Αφηρημένο

Επιγενετική αδρανοποίηση των γονιδίων, που προκαλείται από παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA και κατασταλτικών τροποποιήσεις των ιστονών, είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου. Αν και κληρονομικές, η δυναμική φύση και τις δυνατότητες αναστρεψιμότητα μέσα από φαρμακολογικές παρεμβάσεις κάνουν τέτοιες εκτροπές ελκυστικούς στόχους. Δεδομένου ότι οι καρκίνοι περιέχουν πολλαπλές επιγενετικές ανωμαλίες, συνδυάζοντας θεραπείες που απευθύνονται σε διαφορετικές ανωμαλίες θα μπορούσαν δυνητικά να ενισχύσει την ατομική απόδοση των τους. 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-CDR), FDA-εγκεκριμένο φάρμακο για τη θεραπεία του μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου, μπορούν να αναστείλουν μεθυλτρανσφεράσες DNA (DNMTs) μετά την ενσωμάτωση στο DNA διαιρούμενων κυττάρων, με αποτέλεσμα την παγκόσμια απομεθυλίωση. Πιο πρόσφατα, η πρώτη ιστόνης διμεθυλάση, λυσίνη ειδικές διμεθυλάση 1 (LSD1), η οποία προκαλεί απομεθυλίωση τόσο ιστόνης και μη-ιστόνης υποστρώματα, έχει γίνει ένας νέος στόχος για επιγενετικές θεραπεία. Χρησιμοποιώντας, κλοργυλίνη, έναν αναστολέα LSD1 (LSD1i) για την αντιμετώπιση κυτταρικές σειρές καρκίνου, δείχνουμε ότι κλοργυλίνη χρησιμοποιεί δύο μηχανισμούς δράσης ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου: μπορεί είτε να διεγείρει την παγκόσμια απομεθυλίωση DNA ή αναστέλλουν LSD1 γνώμονα H3K4me2 και H3K4me1 απομεθυλίωση να καθιερώσει μια ενεργό διαμόρφωση της χρωματίνης. Διερευνούμε επίσης τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού 5-Aza-CdR με κλοργυλίνη και να καθορίσει ότι αυτή η συνδυαστική θεραπεία έχει συνεργιστικά αποτελέσματα στην επανενεργοποίηση έκτροπα σιγήσει γονίδια εμπλουτίζοντας H3K4me2 και H3K4me1. Πολλά από τα γονίδια επανενεργοποιηθεί κατηγοριοποιούνται ως αντιγόνα καρκίνου των όρχεων ή ανήκουν στην οδό ιντερφερόνη-σηματοδότησης, προτείνοντας πιθανές επιπτώσεις για την ανοσοθεραπεία. Μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι συνδυαστική θεραπεία που αποτελείται από έναν αναστολέα DNMT (DNMTi) και ένα LSD1i έχουν αυξημένη θεραπευτική αξίες και θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των επιγενετικών θεραπείας

Παράθεση:. Χαν H, Yang Χ, Pandiyan Κ, Liang G (2013) Synergistic επαναδραστηριοποίηση επιγενετικώς κατασιγασμένου γονίδια από Συνδυαστική Αναστολή DNMTs και LSD1 στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10.1371 /journal.pone.0075136

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 7 Μάη, 2013? Αποδεκτές: 10 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) [RO1CA124518 και CA138794] για να Gl. XY και KP υποστηρίζονται γενναιόδωρα από το Stand Up για τον καρκίνο [2000901485]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η γονιδιακή σίγηση που προκαλείται από παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA και των ιστονών τροποποιήσεις είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι τροποποιήσεις είναι κληρονομικές, δυναμική φύση τους και την αναστρεψιμότητα μέσα από φαρμακολογικές παρεμβάσεις τους κάνουν ελκυστική θεραπευτικών στόχων [1]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, διάφορα φάρμακα που στοχεύουν διαφορετικούς τύπους των επιγενετικών αλλαγών έχουν αναπτυχθεί με στόχο την επανενεργοποίηση έκτροπα σιγήσει γονίδια, συμπεριλαμβανομένων DNMTi και αναστολείς αποακετυλασών ιστόνης (HDACi) [2], [3]. Πολλοί από αυτούς έχουν δείξει ελπιδοφόρα θεραπευτική αξία στη θεραπεία διαφόρων κακοηθειών, τόσο ως μεμονωμένοι παράγοντες και σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες και αρκετές έχουν εγκριθεί από το FDA.

Η Ν-άκρα των ιστονών υφίστανται μια ποικιλία μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις για την παραγωγή μεταγραφικά ανεκτική ή ανθεκτική χρωματίνη διαμορφώσεις ανάλογα με τον τύπο και τη θέση της τροποποίησης [4], [5]. Για παράδειγμα, οι μεταγραφικά ενεργή υποκινητές που οριοθετείται από τα εμπλουτισμοί διμεθυλίωση και trimethylation του H3K4 και ακετυλίωση του Η3 [6]. Μεταγραφικά ανενεργοί υποκινητές που χαρακτηρίζεται από τις εμπλουτισμοί του, είτε trimethylation της H3K9 ή trimethylation της H3K27 [5]. Η ισορροπημένη δραστηριότητα των ιστονών τροποποιητικά ένζυμα που προσθέτουν ή να αφαιρέσετε συγκεκριμένες τροποποιήσεις είναι κρίσιμης σημασίας για τη φυσιολογική κυτταρική φυσιολογία [2]. Τα καρκινικά κύτταρα συχνά στερούνται αυτή την ισορροπία και εμφανίζουν συνολική μείωση των ακετυλίωση και αναγωγή υποκινητή ειδικά σε δι- και trimethylation του H3K4, με αποτέλεσμα παρεκκλίνουσα γονιδιακή σίγηση [1], [7]. μεθυλίωση των ιστονών λυσίνη θεωρήθηκε ως μια σχετικά μόνιμη τροποποίησης μέχρι την ανακάλυψη του πρώτου διμεθυλάση ιστονών λυσίνη συγκεκριμένες διμεθυλάση 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Μετά από αυτό, πολλές προσπάθειες έχουν επενδυθεί στην ανάπτυξη αναστολέων έναντι demethylases ιστονών.

