Αφηρημένο

Γεμσιταβίνη (Gem) έχει περιορισμένη κλινικά οφέλη σε πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC). Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε συνδυασμών γεμσιταβίνης με αντιαγγειογενετικές πράκτορες των διαφόρων μηχανισμών για PDAC, συμπεριλαμβανομένης της bevacizumab (Bev), sunitinib (Su) και EMAP II. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκαν με WST-1 προσδιορισμό και κηλίδωση Western. In vivo πειράματα διεξήχθησαν μέσω ποντικού ξενομοσχεύματα. Αναστολή της in vitro πολλαπλασιασμού AsPC-1 κύτταρα PDAC με γεμκιταβίνη (10 μΜ), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 μΜ) και EMAP (10 μΜ) ήταν 35, 22, 81 και 6 τοις εκατό? συνδυασμός γεμσιταβίνης με bevacizumab, sunitinib ή EMAP δεν είχαν αθροιστικά αποτελέσματα. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP προκαλείται 70, 41, 86 και 67 τοις εκατό αναστολή, ενώ ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με bevacizumab, sunitinib ή EMAP είχαν προσθετικά αποτελέσματα. Σε WI-38 ινοβλάστες, γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP προκαλείται 79, 58, 80 και 29 τοις εκατό αναστολή, με πρόσθετο εφέ σε συνδυασμό, όπως καλά. Καθαρή in vivo αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε γεμσιταβίνη, bevacizumab, sunitinib και μονοθεραπεία EMAP ήταν 43, 38, 94 και 46 τοις εκατό? διπλή συνδυασμούς Gem + Bev, Gem + Su και Gem + EMAP οδήγησε σε 69, 99 και 64 τοις εκατό αναστολή. Συνδυασμοί περισσότερες από μία αντιαγγειογόνο παράγοντα με γεμσιταβίνη ήταν γενικά πιο αποτελεσματική, αλλά όχι ανώτερη από Gem + Su. Η ενδονεοπλασματική πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και η πυκνότητα μικροαγγείων ευρήματα συσχετίζονται με δεδομένα αναστολής της ανάπτυξης του όγκου. Η διάμεση επιβίωση των ζώων αυξήθηκε κατά γεμσιταμπίνη (26 ημέρες), αλλά όχι με bevacizumab, sunitinib ή μονοθεραπεία EMAP σύγκριση με τους μάρτυρες (19 ημέρες). συνδυασμών γεμσιταβίνης με bevacizumab, sunitinib ή EMAP βελτίωσε την επιβίωση σε παρόμοιο βαθμό (36 ή 37 ημέρες). Συνδυασμοί γεμσιταβίνης με Bev + EMAP (43 ημερών) ή με Bev + Su + EMAP (46 ημέρες) οδήγησε στο μέγιστο όφελος επιβίωσης που παρατηρήθηκε. Συνδυασμός αντιαγγειογονικών παραγόντων βελτιώνει την απόκριση γεμσιταμπίνη, με sunitinib που προκαλεί την ισχυρότερη επίδραση. Τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν τα πλεονεκτήματα του συνδυασμού πολλών παραγόντων που στοχεύουν με την καθιερωμένη θεραπεία γεμσιταβίνης για PDAC

Παράθεση:. Awasthi Ν, Zhang C, Ruan W, Schwarz MA, ο Σβαρτς RE (2012) Αξιολόγηση της Πολυ-Μηχανιστικές Συνδυασμοί Αντιαγγειογενής να Βελτιώστε την κυτταροτοξική θεραπεία απόκρισης σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (6): e38477. doi: 10.1371 /journal.pone.0038477

Επιμέλεια: Χρύσω Κάνθου, Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 28 Νοέμ 2011? Αποδεκτές: 9η του Μάη 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Awasthi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι ένα από τα. πιο επιθετικές καρκίνους του ανθρώπου και παραμένει η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες. Ταχεία της προόδου των όγκων, αργά διάγνωση, έγκαιρη και επιθετική μετάσταση και υψηλή αντοχή σε συμβατική χημειοθεραπεία οδηγεί σε εξαιρετικά κακή πρόγνωση με ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια λιγότερο από το 5% [1]. Θεραπεία της PDAC εξαρτάται από το στάδιο του καρκίνου? το συνολικό ποσοστό τέλεσης οπισθοεκτομής είναι μόνο 10 έως 15%, και μετεγχειρητική υποτροπή είναι κοινή [2], [3], [4]. Ιδιαίτερη προσοχή έχει στραφεί προς την κατεύθυνση επιλογές συστηματική θεραπεία για PDAC για πιθανή οριστική ή περιεγχειρητική όφελος της θεραπείας. Γεμσιταβίνη (Gem), ένα ανάλογο νουκλεοζίτη δεοξυκυτιδίνης, είναι ένας κυτταροτοξικός παράγοντας που προκαλεί αναστολή της σύνθεσης του DNA και τον κυτταρικό θάνατο. Η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) ενέκρινε γεμσιταβίνης για τη θεραπεία του προχωρημένου PDAC το 1997. Ωστόσο, γεμσιταμπίνη είναι κλινικά αποτελεσματική μόνο στο 20-30% των ασθενών PDAC, οδηγώντας σε μια διάμεση επιβίωση χωρίς εξέλιξη της 5,7 μήνες έναντι 4,4 μήνες η ομάδα που έλαβε αγωγή 5-φθοριοουρακίλη [5]. Γεμσιταβίνης με βάση σχήματα συνδυασμού χημειοθεραπείας έχουν αποτύχει να δείξουν οποιαδήποτε ουσιαστική πλεονέκτημα επιβίωσης πάνω από γεμσιταμπίνη μοναδικός παράγοντας [6], [7]. Τα γεγονότα αυτά καταδεικνύουν σαφώς την επείγουσα ανάγκη για νέες και πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές για PDAC.

