Αφηρημένο

Ιστορικό

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενων πρωτοπαθή καρκίνο του ήπατος και κατατάσσεται ως η πέμπτη πιο συχνά εμφανιζόμενες καρκίνου, συνολικά, και η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο, σε όλο τον κόσμο. Προς το παρόν, η αποτελεσματική θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για HCC είναι περιορισμένη? κατά συνέπεια, η πρόγνωση για τους ασθενείς αυτούς είναι κακή. Ο στόχος μας στην παρούσα μελέτη ήταν να προσδιορίσει ένα νέο στόχο για θεραπεία με αντισώματα εναντίον HCC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιήσαμε Western blot και κυτταρομετρία ροής και ανοσοκυτταροχημικές αναλύσεις για τη διερεύνηση της ρύθμισης των FGFR1 έκφραση με ιντερφερόνη-α /β σε διάφορες ανθρώπινα ηπατικά καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης θεραπείας με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-FGFR1 και ιντερφερόνης-α /β σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος ανθρώπινου HCC. Βρήκαμε ότι η ιντερφερόνη-α /β επάγει την έκφραση των FGFR1 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC, και ότι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-FGFR1 (mAb) στόχευσης της επαγόμενης FGFR1 μπορεί να εμποδίσει αποτελεσματικά την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων HCC

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, ο συνδυασμός της ιντερφερόνης-α, αντι-FGFR1 mAb και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) που ασκείται σημαντική αντικαρκινική δράση

in vitro

.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συνδυασμένη χρήση ενός αντισώματος αντι-FGFR1 και ιντερφερόνης-α /β είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Παράθεση:. Sasaki S, Ishida T, η Toyota Μ, Ota α, Suzuki H, Takaoka A, et al. (2011) Interferon-α /β και αντι-Ινοβλαστών υποδοχέα αυξητικού παράγοντα 1 μονοκλωνικό αντίσωμα Καταστολή Ηπατική καρκινικών κυττάρων ίη vitro και in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10.1371 /journal.pone.0019618

Επιμέλεια: Νέοι Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Δημοκρατίας της Κορέας

Ελήφθη: 9 του Οκτωβρίου 2010? Αποδεκτές: 11η του Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2011

Copyright: © 2011 Sasaki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την επιστημονική έρευνα σε τομείς προτεραιότητας από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας (17016060 έως ΚΙ και TI)? Οι επιχορηγήσεις-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) από την Japan Society για την Προώθηση της Επιστήμης (21.590.853 σε SS)? Grant-in-Aid για την αναγνωριστική έρευνα από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (17659218 σε SS και ΚΙ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Α. Ota, Μ Maeda, Τ Seito είναι υπάλληλοι της Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών με άλλους ερευνητές.

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενων πρωτοπαθή καρκίνο του ήπατος και κατατάσσεται ως η πέμπτη πιο συχνά εμφανιζόμενες καρκίνου, συνολικά, και η τρίτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο, παγκοσμίως [1]. Επί του παρόντος, η χειρουργική επέμβαση, οι διαδερμικές θεραπείες, όπως ένεση αιθανόλης και καυτηρίαση με ραδιοσυχνότητες, και θεραπείες καθετήρα όπως αρτηριακή χημειοεμβολισμό που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Αυτές οι προσεγγίσεις μπορούν επιλεκτικά αφαιρέσει και να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που τις καθιστά χρήσιμες για τον έλεγχο της τοπικής όγκου? Ωστόσο, δεν είναι επαρκής για να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών HCC, καθώς η νόσος υποτροπιάζει εύκολα λόγω μεταστάσεων αίμα-γεν (π.χ., ενδοηπατική μετάσταση και αγγειακή διήθηση) ή την ανάπτυξη νέων HCCs (πολυκεντρικής καρκινογένεση). Κατά συνέπεια, τα ποσοστά επιβίωσης 1-έτους και 3 ετών για HCC είναι μόνο 36% και 17%, αντίστοιχα [2]. Οι αδυναμίες των σημερινών θεραπειών HCC περιλαμβάνει ελλιπή αναστολή της πολυκεντρικής καρκινογένεσης, δυσκολίες στον έλεγχο ενδοπυλαία διήθησης, και η αδυναμία να αποτραπεί η επιδείνωση της ηπατικής λειτουργικής επάρκειας ή να προωθήσουν την αποκατάστασή του. Ετσι ανάπτυξη νέων θεραπειών που βελτιώνουν την πρόγνωση των ασθενών HCC και τα οποία μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν σε ασθενείς ηλικιωμένους και προχωρημένο στάδιο θα ήταν πολύ επιθυμητή.

Στόχευση μόρια κυτταρικής επιφάνειας χρησιμοποιώντας mAbs είναι μια αναδυόμενη στρατηγική στη θεραπεία του καρκίνου, και mAbs έναντι του καρκίνου που σχετίζονται με επιφάνεια μορίων όπως EGFR, HER2 και CD20 έχουν επιτυχώς χρησιμοποιηθεί [3], [4], [5]. Ωστόσο, η έκφραση κυτταρικής επιφάνειας των αντιγονικών μορίων είναι συχνά αδύναμα και ανομοιογενή, πράγμα που εμποδίζει την αποτελεσματική στόχευση των όγκων [6] και, μέχρι σήμερα, μόνο μερικές πιλοτικές μελέτες που εξετάζουν την έκφραση του HCC-αντιγόνα που σχετίζονται πραγματοποιηθεί [7].

