Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

GLI1 είναι ο βασικός παράγοντας της μεταγραφής στην οδό σηματοδότησης Hedgehog στον καρκίνο του παγκρέατος. RegIV σχετίζεται με την αναγέννηση και την ανάπτυξη των κυττάρων, την επιβίωση, προσκόλληση και την αντοχή σε απόπτωση. Επιδιώξαμε να μελετήσει έκφραση RegIV σε καρκίνο του παγκρέατος και η σχέση της με GLI1.

Μέθοδοι

GLI1 και έκφραση RegIV αξιολογήθηκαν στον ιστό του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και 5 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμές από qRT-PCR, κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία (IHC), και τη συσχέτιση μεταξύ τους. Η φορέα λεντοϊού GLI1-shRNA κατασκευάστηκε και διαμολύνθηκε σε PANC-1, και λεντοϊού φορέας που περιέχει την αλληλουχία έκφρασης GLI1 κατασκευάστηκε και διαμολύνθηκε σε BxPC-3. GLI1 και έκφραση RegIV αξιολογήθηκαν με qRT-PCR και κηλίδος Western. Τέλος, αποδεικνύεται RegIV να είναι ο στόχος της GLI1 από χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (CHIP) και δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA).

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα της IHC και qRT-PCR έδειξε ότι RegIV και έκφραση GLI1 ήταν υψηλότερη σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς έναντι γειτονικών κανονικών ιστών (ρ & lt? 0.001). έκφραση RegIV συσχετίζεται με την έκφραση GLI1 σε αυτούς τους ιστούς (R = 0,795, ρ & lt? 0,0001). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν για πρωτεΐνη (R = 0,939, p = 0,018) και η έκφραση του mRNA (R = 0,959, p = 0,011) σε 5 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. RegIV mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης μειώθηκε (94.7 ± 0.3%, 84.1 ± 0.5%? Αντίστοιχα) όταν GLI1 χτυπήθηκε κάτω (82.1 ± 3.2%, 76.7 ± 2.2%? Αντίστοιχα) με την τεχνική RNAi. GLI1 υπερέκφραση σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%? Αντίστοιχα) που προκαλείται RegIV υπερέκφραση (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%? Αντίστοιχα). Επιπλέον, δοκιμασίες CHIP και EMSA έδειξε πρωτεΐνη GLI1 δεσμεύονται σε περιοχές RegIV προαγωγό (GATCATCCA) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

GLI1 προωθεί RegIV μεταγραφή με σύνδεση προς το γονίδιο υποκινητή RegIV σε καρκίνο του παγκρέατος.

Παράθεση: Wang F, Xu L, Guo C, Ke Α, Χου G, Xu Χ, et al. (2011) Ταυτοποίηση RegIV ως Novel GLI1 γονιδίου στόχου στον τομέα των ανθρωπίνων καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10.1371 /journal.pone.0018434

Συντάκτης: Vladimir Ν Uversky, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Οκτ 2010? Αποδεκτές: 4 Μαρτίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81072065), Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία Επιτροπή της Σαγκάης (Αρ 09JC1412200, Νο 09410705400), και Διδακτορικό Ταμείο του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (Αρ 20090072110022). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου που σχετίζονται με αιτία θνησιμότητας στον δυτικό κόσμο [1] – [3] και έχει μια θλιβερή πρόγνωση παρά τη σημαντική πρόοδο στον τομέα της διαχείρισης. Η μέση επιβίωση των PC είναι λιγότερο από 6 μήνες? το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι λιγότερο από το 5% [1], [2]. Περισσότερο από το 80% του παρόντος με ανεγχείρητο νόσο? το ένα τρίτο έχουν τοπική νόσο, ενώ το υπόλοιπο έχει απομακρυσμένες μεταστάσεις. Έρευνα κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών έχει δείξει ότι ο υπολογιστής είναι μια γενετική ασθένεια ριζικά, προκαλούνται από κληρονομική βλαστικής σειράς και που αποκτήθηκαν σωματικών μεταλλάξεων στον καρκίνο που σχετίζεται με τα γονίδια. μοντέλο εξέλιξης του όγκου για PC στις οποίες η παγκρεατικού πόρου επιθήλιο προχωρεί από την κανονική σε αυξημένη ποιότητες παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (PanINs) σε διηθητικό καρκίνο. Πολλαπλές αλλαγές σε γονίδια τα οποία είναι σημαντικά για την εξέλιξη της PC έχουν ταυτοποιηθεί, για παράδειγμα Κ-ras, ΙΝΚ4 &, ρ53, και Smad4 /DPC4 [4], [5]. PC χαρακτηρίζεται από σχεδόν καθολική μεταλλάξεις στο K-ras και συχνή απορρύθμιση της ζωτικής σημασίας οδών εμβρυϊκών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του Hedgehog (HH) σηματοδότηση μονοπατιού [6], [7]. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη των PC μπορεί να βοηθήσει να βελτιωθεί η έγκαιρη διάγνωση και ενδεχομένως τον εντοπισμό μοριακών θεραπευτικών στόχων.

