Abstract

Ενώ φαρμακολογική αναστολή της Akt κινάσης έχει θεωρηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου, οι περισσότερες από τις αναστολέων Akt που έχουν αναπτυχθεί είναι ενζυματικά αναστολείς που στοχεύουν τη δραστική θέση κινάσης της Akt. Ένα άλλο βασικό κυτταρική ρυθμιστική εκδήλωση για την ενεργοποίηση Akt είναι η μετατόπιση της Akt κινάσης στην κυτταρική μεμβράνη από το κυτταρόπλασμα, η οποία επιτυγχάνεται μέσω της περιοχής ομολογίας πλεκστρίνης (ΡΗ) της Akt. Πάντως, ενώσεις ειδικώς αλληλεπιδρά με την περιοχή ΡΗ της Akt να αναστέλλουν την ενεργοποίηση Akt περιορίζονται σήμερα. Εδώ έχουμε εντοπίσει μια ένωση, lancemaside Α (LAN-Α), η οποία δεσμεύεται ειδικά με την περιοχή ΡΗ της Akt κινάσης. Πρώτον, η μάζα ανάλυση φασμάτων μας κυτταρικών Akt κινάσης που απομονώνεται από κύτταρα επεξεργασμένα με LAN-A αποκάλυψε ότι LAN-Α δεσμεύεται ειδικά με την περιοχή ΡΗ της κυτταρικής Akt κινάσης. Δεύτερον, παρατηρήσαμε ότι LAN-Α αναστέλλει τη μετατόπιση της Akt κινάσης στη μεμβράνη και έτσι την ενεργοποίηση Akt, όπως εξετάζεται από την φωσφορυλίωση διαφόρων κατάντη στόχοι της Akt όπως ΟδΚ3β, mTOR και BAD. Τρίτον, σε ένα συν-καλλιεργήθηκαν μοντέλο κυττάρου που περιέχουν ανθρώπινη καρκίνου του πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα (Α549) και με φυσιολογικά ανθρώπινα πρωτογενείς ινοβλάστες πνεύμονα, LAN-Α περιορίζει ειδικά την ανάπτυξη των κυττάρων Α549. LAN-Α εμφανίζονται επίσης αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών άνθρωπο. Τέλος, στο μοντέλο μεταμόσχευσης ποντικού Α549-λουσιφεράση, LAN-Α αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 με λίγο εμφανής κυτταροτοξικότητα. Πράγματι, ο θεραπευτικός δείκτης του LAN-Α σε αυτό το μοντέλο ποντικού ήταν & gt? 250, υποστηρίζοντας ότι LAN-Α είναι μια πιθανή ένωση μολύβδου για χώρο ΡΗ στόχευση ως ασφαλής αναστολέας αντικαρκινική Akt

Παράθεση: Joh. EH, Hollenbaugh JA, Kim B, Kim DH (2012) πλεκστρίνης ομολογία τομέα της Akt κινάσης: μια απόδειξη της αρχής για εξαιρετικά Ειδικοί και αποτελεσματική μη-ενζυματική Anti-Cancer-στόχος. PLoS ONE 7 (11): e50424. doi: 10.1371 /journal.pone.0050424

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 23η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Νοεμ 2012

Copyright: © 2012 Joh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας A1077401 (BK), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης Τ32 DA07232 (JAH), και το Πρόγραμμα του Πανεπιστημίου World Class μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας ( R33-2008-000-10018-0). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να δηλώσουν ότι Μπεκ Kim είναι μέλος συντακτικής επιτροπής PLoS ONE, αλλά αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μια μακροπρόθεσμη φαινότυπο κυτταρική επιβίωση καθορίζεται από την ανίχνευση διαφόρων κυτταρικών γεγονότων , και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αναγνώριση και την παράδοση των σημάτων στρες είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των κυττάρων των θηλαστικών. Η οδός ΡΙ3Κ /Akt είναι μια κεντρική ρυθμιστική δίκτυο που διέπει τα κυτταρικά γεγονότα απαραίτητο για μεταγραφή, την επιβίωση των κυττάρων [1], η ανάπτυξη [2], η διαφοροποίηση [3], η μετανάστευση [4], το μεταβολισμό [5], και την αγγειογένεση [6] . Η απορύθμιση του μονοπατιού ΡΙ3Κ /Akt παρατηρείται συνήθως σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, επιτρέποντας τη μακροπρόθεσμη επιβίωση και έκφυση [7], [8], [9]. Έτσι, φαρμακολογικές αναστολείς που στοχεύουν αυτή την οδό προ-επιβίωσης έχουν ερευνηθεί εκτενώς ως δυνητικοί αντι-καρκινικοί παράγοντες [10]. Δεδομένου Akt είναι ένα κεντρικό ρυθμιστή που ελέγχει τη δραστηριότητα πολλών κατάντη στόχων μέσω δραστικότητα κινάσης της, αναστολείς Akt ήταν το επίκεντρο πολλών μελετών [10], [11], [12]. Ωστόσο, οι περισσότεροι από τους αναστολείς Akt που έχουν δοκιμαστεί κυρίως στοχεύουν τη δραστική θέση κινάσης ή θέση δέσμευσης ΑΤΡ του Akt [13], [14], [15], [16] και επιδεικνύουν εν δυνάμει ανεπιθύμητο εκτός στόχου επιπτώσεις για πολλές άλλες κυτταρικές κινασών.

