Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα περισσότερα χημειοθεραπευτικά φάρμακα για τη δολοφονία του καρκίνου κύτταρα είναι πολύ κυτταροτοξικά σε φυσιολογικά κύτταρα, η οποία περιορίζει την κλινική τους εφαρμογές. Ως εκ τούτου, μια συνεχιζόμενη πρόκληση είναι η αναγνώριση ενός φαρμάκου που είναι υπερευαίσθητοι σε καρκινικά κύτταρα, αλλά έχει ελάχιστη επιβλαβή αποτελέσματα επί υγιών κυττάρων. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις δυνατότητες της 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) για την επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων και να διαφωτίσει σχετικούς μηχανισμούς του.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Οι αλλαγές στην επιβίωση, την οξειδωτική στρες, βλάβη του DNA, και η απόπτωση σηματοδότηση συγκρίθηκαν μεταξύ 4βHWE αγωγή καρκίνο του στόματος (Ca9-22) και φυσιολογική ινοβλάστη (HGF-1) κύτταρα. Στις 24 ώρες και 48 ώρες, οι αριθμοί των κυττάρων Ca9-22 ήταν σημαντικά μειωμένη, αλλά οι αριθμοί των κυττάρων HGF-1 μειώθηκαν μόνο ελαφρά. Επιπλέον, το IC

50 τιμές για 4βHWE στα κύτταρα Ca9-22 ήταν 3,6 και 1,9 μg /ml σε 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα. Εξαρτώμενη από το χρόνο ασυνήθεις αυξήσεις των ROS και δόση-απόκριση μιτοχονδριακή αποπόλωση μπορούν να αξιοποιηθούν με τη χρήση 4βHWE σε χημειοθεραπείες για την επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Δοσοεξαρτώμενη βλάβη του DNA μετράται με τη δοκιμασία κομήτη-πυρηνικού εκχυλίσματος και της ροής γ-H2AX /ιωδιούχου προπιδίου ανάλυση κυτταρομετρίας-based (PI), έδειξε σχετικά σοβαρώτερους βλάβη στα κύτταρα Ca9-22. Τόσο σε χαμηλές όσο και υψηλές συγκεντρώσεις, κατά προτίμηση 4βHWE ενόχλησή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα Ca9-22 αυξάνοντας τον πληθυσμό subG1 και τη σύλληψη των G1 ή G2 /M. Επιλεκτική επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα Ca9-22 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με Annexin V /δοκιμασίας ΡΙ, με προτιμησιακή έκφραση του φωσφορυλιωμένου αταξία-telangiectasia- και Rad3 πρωτεΐνη που σχετίζεται με (ρ-ATR), και με διάσπαση της κασπάσης 9, κασπάσης 3, και πολυ ADP-ριβόζη πολυμεράση (PARP).

Συμπεράσματα /Σημασία

Μαζί, τα ευρήματα της μελέτης αυτής, ιδιαίτερα την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών επιλεκτική θανάτωση των 4βHWE, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας σε σκοτώνει τον καρκίνο του στόματος κύτταρα κατά τη διάρκεια χημειοπροφύλαξη και θεραπεία

Παράθεση:. Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. (2013) Χρυσή Berry-Προέρχεται 4β-hydroxywithanolide Ε για επιλεκτική θανάτωση του καρκίνου του στόματος κύτταρα Ηλεκτροπαραγωγά ROS, βλάβες στο DNA, και αποπτωτικά μονοπάτια. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10.1371 /journal.pone.0064739

Επιμέλεια: Siyaram Pandey, Πανεπιστήμιο του Windsor, Καναδάς

Ελήφθη: 22 του Γενάρη, 2013? Αποδεκτές: 17 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2013

Copyright: © 2013 Chiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC101-2320-B-037-049), το Υπουργείο Υγείας, Εκτελεστικό Yuan, Δημοκρατία της Κίνας (DOH102-TD-C-111-002), και η Εθνική Sun Yat- Πανεπιστήμιο-KMU Κοινό Πρόγραμμα Sen Ερευνών (# NSYSU-KMU 102-034). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στόματος είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1]. υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα του οφείλονται εν μέρει σε σχετικά φτωχές εκβάσεις χημειοθεραπεία του [2]. Λόγω της υψηλής κυτταροτοξικότητας τους σε φυσιολογικά κύτταρα, οι διάφορες αντι-καρκίνο του στόματος φάρμακα έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα έχουν περιορισμένη θεραπευτικές εφαρμογές. Ως εκ τούτου, μια διαρκής πρόκληση είναι να αναπτυχθεί ένα αντι-καρκίνο του στόματος θεραπεία που είναι ασφαλέστερη και πιο αποτελεσματική, ιδίως από την άποψη της επιλεκτικής απόδοσης θανάτωσης.

Εκχύλισμα του

Φυσαλίς του Περού

(χρυσή μούρο), η οποία είναι ένα εδώδιμο φυτό της οικογένειας Solanaceae, σύμφωνα με πληροφορίες προσδίδει ένα αποτέλεσμα αντι-ηπατώματος μέσω απόπτωσης [3]. προηγούμενες εργασίες μας [4] διαπίστωσε ότι

P. peruviana

προερχόμενο 4β-hydroxywithanolide Ε (4βHWE) έχει αποπτωτικών και αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [4]. Οι withanolides 4βHWE είναι φυτικής προέλευσης C (28) στεροειδή λακτόνες [5] με ισχυρή αντικαρκινικές ιδιότητες [6]. Άλλες withanolides, όπως withaferin Α, επίσης φέρεται να διεγείρει απόπτωση σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού [7], το μελάνωμα [8], και λευχαιμία [9].

