραμάτων, τα κύτταρα ελέγχου αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (D). Μετά καμία ολιγονουκλεοτίδιο (Ε), ως κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδια (F) ή ρ65 siRNA (G) επιμόλυνση, DTC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

131I (20 MBq /ml) για 6 ώρες. Στη συνέχεια αναλύθηκαν τα επίπεδα πυρηνική πρωτεΐνη του ΝΡ-κΒ ρ65. PCNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για πυρηνικές πρωτεΐνες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

αποτελέσματα διαφορετικών θεραπειών επί ΝΡ-κΒ ρυθμιζόμενη αντι-αποπτωτικών παραγόντων

Δεδομένου ότι είναι ισχυροί αναστολείς της απόπτωσης, ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-xL τα γονίδια στόχοι θετικά ρυθμίζονται από ΝΡ-κΒ [7], [18]. Δοκιμάσαμε Τι επηρεάζει διαφορετικές θεραπείες θα μπορούσαν να προκαλέσουν σε αυτούς με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας KTC-1 ως εκπρόσωπος κυτταρική γραμμή (Σχήμα 5). Παρά ορισμένα βασικά επίπεδα των ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-XL,

131I αυξημένη ΧΙΑΡ σε 5,5-5,7 πτυχώσεις, cIAP1 σε 4.8 έως 6.7 πτυχώσεις και Bcl-xL σε 3.6 έως 5.1 πτυχώσεις, αντίστοιχα. Ωστόσο, μετά από συνδυασμό με Bay 11-7082, ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-xL εκφράσεις πρωτεΐνης μειώνεται σημαντικά σε 0,09, 0,10 και 0,17 πτυχώσεις των αυξημένα επίπεδα αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση p65 siRNA, αυτές οι εκφράσεις πρωτεΐνης αναστέλλεται σημαντικά σε 0,07, 0,06 και 0,10 αντίστοιχα πτυχώσεις. ANOVA και LSD αποκάλυψε σημαντικές αυξήσεις των παραγόντων αυτών σε

ομάδες 131I σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου (

P

& lt? 0.01), και σημαντικές μειώσεις τους σε ομάδες συνδυασμό από ό, τι σε

ομάδες 131I (

P

& lt?. 0.01)

KTC-1 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως μάρτυρες (Α), ή επεξεργασία με 20 MBq /ml

131I (Β) ή σε συνδυασμό με 5 μmol /L Bay 11-7082 (C) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου εξετάστηκαν με κηλίδα Western για ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-XL. Στο δεύτερο σύνολο πειραμάτων, τα κύτταρα ελέγχου αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (D). Μετά καμία ολιγονουκλεοτίδιο (Ε), ως κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδια (F) ή ρ65 siRNA (G) επιμόλυνση, τα κύτταρα KTC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

131I (20 MBq /ml) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν τα επίπεδα πρωτεΐνης ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-XL. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συνεργιστικά αποτελέσματα ανιχνεύθηκαν σε συνδυαστικές θεραπείες

Πρώτον, κηλίδα Western εφαρμόστηκε για την ανίχνευση μεταβολών της κασπάσης 3 (ένα κλειδί απόπτωση εκτελεστή) και PARP (ένας κύριος στόχος της κασπάσης 3). Δείξαμε ότι αν και κάθε παρέμβαση θα μπορούσε να προκαλέσει διασπάσεις της κασπάσης 3 (υπομονάδες p19 και p17) και PARP (σελ.89), τα επίπεδά τους αυξήθηκε σημαντικά περαιτέρω με συνδυασμό θεραπειών (Σχήμα 6). Στον Πίνακα 1, ANOVA και LSD έδειξαν σημαντικές βελτιώσεις σε συνδυασμένες θεραπείες σε σχέση με το μονο-θεραπείες (

P

& lt? 0,05). Στη συνέχεια, για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα επί της απόπτωσης, διπλό κυτταρομετρία ροής χρώση διεξήχθη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ κάθε θεραπεία θα μπορούσε να επάγει απόπτωση, σε συνδυασμό θεραπειών αυξημένη απόπτωση συνεργιστικά λόγω σημαντικές βελτιώσεις αννεξίνης V θετικά χρωσμένων κυττάρων (Σχήμα 7 και Πίνακας 1).