LSD1 απομεθυλίωση μονο- και διμεθυλίωση της H3K4 μέσω φλαβίνη αδενίνη δινουκλεοτίδιο (FAD) εξαρτάται μηχανισμό [9], και ως εκ τούτου, έχει τη δυνατότητα να καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση [10]. Πριν από την ανακάλυψη της ικανότητας απομεθυλίωσης της, LSD1 ήταν γνωστό να συνδυάζεται με έναν αριθμό συμπλοκών συν-καταστολέα, συμπεριλαμβανομένων CoREST [11], CtBP [12] και ένα υποσύνολο των συμπλεγμάτων HDAC [13]. Κατά τη διαδικασία απομεθυλίωσης, ένα ενδιάμεσο ιμίνη σχηματίζεται η οποία υδρολύεται περαιτέρω για να παράγει ένα μη-μεθυλιωμένο λυσίνης και φορμαλδεΰδης ως υποπροϊόν [9], [14], [15]. LSD1 μπορεί επίσης απομεθυλίωση μια σειρά από μη-ιστόνης υποστρώματα, όπως DNMT1, γεγονός που καθιστά φέρεται πιο σταθερό [16], [17], έτσι πιθανώς συμβάλλει στην αύξηση της παγκόσμιας μεθυλίωσης του DNA. Στο σύνολό τους, LSD1 έχει δύο πιθανούς μηχανισμούς δράσης για την καταστολή γονιδιακής έκφρασης: μπορεί απομεθυλίωση μονο- και διμεθυλιωμένος H3K4 καθώς και τη σταθεροποίηση DNMT1

Η υπερέκφραση του LSD1 έχει αναφερθεί σε ένα αριθμό κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένης της οξείας μυελοειδούς. λευχαιμία (AML) [18], το νευροβλάστωμα [19], του καρκίνου του μαστού [20], καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και του παχέος καρκινώματα [21], υποδηλώνοντας ότι οι αναστολείς LSD1 μπορεί να έχουν σημαντικό θεραπευτικό όφελος σε πολλές όγκους. LSD1 έχει ταυτοποιηθεί να εμποδίσει τη διαφοροποίηση σε MLL [22] και να ρυθμίζουν τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μεταβάσεις (ΕΜΤ) για την ενεργοποίηση γονιδίων κινητικότητα [23]. αναστολείς LSD1 μπορούν να προωθήσουν τη διαφοροποίηση των υψηλής ποιότητας κύτταρα καρκίνου του προστάτη [24], καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό της ουροδόχου κύστης καρκινικών κυττάρων [25], και την επανενεργοποίηση έκτροπα σιγήσει γονίδια [26]. Οι καταλυτικές περιοχές του LSD1 και οξειδασών μονοαμίνης μοιράζονται δομική ομολογία και να κάνουν χρήση του ίδιου καταλυτικού μηχανισμού [9]. Ως εκ τούτου, πολλοί αναστολείς της μονοαμινοξειδάσης είναι επίσης LSDi. Ένας τέτοιος αναστολέας μονοαμινοξειδάσης, κλοργυλίνη, μπορούν επίσης να αναστείλουν λυσίνη ειδικές demethylases [19], [20], [27], [28].

Λόγω της παρουσίας των πολλαπλών επιγενετικών ανωμαλιών στα καρκινικά κύτταρα, ερευνήσαμε η συνδυασμένη θεραπευτική αξία του 5-Αζα-CDR και κλοργυλίνη να αναστέλλουν DNMTs και LSD1, στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης (Τ24), λευχαιμία (HL60) και κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116). Παρατηρούμε ότι κλοργυλίνη χρησιμοποιεί δύο διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης στις τρεις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Σε κύτταρα Τ24 και HL60, κλοργυλίνη παράγει μόνος ελάχιστες επιδράσεις επί επανενεργοποίηση παρεκκλίνοντα σιγήσει γονιδίων σε σύγκριση με τον μη κατεργασμένο έλεγχο. Ωστόσο, συνδυαστική θεραπεία προκαλεί συνεργιστικά αποτελέσματα σχετικά με την επανενεργοποίηση της επιγενετικώς σιγήσει γονιδίων. Επιπλέον, μόνο οι συνδυαστική θεραπεία οδηγεί σε εμπλουτισμό του H3K4me2, H3K4me1 και H3K9 /14 ακετυλίωση στα υποστηρικτές του up-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα HCT116, κλοργυλίνη μόνος προκαλεί παγκόσμια απομεθυλίωση DNA και γονίδιο επανενεργοποίηση. Ωστόσο, η συνδυαστική θεραπεία δεν προκαλούν συνεργιστικά αποτελέσματα στη γονιδιακή επανενεργοποίηση. Παρά δείχνει διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης στις κυτταρικές σειρές, συλλογικά, η μελέτη μας δείχνει ότι η συνδυαστική θεραπεία έχει ενισχυμένη θεραπευτική αξίες, και εισάγει μια νέα προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Η φαρμακευτική αγωγή και συνθήκες καλλιέργειας

Τ24, HCT116 και HL60 κύτταρα, που αγοράζονται από την ATCC, απλώθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα πιάτων /100-mm, 3 × 10