Ο σκαντζόχοιρος (HH) μονοπατιού σηματοδότησης εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην εμβρυϊκή ανάπτυξη της Drosophila [8] και έχει δειχθεί ότι είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη και την σχηματοποίηση στο πάγκρεας κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. HH σηματοδότηση ρυθμίζει την διαφοροποίηση των κυττάρων και το σχηματισμό οργάνων κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, και εκφράζεται σε παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα [9], [10]. Συστατική ενεργοποίηση HH σηματοδότησης ανιχνεύεται σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [9] – [13]. Δεδομένης misexpression του και στις δύο μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και σε πρόδρομες βλάβες (PanIN) [14], η ενεργοποίηση σήμα ΗΗ μπορεί να εμπλέκεται σε τόσο πρώιμη και όψιμη παγκρεατική ογκογένεση.

Από τις τρεις συνδέτες των θηλαστικών στην οικογένεια HH , Sonic (ΕΛΕΡΠΕ), Desert (DHH), και της Ινδίας (ΙΗΗ) σκαντζόχοιρος [15], ο πρώην έχει συνδεθεί τόσο με παγκρέατος οργανογένεση και τον καρκίνο του παγκρέατος. Τα σήματα μεταδίδονται HH και τροποποιούνται από δύο διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, patched (PTCH) και smoothened (SMO), και από μεταγενέστερους παράγοντες μεταγραφής που είναι μέλη της οικογένειας γλοιώματος που σχετίζεται με ογκογονίδιο (GLI) (GLI1, 2 και 3). GLI2 και GLI3 έχουν μετενεργοποίηση και κατασταλτικών τομείς, ενώ GLI1 πιθανό λειτουργεί μόνο ως μετενεργοποιητής και μεταγραφικές στόχος της ίδιας της οδού HH [16] – [19]. Η οικογένεια αναγέννησης γονίδιο (REG), μία ομάδα μικρών εκκριτικών πρωτεϊνών, εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση στα πεπτικά όργανα [20], υπερεκφράζεται σε διάφορες γαστρεντερικών καρκίνων, και λειτουργεί ως τροφικών ή αντιαποπτωτικών παραγόντων [21] – [23] . RegIV, ένα μέλος της αναγέννησης οικογένειας γονιδίων, εμπλέκεται σε κακοήθειες του πεπτικού σωλήνα, συμπεριλαμβανομένων του στομάχου [24], παχέος εντέρου [25], [26], και το πάγκρεας [27], [28], καθώς και σε καλοήθεις νόσους όπως ως ελκώδη κολίτιδα [29]. RegIV υπερέκφραση σε κύτταρα όγκου έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη των κυττάρων, την επιβίωση, προσκόλληση, και αντίσταση στην απόπτωση. Πρόσφατα, RegIV υπερέκφραση αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με την έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος, και προτάθηκε ως μια πολλά υποσχόμενη δείκτης όγκου για διαλογή πρώιμο στάδιο PC και στόχος για επικουρική θεραπεία σε PC [28], [30].

Οι λειτουργίες του GLI1 και RegIV φάνηκε να είναι παρόμοια σε επισκόπησή μας της λογοτεχνίας? Έτσι, ερευνήσαμε την έκφραση και το συσχετισμό GLI1 και RegIV σε ιστούς PC και κυτταρικές σειρές. Έχουμε διερευνηθούν επίσης ο πιθανός μηχανισμός μεταξύ GLI1 και RegIV, χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς chip και EMSA.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και ιστούς

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, PANC -1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2 και SW1990, αγοράστηκαν από την κινεζική Ακαδημία της τράπεζας κυττάρων Επιτροπής Επιστημών Type Culture Collection. PANC-1 καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Gibco BRL, Η.Π.Α.), οι άλλοι τύποι κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco BRL, Η.Π.Α.), και όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FBS (Gibco BRL, USA), πενικιλλίνη G (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO2. Δώδεκα ζεύγη PC και τα αντίστοιχα μη-καρκινικούς ιστούς παγκρέατος ελήφθησαν από τη Σαγκάη Δέκατη Λαϊκό Νοσοκομείο με πλήρη γραπτή ηθική συγκατάθεση. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία ή θεραπεία με ακτινοβολία πριν από την εκτομή του καρκίνου. Ένα άλλο 9 ζεύγη ιστούς φέτες λήφθηκε από το τμήμα παθολογίας του Νοσοκομείου της Σαγκάης Δέκατη Λαϊκής. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Tongji Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου και Επιστήμες της Ζωής.