Η αγγειογένεση, μια διαδικασία με την οποία οι όγκοι αποκτούν παροχή αίματος για τη συνεχή ανάπτυξη τους, είναι απαραίτητη για την εξέλιξη των πρωτογενών και μεταστατικών στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων PDAC. Η αγγειογένεση αρχίζει με την υποξία, αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, και ενεργοποίηση του πρωτο-ογκογονιδίου και απο-ενεργοποίηση των μηχανισμών ογκοκατασταλτικό γονίδιο [8]. Στόχευση αγγειογένεση για τη μείωση της εξέλιξης του όγκου και η μετάσταση μπορεί να δώσει νέα προσέγγιση για τη θεραπεία συνδυασμού. έχουν αντι-αγγειογόνες παράγοντες όπως αντι-αγγειακού bevacizumab ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) παράγοντα (Bev), αναστολείς μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (marimastat) και αναστολείς κυκλοοξυγενάσης (Celecoxib) μελετήθηκε σε θεραπεία συνδυασμού σε PDAC μοντέλα με περιορισμένο όφελος επιβίωσης [9], [10 ], [11]. Erlotinib, ο αναστολέας του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, έχει μέχρι σήμερα ήταν ο μόνος παράγοντας που μεσολαβούν ένα μέτριο συνολικό όφελος επιβίωσης σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη [12].

Η

Πολλές αναφορές στη βιβλιογραφία δείχνουν ότι η σηματοδότηση VEGF παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της PDAC [13], [14], [15], [16]. Ως εκ τούτου bevacizumab, ένα ανασυνδυασμένο εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι VEGF, αξιολογήθηκε σε κλινικές δοκιμές φάσης II και φάσης III. Αν και ο συνδυασμός bevacizumab και gemcitabine έδειξαν κάποια υπόσχεση σε μια μελέτη φάσης ΙΙ, δεν υπάρχει σημαντική βελτίωση παρατηρήθηκε στις μεταγενέστερες μελέτες φάσης ΙΙΙ [17]. Το sunitinib (SU) είναι ένα πολυ-στόχος κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (RTK) αναστολέα με αντί-αγγειογόνο και κατά του όγκου δραστηριότητες [18], [19], [20]. Το sunitinib αναστέλλει RTKs εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση συμπεριλαμβανομένων υποδοχέα του παράγοντα αρχέγονων κυττάρων (c-KIT), FMS που σχετίζονται με τυροσίνη κινάση 3 (FLT3), η νευρογλοιακή κυτταρική γραμμή νευροτροφικό υποδοχέα παράγοντα (RET) και διέγερσης αποικιών τύπου παράγοντα 1 υποδοχέα (CSF-1R) [18], [19]. Το sunitinib αναστέλλει επίσης RTKs εκφράζεται σε ενδοθηλιακά και τοιχογραφία κύτταρα, όπως οι υποδοχείς VEGF (τύπου 1 και 2) και τον αυξητικό παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) υποδοχείς α και β [20], [21]. Στην ανθρώπινη PDAC, VEGF υποδοχείς και τους υποδοχείς PDGF είναι υπερ-εκφράζονται και έχουν συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση [22], [23], [24]. Το sunitinib έχει δειχθεί ότι έχει αποτελεσματικότητα κατά του όγκου σε πειραματικά PDAC [25], [26], [27]. Τα ενδοθηλιακά μονοκύτταρα πολυπεπτίδιο ενεργοποίησης II (EMAP) είναι μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη με αντί-αγγειογόνο και antiendothelial δραστηριότητες. EMAP έχει ισχυρές επιπτώσεις επί των ενδοθηλιακών κυττάρων (ECs) όπως η αναστολή του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και αγγείωση, καθώς και επαγωγή της απόπτωσης [28], [29]. EMAP καταστέλλει πρωτογενών και μεταστατικών ανάπτυξης του όγκου [28], [30], [31] που θα μπορούσε να σχετίζεται με την ικανότητά της να δεσμεύει τους υποδοχείς VEGF και α5β1 ιντεγκρίνης, οδηγώντας σε μια παρέμβαση στις φιβρονεκτίνη και VEGF σηματοδότησης [32], [33] . EMAP έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι βελτιώνει την γεμσιταβίνη και docetaxel απόκριση σε πειραματικά PDAC [34], [35], [36]. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε και σε σύγκριση με τα οφέλη θεραπείας συνδυασμού της γεμσιταβίνης με τρεις αντιαγγειογενετικές παράγοντες bevacizumab, το sunitinib και EMAP για δυνητικά αυξημένη κλινικές εφαρμογές PDAC.