5 κύτταρα /100 mm πιάτο και 5 × 10

5/25 cm

2 φιάλη, αντίστοιχα. Αυτοί υποβλήθηκαν σε αγωγή την επόμενη ημέρα με 1 μΜ, 0.3 μΜ ή 0.1 μΜ 5-αζα-CDR (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), αντίστοιχα, για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του 5-Αζα-CdR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ κλοργυλίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) καθημερινά για 21 ημέρες. Πολλαπλές δόσεις κλοργυλίνη δοκιμάστηκαν: 1 μΜ, 10 μΜ και 100 μΜ. Κλοργυλίνη εξασθενημένη κυτταρική ανάπτυξη σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η βέλτιστη δόση για κλοργυλίνη (10 μΜ) προσδιορίστηκε με παρακολούθηση της καμπύλης απόκρισης δόσης.

Σχηματισμού Αποικίας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 1000 κύτταρα ανά φρεάτιο με ή με ενδεικνυόμενη θεραπεία. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 10 ημέρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

δοκιμασίες ChIP εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας 4 × 10

6 κύτταρα ανά IP [6 ]. Δέκα μ§ από τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: Η3 και H3K4me2antibodies αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Ακετυλιωμένα Η3, και IgG αντισώματα αγοράστηκαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ). H3K4me3 και H3K4me1 αντισώματα αγοράστηκαν από Active Motif (Carlsbad, CA). Εκκινητές PCR είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

Real-time RT-PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Ένα μg RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας M-MLV (Invitrogen) και τυχαία εξαμερή (Invitrogen). Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ΚΑΠΑ SYBR® FAST Οικουμενική 2X qPCR Master Mix και Bio-Rad CFX

© 96 σε πραγματικό χρόνο systerm ανίχνευση PCR. Οι ακολουθίες των συγκεκριμένων γονιδίων εκκινητές είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Με κάθε σετ εκκινητών PCR, τιτλοδοτήσεις των γνωστών ποσοτήτων DNA συμπεριλήφθηκαν ως πρότυπο για την ποσοτικοποίηση.

Infinium

Η δοκιμασία μεθυλίωσης Infinium DNA πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο USC επιγονιδίωμα σύμφωνα με τον κατασκευαστή του προδιαγραφών (Illumina, San Diego, CA). Η ανάλυση μεθυλίωσης του DNA Illumina Infinium (Infinium HumanMethylation450 BeadChip) εξετάζει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των & gt? 485.000 CpG περιοχές, που καλύπτουν το 99% των γονιδίων REFSEQ και διαγονιδιακές περιοχές που επιλέγονται από ειδικούς μεθυλίωσης. Οι μεταγενέστεροι υπολογισμοί επεξεργασίας και την αξία βήτα έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29].

Έκφραση μικροσυστοιχιών

Η ανάλυση έκφρασης εκτελέστηκε σε Sanford-Burnham νοσηλευτικό ίδρυμα (La Jolla, CA) χρησιμοποιώντας το γονιδίωμα Illumina ευρύ BeadChip έκφρασης (HumanHT-12_V4_0_R1) (Illumina). δεδομένα γονιδιακής έκφρασης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του πακέτου lumi στο R. Τα στοιχεία log2 μετασχηματίζονται και κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας Στιβαρή Spline Κανονικοποίηση (RSN) όπως εφαρμόζεται στο πακέτο lumi. Συγκρίσεις μεταξύ του ελέγχου και επεξεργασμένα δείγματα για τις τρεις κυτταρικές γραμμές διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο limma R. Γονίδια (μεταγραφές) με μία τιμή ρ κάτω από 0.01 και μία πολλαπλή μεταβολή είναι μεγαλύτερη από 2 σε σχέση με το μάρτυρα θεωρήθηκαν σημαντικές. Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, ΜΙ) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση και την απεικόνιση των διαθέσιμων στο κοινό δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Κατάντη ανάλυση δικτύου και οντολογίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας MetaCore από GeneGo Inc.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές δοκιμές έγιναν με τη χρήση του λογισμικού R (R έκδοση 2.15.2, R Ανάπτυξης πυρήνα της ομάδας, 2012). πακέτο «Lumi» χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει και τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης διαδικασία. Σχολιασμός και οπτικοποίηση των ανιχνευτών μεθυλίωσης του DNA έγιναν χρησιμοποιώντας τα πακέτα που διατίθενται μέσω Bioconductor ( «TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene», «rtracklayer», «Gviz» και «IlluminaHumanMethylation450kprobe»). Τα ακόλουθα πακέτα CRAN χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν οικόπεδα: «ggplot2», «gplots» και «VennDiagram». Γονιδιακή Οντολογία αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού DAVID (Huang da et al. 2009). τσιπ δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Student t τεστ για GraphPad Prism έκδοση 5 (GraphPad Software).

Αριθμός προσχώρησης GEO

Όλα τα δεδομένα του γονιδιώματος σε επίπεδο που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη έχουν κατατεθεί στο GEO υπό την προσχώρηση αριθμός GSE41754.