Σύντομη φουρκέτα RNA (shRNA) Σχεδιασμός και Vector Παραγωγή

Διαταραχή αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές της GLI1mRNA, όπως και ως αρνητικός έλεγχος χωρίς ομολογία για ανθρώπινη ή ποντικού τα γονίδια έχουν σχεδιαστεί από τη Σαγκάη GeneChem Biotech (Πίνακας 1). Τρεις siRNA δίπολα σαρώθηκαν για GLI1 knock-down με ανάλυση Western blot σε πειράματα συνεπιμόλυνσης με πλασμίδιο έκφρασης GLI1 σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ. Η πιο επιτυχημένη αλληλουχία και ένα μη φίμωση λουσιφεράσης αλληλουχία σχεδιάστηκαν σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο εκμαγείο shRNA που αποτελείται από λογική, φουρκέτα βρόχο, αντινόημα, και αλληλουχίες τερματισμού, οι οποίες έχουν όλες περιστοιχίζεται από θέσεις ενζύμου περιορισμού για να διευκολυνθεί η κατευθυντική υποκλωνοποίηση. Οι προκύπτοντες φορείς που κωδικοποιούνται GFP υπό τον μεταγραφικό έλεγχο του υποκινητή EF1 και έναν προαγωγέα Η1 ανάντι θέσεις κλωνοποίησης περιορισμού (

ΜΙυ

Ι και

Cla

Ι) για να επιτραπεί η εισαγωγή ολιγονουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν Τα siRNAs. Είτε shRNA έναντι GLI1 ή nonsilencing-Λουσιφεράσης shRNA βρισκόταν κάτω από τον προαγωγό H1 (Σχήμα 1). Η σωστή εισαγωγή του ειδικού shRNA επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με άμεσο καθορισμό αλληλουχίας του DNA.

Για τον φορέα GLI1-shRNA, δυο μονόκλωνα ϋΝΑ που κωδικοποιούν δύο συνδετήρες, οι αλληλουχίες στόχου και ένα στοιχείο βρόχου, συνετέθησαν. Αυτές ανοπτήθηκαν σε δίκλωνο DNA, και συνδέθηκε στο pLVTHM εξής

ΜΙυ

Ι και

Cal

Ι πέψη. Η σύντομη μορφή φουρκέτας του shGLI1 εκφράζεται υπό τον έλεγχο του ανθρώπινου προαγωγέα Η1. Ο φορέας περιέχει επίσης ένα ανθρώπινο EF1-α υποκινητής οδηγεί το γονίδιο δείκτη GFP για την παρακολούθηση μετατραπέντα κύτταρα. Οι φορείς που δημιουργούνται από παροδική επιμόλυνση του pRSV-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, και το shRNA κωδικοποιεί pLVTHM σε κύτταρα 293Τ. Συντομογραφίες: RRE, στοιχείο απόκρισης Rev? οΡΡΤ, κεντρική πολυπουρίνης οδό? EF1-α, ανθρώπινο παράγοντα επιμήκυνσης 1-υποκινητή α? Η1, ο προαγωγός ανθρώπινης Η1? GFP, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη? PRE, ανθρώπινο ιό της ηπατίτιδας μετα-μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο.

Η

Για την παραγωγή του φορέα βραδέος ιού, τα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ καλλιεργήθηκαν σε 30-40% συρροή από την επόμενη ημέρα. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ /10% FBS χωρίς αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, 20 μg πλασμιδίου DNA shRNA (ανοησία shRNA ή GLI1 στόχευση shRNA? GeneChem Biotech, Σαγκάη, Κίνα), 7,5 μg pMD2G, 10 μg pRSV-Rev, και 15 μg pMDLg-pRRE αναμίχθηκαν με στείρο αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O να ένα τελικό όγκο 1800 μΐ, στη συνέχεια αναμιγνύονται με 200 μΐ 2.5 Μ CaCl

2. Το μίγμα ΟΝΑ οξυγονώνεται και 2.000 μΙ 2 χ PBS (ρΗ 7,05) προστίθεται κατά σταγόνες, και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Το μείγμα επιμόλυνσης προστέθηκε σε αντίστοιχες πλάκες του και επωάζονται όλη τη νύκτα. Το μέσο αντικαταστάθηκε μετά από 12 ώρες με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 48 ώρες, το ρυθμισμένο μέσο που περιέχει shRNA φακοϊό συλλέχθηκε και διηθήθηκε μέσω φίλτρων οξικής κυτταρίνης με μέγεθος πόρων 0,45 μm και αποθηκεύεται σε πάγο. Ο ιός συμπυκνώθηκε με περιστροφή στα 70.000 G για 2 ώρες και επαναιωρούνται με 500 μΐ PBS. Η μονάδα μεταγωγής (TU) τίτλος εκτιμήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ παρουσία πολυβρενίου 8 μg /mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Οι τίτλοι των 2-5 × 10