οι ιντερφερόνες (IFNs), τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία νεοπλασιών και ιικών ασθενειών, ενισχύουν την έκφραση αρκετών μορίων κυτταρικής επιφάνειας τόσο

in vitro

και σε μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου [8], [9 ]. Η επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης από IFN είναι ένα σύνθετο φαινόμενο που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων μέσω φωσφορυλίωσης των STATs από JAK κινάση [10]. Επιπλέον, IFNs μπορεί να επάγει την έκφραση της ιντερφερόνης ρυθμιστικών παραγόντων (ΔΠΧΑ) και παραγόντων μεταγραφής, η οποία στη συνέχεια επάγουν γονίδια που εμπλέκονται στην απόπτωση και ανοσολογικών αποκρίσεων [11]. Οι IFN χρησιμοποιούνται ήδη για τη θεραπεία οι περισσότεροι ασθενείς με ηπατίτιδα, και τα αποτελέσματά τους δείχνουν στοχεύουν μόρια της κυτταρικής επιφάνειας που προκαλείται από IFN μπορεί να είναι μια χρήσιμη στρατηγική για την αντιμετώπιση της HCC. Ο στόχος μας στην παρούσα μελέτη ήταν να χρησιμοποιήσει κυτταρικές σειρές HCC και ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος του ανθρώπινου HCC να εξετάσει τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που προκαλούνται από IFN και για τον εντοπισμό πιθανών στόχων για θεραπεία αντισωμάτων. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ΙΡΝ-α /β-επαγόμενη υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών 1 (FGFR1) θα μπορούσε να είναι ένα νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

Αποτελέσματα

Η επαγωγή της έκφρασης FGFR1 με ΙΡΝ α /β σε HCC ξενομοσχεύματα

Για την ταυτοποίηση των γονιδίων up-ρυθμίζεται από IFN σε κύτταρα HCC, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας cDNA που παρασκευάζεται από όγκους που αναπτύσσονται σε SCID ποντίκια υποδορίως χορηγούνται κύτταρα HepG2, μια ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά ήπατος. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών συνοψίζονται στο Σχήμα 1Α. Μεταξύ των γονιδίων τα πάνω ρυθμισμένα με IFN ήταν

FGFR1

, που κωδικοποιεί ένα υποδοχέα κινάσης τυροσίνης. Real-time PCR ανάλυση επιβεβαίωσαν την επαγωγή της

FGFR1

μεταγραφή τόσο από ΙΡΝ-α και ΙΡΝ-β (Σχήμα S1), και αντίστοιχες αυξήσεις FGFR1 πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε HepG2, κύτταρα CHC4 Huh-7 και (Σχήμα 1Β -ΡΕ). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση για την εξέταση της κατανομής των ΙΡΝ-α /β-επαγόμενη FGFR1 εντός των όγκων και διαπίστωσαν ότι τα επίπεδα του FGFR1 αυξήθηκαν στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτόπλασμα των κυττάρων HCC (Σχήμα 1 Ε).

Α, περίληψη των γονιδίων που προκαλείται από ΙΡΝ-α στην ηπατική καρκινικές κυτταρικές σειρές και HepG2-ξενομοσχεύματα. Η έκφραση των γονιδίων που επάγονται από ΙΡΝ-α εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση της σειράς DNA, και η έκφραση του

FGFR1

βρέθηκε ότι επάγεται έντονα. Β, κηλίδα Western που δείχνει ΙΡΝ-α /β-επαγόμενη έκφραση FGFR1 σε ανθρώπινα ηπατικά καρκινικά κύτταρα. Τα σχετικά επίπεδα της πρωτεΐνης που αναφέρονται κατωτέρω. C, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που δείχνει ΙΡΝ-α /β-επαγόμενη έκφραση FGFR1 σε ανθρώπινα ηπατικά καρκινικά κύτταρα: μαύρο, κανένα αντίσωμα? πράσινο, δεν IFN? Ροζ, IFN-α? Μπλε, IFN-β. D, κηλίδα Western που δείχνει την χρονική πορεία της έκφρασης FGFR1 μετά από θεραπεία με IFN-α /β. Τα ανοσοαποτυπώματα έγιναν χρησιμοποιώντας συνολικός λύματα από HepG2-ξενομοσχεύματα. Ε, ΙΡΝ-α /β-επαγόμενη έκφραση FGFR1 σε εκτομή ιστούς από HepG2-ξενομοσχεύματα. FGFR1 χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας αντι-FGFR1 αντίσωμα.