αποτελέσματα

Συνδυαστική θεραπεία ενός DNMTi και ένα LSDi καταλήγει σε πιο αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και του σχηματισμού αποικιών από οποιαδήποτε από τις απλούς παράγοντες

Κατά την ανάλυση του γονιδίου δεδομένα έκφραση διαθέσιμα μέσω Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, ΜΙ), παρατηρήσαμε ότι LSD1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, λευχαιμία και αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς (Σχήμα 1Α), υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του LSD1 μπορούν να παίξουν ένα ρόλο στην ογκογένεση. Επιπλέον, έχει καθιερωθεί ότι παρεκκλίνουσα μεθυλίωση ΟΝΑ εμπλέκεται στην έναρξη όσο και στην πρόοδο διαφόρων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου στις τρεις καρκίνους που αναφέρθηκαν παραπάνω [30]. Ως εκ τούτου, μια κύστη κυτταρική σειρά καρκίνου, Τ-24, μία κυτταρική γραμμή λευχαιμίας, HL60 και ένα καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή, HCT116 επιλέχτηκαν για να διερευνηθούν οι επιδράσεις αναστολής LSD1 καθώς και για την αξιολόγηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας μιας συνδυαστικής θεραπείας που αποτελείται από ένα LSD1i και DNMTi.

α. Τα επίπεδα έκφρασης του LSD1 σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης, των Τ-κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, αδένωμα του παχέος εντέρου και τα φυσιολογικά τους αντίστοιχα ελήφθησαν από ONCOMINE. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δείχνουν τον αριθμό των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται για να δημιουργήσουν οικόπεδα κουτί. B-D. Πληθυσμός φορές για έλεγχο (μαύρο), αντιμετωπίζονται κλοργυλίνη (κίτρινο), 5-Aza-CdR αγωγή (κόκκινο) και συνδυαστική θεραπεία θεραπεία (πράσινο) διπλασιάζοντας το Τ24, HL60 και τα κύτταρα HCT116. Οι αντίστοιχοι αριθμοί των ωρών που αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα κάθε γράφημα. Ε Ποσοτικοποίηση των αριθμό των αποικιών που παράγεται από προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας σε Τ24 και κύτταρα HCT116 μετά υποδεικνύεται θεραπείες

Η

Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία ως ακολούθως:. Κλοργυλίνη μόνο, 5-αζα-CdR μόνο, και συνδυαστικές θεραπεία της κλοργυλίνη και 5-Αζα-CDR. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR για 24 ώρες πριν από την αλλαγή του μέσου. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που έλαβαν φρέσκο ​​δόση κλοργυλίνη καθημερινά για 21 ημέρες. Σε όλους τους τρεις τύπους κυττάρων που εξετάστηκαν, και οι δύο 5-Αζα-CDR και κλοργυλίνη θεραπεία μόνη επεκταθεί κυτταρικού πληθυσμού χρόνος διπλασιασμού μεταξύ 3 και 10 ώρες, με η συνδυαστική θεραπεία περαιτέρω αύξηση του χρόνου διπλασιασμού, έως 16 ώρες (Εικόνα 1Β, C, D).

για να εκτιμηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του κλοργυλίνη, 5-Αζα-CDR και την συνδυαστική θεραπεία για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας επί των δύο προσκολλημένων κυτταρικών σειρών, Τ-24 και τα κύτταρα HCT116. Κλοργυλίνη έδειξε μια μέτρια επίδραση στην καταστολή της ικανότητας του Τ24 και HCT116 κύτταρα να σχηματίζουν αποικίες. 5-Αζα-CdR ουσιαστικά κατέστειλε τον σχηματισμό αποικίας και η συνδυαστική θεραπεία μείωσε περαιτέρω τον αριθμό των αποικιών (Σχήματα S1 και 1Ε). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι και οι δύο κλοργυλίνη και 5-Αζα-CdR αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων και την καταστολή του σχηματισμού αποικιών. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία περαιτέρω επιβραδύνει χρόνος διπλασιασμού του πληθυσμού και μειώνει την ικανότητα των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται.

Συνδυαστική θεραπεία ενός DNMTi και ένα LSDi ρυθμίζει αυξητικά σημαντικά περισσότερα γονίδια από οποιοδήποτε από τα μονά παραγόντων σε κύτταρα Τ24 και HL60