8 TU /ml συνήθως επιτυγχάνεται.

Η υπερέκφραση-GLI1 φορέα λεντοϊού Κατασκευή

GLI1 cDNA Ανθρώπου αγοράστηκε από την Open-Biosystem (USA). Η πλήρης αλληλουχία cDNA του GLI1 δημιουργήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τον πρόσθιο εκκινητή 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 ‘? και αντίστροφο εκκινητή, 5’-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3 ‘? Στη συνέχεια εισάγεται σε ένα pGC-FU-EGFP-3FLAG Vector (GeneChem Εταιρείας, Σαγκάη, Κίνα). Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν με αλληλούχιση. Το προκύπτον 3320-bp επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση (Σχήμα S1) και συγκρίθηκε με την αλληλουχία της περιοχής γονιδιακής έκφρασης GLI1 στην GenBank (NM_005269.2). Για την παραγωγή λεντοϊού απόθεμα, 293FT κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 70-85% συρροή την επόμενη ημέρα. Το πλήρες μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε 5 mL μέσο (Opti-ΜΕΜ? Invitrogen) με σύμπλοκα που περιέχουν βοηθητικά συσκευασίας κατασκεύασμα (GeneChem Company, Σαγκάη, Κίνα), 20 μg πλασμιδίου έκφρασης DNA (pGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1), ή πλασμίδιο ελέγχου DNA (pGC-FU-EGFP-3FLAG) με 100 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) παρουσία πολυβρενίου (8 μg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Μετά από επώαση για 24 ώρες, το μέσο μόλυνσης αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο καλλιέργειας. υπερκείμενα φακοϊό περιέχουν συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα υπερκείμενα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα του ιζήματος και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Οι τίτλοι των 2-5 × 10

7 TU /ml ρουτίνας επιτευχθεί.

λεντοϊών Επιμόλυνση

Κύτταρα (1 χ 10

5) σε μια πλάκα έξι φρεατίων μορφομετατράπηκαν με το φορέα λεντοϊού σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) = 5 (PANC-1) ή 20 (BxPC-3) με την παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης, το μέσο αντικαταστάθηκε με 2 ml πλήρους μέσου καλλιέργειας. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση GLI1 ιδρύθηκε με ανάλυση αποτύπωσης σε πραγματικό χρόνο-PCR και Western.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα ρυθμίστηκαν σε 1 χ 10

6 κύτταρα /100 μL και χρησιμοποιήθηκε για κυτταρομετρία ροής. Ένα σύνολο 10.000 συμβάντα αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΟβΙΙ Quest-FACS Calibur (Becton Dickinson, USA).

qRT-PCR

πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάλυση (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με την ΑΒΙ Prism 7900HT Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems, CA, USA). GLI1 και έκφραση RegIV mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green Dye. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας. έκφραση του γονιδίου στόχου ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη και αναλύονται από το 2

-ΔΔCT

τύπο. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι οι εξής: GLI1, προς τα εμπρός: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, αντίστροφη: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, προς τα εμπρός: CGCTGAGATGAACCCCAAG, αντίστροφη: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-ακτίνη, προς τα εμπρός: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, αντίστροφη: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Ολες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές σε PBS, κατόπιν υποβλήθηκαν σε λύση επί 2 ώρες σε RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως επί πάγου και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την BCA μέθοδο πρότυπο (BCA ™ Protein Assay Kit, Pierce, USA). 50 μα ολικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκε με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας 6% ή 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου με Mini-PROTEAN Tetra Κυττάρων (Bio-Rad, USA). GLI1 και πρωτεΐνη RegIV σε πηκτή μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης 0.45-μm με μίνι Μεταφορά τηλέφωνα και SD Trans-blot Semi-Dry Μεταφορά κυττάρων (Bio-Rad, USA), αντίστοιχα.

Τα ανοσοαντιδραστήρια χρησιμοποιούνται για κηλίδας Western ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι GLI1 (1:200? Santa Cruz, USA) και αντι-RegIV αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό (1:100? Santa Cruz, USA). πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης (1:5000? Santa Cruz, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με μία πρότυπη μέθοδο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Pierce, USA). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν αρκετές φορές και έδωσε παρόμοια αποτελέσματα.

Ανοσοϊστοχημεία

τομές όγκων αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6,0) στους 95 ° C για να ανακτήσετε αντιγόνα. Μετά από απόσβεση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης με H

2O

2 και το κλείδωμα με 10% φυσιολογικό ορό αλόγου, οι τομές επωάστηκαν διαδοχικά με τα πρωτεύοντα αντισώματα κατσίκας αντι-RegIV (1:100? Santa Cruz, California, USA), αντι-GLI1 (1:200? Santa Cruz, California, USA), βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα, και το αντιδραστήριο ABC (Gene Tech, Σαγκάη, Κίνα). Η ανοσοχρώση οπτικοποιήθηκε με 3,3-διαμινοβενζιδίνη (Gene Tech, Σαγκάη, Κίνα). Οι τομές στη συνέχεια με αιματοξυλίνη. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση με την αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με PBS.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (CHIP)

Εμείς τροποποίησε το παρελθόν αναφερθεί πρωτόκολλο [31] για χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (CHIP). Εν συντομία, τα κύτταρα PANC-1 (3 × 10