AsPC-1, HUVECs και WI-38 κυτταρικές καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Gem (10 μΜ), Bev (1 mg /ml), Su (10 μΜ) και EMAP (10 μΜ), είτε μόνο του ή σε συνδυασμό για 16 ώρες. Σύνολο κυτταρολύματος από τις ομάδες θεραπείας υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση. Η έκφραση της α-τουμπουλίνης αναλύθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η γεμσιταμπίνη αγοράστηκε από την Eli Lilly (Indianapolis, IN). Bevacizumab αγοράστηκε από την Genentech (South San Francisco, CA). Το sunitinib αγοράστηκε από LC Laboratories, Inc. (Woburn, ΜΑ). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη EMAP παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37], ενώ το αντιδραστήριο πολλαπλασιασμού κυττάρου WST-1 αγοράστηκε από την Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, ΙΝ).

Cell Culture

Το ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική γραμμή AsPC-1, ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών WI-38 και τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) έχουν όλα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 και WI-38 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 και ϋΜΕΜ, αντίστοιχα (Sigma Chemical Co. St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). HUVECs αναπτύχθηκαν σε μέσο EndoGRO-LS που περιέχει συμπληρώματα ενδοθηλιακής κυτταρικής ανάπτυξης (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

In vitro η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία WST-1 . Τέσσερις χιλιάδες κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων και μετά από 16 ώρες το μέσο αντικαταστάθηκε με χαμηλό ορό μέσο που περιέχει. Τα κύτταρα η θεραπεία με γεμσιταβίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP. Το εύρος των συγκεντρώσεων που χρησιμοποιούνται για την γεμσιταμπίνη, sunitinib και EMAP (10 nM έως 10 μM)? και για bevacizumab (1 μg /ml έως 1 mg /ml) ήταν συγκρίσιμη με κλινικά επιτεύξιμες συγκεντρώσεις. Μετά από 72-ωρών επώαση, 10 μΐ WST-1 αντιδραστηρίου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε μετά από 2 ώρες χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με AsPC-1 κύτταρο (0,75 × 10

6) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Gem, Bev, Su και EMAP, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, για 2 εβδομάδες. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε 2 φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας καλίμπρες και καθαρή αύξηση του όγκου υπολογίστηκε με αφαίρεση του όγκου του όγκου κατά την πρώτη ημέρα της θεραπείας από ότι την τελευταία ημέρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά των μέσες τιμές 6 έως 8 ποντίκια ανά ομάδα.

Η

Nude ποντίκια υποδόρια ένεση με κύτταρα AsPC-1 (0,75 × 10

6) και κατεργάζεται με Gem, Bev, Su και EMAP, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, για 2 εβδομάδες. (Α) τομές ιστού όγκων ανοσοχρώση με πυρηνικό αντιγόνο Κί67 και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. (Β) Κί67-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε πέντε διαφορετικά πεδία υψηλής ισχύος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Σύμβολα • και * αντιπροσωπεύουν σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα Gem, αντίστοιχα

Η

Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα AsPC-1 (0.75 χ 10

6) και. αντιμετωπίζονται με Gem, Bev, Su και EMAP, είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό, για 2 εβδομάδες. (Α) τομές ιστού όγκων βάφτηκαν με διαδικασία TUNEL και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. (Β) αποπτωτικά κύτταρα TUNEL θετικά μετρήθηκαν σε πέντε διαφορετικά πεδία υψηλής ισχύος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Σύμβολα • και * αντιπροσωπεύουν σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα Gem, αντίστοιχα

Η

Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα AsPC-1 (0.75 χ 10

6) και. αντιμετωπίζονται με Gem, Bev, Su και EMAP, είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό, για 2 εβδομάδες. (Α) τομές ιστού όγκων βάφτηκαν με PECAM-1 αντίσωμα και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. (Β) PECAM-1 θετικά μικροαγγείων μετρήθηκαν σε πέντε διαφορετικά πεδία υψηλής ισχύος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Σύμβολα • και * αντιπροσωπεύουν σημαντικές διαφορές (P & lt? 0.05). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα Gem, αντίστοιχα

Η

AsPC-1 κύτταρα (0,75 × 10

6) έχουν ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε ποντίκια SCID, και μετά από 2 εβδομάδες ακολουθούμενη από επεξεργασία με Gem, Bev, Su και EMAP, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, για διάρκεια 2 εβδομάδων. Η καμπύλη αναπαριστά τον χρόνο επιβίωσης των ζώων από την έναρξη της αγωγής.

Η

Ανάλυση Western Blot

Ένα υπο-συρρέουσα μονοστιβάδα κυττάρων υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (10 μΜ), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 μΜ) ή EMAP (10 μΜ) και επωάστηκαν 12 ώρες για HUVECs και 24 ωρών για AsPC-1 και WI-38 κύτταρα. Σύνολο κυτταρόλυμα παρασκευάζεται, μετρούμενη συγκέντρωση πρωτεΐνης και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε διάλυμα αποκλεισμού (5% γάλα σε ΤΒδ-Τ [αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει Tween-20]) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: διασπάστηκε πολυ (ADP-ριβόζη) polymerase- 1 (PARP-1), διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) ή α-τουμπουλίνης (Sigma). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίστοιχες συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ειδικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) σε φιλμ αυτοραδιογραφίας και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρία.