KTC-1 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως μάρτυρες (Α ), ή επεξεργασία με 20 MBq /ml

131I (Β), 5 μmol /L Bay 11-7082 (C) ή συνδυασμός (D) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου εξετάστηκαν με κηλίδα Western για κασπάσης 3 και PARP. Στο δεύτερο σύνολο πειραμάτων, τα κύτταρα KTC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς έλεγχο ολιγονουκλεοτίδιο (Ε), ως κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδια (F) ή ρ65 siRNA διαμόλυνση (G) για πρώτη φορά. Στη συνέχεια, αυτές οι τρεις ομάδες κυττάρων εκτέθηκαν σε

131I (20 MBq /ml) για 24 ώρες (H-J). Κασπάσης 3 και PARP πρωτεΐνη επίπεδα εξετάστηκαν με κηλίδα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα

Η

Το πρώτο σύνολο πειραμάτων περιελάμβανε τέσσερις ομάδες:. Κύτταρα KTC-1 δεν έλαβε καμία θεραπεία (Α), 20 MBq /ml

131I (Β), 5 μmol /L Bay 11-7082 (C) ή συνδυασμός (D) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, διπλό χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο ιωδιούχο αννεξίνη V και προπίδιο, και στη συνέχεια υποβάλλεται για κυτταρομετρία ροής. Στο δεύτερο σύνολο πειραμάτων, τα κύτταρα KTC-1 υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία χωρίς έλεγχο ολιγονουκλεοτίδιο (Ε), ως κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδια (F) ή ρ65 siRNA διαμόλυνση (G). Στη συνέχεια, αυτές οι τρεις ομάδες κυττάρων εκτέθηκαν σε

131I (20 MBq /ml) για 24 ώρες (H-J). Και κυτταρομετρία ροής διεξήχθη. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

ιωδιούχου πρόσληψη στα κύτταρα DTC σύμφωνα με NF-κΒ μπλοκάρει

Για να προσδιορίσετε αν επηρεάζει η αναστολή του NF-κΒ οδού ιωδίου πρόσληψη, εμείς δοκιμαστεί ραδιενεργό αλλαγές πρόσληψη ιωδίου, με ή χωρίς αναστολή NF-κΒ από τον κόλπο 11-7082 ή επιμόλυνση p65 siRNA. Σχήμα 8 απέδειξε ότι υπήρχαν μόνο μικρές αλλαγές μετά από θεραπευτικές παρεμβάσεις, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές (

P

& gt? 0,05)., Η οποία έδειξε ότι η NF-κΒ δεν ελέγχουν την πρόσληψη ιωδίου στα κύτταρα KTC-1

(Α) KTC-1 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με Bay 11-7082 (5 μmol /L) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία Na

125Ι (37 KBq /ml) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε. Στη συνέχεια, μετρήθηκε η ραδιενέργεια. (Β) κύτταρα KTC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ολιγονουκλεοτίδιο χωρίς έλεγχο, ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια ή ρ65 μορφομετατροπή siRNA πρώτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Na

125I, και μετρήθηκε η ραδιενέργεια. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Η πιο αποτελεσματική μετα-χειρουργική θεραπεία του DTC αλλοιώσεων είναι

θεραπεία 131I, λόγω της εγγενούς ικανότητας του καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα να επικεντρωθεί ιώδιο.