7) ήταν σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη. Η αντίδραση στερέωση διακόπηκε με προσθήκη 10 ml Glycin (0.125 Μ), τότε χρωματίνη συλλέχθηκε με 1 mL ρυθμιστικό ΙΡ το οποίο περιείχε κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Χρωματίνης διατμήθηκε με τη χρήση υπερήχων με έναν ανιχνευτή άκρο 4 χλστ.3 φορές για 10 δεύτερους παλμούς (60 W, 80 W και 100 W, αντίστοιχα, 90 s διαστήματα) σε ένα κουτί πάγου. Η διασύνδεση αυτή αντιστράφηκε με την προσθήκη 20 μΐ 5Μ NaCl όλη τη νύκτα στους 65 ° C. DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία φαινόλης /χλωροφορμίου. 20 μι του DNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% και το υπόλοιπο διατηρήθηκε στους -20 ° C ως είσοδο DNA. Διαλυτό χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-GLI1 μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού 2 μg (Santa Cruz, California, USA). Η IgG ποντικού 2 μg (Santa Cruz, California, USA) προστέθηκε σαν ένα τυχαίο έλεγχο, RNA πολυμεράση II ως θετικός έλεγχος, και το αντίσωμα β-ακτίνης ως αρνητικός έλεγχος. DNA-πρωτεΐνης άνοσα σύμπλοκα εκλούστηκαν και αντίστροφη σταυροδεσμούς, και το DNA εκχυλίστηκε με φαινόλη /χλωροφόρμιο και καταβυθίστηκε. Η παρουσία της περιοχής RegIV προαγωγό που περιέχουν μοτίβα GLI1 σε άνοσο DNA ταυτοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: RegIV-Α για την θέση 1 (118 bp), προς τα εμπρός: 5′-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 ‘, αντίστροφη: 5 «- TCCAGTATAGATGGCAAA -3 ‘. RegIV-B για την περιοχή 2 (131 bp), προς τα εμπρός: 5’-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 ‘, αντίστροφη: 5′-GACCTGGACACTGAACCTTG-3’. RegIV-C για την περιοχή 3 (70 bp), προς τα εμπρός: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, αντίστροφη: 5′-GTGTTACATAACGGGTTT-3’. RegIV-D για site4 (70 bp), προς τα εμπρός: 5′-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3’. RegIV-Ε για τις περιοχές 3 και 4 (226 bp), προς τα εμπρός: 5′-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-TTCAACATGCGTGAGTTT-3’. RegIV-F για τις περιοχές 3 και 4 (481 bp), προς τα εμπρός: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, αντίστροφη: 5′-AGACGGCTTCAGAATGTA-3’. RegIV-G για την περιοχή 5 (315 bp), προς τα εμπρός: 5′-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CCAAGATTTAACCCAACA-3’. Οι συνθήκες της PCR για την περιοχή προαγωγού RegIV ήταν: μετουσίωση 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, ανόπτηση 30 s, επιμήκυνση 1 λεπτό στους 72 ° C. θερμοκρασίες ανόπτησης για RegIV-Α-G ήταν 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C, και 52 ° C, αντίστοιχα. Η ενίσχυση της περιοχής προαγωγού RegIV αναλύθηκε μετά από 35 κύκλους. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής δοκιμασίες μετατόπισης (EMSA)

Πυρηνική εκχυλίσματα που παρασκευάζονται με NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά εκχύλισης Αντιδραστήρια (Pierce, Rockford, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). EMSA και υπερμετατόπισης EMSA με διγοξίνη-σημασμένους ανιχνευτές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ DIG shift-Gel σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 ‘(μοτίβο σύνδεσης υπογραμμισμένη). Τα μεταλλαγμένα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5’-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 ‘. Στη μελέτη υπερμετατόπισης, 5 μg μονοκλωνικού αντισώματος κατά κουνελιού GLI1 επωάστηκε με 5 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος σε πάγο για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του επισημασμένου ανιχνευτή, και περαιτέρω επωάσθηκε επί πάγου για 30 λεπτά. Ολόκληρη η αντίδραση δέσμευσης 20 μΐ αναλύθηκε σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7% και μεταφέρθηκε σε μια θετικά φορτισμένη μεμβράνη νάιλον (Bio-Rad, USA) σε 0.5 χ ρυθμιστικού διαλύματος Τρις βορικού-ΕϋΤΑ.

Στατιστική ανάλυση

Ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Real-time PCR δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τις διαφορές της έκφρασης γονιδίου-στόχου από το paired t-test και ήταν 2

-ΔΔCT

μετασχηματισμένο πριν από την ανάλυση. Η σχέση μεταξύ GLI1 και της έκφρασης RegIV αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Spearman. δεδομένα IHC αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το Chi-τετράγωνο τεστ. Μια ρ-τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

GLI1 και έκφραση RegIV στον παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς

Για να μελετήσουμε GLI1 και έκφραση RegIV στο PC, qRT -PCR και IHC χρησιμοποιήθηκαν σε 12 ζεύγη βιοψίας ιστών. έκφραση GLI1 ήταν υψηλότερη σε 9 περιπτώσεις (9/12) σε σύγκριση με παρακείμενες κανονικές παγκρεατική ιστούς (ρ = 0,011? Σχήμα 2)? έκφραση RegIV ήταν υψηλότερη σε 9 περιπτώσεις (9/12) (p = 0.011? Σχήμα 2). Υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ GLI1 και RegIV στους ιστούς PC (R = 0.795, p & lt? 0,0001? Σχήμα 2). Στις IHC, βρήκαμε RegIV να εκφράζεται μόνο σε βήτα κύτταρα των φυσιολογικών ιστών ενδοκρινών παγκρεατικών, η οποία επιβεβαίωσε την έκθεση Oue του [37]. Στις IHC, GLI1 και έκφραση RegIV ήταν υψηλότερα στα περισσότερα PC σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς (15/21 έναντι 4/21, ρ = 0.001? 14/21 έναντι 5/21, ρ = 0.005? Αντίστοιχα? Σχήμα 3). 15 από 21 περιπτώσεις PC είχαν υψηλή έκφραση πρωτεΐνης GLI1, μεταξύ των οποίων 11 περιπτώσεις εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του RegIV πρωτεΐνης (p = 0.001? Σχήμα 3).