όγκων Εμφύτευση και in vivo την ανάπτυξη όγκων Πείραμα

Όλα διαδικασίες των ζώων και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές και εγκεκριμένα πρωτόκολλα του Πανεπιστημίου του Τέξας Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Θεσμική φροντίδα ζώων και Επιτροπής Χρήση (πρωτόκολλο ζώων Αριθμός 2008-0348). Αθυμικά θηλυκά γυμνά ποντίκια (ηλικίας 4-8 εβδομάδων) χρησιμοποιήθηκαν σε υποδόριο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Ανθρώπινα καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα AsPC-1 (0.75 χ 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως σε κάθε ποντικό. Μετά από 14 ημέρες όταν όλα τα ποντίκια είχαν μετρήσιμου όγκου, τα ποντίκια ομαδοποιήθηκαν τυχαίως (η = 6 έως 8 ανά ομάδα) και αγωγή ενδοπεριτοναϊκά με PBS (έλεγχος), γεμσιταβίνη (100 mg /kg, δύο φορές την εβδομάδα), bevacizumab (10 μg ανά ποντικό, δύο φορές την εβδομάδα), το sunitinib (40 mg /kg για 1

η εβδομάδα, 20 mg /kg για 2

ου εβδομάδα, 5 φορές την εβδομάδα) και EMAP (80 μg /kg, 5 φορές την εβδομάδα) για 2 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου σε όλους τους ποντικούς μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε με χρήση του τύπου [V = ½ (L × (W)

2], όπου L = μήκος και W = πλάτος. Η καθαρή αύξηση στο μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε για κάθε ζώο με αφαίρεση του όγκου του όγκου την πρώτη ημέρα της θεραπείας από ότι κατά την τελευταία ημέρα. Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας, όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν, αποκόπηκαν και επεξεργασία για ιστολογική ή ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Ιστολογίας και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

δειγμάτων όγκου ιστού μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική και ανοσοϊστολογική ανάλυση. ενδονεοπλασματική πολλαπλασιαστική δραστικότητα μετρήθηκε με τη χρήση με χρώση πυρηνικό αντιγόνο Κί67 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Abcam, Cambridge, ΜΑ). εν συντομία, παραφίνη τομές ιστών -embedded όγκου κόπηκαν, αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και αντιγόνο ανακτηθούν. Οι τομές ιστών επωάστηκαν με ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος CAS ακολουθούμενο από 1 ώρα επώαση με αντίσωμα Κί67 (1:200 αραίωση). Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με Cy3 (1 :200 αραίωση) δευτερογενές αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ) για 40 λεπτά. Τα πλακίδια στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα στερέωσης που περιέχει 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα αξιολογήθηκε με υπολογισμό Κί67-θετικών κυττάρων από πέντε διαφορετικούς τομείς υψηλής ισχύος (HPF) με τυφλό τρόπο. Για την ανίχνευση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD), τμήματα ιστού επωάστηκαν με 1:100 αραίωση PECAM-1 (CD-31) αντίσωμα (BD Pharmingen, Bedford, ΜΑ) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με 1:200 αραίωση του δευτερογενούς αντισώματος Cy3 για 40 λεπτά. Τα πλακίδια στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα στερέωσης που περιέχει DAPI, και MVD αξιολογήθηκε με απαρίθμηση PECAM-1 θετικών αγγείων μέσα σε μια μικροσκοπική HPF με τυφλό τρόπο. Η ενδονεοπλασματική απόπτωση αναλύθηκε με χρώση τομών ιστού με «ApopTag Απόπτωση Detection Kit» σύμφωνα με τις οδηγίες (Millipore) του κατασκευαστή. μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση σημάτων φθορισμού χρησιμοποιώντας IX81 Ολύμπου μικροσκόπιο και οι εικόνες που έχουν ληφθεί με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Hamamatsu Orca (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) με μία μονάδα κλώση ομοεστιακό ΣΕΔ χρησιμοποιώντας το λογισμικό Slidebook (Καινοτομίες Intelligent Imaging, Philadelphia, PA).

Animal Ανάλυση επιβίωσης

μελέτες επιβίωσης σε ζώα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 6- έως 8-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια SCID [38]. AsPC-1 (0.75 χ 10

6) κύτταρα ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε κάθε ποντίκι και μετά από δύο εβδομάδες τα ποντίκια ομαδοποιήθηκαν τυχαίως (η = 6 έως 8 ανά ομάδα) και αγωγή ενδοπεριτοναϊκά με PBS (έλεγχος), γεμσιταβίνη (100 mg /kg, δύο φορές την εβδομάδα), bevacizumab (10 μg ανά ποντίκι, δύο φορές την εβδομάδα), το sunitinib (40 mg /kg για 1

η εβδομάδα, 20 mg /kg για 2

ου εβδομάδα, 5 φορές την εβδομάδα) ή EMAP ( 80 μg /kg, 5 φορές την εβδομάδα) για 2 εβδομάδες. Τα ζώα θανατώθηκαν όταν στρίβουν ετοιμοθάνατο σύμφωνα με προκαθορισμένα κριτήρια που περιλαμβάνουν ταχεία απώλεια ή αύξηση βάρους (& gt? 15%), το μέγεθος του όγκου, λήθαργο, αδυναμία να παραμείνει όρθια και η έλλειψη δύναμης. Επιβίωση αξιολογήθηκε από την πρώτη ημέρα της θεραπείας μέχρι το θάνατο.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε με t-test δύο ουρών Student χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego , CA). In vitro κύτταρο τα δεδομένα πολλαπλασιασμού εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Προσθετικότητας των συνδυασμών φαρμάκου προσδιορίστηκε υπολογίζοντας ένα «δείκτη αλληλεπίδραση» χρησιμοποιώντας το Chou TC, Talalay Ρ [39] και ο Lee JJ [40] μεθόδους. Στατιστική ανάλυση για μελέτες in vivo πραγματοποιήθηκε με ANOVA για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδα και t-test του Student για τη σύγκριση επιμέρους ομάδα. στατιστικές μελέτη επιβίωσης αξιολογήθηκαν με StatView για Macintosh (SAS, Carey, NC) με τις στατιστικές μη παραμετρικές επιβίωση και δοκιμές logrank. Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν αντιπροσωπεύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές ομάδα