Συσσωρευμένα αποδείξεων σε πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι επιλεκτική ενεργοποίηση της απόπτωσης βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας του καρκίνου [10] – [15]. Για βελτιωμένη διαμόρφωση της αποπτωτικής δυναμικό των καρκινικών κυττάρων, ένα πολλά υποσχόμενο γραμμή έρευνας είναι η χρήση των withanolides που σκοτώνουν επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα, αλλά έχουν χαμηλή τοξικότητα σε υγιή κύτταρα [13]. Εν τούτοις, η πιθανή χρήση του withanolides διέγερσης απόπτωσης όπως 4βHWE [4] και withaferin A [7] – [9] για την επιλεκτική θανάτωση, ειδικά στην στοματική καρκινικά κύτταρα, είναι σπάνια συζητείται

Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη. εξέτασε την πιθανή αποτελεσματικότητα και συναφών μηχανισμών του

P. peruviana

προερχόμενο 4βHWE χρησιμοποιείται για την επιλεκτική θανάτωση του στόματος καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταροκαλλιέργειες και τα ναρκωτικά πληροφορίες

Δύο κυτταρικές σειρές, Ca9-22 (ανθρώπινο καρκίνωμα των ούλων) [16] – [18] και HGF-1 (ανθρώπινη φυσιολογική ούλων ινοβλαστών) [19], καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (ϋΜΕΜ) -F12 μέσο και μέσο ϋΜΕΜ (Gibco, Grand Island, ΝΥ), αντίστοιχα , συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 0,03% γλουταμίνη, και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Η 4βHWE (C

28Η

38O

8? MW: 502.6). Παρασκευάσθηκε από χρυσή εκχύλισμα μούρο, όπως περιγράφεται στο [4] και διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για τις δοκιμές

Αξιολόγηση της αναστολής της ανάπτυξης

η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο ( MTS) δοκιμασία όπως περιγράφεται στο [18]. εν συντομία, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε έκδοχο ελέγχου (DMSO) ή να 4βHWE σε συγκεντρώσεις 1, 2, 5 και 10 μg /ml για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε διάλυμα MTS ( CellTiter 96 Υδατικό One Solution, Promega, Madison, WI, USA) και αφέθηκαν να επωαστούν για 1-2 ώρες στους 37 ° C. Το προϊόν μετρήθηκε στα 490 nm απορρόφηση με χρήση Dynex MRX Model 96 Καλά Plate Reader (ΜΤΧ Lab Systems, Inc., Βιέννη, VA, USA).

Αξιολόγηση της ενδοκυτταρικής αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

η ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFH-DA) από Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ) όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Μετά την επεξεργασία 4βHWE, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 μΜ H2DCF-DA σε PBS για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα κύτταρα μετά συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με έναν FACSCalibur ροής κυτταρομετρητή (Becton-Dickinson, Mansfield, ΜΑ, USA) με το λογισμικό Win-MDI (https://facs.scripps.edu/software.html) στους διέγερσης και εκπομπής ρυθμίσεις 480 και 525 nm, αντίστοιχα

Αξιολόγηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού (ΔΨ

m? MitoMP). μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα MitoProbe ™ DiOC

2 ( 3) κιτ δοκιμασίας (Invitrogen, San Diego, CA, USA) όπως περιγράφεται στο [16]. Οι 4βHWE επεξεργασμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 1 ml θερμού PBS σε περίπου 1 × 10

6 κύτταρα /ml, φορτωμένο με 5 μΙ 10 μΜ DiOC

2 (3), και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5 % CO

2 για 20-30 λεπτά. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS, και αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής με λογισμικό Win-MDI σε ρυθμίσεις διέγερσης και εκπομπής των 488 και 525 nm, αντίστοιχα.

Εκτίμηση της βλάβης του DNA από κομήτη-ΝΕ δοκιμασία

Το πυρηνικό εκχύλισμα (ΝΕ) κυττάρων HGF-1 χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει δοκιμασία κομήτη-ΝΕ σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [4], [20] με ελαφρά τροποποίηση. Εν συντομία, κυτταρικά αιωρήματα αναμιγνύονται με ίσους όγκους 1.2% χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζης, φορτώθηκε αμέσως σε 1,2% κανονικό προ-επικαλυμμένες πλάκες αγαρόζης, και στη συνέχεια ψύχθηκε με πάγο μέχρι στερεοποίηση. Το τρίτο στρώμα με ένα ίσο όγκο 1.2% πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως στη συνέχεια φορτώθηκε επί της στερεοποιημένης δεύτερη γέλη και πάλι ψύχθηκε με πάγο. Μετά τη θεραπεία λύση των κυττάρων στους 4 ° C για 2 ώρες, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε πέψη ΝΕ με καλυπτρίδα και επωάστηκε στους 37 ° C για 2 ώρες σε υγροποιημένο χώρο. Η μετουσίωση των διαφανειών σε 0.3 Ν ΝαΟΗ και 1 mM EDTA για 20 λεπτά ακολουθήθηκε από ηλεκτροφόρηση. Μετά την πλύση, τα πλακίδια μεταφέρθηκαν σε 0,4 Μ Tris-HCl (ρΗ 7,5), και 40 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, 50 μg /ml? Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) προστέθηκε για παρατήρηση μικροσκοπία φθορισμού (TE2000-U ? Nikon, Tokyo, Japan). Στον κομήτη δοκιμασία, ένα δωρεάν πρόγραμμα (https://tritekcorp.com) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της βλάβης του DNA σε όρους ποσοστού του DNA ουράς [21].