Η έκφραση του GLI1 RegIV mRNA σε 12 ζεύγη των ιστών PC και παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Α-Β). DNA από τα δείγματα συλλέχθηκαν από χειρουργικές βιοψίες, και η σχετική GLI1 και έκφραση RegIV mRNA ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR. Στατιστική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του GLI1 και RegIV mRNA σε 12 ζεύγη ιστών PC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών αναλύθηκε με δοκιμασία Spearman του (C). Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη έκφραση mRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και υπολογίστηκαν από την paired t-test. Διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των δύο ομάδων: * p & lt? 0,05. ** P & lt? 0,01. NS:. Δεν είναι σημαντική

Η

Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν, φορμόλη σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες, και ανιχνεύεται με IHC. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. Θετική χρώση GLI1 παρατηρήθηκε στο κυτταρικό πυρήνα PDAC (Α)? Ωστόσο, τα παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς εμφάνισε καμιά ή λιποθυμία χρώση για GLI1 (Β). Σε παρακείμενο φυσιολογικό παγκρεατικό ιστούς, μόνο κύτταρα νησιδίων έδειξε θετική χρώση RegIV (D), ενώ η θετική χρώση παρατηρήθηκε RegIV καθώς κυπελλοειδή κόκκοι κυτόπλασμα σε ιστούς PC (C). Όλες οι μικροφωτογραφίες ελήφθησαν σε × 200 μεγέθυνση. Κλίμακα μπαρ, 100 μm.

Η

Η συσχέτιση μεταξύ GLI1 και RegIV

Δοκιμάσαμε έκφραση GLI1 και RegIV σε 5 κυτταρικές σειρές PC με qPCR και κηλίδα Western. Υπήρχε θετική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου του GLI1 και RegIV mRNA και πρωτεΐνης (R = 0,958, p = 0,011 και Ρ = 0,939, ρ = 0,018, αντίστοιχα? Σχήμα 4). GLI1 και RegIV είχαν υπερεκφράζεται σε PC έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του παγκρέατος.

Η έκφραση πρωτεϊνών GLI1 και RegIV σε 5 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές όπως ανιχνεύεται με ανάλυση στυπώματος Western σε εκχυλίσματα κυττάρου, χρησιμοποιώντας αντι-GLI1 και αντι-RegIV αντισώματα ( ΈΝΑ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό των εντάσεων των ζωνών σε σύγκριση με εκείνη του β-ακτίνης (Β). Στατιστική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του GLI1 και πρωτεΐνης RegIV σε 5 κυτταρικές σειρές PC αναλύθηκε με δοκιμασία κατά Pearson (C). Σχετική GLI1 και έκφραση RegIV mRNA εξετάστηκαν με qRT-PCR (D). Η έκφραση του GLI1 και RegIV mRNA κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνης mRNA έκφραση. Στατιστική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του GLI1 και RegIV mRNA σε 5 κυτταρικές σειρές PC αναλύθηκε με δοκιμασία κατά Pearson (Ε). Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

RegIV έκφραση αλλάξει με την έκφραση GLI1 στο PANC-1 και BxPC-3

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ GLI1 και RegIV σε κύτταρα PC, έχουμε σχεδιάζονται και να κατασκευάζονται shRNA-GLI1 φορέα λεντοϊού, και επιμολύνθηκαν σε αυτό PANC-1, μία κυτταρική γραμμή PC με την υψηλότερη έκφραση του GLI1 (Σχήμα 4). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης δείχθηκε με κυτταρομετρία ροής (FCM) για να είναι περισσότερο από 95% (Σχήμα S2)? σταθερός φθορισμός θα μπορούσε ακόμα να ανιχνευτεί ακόμη και μετά από 20 περάσματα (Σχέδιο S3).

Στη συνέχεια, qRT-PCR και στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης σε κύτταρα RegIV GLI1-shRNA-PANC-1. Κύτταρα χωρίς διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με σκαρφάλωμα shRNA χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. RegIV mRNA μειώθηκαν κατά 94,7 ± 0,3%, όταν GLI1 mRNA μειώθηκαν κατά 82,1 ± 3,2%. RegIV πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 84,1 ± 0,5%, όταν GLI1 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 76,7 ± 2,2% (Σχήμα 5). Αυτό πρότεινε ότι η έκφραση RegIV μειώθηκε όταν GLI1 σίγησε με RNAi.