Αποτελέσματα

Επίδραση της γεμσιταβίνη, Bevacizumab, sunitinib και EMAP επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

In vitro ανάλυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. σε AsPC-1 κύτταρα με γεμσιταβίνη (10 μΜ), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 μΜ) και EMAP (10 μΜ) έδειξε 35, 22, 81 και 6 τοις εκατό αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αντίστοιχα. Συνδυασμοί γκεμσιταμπίνης με ενιαίο αντιαγγειογενετικές παράγοντες bevacizumab ή EMAP δεν είχε κανένα πρόσθετο εφέ, ενώ ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με sunitinib δεν θα μπορούσε να ξεπεράσει τις συνέπειες του sunitinib και μόνο παράγοντα. Συνδυασμοί περισσότερες από μία αντιαγγειογόνο παράγοντα με γεμσιταβίνη δεν είχε πρόσθετο in vitro αποτελέσματα (Πίνακας 1). Αν και gemcitabine είχε διάφορες συνέπειες για τις άλλες κυτταρικές σειρές PDAC BxPC-3, ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1, τα αποτελέσματα των συνδυασμών των παραγόντων αντί-αγγειογόνο είχε παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα που παρατηρούνται με AsPC-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

HUVECs, γεμσιταβίνη (10 μΜ), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 μΜ) και EMAP (10 μΜ) αγωγή προκάλεσε μία ποσοστιαία αναστολή 70, 41, 86 και 67 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αντίστοιχα. Συνδυασμοί γκεμσιταμπίνης με μοναδικό παράγοντα bevacizumab, sunitinib ή EMAP οδήγησε σε σημαντικές επιπτώσεις πρόσθετο στην αναστολή του πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, ο συνδυασμός περισσότερων από ένα αντιαγγειογόνο παράγων δεν είχε προσθετικό αποτέλεσμα. Σε WI-38 κύτταρα, γεμσιταβίνη (10 μΜ), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 μΜ) και EMAP (10 μΜ) προκάλεσε 79, 58, 80 και 29 τοις εκατό της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αντίστοιχα. Συνδυασμός της γεμσιταβίνης με bevacizumab, sunitinib ή EMAP είχαν σημαντική επίδραση και ο συνδυασμός περισσότερων του ενός παραγόντων σε αντιαγγειογενή γεμσιταβίνη δεν είχε περαιτέρω προσθετικά αποτελέσματα (Πίνακας 1) προσθέτου. Για συνδυασμούς με διαφορετικούς gemcitabine αντιαγγειογενετική παράγοντες, ο διάμεσος δείκτης αλληλεπίδραση ήταν 1,03 (εύρος 0,9 να 1.34) για τις AsPC-1 κύτταρα, 1,3 (εύρος 1,06 έως 2.59) για HUVECs και 1,35 (εύρος 1,06 να 2.47 Σχέση τιμής απόδοσης) για τις WI-38 κύτταρα. Οι δείκτες αλληλεπίδραση ελήφθησαν σε IC

25, IC

50, IC

75 και IC

90 επίπεδα και δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από 1 υποδεικνύοντας ότι σε όλους τους συνδυασμούς φαρμάκων τα συνδυασμένα αποτελέσματα ήταν πρόσθετο.

επιδράσεις της γεμσιταβίνης, bevacizumab, sunitinib και EMAP στην απόπτωση Σχετικές Πρωτεΐνες

Εξετάσαμε αν η αναστολή της βιωσιμότητας κυττάρων με γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP θα μπορούσε εν μέρει να σχετίζεται με επαγωγή της απόπτωσης. Αξιολόγηση της PARP-1 διάσπασης και η διάσπαση της κασπάσης-3 ως δείκτες της επαγωγής της απόπτωσης αποκάλυψε ότι σε κύτταρα AsPC-1 γεμσιταβίνη θεραπεία προκάλεσε μια μικρή αύξηση, μπεβασιζουμάμπη και EMAP δεν προκάλεσε αύξηση, αλλά sunitinib θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση. Συνδυασμός γεμσιταβίνης με sunitinib είχαν προσθετικά αποτελέσματα (Σχήμα 1). Στο HUVEC, γεμσιταμπίνη, μπεβασιζουμάμπη και EMAP προκάλεσε μια μικρή αύξηση και sunitinib προκάλεσε έντονη αύξηση της PARP-1 και της κασπάσης-3 διάσπασης. Συνδυασμοί της γεμσιταβίνης με αντί-αγγειογόνο παράγοντες είχαν προσθετικά αποτελέσματα. Σε WI-38 κύτταρα, γεμσιταμπίνη και sunitinib και προκάλεσε μια προφανή αύξηση? ενώ η μπεβασιζουμάμπη και EMAP δεν έδειξε καμία σημαντική επίδραση στην PARP-1 και της κασπάσης-3 διάσπασης. Συνδυασμοί γκεμσιταμπίνης με bevacizumab, sunitinib και EMAP όλοι είχαν αθροιστικά αποτελέσματα όσον αφορά διασπασμένη PARP-1 και της κασπάσης-3 έκφραση της πρωτεΐνης (Εικόνα 1).