Για να διερευνηθεί η παγκόσμια αλλαγή στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης μετά κλοργυλίνη, 5-Aza-CdR και συνδυαστική θεραπεία, πραγματοποιήσαμε μελέτες έκφρασης γονιδιώματος σε ολόκληρη την ημέρα 18 μετά την αγωγή (D18), χρησιμοποιώντας την Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip στα κύτταρα Τ24 και HL60. Έχει καλά τεκμηριωμένο ότι 5-Αζα-CdR επάγει άμεση απομεθυλίωση και επακόλουθη γονίδιο επανενεργοποίηση [31], [32]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι ριμπάουντ μεθυλίωση και τα γονίδια γίνει εκ νέου σιγήσει μετά τη διακοπή του φαρμάκου [33], δεδομένου ότι παίρνουν τα επίπεδα DNMT αναπληρώνονται. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε ένα σχετικά αργά χρονικό σημείο για να αξιολογηθεί κατά πόσον η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να προκαλέσει παρατεταμένη γονίδιο επανενεργοποίηση. Οι αλλαγές γονιδιακή έκφραση όλων των μεταγράφων μετά υποδεικνύεται θεραπείες δείχνεται ως οικόπεδα ηφαιστείου (Σχήμα 2Α). Την ημέρα 18, σε κύτταρα Τ24, κλοργυλίνη μόνος έκανε όχι σημαντικά πλειορύθμιση οποιεσδήποτε μεταγραφές, ενώ θεραπεία 5-Αζα-CdR αύξησε την έκφραση του 30 μεταγραφές. Είναι αξιοσημείωτο ότι η συνδυαστική θεραπεία που προκαλείται ουσιαστικά περισσότερο μεταγραφές (108 μεταγραφές), τα οποία ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (Σχήμα 2Α). Για να μελετηθεί η αλληλεπικάλυψη μεταξύ των επάνω ρυθμισμένη μεταγραφές από τις διάφορες επεξεργασίες που δημιουργείται ένα διάγραμμα Venn, η οποία δείχνει ότι όλες οι μεταγραφές που προκαλούνται από 5-αζα-CdR επίσης επάγεται από την συνδυαστική αγωγή (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια, η σύγκριση των συνολικών διαφορά επαγωγή γονιδιακής έκφρασης μεταξύ 5-Αζα-CDR και τη συνδυαστική θεραπεία, έχουμε χαράσσεται η παρατηρούμενη αλλαγή αναδίπλωσης Log2 για όλες επερωτώμενης μεταγραφές στην πλατφόρμα. Η πλειονότητα αυτών των μεταγράφων είναι συνεργικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική αγωγή (Εικόνα S2), δείχνοντας ότι η κλοργυλίνη συμπληρώνει την ικανότητα της 5-Αζα-CDR να επανενεργοποιήσει γονιδίων σε κύτταρα Τ24. Εκτός από τη συμπλήρωση 5-Αζα-CdR, συνδυαστική θεραπεία μπορεί επίσης να επανενεργοποιήσει γονίδια που απέτυχε να ρυθμίζεται προς τα πάνω και μόνο από την 5-Αζα-CDR. Εβδομήντα οκτώ γονίδια μόνο επάνω ρυθμισμένη κατά την συνδυαστική αγωγή (Σχήμα 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να χρησιμοποιεί ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης από τη θεραπεία του και μόνο 5-Αζα-CDR. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονίδια που είναι συνεργικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία εμπλουτισμένη για ειδικές λειτουργίες, όπως ανοσοαπόκριση, κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 2C, Εικόνα S3). Μια λεπτομερής ανάλυση έγινε σε γονίδια τα οποία είναι μέρος του άλφα IFN και IFN βήτα μονοπάτι σηματοδότησης. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι η συνδυαστική θεραπεία διεγείρει την έκφραση αρκετών γονιδίων τα οποία είναι απαραίτητα για την αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση σε ιογενείς λοιμώξεις (Σχήμα 2C).

. Α Gene διαφορά log2 έκφραση αποτυπώνεται στον άξονα χ και το (p-value) -λογ10 σχεδιάζεται στον άξονα γ. Οι ανιχνευτές που ταυτοποιούνται ως σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων χρωματισμένο με κόκκινο χρώμα. B. Venn τέμνει τον αριθμό των γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα πάνω από την ενδεικνυόμενη θεραπεία. διάγραμμα εμπλουτισμός C. Δικτύου που περιέχουν γονίδια που είναι συνεργικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία. Τα συνεργιστικά απορυθμίζεται γονίδια που χαρακτηρίζεται από κόκκινες γραμμές. Τα άλλα σύμβολα που χρησιμοποιούνται είναι όπως φαίνεται στην ιστοσελίδα Metacore.

Η

Επίσης, πραγματοποιούνται μελέτες έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία σε HL60 κύτταρα. Οι αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης όλων των μεταγραφές μετά την ενδεικνυόμενη θεραπεία εμφανίζεται ως οικόπεδα ηφαίστειο. Χρησιμοποιώντας είχαν καθοριστεί προηγουμένως αποκοπές, εντοπίσαμε εκφράζονται διαφορικά μεταγραφές, οι οποίες επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα (Σχήμα 3Α). Βρήκαμε ότι, ενώ και οι τρεις επεξεργασίες επάγουν γονιδιακή ρύθμιση προς τα πάνω η συνδυαστική θεραπεία επάγει την έκφραση των πιο μεταγραφές, εμφανίζουν ένα παρόμοιο προφίλ έκφρασης σε κύτταρα Τ24. Η κλοργυλίνη, 5-Αζα-CDR και η συνδυαστική θεραπεία πάνω ρυθμισμένα 43, 200 και 346 μεταγραφές, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Αν και υπήρχε μια σημαντική επικάλυψη μεταξύ 5-Αζα-CDR και τη συνδυαστική θεραπεία, η συνδυαστική θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή του γονιδίου από το ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω 180 μεταγραφές που δεν ρυθμίζεται προς τα πάνω από την 5-Αζα-CDR (Σχήμα 3Β) .

Α. Gene διαφορά log2 έκφραση αποτυπώνεται στον άξονα χ και το (p-value) -λογ10 σχεδιάζεται στον άξονα γ. Οι ανιχνευτές που ταυτοποιούνται ως σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων χρωματισμένο με κόκκινο χρώμα. B. Venn τέμνει τον αριθμό των γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα πάνω από την ενδεικνυόμενη θεραπεία. C. κατάσταση έκφρασης που λαμβάνεται από ONCOMINE 20 γονιδίων, των οποίων η έκφραση συνεργικά επανενεργοποιήθηκε σε HL60 κύτταρα, στα περιφερικά μονοπύρηνα και χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία.