PANC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με GLI1-shRNA ή GFP-shRNA, BxPC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με LV-GLI1-eGFP ή LV-eGFP , τότε η έκφραση του mRNA GLI1 σε σχέση με εκείνη του mRNA β-ακτίνης αξιολογήθηκε με qRT-PCR (Α, D). Μετά την επιμόλυνση, η έκφραση των πρωτεϊνών GLI1 αναλύθηκε με κηλίδα Western (C, F). Το ένθετο παρουσιάζει μία σημαντική μείωση στην έκφραση RegIV με πραγματικού χρόνου RT-PCT (Β, Ε) και ανάλυση στυπώματος Western (C, F). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη της έκφρασης β-ακτίνης. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

περαιτέρω σχεδιάσει και κατασκευάσει ένα ενδιάμεσο ξενιστή φακοϊού που εκφράζεται GLI1, και επιμολύνθηκαν σε αυτό BxPC-3, με τη χαμηλότερη έκφραση GLI1 στην 5 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4), για να καθοριστεί εάν η έκφραση RegIV αλλάξει μαζί με GLI1. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, qRT-PCR και στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση RegIV στα κύτταρα LV-GLI1-BxPC-3. Κύτταρα χωρίς διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα φακοϊό χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. RegIV mRNA αυξήθηκαν κατά 729,1 ± 4,3%, όταν GLI1 mRNA αυξήθηκαν κατά 924,5 ± 5,3%. RegIV πρωτεΐνη αυξήθηκε κατά 339,0 ± 3,7% όταν GLI1 πρωτεΐνη αυξήθηκε κατά 362,1 ± 3,5% (Σχήμα 5). Αυτό σημαίνει ότι η έκφραση RegIV αυξάνεται όταν GLI1 ήταν υπερεκφράζεται. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι GLI1, ένας μεταγραφικός παράγοντας, μπορεί να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση RegIV.

Αναγνώριση των υποψηφίων Gli1 θέσεων δέσμευσης στον υποκινητή RegIV

Η θετική συσχέτιση μεταξύ GLI1 και RegIV στην τόσο ιστός PC και κυτταρικές σειρές μας ώθησε να κάνετε τον υποκινητή RegIV για θέσεις πρόσδεσης δυναμικό GLI1 με την αλληλουχία DNA συναινετική 5′-GACCACCCA-3 ‘[42]. ανάλυση Database αποκάλυψε τέσσερις πιθανές θέσεις που βρίσκονται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (Σχήμα 6). Η ομολογία της κάθε θέσης δέσμευσης GLI1 στην κανονική συναινετική αλληλουχία κυμαινόταν από 67% (θέσεις 1, 2, 3, και 5) έως 78% (θέση 4), που πρότεινε ότι το γονίδιο υποκινητής RegIV μπορεί να δεσμεύονται σε GLI1.

(Α) Θέση των πιθανών δεσμευτικών GLI1 sites (αριθμοί 1-5) σε σχέση με τη δομή του γονιδίου. Ρ αντιπροσωπεύει την θέση έναρξης της μεταγραφής. Το γκρι πλαίσιο αντιπροσωπεύει τη μεταβλητή περιοχή ματίσματος. Λευκά πλαίσια αντιπροσωπεύουν τα εξόνια. (Β) Η θέση των θέσεων συνδέσεως επί του προαγωγού σε σχέση με την τοποθεσία έναρξης της μεταγραφής Ρ και η αλληλουχία ομολογίας στην αλληλουχία πρόσδεσης GLI1 συναίνεση, GACCACCCA.

Η

Επιβεβαίωση πρωτεΐνης GLI1 δεσμεύεται με την περιοχή προαγωγού του RegIV γονιδίου με CHIP

η δοκιμασία διάλυμα χρωματίνη σε υπερήχους έδειξαν ότι η συνολική θραύσμα DNA εμφανίστηκε αλείψει στην κλίμακα 100 bp έως 1 kb στην ομάδα των 80 W (Εικόνα S4). Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης DNA έδειξε την προβλεπόμενη ζώνη DNA σε ΕΙΣΟΔΟΥ, GLI1-Ab, και postive ομάδες ελέγχου με χρήση ανθρώπινων RegIV εκκινητή-D-F, και όχι στο IgG και ομάδες αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 7). Μόνο INPUT και ο θετικός έλεγχος έδειξε την προβλεπόμενη ζώνη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα RegIV εκκινητή-Α-C, G αλλά όχι σε GLI-Ab, IgG, και αρνητικές ομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αλληλουχίας έδειξε ότι οι αλληλουχίες ήταν η ίδια όπως εκείνη από το γονίδιο υποκινητή RegIV του site 4 (Σχήμα S5, S6, S7). Όλα τα δεδομένα πρότειναν ότι GLI1 συνδέθηκε με το γονίδιο υποκινητή RegIV του site 4 (GATCATCCA), και ρυθμίζεται RegIV στο PC μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης Hh.