Η αξιολόγηση της βλάβης του DNA από γ-H2AX /PI κυτταρομετρία

Μετά την επεξεργασία 4βHWE, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, πλένονται δύο φορές σε διάλυμα BSA-T-PBS (1% αλβουμίνη ορού βοοειδών και 0.2% Triton Χ-100 σε PBS? Sigma), και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε 100 μΙ διαλύματος BSA-T-PBS που περιείχε 0.2 μg ρ-ιστόνης H2A.X (Ser 139) μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Μετά την πλύση, τα κύτταρα ανεστάλησαν για 1 ώρα σε μια αραίωση 1:100 του Alexa Fluor 488-tagged δευτερογενές αντίσωμα (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ΜΕ, USA). Μετά από μια άλλη πλύση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 5 μg /ml ΡΙ για ανάλυση με κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur με λογισμικό Win-MDI.

Εκτίμηση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου και υπο-G1 πληθυσμός

Η χρώση ΡΙ έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (DMSO μόνο) ή 0,5, 1, 2, 5, και 10 μg /ml 4βHWE για 24 και 48 ώρες. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με 70% αιθανόλη. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα σφαιρίδια του κυττάρου επωάστηκαν με 10 μg /ml ΡΙ και 10 μg /ml RNase Α σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό Win-MDI.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Η απόπτωση μετρήθηκε με ανεξίνη /διπλή χρώση ΡΙ (Pharmingen, San Diego, CA, USA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή με 4βHWE σε δόσεις των 1, 2, και 5 μg /ml για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 μg /ml αννεξίνης V-ισοθειοκυανικό φλουορεσκεΐνης και 5 μg /ml ΡΙ και αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton-Dickinson) με λογισμικό Win-MDI.

κηλίδωση Western

δοκιμασία κηλίδος

Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα πρώτα συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Τα κυτταρολύματα φυγοκεντρήθηκαν, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Οι 40 μg προϊόντα λύσης πρωτείνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 10% και στη συνέχεια ηλεκτρομεταφέρθηκαν. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια φωσφορυλιωμένου αταξία-telangiectasia- και Rad3 σχετίζονται πρωτεΐνη (ρ-ATR) (# sc-109 912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, USA), που διασπάται κασπάση-9 (# 9501 , Cell Technology, Beverly, ΜΑ, USA), σηματοδότηση διασπασμένη κασπάση-3 (# img-144Α, Imgenex, San. Diego, CA, USA), που διασπάται πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP) (# 9541, Cell Signaling Technology) και β-ακτίνη (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), και τα αντίστοιχα δεύτερα αντισώματα τους. Το ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, USA) κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για την ανίχνευση του σήματος.

Στατιστική ανάλυση

παρουσιάστηκαν Όλα τα δεδομένα ως μέσοι ± SD. διαφορές Ομάδα στο βιωσιμότητα των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με τη χρήση JMP® 9 λογισμικού για την εκτέλεση μονόδρομη ANOVA με Tukey HSD post hoc Test. Επίπεδα που δεν συνδέονται με το ίδιο γράμμα αναφέρεται σημαντικές διαφορές. Άλλα δεδομένα αναλύθηκαν με Student

t-test

.

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση της αναστολής της ανάπτυξης

Ο προσδιορισμός MTS της κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από 24 ώρες και 48 h θεραπεία με 4βHWE (0, 1, 2, 5 και 10 μg /ml) έδειξαν ότι, για κάθε πειραματική συγκέντρωση του 4βHWE, πολλαπλασιασμού Ca9-22 καρκίνου του στόματος κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του HGF-1 φυσιολογικά κύτταρα (το ένα way ANOVA) (Σχήμα 1). Σε HGF-1 κύτταρα, η θεραπεία με 10 μg /ml 4βHWE μειώθηκε ελαφρά κυτταρικής βιωσιμότητας για 89,02 ± 1,17% και για 65,42 ± 2,26% μετά από 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, η βιωσιμότητα του παρόμοια επεξεργασία 4βHWE κατεργασμένα κύτταρα Ca9-22 μειώθηκε δραματικά σε 26,56 ± 2,22 και 16,01 ± 2,38 μετά από 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της 4βHWE επί Ca9-22 κυττάρων ήταν τόσο δοσο-απόκρισης και χρονο-εξαρτώμενη. Επιπλέον, IC

50 τιμές ήταν 3,6 και 1,9 μg /ml μετά από 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα, σε 4βHWE επεξεργασμένα κύτταρα Ca9-22 ενώ IC

50 ήταν απαρατήρητα σε παρόμοια επεξεργασία των κυττάρων HGF-1.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 2, 5, και 10 μg /ml 4βHWE για 24 και 48 ώρες. Δεδομένα, μέσος όρος ± SD (η = 3). Για ίδιες συγκεντρώσεις φαρμάκου σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες (Ca9-22 για 24 ώρες, Ca9-22 για 48 ώρες, HGF-1 για 24 ώρες, HGF-1 για 48 ώρες), τα δεδομένα που δεν συνδέονται με το ίδιο γράμμα ( επάνω δεξιά γωνία της SD) διέφεραν σημαντικά (one-way ANOVA με Tukey HSD post hoc Test).