Η

Ανάπτυξη ενός μονοκλωνικού αντισώματος αντι-FGFR1

Έχουμε αναπτύξει νέες αντι-FGFR1 mAbs με ανοσοποίηση ποντικών BALB /c με έναν φορέα έκφρασης FGFR1 . Έξι αντισώματα που αναγνωρίζουν FGFR1 απομονώθηκαν από τα ποντίκια, δύο εκ των οποίων, που ορίζονται A2C9-1 και A2D11-1, έδειξε ισχυρή συγγένεια σε ELISAs και χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω. Για την ανάλυση της κινητικής, η εξωκυτταρική περιοχή του FGFR1 συζεύχθηκε ομοιοπολικά σε ένα τσιπ αισθητήρα CM-5 σε χαμηλή πυκνότητα (215 μονάδες απόκρισης του FGFR1), μετά την οποία προσδιορίσαμε τις τιμές Kd για A2C9-1 και A2D11-1 να είναι 209 ηΜ και 7.03 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα S2A). Έτσι A2C9-1 έδειξε την ισχυρότερη συγγένεια για FGFR1. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής επιβεβαίωσε ότι A2C9-1 αντιδρά με FGFR1 (Εικόνα 2), και ανάλυση στυπώματος Western έδειξε το μοριακό βάρος του εκτοπικά εκφραζόμενη FGFR1 να είναι περίπου 115 kDa (Εικόνα S2B).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που δείχνει την επίπεδο έκφρασης του FGFR1 και εξειδίκευση του A2C9-1 mAb. Αριστερά: τα γραφήματα δείχνουν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με λύματα από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στα οποία M19B2 cDNA εισήχθησαν (έλεγχος). Δεξιά: Τα γραφήματα δείχνουν τα αποτελέσματα με λύματα από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στο οποίο πλήρους μήκους εισήχθη FGFR1 cDNA

Η

Anti-FGFR1 μονοκλωνικά αντισώματα αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων HCC in vitro

Στη συνέχεια εξετάσαμε. οι επιδράσεις των A2C9-1 και A2D11-1 mAbs στην ανάπτυξη των ηπατικών καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3). IFN-α έδειξαν κάποια αντικαρκινική δραστικότητα έναντι ηπατικών καρκινικών κυττάρων, και αδύναμη καταστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε όταν A2C9-1 ή A2D11-1 προστέθηκε σε καλλιέργειες εν απουσία της ΙΡΝ-α. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία με ένα συνδυασμό A2C9-1 και IFN-α μειωθεί σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων, σε σύγκριση με τη θεραπεία με IFN-α μόνο (

P

= 0,01) (Σχήμα 3). Η επίδραση του A2D11-1 σε συνδυασμό με ΙΡΝ-α δεν ήταν μεγαλύτερη από την επίδραση της ΙΡΝ-α μόνο. ​​

Στο γράφημα, το ποσοστό επιβίωσης μεταξύ καλλιεργημένα κύτταρα HepG2 HCC παρουσιάζεται στον κάθετο άξονα, και ο χρόνος επώασης μετά την χορήγηση των υποδεικνυόμενων φαρμάκων φαίνεται στον οριζόντιο άξονα. PBS είναι ο αρνητικός έλεγχος. Σύμβολα και ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD. Σημειώστε ότι η θεραπεία με συνδυασμό A2C9-1 και IFN-α μειωθεί σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων, σε σύγκριση με τη θεραπεία με IFN-α μόνο (

P

= 0,01).

Η

Effects του A2C9-1 με και χωρίς ΙΡΝ-α σε ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος ποντικού

στη συνέχεια εξετάσαμε τις επιδράσεις κατά του όγκου του αντι-FGFR1 mAb σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού του ανθρώπινου HCC (Σχήμα 4Α και Β). Σε ποντικούς που έλαβαν μόνο A2C9-1 ή IFN-α, οι όγκοι του όγκου δεν διέφεραν από την ομάδα ελέγχου χορηγήθηκε PBS. Ωστόσο, η θεραπεία με IFN-α + A2C9-1 είχε ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη του όγκου, αν και η καταστολή δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Τέλος, σε ποντικούς που έλαβαν + A2C9-1 + PBMCs IFN-α (μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος), υπήρξε μια σημαντική αντικαρκινική δράση, σε σύγκριση με τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με PBS (ρ = 0,026), INF-α (ρ = 0.03) , A2C9-1 (p = 0,014), PBMC (p = 0.022) ή ΙΡΝ-α + PBMCs (p = 0,007). Στην πραγματικότητα, ο όγκος εξαφανίστηκε σε 2 από τα 4 ζώα που εξετάστηκαν. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων που ανιχνεύεται καμία κυτταροτοξικότητα εναντίον φυσιολογικών ηπατοκυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε έντονη διείσδυση από μονοπυρηνικά κύτταρα των υπολειμματικών καρκινικών ιστών από ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με + A2C9-1 + PBMCs IFN-α, αλλά καμία τέτοια διείσδυση παρατηρήθηκε σε ιστούς όγκων από ποντικούς στις άλλες ομάδες (Σχήμα S3).

Ένα, Εκπρόσωπος φωτογραφίες των μοσχευμάτων όγκου σε SCID ποντίκια. Β, Στο γράφημα, τα μεγέθη των όγκων σε κάθε ομάδα (η = 4 ποντικοί ανά ομάδα) παρουσιάζεται στον κάθετο άξονα, και ο χρόνος που παρήλθε μετά τη θεραπεία με τα υποδεικνυόμενα φάρμακα και τα κύτταρα φαίνεται στον οριζόντιο άξονα. Τα σύμβολα και τα μπαρ είναι μέσοι όροι ± SD. C, όγκοι των όγκων μετά τη θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες φάρμακα και τα κύτταρα. PBS είναι ο αρνητικός έλεγχος. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι ± SD.