επιδράσεις της γεμσιταβίνης, Bevacizumab, sunitinib και EMAP για την τοπική ανάπτυξη του όγκου

η υποδόρια μελέτες ξενομοσχευμάτων ποντικού PDAC έδειξε ότι γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και θεραπεία EMAP ανέστειλε την τοπική ανάπτυξη του όγκου, με μονοθεραπεία με sunitinib έχει την ισχυρότερη επίδραση. Καθαρή αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μετά από μια θεραπεία 2 εβδομάδων με γεμσιταβίνη, bevacizumab και sunitinib και EMAP ήταν 43, 38, 94 και 46 τοις εκατό, αντίστοιχα (Σχήμα 2). Η προσθήκη bevacizumab μόνο παράγοντα, sunitinib και EMAP να γεμσιταμπίνη είχε πρόσθετα αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, όπως Gem + Bev, Gem + Su και Gem + EMAP οδήγησε σε 69, 99 και 64 τοις εκατό αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Συνδυασμοί περισσότερες από μία αντιαγγειογόνο παράγοντα με γεμσιταβίνη ήταν επίσης αποτελεσματικό, αλλά όχι σημαντικά καλύτερα σε αυτό το πείραμα από sunitinib μόνο του (Σχήμα 2, Εικόνα S1). Δεν εμφανή σημεία τοξικότητας που σχετίζονται με τα ναρκωτικά παρατηρήθηκαν σε οποιαδήποτε ομάδα θεραπείας από την άποψη του habitus των ζώων, τα επίπεδα δραστηριότητας και το βάρος (Εικόνα S2).

επιδράσεις της γεμσιταβίνης, Bevacizumab, sunitinib και EMAP για ενδονεοπλασματική πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικά Δραστηριότητα

Ανάλυση του Κί67-θετικών κυττάρων ως δείκτης εντός του όγκου πολλαπλασιαστική δραστηριότητα αποκάλυψε ότι γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και μονοθεραπεία EMAP προκαλείται 34, 28, 82 και 22 τοις εκατό αναστολή της πολλαπλασιαστικής δείκτη. Συνδυασμοί gemcitabine με έναν ή περισσότερους παράγοντες αντιαγγειογόνο ήταν αποτελεσματικές, αλλά δεν ενισχύουν την αναστολή της πολλαπλασιαστικής ενδοογκική δείκτη πέραν επίπεδα επιτυγχάνονται με sunitinib μόνο του (Σχήμα 3).

Αξιολόγηση των ενδοογκική απόπτωσης με TUNEL κηλίδωση κατέδειξε μικρές αυξήσεις στην απόπτωση με γεμσιταμπίνη, μπεβασιζουμάμπη και EMAP, και μια σημαντική αύξηση από το sunitinib και μόνο. Συνδυασμοί bevacizumab και sunitinib ή EMAP με γεμσιταβίνη οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα απόπτωσης σε σύγκριση με μόνο παράγοντες. Αποπτωτικών δεικτών (ΤΟΥΝΕΛ-θετικά κύτταρα /σύνολο κυττάρων ανά HPF) σε ελέγχους, και Gem, Bev, Su, EMAP, Gem + Bev, Gem + Su, ομάδες Gem + EMAP ήταν 0,13 ± 0,03, 0,21 ± 0,06, 0,19 ± 0,03 , 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,01, 0,26 ± 0,03, 0,53 ± 0,01 και 0,25 ± 0,02, αντίστοιχα. Συνδυασμοί περισσότερες από μία αντιαγγειογόνο μέσο με γεμσιταβίνη αυξήθηκε επίσης απόπτωση, αλλά δεν ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική από μόνη της sunitinib (Σχήμα 4).

επιδράσεις της γεμσιταβίνης, Bevacizumab, sunitinib και EMAP για ενδονεοπλασματική μικροαγγειακή πυκνότητα

PECAM-1 χρώση τομών ιστού όγκου για να μελετήσει αγγείωσης του όγκου αποκάλυψε ότι γεμσιταβίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP όλα προκάλεσε σημαντική μείωση στην πυκνότητα μικροαγγείων σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 5). Το sunitinib και μόνο που προκαλείται από το μέγιστο αποτέλεσμα στη μείωση της MVD μεταξύ όλων των παραγόντων, που εξετάσθηκαν. Συνδυασμοί γκεμσιταμπίνης με μπεβασιζουμάμπη και EMAP έδειξαν αθροιστικά αποτελέσματα όσον αφορά τη μείωση μετράει μικροαγγείων σε σύγκριση με το ενιαίο παράγοντες. Όλοι οι συνδυασμοί με sunitinib ήταν πολύ αποτελεσματική, αλλά δεν ξεπερνούν sunitinib και μόνο αποτελέσματα. Όλες οι ομάδες αξιολογήθηκαν για μέση μικροαγγειακή μετράει συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων (25,5 ± 3,5), γεμσιταβίνη (14,2 ± 2,1), bevacizumab (11,8 ± 2,6), το sunitinib (5,0 ± 2,3), EMAP (11,1 ± 2,5), Gem + Bev (7,8 ± 2), Gem + Su (5.6 ± 1.1), Gem + EMAP (7,9 ± 1,7), Bev + Su (2.9 ± 1), Bev + EMAP (8.2 ± 1.5), Su + EMAP (5.2 ± 1.5), Gem + Bev + Su (3.9 ± 1), Gem + Bev + EMAP (5.5 ± 1.5), Gem + Su + EMAP (3.3 ± 0.6), και Gem + Bev + Su + EMAP (2.9 ± 1), αντίστοιχα (Σχήμα 5 ).