Η

Για να αξιολογηθεί η λειτουργική σημασία των γονιδίων συνεργικά ρυθμισμένα προς τα πάνω από τη συνδυαστική θεραπεία που ρωτήθηκαν τη βάση δεδομένων Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Στη μελέτη γονιδιακής έκφρασης για χρόνια δείγματα λεμφοκυτταρική λευχαιμία σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα περιφερικού αίματος μονοπυρηνικά, παρατηρήσαμε ότι πολλά γονίδια σε αυτές τις κατηγορίες ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στις λευχαιμίες σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα (Σχήμα 3C), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα γονίδια είναι δυνητικοί καταστολείς όγκων στη λευχαιμία. Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τις αλλαγές στην αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και ότι η συνδυαστική θεραπεία έχει περισσότερο μια πιο βαθιά επίδραση στην αναστολή ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με μόνο παράγοντες, τα αποτελέσματα τα οποία είναι σύμφωνα με τις παγκόσμιες μελέτες έκφρασης μας . Επιπλέον, συνδυαστική αγωγή προκαλεί μια συνεργική επίδραση στο up-ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων σε δύο κύτταρα Τ24 και HL60. Επιπλέον, πολλά από αυτά τα γονίδια έχουν πιθανές επιπτώσεις για ανοσοθεραπεία, όπως γονίδια αντιγόνο καρκίνου των όρχεων, και γονίδια στο μονοπάτι ιντερφερόνη, γεγονός που υποδηλώνει την σκοπιμότητα του συνδυασμού επιγενετικών θεραπεία και ανοσοθεραπεία στη θεραπεία κακοηθειών. Αξιοσημείωτα, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση είναι συνεπείς με την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης? οι συνδυαστικές θεραπείες up-ρυθμίζει σημαντικά περισσότερα γονίδια, τα οποία είναι δυνητικά κατασταλτικές του όγκου, με αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη επίδραση στον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων μεταξύ όλων των θεραπειών.

Gene πάνω ρύθμιση που επάγεται από συνδυαστική θεραπεία είναι λόγω των διαταραγμένων ιστόνης τροποποιήσεις που δεν απομεθυλίωση σε κύτταρα Τ24

για να διερευνηθεί αν DNA απομεθυλίωση ήταν υπεύθυνος για την ρύθμιση προς τα πάνω των περισσότερων γονιδίων μετά από συνδυαστική θεραπεία, πραγματοποιήσαμε μελέτες της μεθυλίωσης του DNA παγκόσμια χρήση της πλατφόρμας Illumina Infinium HumanMethylation450, η οποία περιλαμβάνει περισσότερα από 450.000 περιοχές CpG , καλύπτοντας περιοχές προαγωγού, 5’ΙΙΤΚ, 3’ΙΙΤΡ, το σώμα του γονιδίου και το πρώτο εξώνια. Δεδομένου ότι τόσο Τ24 και HL60 έδειξε συνεργιστική γονιδίου ρύθμιση προς τα πάνω λόγω της θεραπείας συνδυασμού, επιλέξαμε T24 ως εκπρόσωπος κυτταρική γραμμή για να μελετήσει την αιτία της επαγωγής του γονιδίου. Το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA για κάθε ανακρίθηκε ιστοσελίδα CpG αναφέρεται ως τιμή beta, κυμαίνεται από 0 (μη μετουσιωμένο) έως 1 (πλήρως μετουσιωμένο). Ένα οικόπεδο πυκνότητα, το οποίο περιλαμβάνει όλους τους ανιχνευτές στη συστοιχία, δημιουργήθηκε για να δείξει τις παγκόσμιες προφίλ μεθυλίωσης DNA για κάθε αγωγή (Σχήμα 4Α). Οι ανιχνευτές μπορούν να διαχωριστούν χονδρικά σε δύο ομάδες στον έλεγχο με βάση την κατανομή κατά δύο τρόπους των αξιών beta: μια υπο-μεθυλιωμένα ομάδα (beta τιμή & lt? 0,2) και μια υπερμεθυλιωμένων ομάδα (beta τιμή & gt? 0,8) (Σχήμα 4Α). Τα κύτταρα ελέγχου και κλοργυλίνη αντιμετωπίζονται παρουσίασαν πολύ παρόμοια προφίλ μεθυλίωσης. Μετά, κατεργασία 5-Αζα-CdR, η κορυφή που αντιπροσωπεύει υπερμεθυλιωμένων ανιχνευτές μετατοπίστηκε προς χαμηλότερες τιμές βήτα, που απεικονίζει ότι η 5-Αζα-CdR επάγει παγκόσμια απομεθυλίωση. Τ24 κύτταρα που εκτίθενται σε θεραπεία 5-Αζα-CdR έδειξαν πολύ παρόμοιο προφίλ μεθυλίωσης όπως τα κύτταρα που εκτίθενται σε συνδυαστική αγωγή (Σχήμα 4Α). Παρά το γεγονός ότι DNMT1 έχει αναφερθεί ως πιθανός υπόστρωμα για LSD1 [16], τα στοιχεία μας δείχνουν ότι κλοργυλίνη δεν προκαλεί απομεθυλίωση σε κύτταρα Τ24.