Οι θέσεις των RegIV εκκινητή-AG στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου RegIV . Οι αριθμοί στο σχηματικό του γονιδίου RegIV (αριθμοί 1-5) αντιστοιχούν στις πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI1. Ρ αντιπροσωπεύει την θέση έναρξης της μεταγραφής. Τα προϊόντα λύσης από κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση χρωματίνης από αντι-GLI1 αντίσωμα. Ανθρώπινη RegIV εκκινητή-A-G χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την περιοχή RegIV προαγωγού που περιέχει την υποθετική θέση GLI1 δέσμευσης. Επεξεργασία με υπερήχους χρωματίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος INPUT DNA. IgG, RNA πολυμεράση II, και β-ακτίνης Ab χρησιμοποιήθηκαν ως δειγματοληπτικούς ελέγχους, θετικοί έλεγχοι, και αρνητικοί μάρτυρες. (Β) Μόνο INPUT, θετικός έλεγχος, και GLI1-Ab έδειξε την προβλεπόμενη ζώνη σε πηκτές αγαρόζης με βρωμιούχο χρώση αιθιδίου χρησιμοποιώντας τα προϊόντα CHIP-PCR που ενισχύθηκαν με RegIV εκκινητή-D (i), RegIV εκκινητή-Ε (ii), και RegIV εκκινητή-F (iii). Καμία ανιχνεύσιμη μεταγραφή παρατηρήθηκε σε ενισχύθηκε πρότυπο από IgG ή αρνητικό μάρτυρα και έναν θετικό λωρίδα ελέγχου επιβεβαίωσαν την αναμενόμενη θραύσμα. Τα πρότυπα μοριακά βάρη (Marker) χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί το μέγεθος των ενισχυμένων ζωνών.

Η

Επιβεβαίωση GLI1 δεσμεύονται στον υποκινητή RegIV από

Όπως περιγράφεται παραπάνω, δεσμεύουν το GLI1 EMSA Ιστοσελίδα στην περιοχή προαγωγέα του γονιδίου RegIV επιβεβαιώθηκε με τσιπ PCR. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν αναλύσεις EMSA να αντιμετωπίσει άμεσα αν GLI1 δεσμεύει RegIV

in vivo

. Συνθέσαμε ειδικά ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν το στοιχείο GLI1 παρόν στον υποκινητή RegIV σε EMSA πειράματα με πυρηνικά εκχυλίσματα από PANC-1 κυτταρικές γραμμές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, η επώαση των κυττάρων PANC-1 εκχυλίσματα με το επισημασμένο με βιοτίνη αλληλουχία GLI1-RegIV παρήγαγε μία μετατόπιση ζώνης DNA-πρωτεΐνης. Αυτά τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης ήταν ειδικά για την ιστοσελίδα GLI1 από την επιτυχία δοκιμασίες ανταγωνισμού χρησιμοποιώντας διαφορετικές πτυχές της περίσσειας μη επισημασμένου GLI1-RegIV και μεταλλαγμένων επισημαίνονται GLI1-RegIV ολιγονουκλεοτίδια. Για να επιβεβαιώσετε τη σύνδεση του GLI1 στην ακολουθία GLI1-RegIV, αυτές οι αντιδράσεις EMSA επωάστηκαν περαιτέρω με αντίσωμα αντι-GLI1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, η προσθήκη αυτού του αντισώματος οδήγησε σε υπερμετατοπισθεί συγκρότημα εκτός από την ζώνη DNA-πρωτεΐνης. Αυτά τα δεδομένα απέδειξαν την παρουσία του GLI1 στο συγκρότημα πυρηνική πρωτεΐνη που δεσμεύεται με το θέση πρόσδεσης GLI1 του υποκινητή RegIV (-528~-520).

EMSA διεξήχθη με πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων PANC-1 (διαδρομές 2 έως 7) ή χωρίς πυρηνικά εκχυλίσματα (διαδρομή 1). Ο ανιχνευτής RegIV παράχθηκε με αναδιάταξη των ολιγονουκλεοτιδίων μονής έλικας και τέλος σημασμένο που περιέχει την περιοχή υποκινητή RegIV (νουκλεοτίδια -528~-520). Πειράματα ανταγωνισμού πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 1-πλάσιο (λωρίδες 3), 10-πλάσιο (4 λωρίδες), και 100 φορές (διαδρομές 5) περίσσειας μη επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδίων, αντίστοιχα (διαδρομές 3 έως 5) ή 100-φορές μεταλλαγμένη σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια (λωρίδα 6). Για υπερ-μετατόπιση, αντίσωμα αντι-GLI1 (λωρίδα 7) επωάστηκε με πυρηνικά εκχυλίσματα πριν από την προσθήκη στην αντίδραση.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει ότι GLI1 και RegIV ήταν υπερεκφράζεται σε γραμμές ιστό PC και κυττάρων, επιβεβαιώνεται και από άλλες εκθέσεις [12], [20], [32]. Δείξαμε επίσης μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης GLI1 και RegIV. Παρεμβολή RNA και τα πειράματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση έκφραση RegIV άλλαξε με έκφραση GLI1 σε κυτταρικές σειρές PC? Αυτό επιβεβαιώθηκε από CHIP και EMSA.