Η

IFN ενισχύει τη συσσώρευση της αντι-FGFR1 mAb εντός των όγκων

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η παρατηρούμενη υποχώρηση των ξενομοσχευμάτων είχε σχέση με τη θεραπεία με A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680-συζευγμένο A2C9-1 εγχύθηκε μέσα στις φλέβες της ουράς των ποντικιών που φέρουν όγκο SCID, μετά την οποία η στόχευση του όγκου από A2C9-1 αξιολογήθηκε στα ίδια ζώα σε διαφορετικά χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα οπτικό σύστημα μοριακή απεικόνιση (Σχήμα 5Α και Β). Σε ποντίκια προκαταρκτική αγωγή με IFN-α, A2C9-1 επιλεκτικά και χρονικά εξαρτώμενο συσσωρευτεί εντός των όγκων κατά την περίοδο από 24 ώρες έως 192 ώρες μετά τη χορήγηση του. Σε αντίθεση, μόνο αμελητέα επίπεδα του mAb ανιχνεύτηκαν σε ποντικούς ελέγχου χορηγήθηκε A2C9-1 + PBS. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι δεν υπήρχε συσσώρευση ενός 680-συζευγμένο αντίσωμα ελέγχου Alexa Fluor (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Φαίνεται, συνεπώς, ότι η IFN-α ενισχύει την συσσώρευση των αντι-FGFR1 mAb

in vivo

, πιθανότατα έως και ρύθμισης FGFR1.

Α, ποντίκια SCID είχαν ξενομοσχεύτηκε με 1 × 10

6 κύτταρα HepG2, μετά το οποίο 50 μα Cy5-συζευγμένου mAb A2C9-1 ενδοφλεβίως χορηγείται μέσω της φλέβας της ουράς. Οι ποντικοί κατόπιν απεικονίζεται κάτω από αναισθησία. Β, Χρόνος πορεία της έντασης του σήματος Cy5.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι FGFR1 μπορεί να χρησιμεύσει ως νέο στόχο για θεραπεία αντισωμάτων σε HCC. Πιο συγκεκριμένα, η συνδυασμένη θεραπεία με IFN-α /β και αντι-FGFR1 mAb (A2C9-1) έδειξε ισχυρές επιδράσεις καταστολής της ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα HCC

in vitro

και

in vivo

. Πέντε ισομορφές του υποδοχέα διαμεμβρανικού FGFR (FGFR1-4 και FGFR5 /1L) είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε θηλαστικά [12]. Κάθε αποτελείται από τρεις εξωκυτταρικές επικράτειες τύπου ανοσογλοβουλίνης, μια διαμεμβρανική περιοχή, και δύο ενδοκυτταρικές περιοχές κινάσης τυροσίνης. FGF συνδέεται με την FGFR μέσω δύο από τις περιοχές που μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνη (II και III). Κατά τη διάρκεια της έκφρασης FGFR, εναλλακτικό μάτισμα του

FGFR

μεταγραφές παράγει πολλαπλές παραλλαγές ματίσματος με διαφορετικές εξειδικεύσεις συνδέτη ιστοειδική [13]. Μεταξύ αυτών, FGFR1 έχει δειχθεί ότι εκφράζεται σε HCC και είναι γνωστό ότι προάγει την ανάπτυξη HCC σε απόκριση σε καρκινογόνες διέγερση [14]. FGFR1 δεν εκφράζεται σε noncancerous ηπατοκύτταρα. FGFR1 μεσολάβηση σηματοδότηση εμπλέκεται εις την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και διείσδυση, καθώς και στην αγγειογένεση [15], το οποίο είναι ήδη ένας στόχος για αντικαρκινική θεραπεία [16]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει αυξημένη έκφραση προσδεμάτων FGFR, συμπεριλαμβανομένων FGF1 και FGF2, σε πρωτογενείς ιστούς HCC και ηπατική καρκινικές κυτταρικές γραμμές [17], [18], [19], [20], υποδηλώνοντας έντονα σηματοδότηση FGF διαδραματίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη του HCC. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν μια ελκυστική FGFR1 μοριακός στόχος για τη θεραπεία της HCC.

Ένα σημαντικό πρόβλημα με τη θεραπεία με αντίσωμα κατά του καρκίνου είναι η αδύναμα και ανομοιογενή έκφραση αντιγόνων κυτταρικής επιφάνειας. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, εξετάσαμε τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω από IFN σε HCC ξενομοσχεύματα. Βρήκαμε ότι η έκφραση του FGFR1 επάγεται από την ΙΡΝ-α /β και ότι η θεραπεία των κυττάρων HCC με ένα συνδυασμό IFN-α /β και αντι-FGFR1 mAb αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων HCC. Ετσι, ένας λόγος για την ανεπαρκή θεραπευτικό αποτέλεσμα των αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν FGFR1 φαίνεται να είναι είναι ότι, χωρίς επαγωγή, έκφραση του FGFR1 σε καρκινικά κύτταρα δεν είναι επαρκής για την αποτελεσματική θεραπεία. Συνεπής με αυτή την ιδέα, ανοσοϊστοχημική ανάλυση μας έδειξε έκφραση FGFR1 να είναι πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε μη επεξεργασμένα κύτταρα HCC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω από IFN [21], και αυτή η αυξητική ρύθμιση του EGFR είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που διέπουν την ευαισθησία των προσβεβλημένων κυττάρων καρκίνου σε θεραπεία αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα [22]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ότι η θεραπεία με ένα συνδυασμό IFN και ένα αντίσωμα μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου.

Ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο ΙΡΝ-α /β επάγει την έκφραση FGFR1 παραμένει άγνωστη. Είναι γνωστό, ωστόσο, ότι τα κατά του όγκου και αντι-ιικά αποτελέσματα των IFN περιλαμβάνουν αλλαγές στο μεταγραφική ρύθμιση διαφόρων γονιδίων [23], και ότι τα γονίδια ΙΡΝ-διεγέρσιμο περιέχουν ένα στοιχείο απόκρισης ιντερφερόνης (ISRE) σε περιοχές υποκινητή τους [24]. Με τη χρήση ενός προγράμματος αναζήτησης παράγοντα μεταγραφής, ταυτοποιήσαμε διάφορες υποθετικές ISREs στην 5 ‘UTR του FGFR1, γεγονός που υποδηλώνει ότι FGFR1 μπορούσε να είναι ένας άμεσος στόχος του τύπου Ι IFN (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η περαιτέρω μελέτη θα είναι αναγκαίο να προσδιοριστεί με ακρίβεια το πώς η ιντερφερόνη προκαλεί FGFR1.

Επίσης, δεν έχει ακόμη κατανοήσει πλήρως τον μοριακό μηχανισμό με τον οποίο το αντίσωμα μας ασκείται αντικαρκινική δράση της, αν και υπάρχουν αρκετές δυνατότητες. Πολλοί από τους στόχους όγκου-εκφράζεται θεραπευτικών αντισωμάτων είναι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Για παράδειγμα, αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ, συμπεριλαμβανομένων Cetuximab, έχουν δειχθεί να εμποδίσει σηματοδότηση παράγοντα ανάπτυξης, εμποδίζοντας τον συνδέτη από τη σύνδεση με τον υποδοχέα του, ή εμποδίζοντας διμερισμό του υποδοχέα [25]. Είναι πολύ πιθανό ότι A2C9-1 καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω ενός παρόμοιου μηχανισμού με στοχοθέτηση IFN-επαγόμενη FGFR1. Αναφέρθηκε επίσης ότι η δέσμευση ενός αντισώματος σε ένα αποτέλεσμα υποδοχέα παράγοντα ανάπτυξης στην εσωτερίκευση του συμπλόκου αντισώματος-υποδοχέα, και η ρύθμιση προς τα κάτω των κατάντη σηματοδότησης [26]? Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία A2C9-1 επαγόμενη εσωτερίκευση σε καρκινικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τρίτον, τα αντισώματα έναντι των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα ασκούν επίσης αύξηση καταστολή εφέ μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος [27]. Εδώ, για παράδειγμα, δείξαμε ότι η ΙΡΝ-α /β αυξάνει την επιφανειακή έκφραση του FGFR1, ίσως επιτρέποντας ένα αντικαρκινικό αποτέλεσμα βασίζεται σε κυτταρομεσολαβητική κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από αντίσωμα για να συνοδεύσει την σύνδεση του αντι-FGFR1 mAb στον υποδοχέα. Τα αποτελέσματα των μας

in vivo

πείραμα που δείχνει τη σημασία των PBMCs με τα κατά του όγκου αποτελέσματα του A2C9-1 συνάδει με την ιδέα ότι αυτό το αντίσωμα διεγείρει έντονα εξαρτώμενη από αντίσωμα διαμεσολαβούμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα.

Περιληπτικά, βρήκαμε ότι η ΙΡΝ-α /β επάγει την έκφραση του FGFR1 και ότι η θεραπεία με ένα συνδυασμό IFN-α /β και αντι-FGFR1 mAb καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων HCC

in vitro

και

στο vivo

. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η ΙΡΝ-α /β αυξάνει την συσσώρευση του αντι-FGFR1 mAb εντός των όγκων. Αυτό το πρωτόκολλο θεραπείας αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη των κυττάρων HCC χωρίς να επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της HCC χωρίς μείωση της ηπατικής προκαταρκτική απόδοση. Ως εκ τούτου, προτείνουν ότι τα αποτελέσματά μας μπορεί να αποτελέσει τη βάση για μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία του HCC, για τα οποία δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία αυτή τη στιγμή.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και πειραματική ζώα

Ανθρώπινο ηπατικό καρκινικές κυτταρικές σειρές (HepG2, Huh-7 και CHC4) ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (Tokyo, Japan) και καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C υπό μία ατμόσφαιρα υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν από υγιείς εθελοντές με τη χρήση Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sweden) και χρησιμοποιήθηκε ως κύτταρα τελεστές σε SCID ποντίκια. Όλα δοτών γραπτή συγκατάθεση πριν από τη συλλογή, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι, και όλα τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν ανθρώπινα δείγματα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Sapporo Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ολόκληρο PBMCs (1 × 10

7) αιωρήθηκε σε 0.2 ml RPMI 1640 εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε κάθε ποντικό SCID. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα αποδεκτά πρότυπα φροντίδας των ζώων και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των Sapporo Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Για την ανάλυση μικροσυστοιχιών, κύτταρα HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα) αρχικά ξενο-μεταμόσχευσις σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικούς. Τρεις εβδομάδες αργότερα, όταν η προκύπτουσα όγκος είχε φθάσει 6-7 mm σε διάμετρο, IFN-α (OIF®? Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Τοκουσίμα, Ιαπωνία) εγχύθηκε υποδόρια σε μία δόση των 2000 U /ποντικό. Δείγματα ιστού όγκου συλλέχθηκαν πριν και 24 ώρες μετά την ένεση του IFN-α. RNA εκχυλίστηκε από τους συλλεγόμενους ιστούς χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript III (Invitrogen). Το cDNA στη συνέχεια αντιδρά με χρήση Gene Navigator cDNA Array Filter-ανθρώπινου καρκίνου (Toyobo, Osaka, Japan) και υποβλήθηκαν σε ανάλυση DNA συστοιχίας χρησιμοποιώντας μία Fluor-S Πολλαπλών Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Real-time RT-PCR ανάλυση

HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα) κύτταρα υποδορίως ξενομοσχεύτηκε στις πλάτες των ποντικών SCID. Όταν η εμβολιασμένη όγκου έφτασε 10 mm σε διάμετρο, IFN-α (OIF®) ή ΙΡΝ-β (Feron®? Κατασκευάζεται από την Toray Industries, Inc., Tokyo, Japan) χορηγήθηκε ενδοφλεβίως σε μια δόση των 2000 U /ποντικό, και δείγματα ιστού όγκου συλλέχθηκαν 0, 1, 3, 8, 24 και 48 ώρες μετά τη χορήγηση. Ολικό RNA καθαρίστηκε από τα δείγματα χρησιμοποιώντας ένα RNeasy κιτ (Qiagen, Hilden, Γερμανία), και μονής έλικας cDNA συνετέθη από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Σουηδία) . Σε πραγματικό χρόνο ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green Ι (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) με ένα σύστημα PCR LightCycler πραγματικού χρόνου (Roche). Επίπεδα FGFR1 και OAS1 έκφρασης (έλεγχος) mRNA κανονικοποιήθηκαν προς την έκφραση του GAPDH mRNA. Primer σύνολα για FGFR1 (νόημα, 5′-GGA CGA TGT GCA GAG CAT CAA CTG-3 ‘? Αντι-νόημα, 5′-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3′), OAS1 (νόημα, 5’-CAT CCG ΚΔ AGT CAA GCA CTG-3 ‘? αντι-νόημα, 5′-CCA CCA CCC AAG ΤΤΤ ΚΔ GTA-3′) και GAPDH (νόημα, 5’-ΟΑΑ GGT ΟΑΑ GGT CGG AGT C-3 ‘? αντι-νόημα , 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ΑΤΤ-TC-3 ‘) συνετέθησαν σε Greiner Bio-One (Τόκιο, Ιαπωνία).

ανάλυση Western blot

HepG2, Huh-7 ή κύτταρα CHC4 επωάστηκαν για 48 ώρες με την παρουσία ΙΡΝ-α ή ΙΡΝ-β (1000 IU /ml), μετά την οποία τα κύτταρα λύθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος (50 mM Tris-HC1, ρΗ 6,8, 6% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS, 0,004% κυανό βρωμοφαινόλης, και 10% γλυκερόλη). Πρωτεΐνες σε δείγματα λύματος διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 7,5% και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad Laboratories). Μετά τον αποκλεισμό της μεμβράνης με 2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, αυτό επωάστηκε με αντι-ανθρώπινο FGFR1 αντίσωμα (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η κηλίδα στη συνέχεια αναπτύχθηκε με 0,005% Η

20

2-3, 3′-διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανοσοϋπεροξειδάσης ABC (κιτ Vectastain ABC, Vector Labs, Burlingame, CA, USA).

κυτταρομετρίας ροής ανάλυση

Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη χορήγηση της ΙΡΝ-α, η έκφραση του FGFR1 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Κύτταρα σε εναιώρημα (4 χ 10

5 κύτταρα /σωληνάριο) πλύθηκαν με 2 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (0,2% αλβουμίνη βόειου ορού, 0.1% NaN

3/10 mmol /L αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, ρΗ 7.4) και φυγοκεντρήθηκε στα 300

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C, μετά το οποίο αφαιρέθηκε το υπερκείμενο. Το υπόλοιπο κυτταρικό ίζημα σταθεροποιήθηκε σε 0,25% παραφορμαλδεΰδη για τουλάχιστον 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν δύο φορές με 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης, επωάστηκαν για 1 ώρα σε 70% μεθανόλη στους 4 ° C, και στη συνέχεια πλένεται και πάλι. Για να εξεταστεί η έκφραση της FGFR1, τα σταθεροποιημένα κύτταρα επωάζονται πρώτα με αντίσωμα αντι-FGFR1 (1:100 αραίωση) για 1 ώρα στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε 4 mL ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG επί πάγου στο σκοτάδι. Μετά πάλι από έκπλυση των κυττάρων δύο φορές, αυτά εναιωρήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης για ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).