Είναι σημαντικό, για Akt κινάση να ενεργοποιούνται, η πρωτεΐνη πρέπει να μεταναστεύει από το κυτόπλασμα προς την κυτταρική μεμβράνη όπου ο τομέας NH

2-τερματικό πλεκστρίνης ομολογία (ΡΗ) της Akt αλληλεπιδρά με ΡΙ3Κ. Μόλις στην πλασματική μεμβράνη, συστατικώς δραστική 3-φωσφοϊνοσιτιδίου-εξαρτώμενη κινάση 1 (ΡϋΚ1), ένα ανάντη κινάση, ενεργοποιεί Akt με φωσφορυλίωση σε Thr

308 που ακολουθείται από ένα πρόσθετο φωσφορυλίωση σε Ser

473, που μπορεί να συμβεί με mTOR -rictor συγκρότημα [17], πρωτεΐνη κινάση Cβ [18], ιντεγκρίνη-συνδεδεμένη κινάση [19] και από την αυτοφωσφορυλίωση [20]. Ο χώρος ΡΗ μπορεί να βρεθεί σε αρκετές πρωτεΐνες ενδοκυτταρική σηματοδότηση και είναι ανάγκη να ταξιδέψει σε διάφορα διαμερίσματα της κυτταρικής μεμβράνης [21]. Ο τομέας αυτός διευκολύνει επίσης το σχηματισμό διμερούς που επιτρέπει την λειτουργία σύνδεσης λιπιδίου που αναγνωρίζει ειδικά φωσφορυλιωμένα φωσφοϊνοσιτίδιων [22]. Κατά τη διάρκεια της ΡΙ3Κ /Akt ενεργοποίηση, ΡΙΡ2 φωσφορυλιώνεται να ΡΙΡ3 από ΡΙ3Κ, και στη συνέχεια η συγκέντρωση μεμβράνη ΡΙΡ3 ανυψωμένη εκκινεί την ενεργοποίηση των ΡϋΚ1 που ακολουθείται από την μετατόπιση της μεμβράνης του Akt και ενεργοποίηση της δραστικότητας κινάσης Akt [22].

Διάφορα μοντέλα καρκινικό κύτταρο και κύτταρα που εκφράζουν ογκογονίδια, τα οποία εμφανίζουν ένα κυτταροπροστατευτικό φαινότυπο μέσω ενεργοποίησης του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, έχουν χρησιμοποιηθεί ως συστήματα διαλογής για δυνητικούς αναστολείς Akt [23], [24], [25]. Ιδρύσαμε πρόσφατα ένα μοναδικό κύτταρο-based σύστημα αντι-PI3K /Akt διαλογή αναστολέα [26], η οποία απασχολεί την έκφραση των μη ογκογόνων τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1) Tat. Σε αντίθεση με άλλες ιογενείς ογκογονίδια όπως Ε1Α ανθρώπινου papilomavirus [27], Tax του ανθρώπινου ιού Τ κυττάρων λευχαιμίας [28] και NS5A του ιού ηπατίτιδας C [29], HIV-1 Tat δεν ενεργοποιεί άμεσα το μονοπάτι Akt. Αντ ‘αυτού, φαίνεται να ρυθμίζει αρνητικά την ΡΤΕΝ, το οποίο είναι ένα φωσφατάση που ελέγχει αρνητικά ΡΙ3Κ χαμηλώνοντας συγκέντρωση ΡΙΡ3 στην κυτταρική μεμβράνη [30]. Λόγω της PTEN αρνητική δραστηριότητα ρύθμιση, έκφρασης Tat σε ένα ανθρώπινο μικρογλοιακά κυτταρική σειρά (CHME5) παρέχει μια υπερυψωμένη φαινότυπο προστασία των κυττάρων κατά τη διάρκεια της κυτταροτοξικής θεραπείας LPS [31]. Αυτή η κυτταροπροστατευτική φαινότυπος του συστήματος CHME5 Tat-based χρησιμοποιήθηκε πρόσφατα για τη διαλογή και αναγνωρίστηκαν αντι-ΡΙ3Κ ενώσεις /Akt που κατάργησε την Tat επαγόμενη κυτταροπροστατευτική φαινότυπο [26]. Πιο ενδιαφέροντα, οι ενώσεις αυτές στοχεύουν διάφορα στάδια της PI3K /Akt μονοπατιού, την επικύρωση της Akt ικανότητα διαλογής PI3K /αναστολέα της οδού του συστήματος [26].

Εδώ, θα χαρακτηρίζεται lancemaside Α (LAN-Α), η οποία ήταν μία από τις πολλές ενώσεις που έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως από την έκφραση του συστήματος CHME5 Tat από βιβλιοθήκες που φιλοξενούν προ-επιλεγμένο μη-τοξικές ενώσεις [26]. Σε αυτή τη μελέτη, LAN-Α ερευνήθηκε για μηχανισμό αντι-Ακί δράση της, εκλεκτική αντικαρκινική δράση

in vitro

, και αντικαρκινική δράση σε ένα μοντέλο ποντικού. Πράγματι, LAN-Α συνδέεται μοναδικά στην περιοχή ΡΗ της κυτταρικής Akt κινάσης, αναστέλλει την μετατόπιση της Akt κινάσης, η οποία είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση Akt, και εμφανίζει αντι-πολλαπλασιασμού /αντικαρκινικές επιδράσεις σε ένα μοντέλο ποντικού με μεγάλο θεραπευτικό δείκτη, ο οποίος αποτελέσματα από τη μη τοξική φύση της ένωσης αυτής