η

Αξιολόγηση των ROS

Μερικές withanolides όπως withaferin Α φέρεται να προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα μελανώματος μέσω της παραγωγής ROS [8]. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη συνέκρινε τα επόμενα ρυθμίζουν επιδράσεις των ROS στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και Ca9-22 HGF-1. Τα Σχήματα 2Α και 2Β δείχνουν τις εντάσεις φθορισμού ROS ως ποσοστά του Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα θετικά για DCFD-Α, η οποία μετρήθηκαν μετά από θεραπεία με 3,6 μg /ml 4βHWE για διάφορα χρονικά διαστήματα. Το Σχήμα 2C δείχνει την ήπια επαγωγή του ROS παρατηρούνται σε HGF-1 κύτταρα σε σύγκριση με το σχετικά δραματική χρονο-εξαρτώμενη επαγωγή ROS στα κύτταρα Ca9-22. Για κάθε πειραματική συγκέντρωση του 4βHWE, το ποσοστό των DCFD-Α θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα Ca9-22 στόματος καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα HGF-1 (

P

& lt? 0,0001).

τα κύτταρα χορηγήθηκαν ένα όχημα και 3,6 μg /ml του 4βHWE για διάφορα χρονικά διαστήματα (0 έως 5 ώρες). Για τη μέτρηση της ROS αλλαγή, 200 μΜ H

2O

2 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. (Α, Β) Αντιπροσωπευτική κυτταρομετρία ροής με βάση ROS προφίλ για 4βHWE-κατεργασμένα κύτταρα. (Γ) ποσοτική ανάλυση της έντασης ROS από την άποψη της DCFD-Α θετικότητα (%). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές μετά από θεραπεία με παρόμοιες συγκεντρώσεις 4βHWE (

t-test

,

P

& lt? 0.0001 **).

Η

Αξιολόγηση μιτοχονδριακών δυναμικών μεμβράνης (mitoMP)

στη συνέχεια, ένα DiOC

2 (3) δοκιμασία διεξήχθη για να εξετάσει τα αποτελέσματα της 4βHWE που προκαλείται από επαγωγή ROS σε mitoMP. Τα Σχήματα 3Α και 3Β δεικνύουν τις εντάσεις φθορισμού mitoMP ως ποσοστά του DiOC

2 (3) -θετικό Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα μετά από 24 ώρες αγωγή με 0, 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE. Η Εικόνα 3C δείχνει ότι mitoMP μειώθηκε μέτρια σε κύτταρα HGF-1 αλλά ουσιαστικά μειωμένη σε Ca9-22 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Για κάθε πειραματική συγκέντρωση του 4βHWE, το ποσοστό των κυττάρων θετικά για DiOC

2 (3) ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα Ca9-22 ό, τι στα κύτταρα HGF-1 (

P

& lt? 0,0005).

(Α, Β) Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής με βάση το προφίλ MitoMP για 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0-5 μg /ml) του 4βHWE για 24 ώρες. (C) ποσοτική ανάλυση της έντασης MitoMP. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SDs% (n = 3). Οι αστερίσκοι δεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυτταρικών γραμμών Ca9-22 και HGF-1 μετά από αγωγή με παρόμοιες συγκεντρώσεις του 4βHWE (

t-test

,

P

& lt? 0,0005 **).

η αξιολόγηση της βλάβης του DNA από κομήτη-ΝΕ δοκιμασία

στην δοκιμασία κομήτη-ΝΕ (Εικόνα 4Α), οι «ουράς» ενέργειες που παρατηρήθηκαν στα κύτταρα Ca9-22 ήταν μεγαλύτερη σε υψηλές Οι συγκεντρώσεις 4βHWE. Σε αντίθεση, κανένας από τους πειραματικούς συγκεντρώσεων 4βHWE προκάλεσε παρατηρήσιμο αποτέλεσμα ουράς σε κύτταρα HGF-1. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι τα κύτταρα HGF-1 δεν έδειξε ορατή αύξηση στο DNA% ουρά ενώ τα κύτταρα Ca9-22 έδειξαν δραματική αύξηση της DNA% ουρά με ένα τρόπο δόσης-απόκρισης. Για κάθε πειραματική συγκέντρωση του 4βHWE, η βλάβη του DNA σε όρους% DNA σε ουρές των κυττάρων σε επεξεργασία με 4βHWE ήταν σημαντικά πιο σοβαρή σε HGF-1 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα Ca9-22 (

P

& lt? 0,0001) .

(Α) Αντιπροσωπευτική κομήτη αποτελέσματα χρώσης ΡΙ για τους ελέγχους κυττάρων (DMSO) και τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 0.5, 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE για 2 ώρες. Οι πυρήνες εμφανίζονται ως κόκκινες κηλίδες, και οι ουρές των κηλίδων δείχνουν τη σοβαρότητα της βλάβης του DNA μετά από θεραπείες 4βHWE. (Β) Μέσος όρος του% του DNA ουράς σε 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. Δεδομένα, μέσος όρος ± SD (πυρήνες = 50). Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυτταρικών γραμμών Ca9-22 και HGF-1 μετά από αγωγή με παρόμοιες συγκεντρώσεις 4βHWE (

t-test

,

P

& lt? 0,0001 **).