επιδράσεις της γεμσιταβίνης, Bevacizumab, sunitinib και EMAP σε ζώων επιβίωση

PDAC μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού σε ποντίκια SCID-NOD οδήγησε σε μέση επιβίωση 19 ημέρες στην ομάδα ελέγχου. Η διάμεση επιβίωση (Φ.Μ.) αυξήθηκαν μέτρια μετά γεμσιταμπίνη (26 ημέρες, p = 0.02), αλλά δεν υπήρχε σημαντικό όφελος επιβίωσης με bevacizumab και μόνο παράγοντα, sunitinib ή EMAP σε σύγκριση με τον έλεγχο. θεραπεία συνδυασμού της γεμσιταβίνης με bevacizumab και μόνο παράγοντα, sunitinib και EMAP όλα τα σημαντικά βελτιωμένη επιβίωση των ζώων σε παρόμοια έκταση, με διάμεση επιβίωση στην ομάδα Gem + Bev από 36 ημέρες (p = 0,003 έναντι του ελέγχου, 0.006 έναντι Gem), μετά Gem + Su 37 ημέρες (p = 0,003 έναντι του ελέγχου, 0,01 vs. Gem) και μετά Gem + EMAP 36 ημέρες (p = 0,002 έναντι του ελέγχου, 0.001 έναντι Gem). Ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με Su + EMAP (Φ.Μ. = 36 ημέρες) δεν ήταν καλύτερη από ό, τι συνδυασμός γεμσιταβίνης με ενιαίο sunitinib πράκτορα ή EMAP. Συνδυασμός γεμσιταβίνης με Bev + EMAP (ms = 43 ημέρες, p = 0,001 έναντι του ελέγχου, 0.005 έναντι Gem) ή με Bev + Su + EMAP (46 ημέρες, p = 0,001 έναντι του ελέγχου, 0,003 έναντι Gem) αποδεικνύεται η μέγιστο όφελος επιβίωσης (Σχήμα 6).

Συζήτηση

Ο καρκίνος του παγκρέατος έχει μια εξαιρετικά κακή πρόγνωση λόγω της διάγνωσης προχωρημένου σταδίου, νωρίς μεταστατική εξάπλωση και υψηλή αντοχή σε ακτινοβολία και χημειοθεραπεία. Αν και η θεραπεία γεμσιταμπίνη μοναδικός παράγοντας έχει παραχθεί κάποια κλινικά οφέλη για μεταστατικό PDAC, το συνολικό όφελος επιβίωσης παραμένει περιορισμένη [1]. Επειδή η αγγειογένεση είναι κρίσιμη για την πρωτογενή και μεταστατικό PDAC εξέλιξη, αντιαγγειογενετικές θεραπεία είναι μια λογική και ακόμα πολλά υποσχόμενη θεραπευτική λεωφόρος λόγω του δυναμικού της για συνεργιστική αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες κατά του όγκου, της χαμηλής τοξικότητας και την ενισχυμένη αντικαρκινική δράση [41], [42]. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης όπως VEGF, αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (FGF), PDGF ή ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF) είναι μεταξύ των πλέον σημαντικών αγγειογενετική ενεργοποιητές σε εξέλιξη PDAC. Bevacizumab, το πρώτο FDA-εγκριθεί αναστολέας αγγειογένεσης έδειξε κάποια υπόσχεση στην αρχική PDAC μελέτες σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, αλλά απέτυχε να επιβεβαιώσει όλες τις σημαντικό όφελος επιβίωσης σε μεταγενέστερες μελέτες [17]. Sunitinib, πολλαπλών στόχων αναστολέας αγγειογένεσης RTKs VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT-3 και RET, είναι μια ενδιαφέρουσα παράγοντας όσον αφορά την πιθανή θεραπεία συνδυασμού της, σε σύγκριση με στενού φάσματος αναστολείς που έχουν μέχρι στιγμής δείξει μάλλον περιορισμένη κλινική δραστηριότητα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 1 .: ο συνδυασμός των παραγόντων αντιαγγειογενετικές με γεμσιταβίνη παράγει γενικά καλύτερα αποτελέσματα από ό, τι η μονοθεραπεία? 2 .: τα αποτελέσματα της μόνη της sunitinib μπορεί να είναι μάλλον έντονη, τουλάχιστον στα μοντέλα δοκιμάζονται? 3 .: πολλαπλούς συνδυασμούς αντιαγγειογόνα μέσα εκτός από γεμσιταβίνη τείνουν να δώσουν τα καλύτερα αποτελέσματα? και 4 .: sunitinib και bevacizumab δεν φαίνεται να έχουν προφανές όφελος συνδυασμό.