Υλικά και Μέθοδοι

πολιτισμό καρκινική κυτταρική σειρά και μέτρηση της κυτταροτοξικότητας

το Α549 (ανθρώπινο καρκίνωμα του πνεύμονα?. KCLB No. 10185), ΚΑΤΩ III (γαστρικό καρκίνωμα? KCLB Νο 30103), MCF-7, (καρκίνωμα του μαστού? KCLB Νο 30022) αγοράστηκαν από την Κορέα τράπεζα κυτταρική σειρά (Σεούλ, Κορέα) στις 2010-11-25. Η κυτταρική σειρά Α549-Luc-C8 αγοράστηκε από την δαγκάνα Lifescience (Hopkinton, MA, USA) στις 2011-04-20. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM Ε-γλουταμίνη, και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο, 24 ώρες πριν από την προσθήκη των ενώσεων. Οι ενώσεις διαλυτοποιήθηκαν σε 100% αιθανόλη και στη συνέχεια προστέθηκε στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα νεκρά κύτταρα αξιολογήθηκαν με χρήση κυτταρομετρίας FACS (ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο, Accuri). Όλες οι μελέτες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

συν-καλλιέργεια των πρωτογενών και νεοπλασματικών κυττάρων

Για καλλιέργεια διαφορετικά ζεύγη τύπων κυττάρων, το μέσο του πρωτογενούς κυτταρικού τύπου, όχι η κυτταρική γραμμή όγκου, ήταν μεταχειρισμένος. Για συν-καλλιέργεια των ανθρώπινων ινοβλαστών πνεύμονος και του πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή όγκου Α549-luc-C8, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (Invitrogen) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Εικόνες ελήφθησαν στις 0, 6, 12 και 24 ώρες μετά τη θεραπεία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss).

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα υπερκείμενα κυτταρικών εκχυλισμάτων που παρασκευάζονται από μακροφάγα διαχωρίστηκαν με 10% SDS -PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο πρωτεΐνες ξηραίνονται γάλα σε 0.05% PBST, τότε ανιχνεύθηκαν με αντισώματα. Μετά από πλύση με PBST, πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 50 λεπτά. Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) αντιδραστήριο.

Ανάλυση Lancemaside Α και Akt δέσμευσης χρησιμοποιώντας MS /MS

Α549-Luc-C8 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε RPMI 1640 μέσο με ή χωρίς lancemaside Α για 2 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν με 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανά 100 mm δίσκο καλλιέργειας. Προϊόντα λύσης (3 ml) συμπληρώθηκαν με 9 ml ΝΕΤ ρυθμιστικού [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, και 0,05% ΝΡ-40] και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 10 μΙ Akt ή αντίσωμα β-ακτίνης (200 μg /ml). Για την καταβύθιση ανοσοσύμπλοκα, προϊόντα λύσης επωάστηκαν με 50 μΙ πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz, L.A., USA) για 1 ώρα στους 4 ° C. Στεφάνη δεσμευμένα συμπλέγματα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα ΝΕΤ και μετουσιώνεται για 5 λεπτά στους 100 ° C, φυγοκεντρήθηκε και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα MS /MS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Ηλεκτροψεκασμού ιονισμού φασματομετρία μάζας (ESI-MS) και διαδοχική MS /MS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα LCQ DECA XP MS (Thermo Finnigan, CA, USA) εφοδιασμένο με μία πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού. Όλες οι παράμετροι του αναλυτή παγίδα ιόντων βελτιστοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε μαζική πειράματα, η τάση ψεκασμού ήταν 4,5 kV με θετικό τρόπο και 4 kV στην αρνητική κατάσταση υπό Ν ροή αερίου

2 μανδύας σε 50 αυθαίρετες μονάδες. Η θερμοκρασία τριχοειδής διατηρήθηκε στους 275 ° C. Δύο μικρολίτρα δειγμάτων εγχύθηκαν μέσα στη στήλη. ελήφθησαν Σύνολο χρωματογραφήματα ιόντων από

m /z

150 έως 2000 σε ESI αρνητικό τρόπο. Για διαδοχική φασματομετρία μάζας, το μέγιστο χρόνο ένεσης ιόντων, χρόνος ενεργοποίησης, και απομονωμένες πλάτος ιόντων τέθηκαν σε 500 ms, 30 ms και 2,0 Θ, αντίστοιχα. Η ενέργεια της σύγκρουσης με ήλιο ορίστηκε στο 30% της ραδιοσυχνότητας (5 V) που εφαρμόζεται στον αναλυτή παγίδα ιόντων.

Αντικαρκινική δράση στο γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου ποντικού

A549- luc-C8 κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και ενέθηκαν υποδορίως σε αριστερό πόδι (10

6 κύτταρα /πόδι) 8-εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών όπως αναφέρθηκε προηγούμενα [33]. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 50 mm

3, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν και δοσολογήθηκαν στοματικά με 5, 10 και 20 mg /kg /ημέρα lancemaside Α ή όχημα (0,2 ml 10% Tween 80) 6 ημέρες την εβδομάδα. Κάθε ομάδα αποτελούνταν από 9 ποντίκια. Lancemaside Α αιωρήθηκε σε 10% Tween 80. Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν κάθε 3-4 ημέρες μετά την επίτευξη 50 mm

3. Τέλος, ενδοπεριτοναϊκή ένεση αντιδραστήριο λουσιφερίνη (150 mg /kg, δαγκάνας Lifescience) μετά την τελική χορήγηση της lancemaside Α και μετρήθηκαν τα μεγέθη όγκων με

in vivo

φωταύγεια απεικόνισης.