η αξιολόγηση της βλάβης του DNA από γ-H2AX /PI κυτταρομετρία

Για περαιτέρω επιβεβαίωση της συμμετοχής της βλάβης του DNA σε 4βHWE που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης σε Ca9-22 καρκίνο του στόματος κύτταρα, η διπλή έλικα του DNA διάλειμμα (DSB) μετρήθηκε από την άποψη της έκφρασης γ-H2AX. Το σχήμα 5Α εμφανίζει τα προφίλ γ-Η2ΑΧ χρώση /ΡΙ που ελήφθη μετά από 24 ώρες θεραπείες με θετικό μάρτυρα ή με 0, 0,1, 0,25, 0,5 και 1 μg /ml του 4βHWE. Το Σχήμα 5Β δείχνει ότι, μετά από επεξεργασία με συγκεντρώσεις 4βHWE μικρότερη από 2 μg /ml, τα κύτταρα HGF-1 διατηρείται χαμηλά επίπεδα έκφρασης γ-Η2ΑΧ ενώ κύτταρα Ca9-22 παρουσίασαν δραματική δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στην έκφραση γ-Η2ΑΧ. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις 4βHWE, ωστόσο, η πτυχή αλλαγή στο% του γ-Η2ΑΧ-θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερο σε κύτταρα Ca9-22 ό, τι σε HGF-1 κύτταρα (

P

& lt? 0,0005).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 2, και 5 μg /ml του 4βHWE για 24 ώρες. (Α) Αντιπροσωπευτική κυτταρομετρία ροής με βάση το προφίλ DSB για 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. Κύτταρα κατεργασμένα με 5 μΜ καμπτοθεκίνη (CPT) για 24 ώρες θεωρήθηκαν γ-Η2ΑΧ θετικών μαρτύρων. (Β) ποσοτική ανάλυση της αναδίπλωσης αλλαγές στη βλάβη του DNA γ-Η2ΑΧ που βασίζονται σε 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. Δεδομένων, μέση τιμή ± SD. Οι αστερίσκοι δεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα κατεργασμένα με παρόμοιες συγκεντρώσεις 4βHWE (

t-test

,

P

& lt? 0,0005 **? Η = 2 και 3, αντίστοιχα).

η

Αξιολόγηση του κυτταρικού κύκλου

διανομή

το σχήμα 6 δείχνει ότι, μετά από 24 ώρες θεραπείας με 4βHWE, το ποσοστό μεταβολής του πληθυσμού υπο-G1 στην HGF-1 κύτταρα δεν ήταν στατιστικά σημαντική σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από 2 μg /ml. Η ποσοστιαία αλλαγή σε υπο-G1 αυξήθηκε ελαφρώς στο 2,75% όταν η συγκέντρωση φτάσει 5 μg /ml. Σε αντίθεση, η ποσοστιαία μεταβολή σε υπο-G1 στα κύτταρα Ca9-22 αγωγή με 4βHWE για 24 ώρες άρχισε να δείχνει σημαντικές αλλαγές σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 2 μg /ml και τελικά έφτασε 30.59%. Μετά από 48 ώρες θεραπείας, το ποσοστό των πληθυσμών sub-G1 σε κύτταρα HGF-1 μέτρια αυξήθηκε σε 25,03% και 29,42% μετά από θεραπείες με 2 και 5 μg /ml 4βHWE, αντίστοιχα. Αντίθετα, το ποσοστό των υπο-G1 σε κύτταρα Ca9-22 σε επεξεργασία με 4βHWE για 48 ώρες έδειξε μία στατιστικά σημαντική μεταβολή (42,76%) μετά τη θεραπεία με 1 μg /ml και μια πολύ μεγαλύτερη μεταβολή (78,89%) μετά από θεραπεία με 5 μg /ml.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE για 24 ώρες και 48 ώρες. (Α) κατανομή του κύκλου Εκπρόσωπος κυττάρων σε 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. ποσοστά (Β) φάση κυττάρων που ελήφθησαν για (Α) σε πειράματα εις τριπλούν. Για την ίδια φάση των διαφορετικών συγκεντρώσεων του φαρμάκου, τα δεδομένα δεν συνδέονται με το ίδιο γράμμα (επάνω δεξιά SD) διέφεραν σημαντικά (one-way ANOVA με Tukey HSD post hoc Test).