Ανάλυση της έκφρασης FGFR1 σε ανθρώπινα ηπατικά ξενομοσχεύματα καρκίνου του

κύτταρα HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα) ξενο-μεταμόσχευσις σε SCID ποντίκια. Όταν το προκύπτον όγκου έφτασε 10 mm σε διάμετρο, IFN-α (OIF®) ή ΙΡΝ-β (Feron®) χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά ή ενδοφλέβια σε μια δόση των 100 U /g, και 24 ώρες αργότερα συλλέχθηκαν ιστούς όγκων. αναλύσεις κηλίδος Western και η ανοσοϊστοχημική διεξήχθησαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα FGFR1. (SC-121? Santa Cruz Biotechnology)

Παρασκευή Αντι-FGFR1 Αντίσωμα

Ένα πολυνουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί την περιοχή που εκτείνεται από αμινοξέων 1 έως 822 του FGFR1 και αντιπροσωπεύεται από την SEQ ID ΝΟ. 1 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας πλήρους μήκους FGFR1 (Accession Νο NM_000604) σαν εκμαγείο με τα εναρκτήρια Νο 5′-3 [(αλληλουχία αρ. 3): 5′-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 ‘] και Νο 3′- 3 [(αλληλουχία αρ. 4): 5’-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 ‘]. Το ενισχυμένο πολυνουκλεοτίδιο εισήχθη εντός pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για την κατασκευή ενός φορέα έκφρασης που χορηγήθηκε ως αντιγόνο ανοσοποίησης σε δόση 50 μg /ποντικό σε όγκο 50-μί σε 1- ή 2- διαστήματα εβδομάδων. Το αντιγόνο για την αρχική ανοσοποίηση αναμίχθηκαν με πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund, ενώ τα αντιγόνα για τη δεύτερη και τις επόμενες χορηγήσεις αναμίχθηκαν με ατελές ανοσοενισχυτικό Freund. Σπληνικά μονοκύτταρα από τον ανοσοποιημένο ποντικό και έναν εταίρο σύντηξης, Χ63-Ag8-653, συντήχθηκαν χρησιμοποιώντας πολυαιθυλενογλυκόλη μεσολάβηση κυττάρων σύντηξης, η οποία ακολουθήθηκε από την επιλογή ενός υβριδώματος χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του Kinebuchi et al. [28]. Κύτταρα που είχε αντιδράσει με το ακινητοποιημένο FGFR1 καλλιεργήθηκαν σε μέσο GIT ελεύθερο ορού (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) για την παραγωγή mAbs μέχρι είχε πεθάνει το 80% των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνεται από αυτό το μέσο με φυγοκέντρηση (1000 rpm, 15 λεπτά), και προστέθηκε θειικό αμμώνιο σε 50% κορεσμό και αφέθηκε για μια νύχτα στους 4 ° C. Τα προκύπτοντα ιζήματα ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση (1000 rpm, 30 λεπτά) και διαλύθηκε σε δύο φορές αραιωμένο ρυθμιστικό σύνδεσης (Protein AMAPS κιτ II), μετά την οποία η IgG προσροφήθη επί στήλης πρωτεΐνης Α (GE Healthcare Life Science). Μετά από έκλουση των mAbs από τη στήλη, το προϊόν έκλουσης υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι PBS όλη την νύχτα για τον καθαρισμό των αντισωμάτων, τα οποία απέδωσαν έναν αριθμό mAbs αναγνωρίζουν FGFR1. Ένα από αυτά τα mAbs ορίστηκε A2C9-1 και επιβεβαιώθηκε να αναγνωρίσει FGFR1 με κηλίδωση Western και FACS χρησιμοποιώντας δείγματα από FGFR1 εκφράζεται σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3.

Affinity

μέτρηση

Η συγγένεια του αντι-FGFR1 mAbs για FGFR1 προσδιορίσθηκε με βάση συντονισμό επιφανειακού πλασμονίου (SPR) χρησιμοποιώντας μια συσκευή Biacore 3000 (Biacore ΑΒ, Uppsala, Σουηδία). Η εξωκυτταρική περιοχή του FGFR1 συζεύχθηκε ομοιοπολικά σε ένα τσιπ αισθητήρα CM-5 σε χαμηλή πυκνότητα (215 μονάδες απόκρισης του FGFR1). κινητική Δεσμευτική στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις στο διπλάσιο του αντισώματος σε συγκεντρώσεις από 500 έως 0,08 ηΜ σε ρέον ρυθμιστικό (PBS, ρΗ 7,4, 0,005% (ν /ν), πολυσορβικό 20 – διηθούνται και απαεριωμένο) στους 25 ° C και μία ροή ρυθμό 25 ml /min. Η διαδικασία αναγέννησης αποτελούνταν από τρεις ενέσεις των 10 ml υδροχλωρικής 2,5 Μ γουανιδίνιο, μετά το οποίο εκκενώθηκε το τσιπ αισθητήρα για 5 λεπτά με τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα. Στατιστικές και επεξεργασία δεδομένων εκτελέσθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό αξιολόγησης ΒΙΑ 4.0.1 και GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Όλα τα SPR πειράματα διεξήχθησαν σε Biaffin GmbH & amp? Co. KG (Kassel, Γερμανία).

Αξιολογώντας την επίδραση των αντι-FGFR1 mAb για καρκίνο του ήπατος κυτταρικής βιωσιμότητας

Για να εξεταστεί η επίδραση της χορήγησης IFN-α (OIF®) σε συνδυασμό με αντι-FGFR1 mAb (A2C9-1 ή A2D11-1) σε κύτταρα HCC, αξιολογήσαμε το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων HepG2 με την παρουσία και απουσία της ΙΡΝ-α ή /και αντι-FGFR1 mAb. κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε φρεάτια ενός 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, μετά την οποία αντι-FGFR1 mAb, προστέθηκε IFN-α ή αντι-FGFR1 mAb + IFN-α, και η καλλιέργεια συνεχίστηκε για 0 ​​έως 6 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη, και το ποσοστό επιβίωσης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας αναλύσεις ΜΤΤ. Αντίσωμα ελεύθερο μέσο καλλιέργειας προστέθηκε ως αρνητικός έλεγχος, και τα κύτταρα στα οποία προστέθηκε χρησιμοποιήθηκαν ως επιπρόσθετος έλεγχος τίποτα.