In vivo

φωταύγεια απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Maestro In Vivo Πολυφασματικής Σύστημα Απεικόνισης (Woburn, MA, USA). Τα δεδομένα ποσοτικά με το λογισμικό Maestro (έκδοση 2.10.0, CRI Inc.) με τη χρήση των απόλυτων αριθμών φωτονίων.

Ανθρώπινα κύτταρα Α549 επιμολυσμένα με PH-GFP ή φορείς GFP

Το Α549-luc- c8 κύτταρα επιμολύνθηκαν με PH-GFP ή φορέα GFP και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε μέσο RPMI 1640 με ή χωρίς lancemaside Α (1 μΜ) για 100 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν με 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανά φρεάτιο. Τα προϊόντα λύσης συμπληρωμένο με 5 ml ΝΕΤ ρυθμιστικού [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, και 0,05% ΝΡ-40] και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 10 μΙ αντισώματος GFP (200 μg /ml). Για την καταβύθιση ανοσοσύμπλοκα, προϊόντα λύσης επωάστηκαν με 50 μΙ πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz, L.A., USA) για 1 ώρα στους 4 ° C. Στεφάνη δεσμευμένα συμπλέγματα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα ΝΕΤ και μετουσιώνεται για 10 λεπτά στους 100 ° C πριν φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα θραύσματα. Τα υπερκείμενα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ MeOH.

Αποτελέσματα

προηγουμένως είχε εντοπιστεί LAN-Α ως ένα μονοπάτι αντι-ΡΙ3Κ /Akt αναστολέα χρησιμοποιώντας μια Ηΐν Tat που εκφράζει κυτταρική γραμμή CHME5 [26]. Εμείς, πρώτα, εξέτασε την ικανότητα του LAN-Α να αναστέλλει αυτή την οδό σε αρκετές διαφορετικές καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, αυξανόμενες συγκεντρώσεις του LAN-A μειωμένη επιβίωση κυττάρου σε Α549 (αδενοκαρκίνωμα επιθηλιακών κυττάρων), ΚΑΤΟ III (γαστρικό κυττάρων καρκίνωμα) και MCF-7 (κυτταρική καρκίνωμα μαστού) κυττάρων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, που οδηγεί σε σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (μη επεξεργασμένα) κύτταρα με τόσο λίγο όσο 2 μΜ του φαρμάκου. Στα 20 μΜ LAN-Α, την υψηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε, μείωση μεγαλύτερη από 60% σε βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, ανάλυση στυπώματος western επιβεβαίωσε την μείωση των επιπέδων ρΑΚΤ για τις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1). Τα Α549-Luc-C8 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν επίσης για αυτή τη μελέτη και επιβεβαιώσαμε ότι LAN-Α αγωγή προκάλεσε επίσης ένα συγκρίσιμο μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 1Β). Κύτταρα Α549 έχουν μια στρογγυλή μορφολογία όπως φαίνεται στο πινάκια πυθμένος Σχήμα 1Β, το οποίο είναι ένα σημαντικό στοιχείο κατά την εξέταση των πειραμάτων συνκαλλιέργειας (παρακάτω).

(Α) Α549, ΚΑΤΟ III και κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία για 24 ώρες απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του LAN-A. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα ζωντανά κύτταρα προσδιορίστηκαν με ανάλυση FACS. (Β) Α549-Luc-C8 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 και 10 μΜ LAN-A για 24 ώρες. Εικόνες δείχνουν λιγότερο πυκνό στρώμα κυττάρων με LAN-A θεραπείας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε και σχετικές τιμές απεικονίζονται σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (100%). ανάλυση ANOVA πραγματοποιήθηκε σε σύνολα δεδομένων, και τα στατιστικά σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου που υποδεικνύονται με αστερίσκους (* =

σ

& lt? 0,05).

Η

Για να επικυρώσετε την περαιτέρω LAN-Α ως ΡΙ3Κ αναστολέα /Akt μονοπάτι σε κύτταρα Α549, ανάλυση στυπώματος western διεξήχθη για το καθεστώς φωσφορυλίωση διαφόρων κατάντη στόχοι: ΡϋΚ1, Akt, ΡΤΕΝ, ΟδΚ3β, ΙΚΚ-α, mTOR και BAD πρωτεΐνες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α-Ε (και σχήμα S2), η φωσφορυλίωση της Akt και κατάντη στόχοι της Akt κινάσης: p-ΟδΚ3β, ρ-mTOR, ρ-BAD και π-ΙΚΚ-α ήταν σημαντικά μειωμένες με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, με LAN -Ένα θεραπεία. Ωστόσο, LAN-A θεραπεία δεν οδήγησε σε μείωση των κυτταρικών επιπέδων του ΡΤΕΝ (Σχήμα 2F), ρ-ΡϋΚ1 (Σχήμα 2G) ή ΡΙ3Κ (Σχήμα 2Η). Επιπλέον, LAN-A μειωμένη δραστικότητα ΡΙ3Κ σε κύτταρα Α549 (Εικόνα S3) και ανέστειλαν Akt διακίνησης στην μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα S4). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα δημοσιευμένα ευρήματα μας [26] ότι το LAN-Α είναι μια Akt αναστολέα της PI3K /μονοπατιού.