Η

Σε 24 h, αναλύσεις G1 και G2 /M πληθυσμών σε κύτταρα HGF-1 έδειξε μία μη σημαντική αλλαγή στον πληθυσμό G1 και ένα βασικό επίπεδο μεταβολή της G2 /M ρύπανση. Αντίθετα, μετά από αγωγή 4βHWE 24 h, τα κύτταρα Ca9-22 έδειξαν σημαντικές μεταβολές στην G1 σύλληψη (57,49% και 40,75% σε 0.5 και 1 μg /ml, αντίστοιχα), και G2 /M σύλληψης (50,44% και 62,08% σε 1 και 2 μg /ml, αντίστοιχα). Μετά από 48 ώρες αγωγής με 5 μg /ml βHWE, τον πληθυσμό G1 στα κύτταρα HGF-1 μειώθηκε ελαφρά σε 56,27%, ενώ το G2 /M πληθυσμός αυξήθηκε ελαφρά. Σε αντίθεση, τα κύτταρα Ca9-22 έδειξαν σημαντική (79,23%) G1 σύλληψης μετά από 48 ώρες αγωγή με μια συγκέντρωση 4βHWE μόνο 0.5 μg /ml. Στην G2 /M του πληθυσμού, η θεραπεία με 1 μg /ml 4βHWE οδήγησε σε μέτρια (27,34%) σύλληψη G1 σε συνδυασμό με την δραματική συσσωρεύσεις subG1 όπως περιγράφεται παραπάνω.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Για να εξεταστεί η εμπλοκή της απόπτωσης σε συσσώρευση υπο-G1 4βHWE επαγόμενη, κυτταρομετρία ροής με βάση αννεξίνης V /διπλή χρώση ΡΙ διεξήχθη. Το Σχήμα 7Α δείχνει τα προφίλ χρώση γ-Η2ΑΧ /ΡΙ του HGF-1 και τα κύτταρα Ca9-22 κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις 4βHWE. Τα διπλά θετικές περιοχές της γ-H2AX και PI εντάσεις συνήθως ορίζεται ως αργά την απόπτωση. Αναλύσεις αργά απόπτωσης (Εικόνα 7Β) έδειξε μία ήπια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στα κύτταρα HGF-1 αλλά μία δραματική δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα κύτταρα Ca9-22. Για κάθε πειραματική συγκέντρωση του 4βHWE, το ποσοστό των κυττάρων τα οποία υπέστησαν απόπτωση αργά μετά τη θεραπεία 4βHWE ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα Ca9-22 ό, τι σε HGF-1 κύτταρα (

P

& lt? 0,0001).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE για 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά προφίλ αποπτωτικών (Α) που λαμβάνεται με Annexin V /PI διπλή χρώση σε 4βHWE επεξεργασμένα Ca9-22 και τα κύτταρα HGF-1. αποτελέσματα της ανάλυσης (Β) Ποσοτικοποίηση για τα τέλη του πληθυσμού της απόπτωσης (%). Μόνο αννεξίνη V (+) /ΡΙ (+) περιοχές αναλύθηκαν. Δεδομένα, μέσος όρος ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (Ca9-22 και HGF-1) υποβάλλεται σε επεξεργασία με παρόμοιες συγκεντρώσεις 4βHWE (

t-test

,

P

& lt? 0,0001 **).

Αξιολόγηση των αποπτωτικών σηματοδότησης

Τα αποπτωτικά σηματοδότηση εξετάσθηκε με δοκιμασίες Western κηλίδωση του Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις 4βHWE (0, 1, 2, και 5 μg /ml). Το Σχήμα 8 δείχνει ότι η αύξηση των συγκεντρώσεων του 4βHWE επάγεται βαθμηδόν αυξήσεις στη φωσφορυλίωση ATR συνδέονται με την κυτταρική βλάβη του DNA στα κύτταρα Ca9-22. Διάσπαση της κασπάσης 9, κασπάσης 3 και PARP επίσης επάγεται σε κύτταρα Ca9-22, ειδικά σε συγκεντρώσεις 4βHWE του 2 μg /ml και 5 μg /ml. Σε αντίθεση, 4βHWE δεν ενεργοποιούν είτε ATR φωσφορυλίωση ή την ενεργοποίηση της κασπάσης καταρράκτη στα κύτταρα HGF-1.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE για 24 ώρες. Η απόπτωση πρωτεΐνες, όπως π-ATR, και διάσπαση της προ-κασπάσης 9 σηματοδότησης, προ-κασπάσης 3 και PARP ανιχνεύθηκαν. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Κάθε κηλίδα αντιπροσωπεύει ένα ανεξάρτητο πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Withanolides είναι φυτικής προέλευσης C (28) στεροειδή λακτόνες με ισχυρή αντικαρκινική δράση [24], [25] . Ωστόσο, η χρήση του withanolides για την επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων δεν έχει μελετηθεί εντατικά. Withaferin Α είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας [9], το μελάνωμα [8], και καρκίνους του στήθους [7], το ήπαρ [26], το πάγκρεας [27], του παχέος εντέρου [28], του πνεύμονα [29 ], και του προστάτη [30]. Σε προηγούμενες μελέτες, δοκιμασίες ΧΤΤ εκτελείται μετά από θεραπεία 24 ώρες με withaferin Α έδειξε IC

50 τιμές 2 μΜ σε κύτταρα λευχαιμίας (HL-60) [31], 4 μΜ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PC3) [30], και & gt ? 6 μΜ σε ηπατώματος (SK-ΗΕΡ1), ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΗΤ29) και τα κύτταρα καρκίνου του νεφρού (Caki) [26]. Αναφέρθηκαν IC

50 τιμές που λαμβάνονται από προσδιορισμούς ΜΤΤ καρκινικών κυττάρων μαστού (MDA-MB-231) περιλαμβάνουν 13 μΜ για anomanolide Α, 15 μΜ για tubocapsanolide E, και & gt? 20 μΜ για tubocapsenolide Β, tubocapsanolide C, και peruvianolide H [ ,,,0],6].