Θεραπευτικές πείραμα με ανθρώπινα ηπατικά καρκινικά κύτταρα-ξενομόσχευμα

ποντίκι

κύτταρα HepG2 ( 5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) ήταν ξενομόσχευμα υποδόρια μέσα στις πλάτες των CB17-scid /scid ποντικούς. Όταν οι όγκοι των όγκων έφθασε 100 mm

3, οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε 7 ομάδες θεραπείας: 1) Ποντικοί στην ομάδα PBS έλαβε ενδοφλέβιες ενέσεις PBS (250 μί) και η κανονική IgG ποντικού (100 μg). 2) Η ομάδα ΙΡΝ-α έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις ΙΡΝ-α (OIF®: 2000 U) και η κανονική IgG ποντικού (100 μg). 3) Η ομάδα αντίσωμα έλαβε ενδοφλέβιες ενέσεις PBS και αντι-FGFR1 mAb (100 μg? A2C9-1). 4) Η ομάδα ΙΡΝ-α + αντίσωμα έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις ΙΡΝ-α (2000 U) και ενδοφλέβιες ενέσεις αντι-FGFR1 mAb (100 μg). 5) Η IFN-α + αντίσωμα ομάδα + PBMC έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις ΙΡΝ-α (2000 U), ενδοφλέβιες ενέσεις αντι-FGFR1 mAb (100 μg) και ενδοφλέβια χορήγηση PBMCs (1 × 10

7 κύτταρα). 6) Η IFN-α + ομάδα PBMC έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις ΙΡΝ-α (2000 U) και ενδοφλέβια χορήγηση PBMCs (1 × 10

7 κύτταρα). 7) Η ομάδα PBMC έλαβαν ενδοφλέβια χορήγηση PBMCs (1 × 10

7 κύτταρα). Οι αγωγές χορηγήθηκαν 5 φορές συνολικά, αρχίζοντας την ημέρα 0 και στη συνέχεια 1 εβδομάδα αργότερα (w1), 2 εβδομάδες αργότερα (w2), 5 εβδομάδες αργότερα (W5) και 6 εβδομάδες αργότερα (W6). Μόνο στο w6, η δόση του αντισώματος αυξήθηκε στα 200 μg /ποντικό. Κάθε ομάδα περιείχε 4 ζώα, και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε ως (μείζων άξονας) χ (ελάσσων άξονας) χ 2 εβδομαδιαίες μετά την αρχική χορήγηση. Οι όγκοι συλλέχθηκαν 1 εβδομάδα μετά την τελική αγωγή.

Immunophotodetection σε ποντίκια που φέρουν όγκο

ανθρώπινα κύτταρα HCC HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα) ξενο-μεταμόσχευσις στις πλάτες των ποντικών SCID . Τρεις εβδομάδες αργότερα, όταν ο όγκος εμβολιάζεται είχε φθάσει περίπου 10 mm σε διάμετρο, IFN-α (OIF? Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) σε μία δόση 20.000 U /ποντίκι ή PBS (έλεγχος) χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς. Μετά από 24 ώρες, 50 μg του Alexa Fluor 680-συζευγμένο αντι-FGFR1 mAb έγινε ενδοφλεβίως χορηγείται μέσω της φλέβας της ουράς. Τα ποντίκια στη συνέχεια απεικονίζονται υπό αναισθησία χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης IVIS LUMINA (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, MA, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Πρόκληση

FGFR1

μεταγραφές από την IFN-α και IFN-β. κύτταρα HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα) υποδορίως ξενομόσχευμα στις πλάτες των ποντικών SCID. Όταν η εμβολιασμένη όγκος είχε φθάσει 10 mm σε διάμετρο, ΙΡΝ-α ή ΙΡΝ-β χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς ή ενδοφλεβίως σε δόση των 2000 U /ποντικό. ιστοί όγκου στη συνέχεια συλλέχθηκαν 0, 1, 3, 8, 24 και 48 ώρες μετά τη χορήγηση. Α, χρονική πορεία της (έλεγχος) έκφραση mRNA FGFR1 και OAS1 μετά τη χορήγηση της ΙΡΝ-α. FGFR1 mRNA (μπλε γραμμή) αυξήθηκε από 3 ώρες (151%), 8 ώρες (202%) και 24 ώρες (119%) μετά τη χορήγηση. OAS1 mRNA (κόκκινη γραμμή) αυξήθηκε από 3 ώρες (162%), 8 ώρες (133%) και 24 ώρες (150%) μετά τη χορήγηση. Ορατή είναι μέσω δύο αντίγραφα του πραγματικού χρόνου RT-PCR. B, χρονική πορεία της έκφρασης FGFR1 και OAS1 mRNA μετά τη χορήγηση της IFN-β. FGFR1 mRNA (μπλε γραμμή) αυξήθηκε 8 ώρες (348%) και 24 ώρες (337%) μετά τη χορήγηση, ενώ OAS1 mRNA (κόκκινη γραμμή) αυξήθηκε από 3 ώρες (262%) και 8 ώρες (511%) μετά τη χορήγηση. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του GAPDH mRNA.