(Α) κύτταρα Α549 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με 5, 10 ή 20 μΜ LAN-A για 24 h. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη σε κυτταρολύματα (Συμπληρωματικές Σχήμα 2) και έδειξε μία μείωση στη φωσφορυλιωμένη Akt (Ser

473). (Β-Ε) Ανάλυση του Akt κατάντη στόχων δείχνεται. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης για ΟδΚ3β, ΙΚΚ-α, mTOR και BAD εξετάστηκαν και μειώνονται σε ομάδες αντιμετωπίζονται LAN-A. (F) Cellular ΡΤΕΝ παρέμεινε σταθερή με LAN-A θεραπείας. επίπεδο (G) φωσφο-ΡϋΚ1 παρέμεινε αμετάβλητη με LAN-A θεραπείας. (H) επίπεδο ΡΙ3Κ παρέμεινε αμετάβλητη με LAN-A θεραπείας. σύνολα δεδομένων έγιναν εις διπλούν. ανάλυση ANOVA πραγματοποιήθηκε για τα σύνολα δεδομένων με * =

σ

& lt? 0,05, ** =

σ

& lt? 0,01 και *** =

σ

& lt? 0.001 .

η

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν η ΛΑΝ-Α κυτταροτοξική δράση ήταν ειδική για τα καρκινικά κύτταρα. Για τη δοκιμή αυτή, έχουμε συν-καλλιεργημένα 1) MRC-5, ένα εμβρυϊκό πρωτογενή ανθρώπινα ινοβλαστών πνεύμονος [34], και 2) Α549-luc-C8, αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου κυψελιδικού βασικά επιθηλιακά κύτταρα σε μεταγωγή για να εκφράζουν λουσιφεράση [35], υπό διαφορετικές συγκεντρώσεις της ΛΑΝ-Α για 12 ώρες (Εικόνα 3Α, κορυφή). MRC-5 κύτταρα παρέμειναν βιώσιμα σε όλο το εύρος της δόσης της ΛΑΝ-A θεραπείας (Σχήμα 3Α? Κάτω γράφημα), ενώ τα Α549-Luc-C8 κύτταρα έδειξαν σημαντική θάνατο σε 10 και 20 μΜ. Μία κινητική ανάλυση με τη χρήση 10 μΜ LAN-A θεραπεία σε 0, 6, 12 και 24 ώρες διεξήχθη επίσης (Σχήμα 3Β, κορυφή). Και πάλι, Α549-Luc-C8 κύτταρα ήταν σημαντικά πιο επιρρεπείς σε κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με κύτταρα MRC-5 (Σχήμα 3Β, κάτω γράφημα). Ακόμα και μετά από 24 ώρες της ΛΑΝ-A θεραπείας, MRC-5 κύτταρα παρέμειναν βιώσιμα, ενώ η βιωσιμότητα Α549-Luc-C8 κυττάρων συνέχισε να μειώνεται. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι LAN-Α εμφανίζει μια συγκεκριμένη αντικαρκινική δράση στην κανονική και καρκινικές κυτταρικές μοντέλο συν-καλλιέργειας ανθρώπινου πνεύμονα.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες για τις διαφορετικές ομάδες θεραπείας συλλήφθηκαν 12 ώρες μετά θεραπεία. (Β) Εικόνες από τρία ανεξάρτητα πειράματα με το χέρι μετρήθηκαν για τις ζωντανές /νεκρών κυττάρων για τις διάφορες ομάδες θεραπείας. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς και δείχνει το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων. Τ test του Student πραγματοποιήθηκε στο σύνολα δεδομένων για τον προσδιορισμό σημαντικών διαφορών (* =

σ

& lt? 0,05). (C-D) Co-καλλιεργημένα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ LAN-Α και στη συνέχεια παρακολουθείται για κυτταρικό θάνατο σε διαφορετικούς χρόνους μετά την αγωγή. Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα στοιχεία προέρχονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης της ΛΑΝ-Α χρησιμοποιώντας μια σειρά από τεχνολογίες φάσματα μάζας. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α549 προ-επωάστηκαν με LAN-Α πριν τη λύση και ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) της Akt. Pull-downs αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φασματική ανάλυση μάζας. Εικόνα 4Α δείχνει την ανάλυση ESI-MS της ΛΑΝ-Α (στάνταρ). Η ένωση δομή απεικονίζεται και ένα προφίλ ίχνους με LAN-Α σε MW 1190 παρέχεται. Ένα δείγμα IP Akt για Α549 κύτταρα επεξεργασμένα LAN-Α αναλύθηκε (Σχήμα 4C), και έδειξε μια κορυφή για το LAN-A. Σημαντικά, τα δείγματα ελέγχου, δεν LAN-Α αγωγή των κυττάρων Α549 (Σχήμα 4Β) και β-ακτίνη IP με LAN-Α αγωγή (Εικόνα 4D), δεν έδειξε κορυφές για το LAN-αλληλεπίδραση. Στη συνέχεια, για την περαιτέρω επικύρωση ότι LAN-Α αλληλεπιδρά με Akt, παράλληλα ανάλυση MS /MS έγινε. Έχουμε προηγουμένως αναπτύξει μια ευαίσθητη ανάλυση HPLC-MS /MS για το LAN-A (MW 1190) και τα παράγωγά του μεταβολισμού της, lancemaside X (MW 648) και echinocystic οξέος (ΜΒ 472) [32]. Το πρότυπο προφίλ ίχνος LAN-A μόνο δείχνεται στο Σχήμα 4Ε, ενώ IP Akt δείγμα δείξει με σαφήνεια τα δύο θραύσματα – MW 648 και MW 472 (Σχήμα 4F). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι η ΛΑΝ-A αλληλεπιδρά φυσικά με Akt μέσα στο κύτταρο.