Πρόσφατα, withanolide προέρχονται από Ashwagandha φύλλο extract [32] έδειξε έναν πιθανό ρόλο στην εκλεκτική θανάτωση κυττάρων καρκίνου του στήθους MCF7 σε συγκέντρωση 24 μg /ml [33]. Η τρέχουσα μελέτη παρομοίως έδειξαν ότι το IC

50 τιμές του Ca9-22 καρκίνο του στόματος κύτταρα ήταν 3,6 μg /ml (7,16 μΜ) και 1,9 μg /ml (3,78 μΜ) μετά από 24 ώρες και 48 ώρες επεξεργασίας με 4βHWE, αντίστοιχα. Υποθέτουμε ότι η επιλεκτική θανάτωση επίδραση του 4βHWE μπορεί να είναι συγκρίσιμες ή ακόμη και περισσότερο ισχυρή σε άλλες στοματικές καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε κύτταρα HGF-1, ωστόσο, IC

50 τιμές ήταν μη ανιχνεύσιμη με προσδιορισμό MTS σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από 10 μg /ml. Σε άλλες μελέτες των θεραπειών 4βHWE για 24 ώρες, ένα IC

50 τιμή 6 μΜ αναφέρθηκε σε μία δοκιμασία ΜΤΤ του καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 κύτταρα [6] και ένα IC

50 τιμή του 1,41 μΜ ήταν αναφέρεται σε trypan μπλε δοκιμασία του καρκίνου του πνεύμονα Η1299 κύτταρα [4]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ευαισθησία φαρμάκου 4βHWE ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που επιβεβαιώνει ότι 4βHWE σκοτώνει τον καρκίνο του στόματος κύτταρα κατά προτίμηση σε φυσιολογικά προφορική κύτταρα.

Επιπλέον, τα προστατευτικά αποτελέσματα των withanolides βρίσκονται σε φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών. Για παράδειγμα, withanone προέρχεται από το φύλλο προστατεύει Ashwagandha φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών κατά μεθοξυοξικού οξέος που προκαλείται από γηρασμό, όπως αναστολή της ανάπτυξης από την άποψη της γήρανση σχετίζεται με χρώση β-γαλακτοσιδάσης [34]. Παρομοίως, η παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι η μορφολογία των κυττάρων HGF-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 1, 2, και 5 μg /ml 4βHWE ήταν παρόμοια με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων ινοβλαστών HGF-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περαιτέρω μελέτες των φαινοτύπων σύλληψη ανάπτυξης που απαιτούνται για να διαπιστωθεί αν 4βHWE είναι ασφαλές για τα φυσιολογικά κύτταρα.

Παρά το γεγονός ότι συσσωρεύονται αποδείξεις συμφωνεί ότι withanolides επάγουν ROS-απόπτωση, την πιθανή χρήση τους για την επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων είναι σχετικά ασαφής. Για παράδειγμα, withaferin Α είναι γνωστό ότι προκαλεί ROS απόπτωση που διαμεσολαβείται στον καρκίνο του μαστού [7], το μελάνωμα [8], και λευχαιμία [9], [31]. Αν και τα καρκινικά κύτταρα αναμένεται να έχουν υψηλότερο οξειδωτικό στρες σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [35], τα φυσιολογικά κύτταρα μπορούν να ανεχθούν ένα εξωγενές επίπεδο στρες οξειδωτικού επαρκής για να αποτρέψει την υπερφόρτωση με αποτέλεσμα σε κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση, τα καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε υψηλό οξειδωτικό στρες δεν μπορεί να ανεχθεί εξωγενείς παράγοντες ROS-διαμόρφωση, και αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο, όπως το όριο υπέρβασης [36]. Αυτή η έννοια μπορεί να εξηγήσει εν μέρει τις εκλεκτικές επιδράσεις θανάτωση 4βHWE σε στοματική καρκινικά κύτταρα παρατηρούνται εδώ και εκείνων της withanone σε καρκινικά κύτταρα του μαστού, όπως αναφέρεται στο [33], δηλαδή, τόσο ROS επαγωγής και η μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι υψηλότερα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι θεραπείες για την επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων θα πρέπει να απευθύνονται σε διαμόρφωση οξειδοαναγωγική κατάσταση και στις δύο καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα [36]. Ωστόσο, οι ρόλοι των κασπασών και των αναστολέων κασπάσης [37] σε 4βHWE που προκαλείται από την επιλεκτική απόπτωση χρειάζεται περαιτέρω μελέτη.

Οι ROS μεσολάβηση επιπτώσεις της withanolides μπορεί να ρυθμίζεται με αντιοξειδωτικά. Για παράδειγμα, η Ν-ακετυλκυστεϊνη μπορεί φέρεται διασώσει τα ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος από withaferin Α-επαγόμενη, ROS απόπτωση που διαμεσολαβείται [8]. Κατά συνέπεια, ο ρόλος των ROS στην επιλεκτική θανάτωση 4βHWE μπορούν να διευκρινιστούν περαιτέρω από τη μελέτη ROS ρυθμιστές.

Το ROS είναι γνωστό ότι προκαλούν βλάβες στο DNA και το σημείο ελέγχου απαντήσεις [38]. Για παράδειγμα, οι δοκιμασίες κομήτη-NE και γ-Η2ΑΧ σε αυτή τη μελέτη έδειξε ότι 4βHWE προκαλούμενη βλάβη του DNA και G1 ή G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου, οι οποίες έχουν παρατηρηθεί νωρίτερα σε άλλες withanolides. Για παράδειγμα, tubocapsanolide Α αναστέλλει φέρεται πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα Α549 μέσω G1 σύλληψης [39]. Ωστόσο, 4βHWE [4] και withanone [33] είναι γνωστό ότι προκαλεί βλάβη στο DNA και στη συνέχεια ανακοπή σε G2 /M σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Η1299 και στον καρκίνο του μαστού MCF-7 κύτταρα, αντίστοιχα.