Α. οικόπεδα πυκνότητας για κάθε θεραπεία σε όλους 450.000 περιοχές CpG. Ο άξονας x αντιπροσωπεύει τιμές βήτα κυμαίνονται από 0 (μη μετουσιωμένο) έως 1 (πολύ μετουσιωμένο). B. Heatmap ανιχνευτών CpG που ανήκουν σε γονίδια τα οποία είναι συνεργικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία. Το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA για κάθε ανιχνευτή σε κάθε δείγμα αντιπροσωπεύεται με χρήση της κλίμακας χρώματος που φαίνεται στο υπόμνημα. Γ ChIP αποτέλεσμα των τροποποιήσεων των ιστονών μετά την εξομάλυνση στην είσοδο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης των γονιδίων που ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία. Ένας θερμικός χάρτης δημιουργήθηκε για να απεικονίσουν τα επίπεδα μεθυλίωσης ανιχνευτών, που βρίσκονται εντός των περιοχών προαγωγού (ανιχνευτές που βρίσκονται εντός 1500 bps από την θέση έναρξης της μεταγραφής) του εν λόγω σημαντικά τροποποιημένα γονίδια μετά από κάθε θεραπεία (Σχήμα 4Β). Ο έλεγχος και κύτταρα επεξεργασμένα κλοργυλίνη έδειξε πολύ παρόμοια προφίλ μεθυλίωσης με λίγους ανιχνευτές που είτε κερδίσει είτε χάσει μεθυλίωσης μετά κλοργυλίνη θεραπείας (τιμή βήτα δέλτα & gt? 0,2). Ωστόσο, συνδυαστική θεραπεία δεν προκάλεσε περαιτέρω απομεθυλίωση αυτών των ανιχνευτών που υπερμεθυλίωση αρχικά. Συγκρίνοντας θεραπεία 5-Αζα-CdR με συνδυαστική θεραπεία, 0 ανιχνευτές είχαν μια τιμή δέλτα βήτα μεγαλύτερη από 0,2, επιβεβαιώνοντας ότι δεν υπήρξε καμία ουσιαστική αλλαγή στη μεθυλίωση, λόγω της συνδυαστικής θεραπείας (Σχήμα 4Β). Κατά τρόπο αμερόληπτο επιλέξαμε δύο γονίδια, IFI27 και PAGE2B, οι οποίες συνεργικά επανενεργοποιηθεί με συνδυαστική θεραπεία, για να μελετήσει τις αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA μετά από κάθε θεραπεία (Σχήμα S4 Α και Β). Και τα δύο γονίδια έχουν αρκετές ανιχνευτές στην πλατφόρμα Infinium. Ο υποκινητής της IFI27 είναι μη μεθυλιωμένο? Από την άλλη πλευρά, ο υποκινητής του PAGE2B είναι μεθυλιωμένη. Καθώς τα δεδομένα αποδεικνύουν, αυτά τα δύο γονίδια έδειξαν παρόμοια επίπεδα μεθυλίωσης του DNA μετά είτε συνδυαστική θεραπεία ή θεραπεία 5-Αζα-CDR. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα γονίδια τα οποία είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία δεν διαθέτουν την αντίστοιχη αλλαγή απομεθυλίωση σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν μόνο 5-Αζα-CdR, γεγονός που υποδηλώνει ότι ενεργοποιεί τα γονίδια ανεξάρτητα από αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα Τ24.

για να διερευνήσουν άλλα πιθανός μηχανισμός για την περαιτέρω γονίδιο επανενεργοποίηση που προκαλείται από τη συνδυαστική θεραπεία, αποφασίσαμε να ερευνήσουμε τις αλλαγές στο σήμα της ιστόνης που θα μπορούσαν να σχετίζονται με τις παρατηρούμενες αλλαγές έκφρασης. Πρέπει πρώτα τυχαία επιλεγμένο 8 γονίδια, ανεξάρτητα από την κατάσταση μεθυλίωσης στον έλεγχο, (CT45A4, GTSF1, TKTL1, PAGE2B, IFI6, IFI27, IFIT1 και HIST1H2BK) από το σύνολο των 92 γονιδίων, τα οποία ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα κατά συνδυαστική θεραπεία, και . επικυρωμένα αποτελέσματα συστοιχία έκφρασης μας με RT-PCR στην υποδεικνυόμενη ημέρες (Σχήμα S5)

Μετά την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων σειρά, έχουμε επιλέξει 6 από τα 8 γονιδίων και διερεύνησε τις αλλαγές σε συγκεκριμένα σήματα ιστονών: H3K4me1, H3K4me2 και H3K4me3 εκτελώντας προσδιορισμούς μάρκα στο υποκινητές αυτών των γονιδίων. Τόσο H3K4me1 και H3K4me2 έχουν αναφερθεί ως άμεση υποστρώματα LSD1 [9]. Μεταξύ των γονιδίων επιλέξαμε, υποκινητές από τρία από αυτά τα γονίδια, CT45A4, GTSF1 και PAGE2B, είναι μεθυλιωμένα σε Τ-24 κύτταρα και τα υπόλοιπα είναι μη μεθυλιωμένα. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, δεν εμπλουτισμούς του H3K4me1 και H3K4me2, οι στόχοι LSD1, παρατηρήθηκαν στις υποκινητές όλων των επιλεγμένων γονιδίων κατά την κατεργασία κλοργυλίνη (Σχήμα 4C). Τόσο θεραπεία 5-Αζα-CDR και η συνδυαστική θεραπεία που προκαλείται εμπλουτισμοί H3K4me1 και H3K4me2 στις υποκινητές μεθυλιωμένων γονιδίων (Σχήμα 4C). Τα επίπεδα εμπλουτισμού ήταν σημαντικά υψηλότερες μετά από συνδυαστική θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει συμπληρώματα κλοργυλίνη 5-Aza-CdR για τη δημιουργία ενός ενεργού δομής της χρωματίνης σε μετουσιωμένο γονίδια.