(Α) Ιονισμός Electrospray φασματομετρία μάζας (ESI-MS) της ΛΑΝ-A πρότυπο εμφανίζεται. LAN-Α μοριακή φαίνεται να διαμένουν σε MW 1190. ESI-MS ανάλυση των δειγμάτων IP Akt από μη επεξεργασμένα (Β) LAN-Α κατεργασμένα κύτταρα (C) Α549 φαίνονται. (D) ESI-MS ανάλυση του ΙΡ β-ακτίνης από κύτταρα επεξεργασμένα LAN-Α δείχνεται. (Ε) Tandem MS /MS ανάλυση της ΛΑΝ-Α δείχνει τα δύο προηγούμενα εντοπίστηκαν θραύσματα Lancemaside Χ (MW 648) και echinocystic οξύ (MW 472) για το LAN-Α [32]. (F) ανάλυση Tandem MS /MS για IP Akt δείγμα από κύτταρα επεξεργασμένα LAN-Α.

Η

Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως ότι η ΛΑΝ-Α αναστέλλει μετατόπιση του Akt από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη του πλάσματος ([26 ]? Σχήμα S4). Ως εκ τούτου, η υπόθεση ότι LAN-Α αλληλεπιδρά άμεσα με τον χώρο ΡΗ της Akt. Για να ελεγχθεί αυτό, PH domain-GFP σύντηξη και GFP φορείς επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549, που ακολουθείται από IP του GFP. Τα δείγματα στη συνέχεια υπέστησαν επεξεργασία για και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας HPLC-MS /MS [32]. Το δείγμα IP GFP (Σχήμα 5Α) που παράγεται πολλές κορυφές, αλλά καμία δεν ήταν ειδική για το LAN-Α (Σχήμα 5Β? Πρότυπο μόνο). Ωστόσο, MS /MS ανάλυση του δείγματος IP PH-GFP που παράγεται τις κορυφές παράγωγα σωστή μεταβολίτη (MW 648 και MW 472) για το LAN-Α (βλέπε επίσης Σχήμα 4Ε και F). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά φάσματα μάζας υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο LAN-Α αλληλεπιδρά άμεσα με χώρο ΡΗ της Akt, η οποία περιορίζει τη μετανάστευση Akt και στη συνέχεια αναστέλλει την ενεργοποίηση Akt.

GFP και ΡΗ domain-GFP φορείς επιμολύνθηκαν σε A549- luc-C8 κύτταρα και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ LAN-Α για 1 ώρα. IP κατά GFP έγινε και τα δείγματα αναλύθηκαν με ESI-MS. δείγματος (Α) IP GFP δεν έδειξε εξέχουσα αιχμής για το LAN-Α, (Β), ενώ IP PH δείγμα domain-GFP είχαν την συγκεκριμένη κορυφή για το LAN-A. (Γ) Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτή ήταν LAN-Α, παράλληλα MS /MS ανάλυση του δείγματος domain-GFP IP PH έδειξε δύο κομμάτια για το LAN-Α (επίσης βλέπε Εικόνα 4Ε και F).

Η

Τέλος, εξετάσαμε την επίδραση της LAN-Α στην ανάπτυξη Α549-luc-C8 σε ένα γυμνό μοντέλο ποντικού. Για τη δοκιμή αυτή, Α549-Luc-C8 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του αριστερού ποδιού γυμνών ποντικών για τη δημιουργία όγκων. Μόλις ο όγκος φθάσει 50 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν από του στόματος 10 και 20 mg /kg /ημέρα lancemaside Α ή όχημα (10% Tween 80) 6 ημέρες την εβδομάδα. LAN-Α έχει ένα ΕΔ

50 = 4,09 mg /kg και LD

50 = & gt? 1 g /kg. Ως εκ τούτου, ο θεραπευτικός δείκτης είναι & gt? 250 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι όγκοι μετρήθηκαν από τις ημέρες 10 έως 45. LAN-A όγκου θεραπεία μειωμένος ρυθμός ανάπτυξης όπως απεικονίζεται από μειωμένους όγκους όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Α). Την ημέρα 45, τα ποντίκια ενέθηκαν ΙΡ με αντιδραστήριο λουσιφερίνη για

in vivo

απεικόνισης (Σχήμα 6Β).

In vivo

φωταύγεια είναι μεγαλύτερη για την ομάδα ελέγχου σε σύγκριση με τις ομάδες είτε 10 ή 20 mg /kg LAN-A. Οι σχετικές εντάσεις φωταύγειας εμφανίζονται (

n

= 5). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρούνται. Σχετική όγκοι προσδιορίστηκαν και απεικονίσθηκαν (

n

= 9) για τη μάζα του όγκου (Σχήμα 6C). Οι όγκοι στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-pAkt και DAPI (Σχήμα S5) και την εμφάνιση μιας LAN-εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση μείωση του pAkt εντός του ιστού του όγκου. Συνολικά, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι LAN-Α έχει ένα αποτέλεσμα κατά του όγκου

in vivo

.