την εξέλιξη του όγκου εξαρτάται καθοριστικά από μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφόρων εξαρτημάτων, συμπεριλαμβανομένων καρκινικά κύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ECs, εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και ινοβλάστες του στρώματος. Επεξεργασίας στερεών όγκων με στόχο την ΕΚ και των ινοβλαστών διαμερίσματα μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου έχει δείξει κάποια σημαντικά πλεονεκτήματα [43], [44]. EMAP, ένας όγκος που προέρχεται αντιαγγειογενετική και antiendothelial κυτοκίνης, από την εμπειρία μας παρουσίασαν επιδράσεις κατά του όγκου σε αρκετούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων PDAC [28], [30], [31], [34], [35], [45], [46] . Το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει την ενίσχυση της γεμσιταβίνης απάντησης από συνδυασμό περισσοτέρων του ενός αντιαγγειογόνα μέσα με ένα ολόκληρο φάσμα διαφορετικών μηχανισμών κατά PDAC. Για παράδειγμα, αποδείξαμε πρόσφατα ότι EMAP βελτιώνει γεμσιταβίνης σε συνδυασμό με bevacizumab συνδυασμό αποτελεσμάτων κατά PDAC [34]. Προσθέτοντας ένα πολυ-ΟΑΓ παράγοντας στόχευσης όπως sunitinib εμφανίστηκε ως εκ τούτου λογικό. Γεμσιταμπίνη είχε διαφορική απόκριση ανασταλτική ανάπτυξης σε PDAC κύτταρα in vitro. ευαισθησία γεμσιταμπίνη παρατηρήθηκε με τη σειρά της BxPC-3 & gt? ΜΙΑ PaCa-2 & gt? Panc-1 & gt? AsPC-1, αναφέροντας BxPC-3 ως πιο ευαίσθητη και AsPC-1 ως λιγότερο ευαίσθητα κύτταρα (Σχήμα S3). Ίσως αυτό είναι ένα μάλλον χρήσιμη προσέγγιση που επιτρέπει τον έλεγχο των πρόσθετων μηχανισμών για την in vivo συνδυασμό όφελος σε αντίθεση με PDAC γραμμές που είναι γεμσιταβίνης-ευαίσθητα. Μεταξύ αντιαγγειογενετικές παράγοντες, μπεβασιζουμάμπη και EMAP μόνη της δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στη AsPC-1 πολλαπλασιασμό, ενώ το sunitinib ήταν πολύ αποτελεσματική. Η επίδραση sunitinib ήταν ισχυρότερη από ισομοριακή γεμσιταβίνη, ενώ προσθήκη δύο ή περισσότερων αντιαγγειογόνο παράγοντες δεν ήταν περισσότερο ανασταλτικά από μόνη της sunitinib. Όπως αναμενόταν, οι τρεις παράγοντες αντιαγγειογένεσης ανέστειλε σημαντικά ΕΚ και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών in vitro, με sunitinib πάλι μόνη είναι η πιο αποτελεσματική. Στις μελέτες μας, αφού sunitinib είχε μέγιστη in vitro δραστικότητα έναντι κυττάρων όγκου, ECs και ινοβλάστες, υποστηρίζει την υπόθεση ότι ίη νίνο αντικαρκινική δραστηριότητα του sunitinib μπορεί να εξαρτάται εν μέρει κατά την πρόσκρουση του σε καρκινικά κύτταρα, καθώς και αγγειακό σύστημα του όγκου και στρωματικά συστατικά, όπως προηγουμένως αναφερθεί [20],. Μέντελ et al. [20] έδειξε ότι το sunitinib IC

50 για VEGF- και PGDF που προκαλείται από HUVECs ήταν σε μια σειρά nanomolar. Ένα συγκριτικά αδύναμη δραστηριότητα του sunitinib παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη? υποθέτουμε ότι αυτό οφείλεται στη χρήση του μέσου πλήρους ανάπτυξης για HUVECs, η οποία θα μπορούσε να καταστήσει τα κύτταρα πιο ανθεκτικά στην ανασταλτικές επιδράσεις της κινάσης της τυροσίνης. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα οφέλη μπορούν να προέρχονται από συνδυασμούς πολλαπλών παράγοντες στόχευσης έναντι παραγόντων με περιορισμένη στόχων από μόνη της, ή επιπροσθέτως σε αυτά. Η γεμσιταβίνη και sunitinib έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα όγκου όπως επίσης και ενδοθηλιακά κύτταρα [49], [50], [51], [52], ενώ μπεβασιζουμάμπη και EMAP έχουν κυρίως προαποπτωτική δραστικότητα προς τα ενδοθηλιακά κύτταρα [28], [53 ]. Στην παρούσα μελέτη, η αξιολόγηση της επαγωγής στην απόπτωση με γεμσιταβίνη και αντιαγγειογόνο παράγοντες, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό, συσχετίστηκε με τα αποτελέσματα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που δείχνει ότι η απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων από αυτούς τους παράγοντες μπορεί εν μέρει να οφείλεται στην επαγωγή στην απόπτωση.

In vivo μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού απέδειξαν ότι η γεμσιταμπίνη, bevacizumab, sunitinib και EMAP ανέστειλε την τοπική ανάπτυξη του όγκου ως μονοθεραπεία. Αντικαρκινικά αποτελέσματα του bevacizumab και EMAP είναι πιο πιθανό να οφείλεται στην επίδρασή τους στην ΕΣΕ και ινοβλάστες, αντί καρκινικά κύτταρα, και ως εκ τούτου, η επίδραση αυτών των παραγόντων ως μονοθεραπεία ήταν περιορισμένη.