Κατά τους υποστηρικτές της μη μεθυλιωμένα γονίδια, ούτε 5-Aza-CdR ούτε κλοργυλίνη μόνη της αύξησε τον εμπλουτισμό των ενεργών σημάτων χρωματίνης? Ωστόσο, η συνδυαστική θεραπεία που προκαλείται περαιτέρω τα εμπλουτισμοί H3K4me2 και H3K4me1. Εξετάσαμε επίσης το επίπεδο των H3K4me3, η οποία δεν αποτελεί άμεσο στόχο LSD1, αλλά είναι ένα ενεργό σήμα της ιστόνης, εμπλουτισμένη με τους υποστηρικτές της μη μεθυλιωμένα γονίδια. Η κλοργυλίνη που προκαλείται πιο δραματικό εμπλουτισμό της H3K4me3 για IFI27 σε σύγκριση με τον έλεγχο. θεραπεία 5-Αζα-CDR και η συνδυαστική θεραπεία έδειξε συγκρίσιμη εμπλουτισμοί H3K4me3 για όλα τα επιλεγμένα γονίδια, ενισχύοντας το γονίδιο επανενεργοποίηση προκλήθηκε με εμπλουτισμοί H3K4me2 και H3K4me1, των δύο απευθείας στόχους του LSD1. Επιπλέον, ερευνήσαμε τις εμπλουτισμοί H3K9 /14 ακετυλίωση επειδή σφικτά συσχετίζονται με γονιδιακή έκφραση [34]. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία κλοργυλίνη δεν μεταβάλλουν το επίπεδο της ακετυλίωσης όπως φαίνεται στον έλεγχο, σύμφωνα με παρατηρούμενα επίπεδα έκφρασης. 5-Αζα-CdR επαγόμενη τον εμπλουτισμό της ακετυλίωσης και της συνδυαστικής θεραπείας αυξήθηκε περαιτέρω το επίπεδο εμπλουτισμού στους υποκινητές των μεθυλιωμένων γονιδίων, καθώς και IFI27 (Σχήμα 4C). Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το Τ-24 κύτταρα, η συνδυαστική θεραπεία προκαλεί περαιτέρω γονίδιο επανενεργοποίηση όχι μέσω DNA απομεθυλίωση. Ενδιαφέροντος, είναι εμπλουτισμοί των H3K4me2 και H3K4me1 είναι οι βασικές αλλαγές ενεργοποίησης που οδηγούν σε γονίδιο επανενεργοποίηση.

Clorgyline προκαλεί DNA απομεθυλίωση σε κύτταρα HCT116

Διενεργήσαμε ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος σε ολόκληρη την ημέρα 20 μετά θεραπεία σε κύτταρα HCT116 να διερευνήσει τις αλλαγές στην παγκόσμια γονιδιακή έκφραση μετά από κάθε θεραπεία. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι τρεις θεραπείες: κλοργυλίνη, 5-Αζα-CdR και η συνδυαστική θεραπεία, που προκαλείται σημαντική γονιδιακή ρύθμιση προς τα πάνω καθώς επίσης και ρύθμιση προς τα κάτω (Σχήμα S6). Υπάρχει μια σημαντική επικάλυψη (348 μεταγραφές) μεταξύ όλων των τριών θεραπείες (Σχήμα 5Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι όλες οι θεραπείες μπορούν να χρησιμοποιούν παρόμοιους μηχανισμούς δράσης στην επανενεργοποίηση σιγήσει γονίδια. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει την έλλειψη συνεργιστική απόκριση σε κύτταρα HCT116.

Α. Venn τέμνει των γονιδίων που είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω από την ενδεικνυόμενη θεραπεία. Β οικόπεδα πυκνότητας για κάθε θεραπεία σε όλους 450.000 περιοχές CpG. Ο άξονας x αντιπροσωπεύει τιμές βήτα κυμαίνονται από 0 (μη μετουσιωμένο) έως 1 (πολύ μετουσιωμένο). Γ Venn τέμνονται των ανιχνευτών που απομεθυλιώνεται από την ενδεικνυόμενη θεραπεία. Η επικάλυψη των δύο κύκλων εκπροσωπεί τα κοινά ανιχνευτές που έχουν απομεθυλιωθεί και από τις δύο θεραπείες.

Η

Αν και κλοργυλίνη δεν προκαλεί DNA απομεθυλίωση σε κύτταρα Τ24, ερευνήσαμε κατά πόσον η σημαντική γονίδιο πάνω ρύθμιση που παρατηρείται κατά τις τρεις θεραπείες σε HCT116 αποδόθηκε σε DNA απομεθυλίωση διεξάγοντας σφαιρική ανάλυση μεθυλίωσης του DNA κατά την ημέρα 20 μετά την αγωγή. Το οικόπεδο πυκνότητα καταδεικνύει ότι τόσο θεραπεία 5-Αζα-CDR και η συνδυαστική θεραπεία που προκαλείται ουσιαστική απομεθυλίωση, που εμφανίζουν παρόμοια παγκόσμιο προφίλ μεθυλίωσης (Σχήμα 5Β). Σε αντίθεση με τα κύτταρα Τ24, κλοργυλίνη επάγεται μέτρια απομεθυλίωση DNA σε HCT116. Την ημέρα 20, 21049 ανιχνευτές απομεθυλιούνται δια κλοργυλίνη θεραπεία, ενώ 59.834 ανιχνευτές παρέμεινε απομεθυλιώνεται μετά από αγωγή 5-Αζα-CDR. Υπάρχει μια σημαντική επικάλυψη μεταξύ απομεθυλιωμένο ανιχνευτές μεταξύ αυτών των δύο θεραπειών (Σχήμα 5C). Η κλοργυλίνη απομεθυλίωση κυρίως νησιωτικές περιοχές μη-CpG (Σχήμα S7A). Δεδομένου ότι τα κύτταρα HCT116 έχουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε μη-CpG νησιωτικές περιοχές από ό, τι στα κύτταρα Τ24 (Σχήμα S7B), αυτό μπορεί να παρέχει μια εξήγηση για την αποτελεσματικότητά της στην HCT116. Έχει αποδειχθεί ότι DNMT1 είναι ένα υπόστρωμα για αναστολείς LSD1 και LSD1 έχουν τη δυνατότητα να αποσταθεροποιήσουν DNMT1, με αποτέλεσμα την παγκόσμια απομεθυλίωση [16]. Το εργαστήριο μας έχει δείξει στο παρελθόν ότι DNMT1 είναι πιο σημαντικό για τη διατήρηση της μη-CpG νησί μεθυλίωση [35], ενισχύοντας την υπόθεση μας ότι κλοργυλίνη προκαλεί απομεθυλίωση με αποσταθεροποίηση DNMT1.