(Α) Οι όγκοι των όγκων μετρούνται από ημέρες 10-45 σε γυμνούς ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μάρτυρα (con) και 10 ή 20 mg /kg /ημέρα LAN-Α (9 ποντικοί /ομάδα). (Β) Την ημέρα 45, τα ποντίκια ενέθηκαν με λουσιφερίνη αντιδραστήριο για φωταύγεια ζωντανή απεικόνιση. Οι σχετικές εντάσεις για 5 ποντικοί /ομάδα παρουσιάζεται, και η σχετική ένταση αναφέρθηκε σε σχέση με εκείνη του ελέγχου (έλεγχος = 1). (Γ) Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρούνται. Οι όγκοι μετρήθηκαν με Maestro

In Vivo

Σύστημα Απεικόνισης πολυφασματικών και σχετικό όγκο απεικονίζονται. ανάλυση ANOVA πραγματοποιήθηκε σε σύνολα δεδομένων, και στατιστικώς σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο (* =

σ

& lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Προηγουμένως, διαλογή δυνητικών αντικαρκινικών παραγόντων, που επέδειξε ελάχιστη κυτταροτοξικότητα και υψηλής φυσικής αφθονίας, χρησιμοποιώντας την ισχυρή κυτταροπροστατευτικών φαινότυπο που επάγεται από την έκφραση του HIV-1 Tat πρωτεΐνη [26], η οποία παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις πρωτογενή ανθρώπινα μακροφάγα και μικρογλοία ανθρώπινη κυτταρική σειρά [30], [31]. Μεταξύ των ενώσεων που εξετάστηκαν, η αγωγή με LAN-Α κατάργησε την Tat επαγόμενη κυτταροπροστατευτική φαινοτύπου των κυττάρων CHME5 μετά τη χορήγηση LPS /CHX, ενώ LAN-Α μόνη δεν προκάλεσε καμία κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα ελέγχου που δεν εκφράζουν CHME5 Tat [26]. LAN-Α ανήκει στη χημική οικογένεια που ονομάζεται σαπωνίνες, οι οποίες είναι γνωστό ότι εμφανίζουν αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών ιδιότητες [33], [36], [37], [38]. LAN-A έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει ισχυρώς κολίτιδα μέσω TLR-συνδεδεμένη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε ποντικούς με μη ανιχνεύσιμη κυτταροτοξικότητα [39], [40].

Στη μελέτη αυτή χαρακτηριστεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση του ΛΑΝ-A. πειράματα συν-καλλιέργειας με τη χρήση Α549 και MRC-5 κύτταρα δείχνουν ότι LAN-Α αναστέλλει ειδικά την κυτταρική γραμμή όγκου και όχι πρωτογενή κύτταρα. Αυτό ήταν ένα πολύ συναρπαστικό αποτέλεσμα και πρότεινε ότι η ΛΑΝ-Α είχε ένα συγκεκριμένο αποτέλεσμα των καρκινικών κυττάρων. Δείχνουμε ότι η θεραπεία των κυττάρων με LAN-Α οδηγεί σε μία μείωση στη φωσφορυλίωση της Akt, ακόμη π-ΡϋΚ1, η οποία απαιτείται για Thr

308 φωσφορυλίωση, και τα συνολικά επίπεδα PDK1 δεν είχαν επηρεαστεί από LAN-Α αγωγή. Επιπλέον, κατάντη στόχοι, συμπεριλαμβανομένων ρ-ΟδΚ3β, ρ-mTOR, ρ-BAD και π-ΙΚΚ-α μειώθηκαν, ενώ τα επίπεδα ΡΤΕΝ και ΡΙ3Κ παρέμεινε αμετάβλητη (Σχήμα 2). Συλλογικά αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν προηγούμενα ευρήματα μας που LAN-Α αναστέλλει την ενεργοποίηση Akt [26].

Πολλά διαφορετικούς μηχανισμούς για την αναστολή Akt έχουν αναφερθεί. Πρώτον, φάρμακα όπως ουορτμανίνη, LY294002, PWT-458 [41] και PX-866 [42], [43], SF-1126 [44], IC87114 και TGX-115 [45] στοχεύουν στην ανάντη τελεστή PI3K, αναστέλλοντας την παραγωγή φωσφατιδυλινοσιτόλης 3,4,5-τριςφωσφορικής, το οποίο ενεργοποιεί ΡϋΚ1 που οδηγεί σε φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση Akt. Άλλα φάρμακα που έχουν διπλή στόχευση για PI3K και mTORC2, συμπεριλαμβανομένων NVP-BEZ235 [46]. Πολλά φάρμακα έχουν αναπτυχθεί αυτή τη δραστηριότητα ΡϋΚ1 στόχο. Σε αντίθεση με ΡΙ3Κ, το οποίο έχει αρκετά ισομορφές, ΡϋΚ1 έχει μόνο μία ισομορφή σε ανθρώπους, γεγονός που το καθιστά ελκυστικό στόχο για την αναστολή. UCN-01 είναι ένα τέτοιο φάρμακο σε εξέλιξη [47]. Η δεύτερη Akt φωσφορυλίωση σε Ser

473 καταλύεται από mTORC2 [48] και μπορεί να ανασταλεί από την ραπαμυκίνη, temsirolimus, το everolimus και deforolimus [49].