131I εκπέμπει σύντομο μήκος διαδρομής (0.5-2.2 mm) β-ακτινοβολία η οποία είναι κυτταροτοξική για τα κύτταρα, το οποίο είναι εγγενώς πολύ παρόμοια με την εξωτερική ακτινοθεραπεία. Ωστόσο, αυτή η μεθοδολογία είναι αναποτελεσματική σε ασθενείς των οποίων οι όγκοι επικεντρώνονται πλέον

131I αποτελεσματικά [4], [19], [20]. Ελέγξαμε την υπόθεση μας σε αυτή τη μελέτη, ότι το NF-κΒ θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που ρυθμίζει την αντι-αποπτωτική διαδικασία κατά τη διάρκεια

θεραπεία 131I. NF-κΒ έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλούς τύπους καρκίνου [14], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς [7], [8], [13], [21], [22], η οποία προανήγγειλε αναζητήσεων για φάρμακα ικανά να καταστέλλουν δραστικότητα ΝΡ-κΒ [7], [18]. Μέχρι τώρα, ένας αριθμός αναστολέων ΝΡ-κΒ έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του θυρεοειδούς, για παράδειγμα, SN50, DHMEQ, bortezomib και Bay 11-7082. Και όταν χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, θα μπορούσε να επιτευχθεί συνεργία [9], [10], [11], [12]. Μια άλλη προσέγγιση του p65 siRNA μετεμβολιασμού έχει δοκιμαστεί σε πολλούς τύπους καρκίνων [15], [23], [24], [25], και ενισχυμένη χημειοευαισθησία καταδείχθηκε επίσης [15], [23]. Ωστόσο, η συνδυασμένη θεραπεία συμπεριλαμβανομένης της p65 siRNA επιμόλυνσης δεν έχει δοκιμαστεί στον καρκίνο του θυρεοειδούς μέχρι στιγμής.

Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα της

131I για NF-κΒ λειτουργία και έκφραση σε DTC κύτταρα αναλύθηκαν για πρώτη φορά. DNA-δοκιμασία δέσμευσης έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ αυξήθηκε δραματικά στις 6 ώρες σημείο του χρόνου, φθάνοντας κορυφές σε 24 ώρες χρονικό σημείο για KTC-1 και WRO κύτταρα. Αυξημένη ενεργοποίηση ρεπόρτερ του ΝΡ-κΒ έχει επίσης αποδειχθεί με δοκιμασία λουσιφεράσης. Ωστόσο, αυτές οι ενεργοποιήσεις θα μπορούσαν να κατασταλεί σημαντικά από έναν αναστολέα του ΝΡ-κΒ ή με ρ65 μορφομετατροπή siRNA. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε δεδομένα κηλίδος Western για να δείξει ότι

131I θα μπορούσε να αυξήσει τα επίπεδα της πυρηνικής πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ, ενώ Bay 11-7082 ή διαμόλυνση ρ65 siRNA θα μπορούσε να αναστείλει δραματικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ.

ΝΡ-κΒ διαμεσολαβείται αντι-απόπτωση εξαρτώνται ουσιαστικά από την ικανότητά της να ενισχύσει μεταγραφές του κυτταρικού θανάτου κατασταλτικής γονίδια [7], [18], [26]. Οι πιο αντιπροσωπευτικές ΝΡ-κΒ ελεγχόμενης αντι-αποπτωτική παράγοντες είναι ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-XL, η οποία μπορεί να αποτρέψει των καρκινικών κυττάρων θανάτωσης επιδράσεις [7], [18]. ΧΙΑΡ μπορούν να αναστείλουν κασπάσης 3 και 7, και είναι επίσης εμπλέκεται στην καταστολή της δραστικότητας προ-αποπτωτικών JNK. cIAP1 είναι ένας άλλος ισχυρός αναστολέας της απόπτωσης, η οποία μπορεί να δεσμεύει και να αναστέλλει κασπάσης 3 και 8. και Bcl-xL είναι γνωστό ότι αναστέλλει την απελευθέρωση κυτοχρώματος Ο από μιτοχόνδρια. Σε αυτή την έρευνα, διαπιστώσαμε ότι ΧΙΑΡ, cIAP1 και Bcl-xL ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα μετά από έκθεση σε

131I. Η αναστολή της NF-κΒ από τον κόλπο 11-7082 ή p65 επιμόλυνση siRNA κατά τη διάρκεια

έκθεσης 131I θα μπορούσε να αλλάξει την ισορροπία προς την κατεύθυνση σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των παραγόντων.