Επιλεκτική DNA βλάβη ( δηλαδή, DSB) μπορεί να παρακολουθηθεί με Η2ΑΧ, το οποίο φωσφορυλιώνεται σε ένα ATR-εξαρτώμενο τρόπο [40]. Η Η2ΑΧ βοηθά επίσης να σταθεροποιήσει το γονιδίωμα [41] και είναι απαραίτητη για την κασπάση-ενεργοποιημένου DNA κατακερματισμό [42]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία 4βHWE επαγόμενη υψηλότερες εκφράσεις του ATR και κασπάσης σηματοδότηση πρωτεϊνών σε κύτταρα Ca9-22 συγκριτικά με κύτταρα HGF-1.

Μετά από 24 ώρες αγωγή με 2 μg /ml 4βHWE, Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα έδειξαν βιωσιμότητες κυττάρου (%) των 56,09 ± 1,78 και 92,81 ± 2,20 (Εικόνα 1)? mitoMP (%) των 61,18 ± 3,21 και 99,81 ± 0,74 (Εικόνα 3)? γ-Η2ΑΧ (fold) των 8,47 ± 0,54 και 0,73 ± 0,19 (Εικόνα 5)? πληθυσμοί subG1 (%) των 14,74 ± 0,30 και 1,32 ± 0,15? G2 /M συλλήψεις 62,08 ± 1,03 και 15,89 ± 0,19 (Εικόνα 6) αργά απόπτωση (%) των 13,80 ± 1,05 και 7,97 ± 0,06 (Εικόνα 7)? και υπερ- και υπο-έκφραση της απόπτωσης σηματοδότησης πρωτεΐνες (Σχήμα 8), αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν με συνέπεια τα αποτελέσματα της 4βHWE από την άποψη της επιλεκτικής θανάτωσης, επιλεκτική μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, επιλεκτική βλάβη του DNA (δηλ, DSB), επιλεκτική G2 /M σύλληψης, και επιλεκτική απόπτωση κυττάρων Ca9-22 προτίμηση σε κύτταρα HGF-1. Μετά παρόμοια κατεργασία με 3,6 μg /ml 4βHWE για 2 ώρες, το Ca9-22 και HGF-1 κύτταρα έδειξαν επαγωγή ROS (%) των 158,83 ± 0,34 και 108,63 ± 1,04 (Εικόνα 2) και κομήτη-ΝΕ-based βλάβη του DNA του 29,21 ± 5,93 και 0,27 ± 0,52 (Εικόνα 4), αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι η θεραπεία 4βHWE προκαλεί επιλεκτικά ROS και βλάβη του DNA στα κύτταρα Ca9-22 κατά προτίμηση σε κύτταρα HGF-1.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης επιβεβαιώνουν ότι η θεραπεία 4βHWE προκαλεί επιλεκτικά ROS, μιτοχονδριακή αποπόλωση , και βλάβη του DNA, το οποίο με τη σειρά του επάγει σηματοδότηση επιλεκτική απόπτωση, η οποία τελικά καταλήγει στην επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από το στόμα (Σχήμα 9). Συνεπώς, αυτή η μελέτη έδειξε, για πρώτη φορά, ότι η θεραπεία 4βHWE σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα από το στόμα κατά προτίμηση σε κανονική στοματική κύτταρα. Η περαιτέρω μελέτη των υποψηφίων στόχων και των μηχανισμών σηματοδότησης που αναφέρονται εδώ μπορεί επίσης να παρέχει ένα αρκετά βελτιωμένη κατανόηση των μηχανισμών επιλεκτικής θανάτωσης 4βHWE για να καταστεί δυνατή η αποτελεσματική χρήση της στη θεραπεία του καρκίνου του στόματος με ελάχιστες ανεπιθύμητες ενέργειες.

Οι αλλαγές στην Ca9-22 τα κύτταρα υποδεικνύονται με μπλε βέλη. Κανονική στόματος κύτταρα (δεν δείχνεται) έδειξαν σχετικά μικρότερες αλλαγές σε σύγκριση με τα κύτταρα Ca9-22. Σε Ca9-22 αντιμετωπίζονται με 4βHWE, ενισχυμένη γενιά ROS οδήγησε σε αυξημένο οξειδωτικό στρες. Η επαγωγή των ROS στη συνέχεια αυξήθηκε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και διευκόλυνε τη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης στα κύτταρα Ca9-22. Επαγωγή των ROS οδήγησε επίσης σε αύξηση της βλάβης του DNA σε κύτταρα Ca9-22, π.χ., γ-H2AX στο DSB, η οποία στη συνέχεια επαγόμενη φωσφορυλίωση ATR. Μαζί, μιτοχονδριακή σηματοδότησης ζημιά και σηματοδότηση βλάβης του DNA οδήγησε σε αυξημένη σηματοδότηση της απόπτωσης, η οποία στη συνέχεια οδήγησε σε επιλεκτική απόπτωση και θανάτωση κυττάρων Ca9-22.

Η