Akt έχει τρεις διαφορετικές ισομορφές και διάφορες ομάδες της Akt οι αναστολείς έχουν αναπτυχθεί. Μια ομάδα των αναστολέων: GDC-0068 (Genetech? [50]) και Akt αναστολέα IV (Millipore) στοχεύει στην ενεργή θέση ATP της Akt [51]. Μια δεύτερη ομάδα αναστολέων στοχεύουν το χώρο ΡΗ, που οδηγεί σε διαταραχή της στόχευσης μεμβράνης [52], [53]. Akt-Ι-1/2 είναι συνθετικά αναστολέα αναστρέψιμες αλλοστερική, τα οποία στοχεύουν την περιοχή ΡΗ συγκράτησης αυτό σε ανενεργό κατάσταση [54]. Perifosine είναι ένα άλλο φάρμακο που στοχεύουν τομέα ΡΗ και αναστέλλει Akt, mTORC1 και mTORC2 [55].

Για τον προσδιορισμό της ειδικότητας της ΛΑΝ-Α, έχουμε ήδη αναπτύξει μια ειδική ανάλυση HPLC-MS /MS για το LAN-Α [32 ]. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία, διαπιστώσαμε ότι LAN-Α αλληλεπιδρά άμεσα με Akt μέσω του χώρου ΡΗ (Σχήμα 5). Έχουμε προηγουμένως Εξετάσαμε στοματική δοσολόγηση των ποντικών με LAN-Α και βρήκαν ότι η εντερική χλωρίδα μετατρέπει LAN-Α σε lancemaside Χ και στη συνέχεια σε echinocystic οξύ, το οποίο μπορεί να απορροφηθεί στο αίμα [32]. Μπορούμε να υποθέσουμε από τα δεδομένα μας ότι echinocystic οξύ μπορεί να είναι η ελάχιστη μεταβολίτης δομή από το LAN-Α που απαιτείται για τη δέσμευση χώρου ΡΗ και Akt αναστολή της κινάσης. Τόσο lancemaside Χ και echinocystic οξέος θα πρέπει να εξετάζονται για θεραπευτική αποτελεσματικότητα τους στο μέλλον. Επιπλέον,

in vivo

δεδομένα ποντίκι μας είναι συνεπής με τα αποτελέσματα της Jo

et al.

[53], που δείχνει ότι η στόχευση του χώρου ΡΗ της Akt κινάσης είναι πολύ αποτελεσματική στην επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου.

έχει γίνει εκτεταμένη έρευνα για να ανακαλύψει αναστολείς του μονοπατιού PI3K /Akt /mTORC2 [56], [57]. Πολλά νέα φάρμακα πρέπει να ασχοληθεί με την τοξικότητα ενώ παρέχει θεραπευτική αποτελεσματικότητα. LAN-Α παρέχει χαμηλή τοξικότητα και την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου in vivo. Συλλογικά, η μελέτη μας επικυρώνει με φασματοσκοπική ανάλυση μάζας που LAN-Α στοχεύει στην περιοχή ΡΗ της Akt και παρέχει μια έγκυρη προσέγγιση για τη συνέχιση της έρευνας σε αυτό το αντικαρκινικό φάρμακο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανάλυση Western blot των Α549, ΚΑΤΟ III και κύτταρα MCF-7. (Α) Φαίνονται αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western σχολαστικά για pAkt και ολική Akt με και χωρίς 10 μΜ LAN-A. (Β) Τα στοιχεία από δύο ανεξάρτητα πειράματα γράφημα. ανάλυση ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν σημαντικές διαφορές και σημειώνονται με αστερίσκους (*** =

σ

& lt? 0.001)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ανάλυση κηλίδας Western. Αυτό είναι ένα σύνθετο για ένα ή δύο ανάλυση Western blots χρησιμοποιήθηκαν για να παραχθούν τα δεδομένα για το Σχήμα 2.

DOI: 10.1371 /journal.pone.0050424.s002

(TIF)

Σχήμα S3.

δοκιμασία ΡΙΡ3. Α549 κύτταρα προ-αγωγή με το lancemaside Α (Lan, 20 μΜ) ή ουορτμανίνη (W, 0,1 μΜ) για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LPS για μια επιπλέον 60 λεπτά. Κυτταρολύματα παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διαμερισματικό κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) από ένα ίσο αριθμό των κατεργασμένων κυττάρων. Τα προϊόντα λύσης εκχύλισμα μεμβράνης αναλύθηκαν με ανάλυση δυτικού στυπώματος κηλίδας (Echelon, San Jose, CA, USA) και εμφανιζόμενα με αντι-αντίσωμα ΡΙΡ3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s003

(TIF)

Εικόνα S4.

Δοκιμασία μετατόπισης μεμβράνης Akt. Εκφράσαμε μια πρωτεΐνη GFP συγχωνευμένο με το ρΗ-περιοχή της Akt, η οποία είναι γνωστή για την μετανάστευση μεμβράνης, σε κύτταρα Α549-Luc-C8. Όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που εκφράζει την πρωτεΐνη PH-Akt-GFP, αυτή η πρωτεΐνη σύντηξης παρατηρήθηκε σε όλη των κυττάρων, αλλά κυρίως εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος. LAN-Μια θεραπεία δείχνει το σήμα GFP έχει απομακρυνθεί από τη μεμβράνη του πλάσματος. Φωτεινό οπτικό πεδίο (BF) οι εικόνες είναι στην αριστερή στήλη. Akt εντοπισμού μεμβράνης πλάσματος οπτικοποιήθηκε από την κίνηση της Akt-PH-eGFP χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Ανοσοϊστοχημεία του ρΑΚΤ εντός του όγκου. Ανοσοεντοπισμός pAkt αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια διαδικασία χρώσης δύο σταδίων που συνίσταται από διαδοχική επώαση με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα και με DAPI. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s005

(ΔΕΘ)