Στη συνέχεια, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η δυνατότητα συνεργιστική επιδράσεις που προκαλούνται από συνδυασμένες θεραπείες, πραγματοποιήσαμε Western blot σε βασικά αποπτωτικών πρωτεϊνών και διεξάγεται κυτταρομετρία ροής για την εκτίμηση της απόπτωσης. Τα αποτελέσματα μας κατέδειξαν σημαντική συνέργεια και αν NF-κΒ ανεστάλη κατά τη διάρκεια

θεραπεία 131I. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι η NF-κΒ αναστολή οδού δεν ελέγχουν ιώδιο πρόσληψη, γεγονός που δείχνει προ-αποπτωτικών αποτελεσμάτων της είναι ο κύριος μηχανισμός για την συνεργιστική αποτελέσματα.

Η απόπτωση είναι μια απαραίτητη διαδικασία για την εξάλειψη προορίζονται κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ή μετά από βλάβη από τη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Είναι γνωστό ότι

131I-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μπορεί να είναι τόσο απόπτωση και νέκρωση, η φύση του οποίου εξαρτάται από τη δόση [27]. Marx et al. [27] έδειξε ότι, σε κύτταρα Β-CPAP (άλλο DTC κυτταρική γραμμή), η απόπτωση ήταν ανιχνεύσιμη μετά από επώαση με 1 MBq /ml του

131I για 2 ημέρες. Κατά μέσο

συγκέντρωσης ραδιενέργειας 131I (1-10 MBq /ml) απόπτωση ήταν κυρίαρχη, ενώ σε πολύ υψηλότερες

συγκέντρωσης ραδιενέργειας 131I (ιδιαίτερα υψηλότερη από 100 MBq /ml) νέκρωση έγινε κυρίαρχη. Στην έρευνά μας, χρησιμοποιήσαμε

131I συγκέντρωση ραδιενέργειας 20 MBq /ml, η οποία θα μπορούσε να παράγει αρκετό απόπτωση για διαφορετικά πειράματα. Η μικρή διαφορά δόση θα μπορούσε να είναι από διαφορετικές κυτταρικές σειρές και διαφορετικές εργαστηριακές συνθήκες.

Η καταστροφή των προ-αποπτωτικών ή αντι-αποπτωτικών ισορροπία έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί καρκινογένεση. Στις ρυθμίσεις θεραπεία του καρκίνου, ανώμαλης σηματοδότησης αποπτωτικών θα μπορούσε να προκαλέσει αντίσταση στη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Ως εκ τούτου, η αποκατάσταση της λειτουργικής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να είναι μία χρήσιμη προσέγγιση για την ενίσχυση της θεραπευτικές αποτελεσματικότητες. NF-κΒ μονοπάτι υπόθεση έχει δοκιμαστεί αληθές στον καρκίνο του θυρεοειδούς ήδη [9], [10]. Η αυξημένη δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ενισχύει την ενδογενή φαινότυπο θεραπεία ανθεκτικότητα του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων, και η αναστολή του έχει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [9], [10]. Η παρούσα δεδομένων προσθέτει στην υπόθεση, ότι

131I θα μπορούσε να προκαλέσει την ενεργοποίηση του NF-κΒ που εξασθενεί

131I αποτελεσματικότητα στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. αναστολή ΝΡ-κΒ είναι αποτελεσματική στην καταστολή σχετίζονται

131I επαγωγή ΝΡ-κΒ και αντι-αποπτωτική αλλαγές. Σε συνδυασμένα αγωγή απόπτωση μπορεί να επιτευχθεί συνεργικά.