Αφηρημένο

μη θερμικού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης (NTAPP) είναι ένα ιονισμένο αέριο στο δωμάτιο θερμοκρασία και έχει δυνατότητες ως μια νέα θεραπεία του καρκίνου απόπτωση προάγουν που δρα μέσω της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Ωστόσο, είναι επιτακτική ανάγκη να καθοριστεί η επιλεκτικότητα του και την τυποποίηση των εξαρτημάτων και τη σύνθεση των NTAPP. Εδώ, σχεδιάσαμε μία συσκευή NTAPP ροών σε συνδυασμό με ένα σύστημα τροφοδοσίας αερίου Αυτός και επέδειξε υψηλή επιλεκτικότητα της προς p53-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα. Πρώτα καθορίζονται οι κατάλληλες συνθήκες για την έκθεση NTAPP να προκαλέσει επιλεκτικά απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Το αποπτωτικό αποτέλεσμα NTAPP ήταν μεγαλύτερη για ρ53 μεταλλαγμένη καρκινικά κύτταρα? τεχνητή έκφραση ρ53 σε κύτταρα ΗΤ29 p53-αρνητικά μείωσε την προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα NTAPP. Εξετάσαμε επίσης εξω- και ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε NTAPP-επεξεργασμένα κύτταρα για να συναγάγει το μηχανισμό δράσης NTAPP. Ενώ NTAPP μεσολάβηση αυξήσεις στην εξωκυτταρική μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η ενδοκυτταρική ROS αυξημένη έκθεση υπό NTAPP και επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αυτό το αποτέλεσμα εξαρτώμενο από τη δόση μειώνεται μετά από θεραπεία με ROS καθαριστές. NTAPP επαγόμενη απόπτωση, ακόμη και σε δοξορουβικίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου, καταδεικνύοντας την εφικτότητα της NTAPP ως ισχυρό θεραπεία του καρκίνου. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά τις δυνατότητες του NTAPP ως επιλεκτική αντικαρκινική θεραπεία, ειδικά για ρ53-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Ma Υ, Ha CS, Hwang ΝΔ, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et al. (2014) Μη-Thermal Ατμοσφαιρική πίεση Plasma Προκαλεί Κατά προτίμηση απόπτωση σε κύτταρα p53-Μεταλλαγμένα του καρκίνου ενεργοποιώντας ROS Stress-Response Pathways. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10.1371 /journal.pone.0091947

Επιμέλεια: Subrata Roy, το Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25η Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 18 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 23, Απρ, 2014

Copyright: © 2014 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από KRICT (SI-1304) και το Υπουργείο Οικονομίας της Γνώσης, Κορέα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η απόπτωση είναι ένας γνωστός μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που απομακρύνει τα κατεστραμμένα και ανεπιθύμητα κύτταρα? χρησιμεύει ως ένα ζωτικής σημασίας μηχανισμό για την υπεράσπιση των ιστών και οργάνων από διάφορα είδη των τάσεων και τις κυτταρικές αλλοιώσεις [1]. Επιλεκτική επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα θεωρείται ιδανική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου, και έχουν πολλές αντικαρκινικούς παράγοντες με αυτόν τον μηχανισμό έχουν αναπτυχθεί. Ωστόσο, οι τρέχουσες προσεγγίσεις εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν σημαντικές προκλήσεις για να ξεπεραστούν, συμπεριλαμβανομένης της αντοχής των ναρκωτικών, χαμηλή θεραπευτική αποτελεσματικότητα, και καρκινικών κυττάρων επιλεκτικότητα.

Η ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας στα θηλαστικά. Όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε διάφορες γονοτοξικές και κυτταρική καταπονήσεις, όπως το οξειδωτικό στρες, υποξία, ακτινοβολία, ή χημειοθεραπευτικά φάρμακα, ρ53 ενεργοποιείται, και ουβικιτίνη-εξαρτώμενη αποδόμηση του εμποδίζεται, οδηγώντας σε μια συσσώρευση δραστικού παράγοντα μεταγραφής ρ53 [1]. Η ενεργοποιημένη ρ53 ρυθμίζει διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την ενεργοποίηση των αντι-οξειδωτικών και επιδιόρθωση του DNA, και η απόπτωση επηρεάζοντας την έκφραση των γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένης της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDK) αναστολέα

p21 /WAF1

και γονίδια που εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο, όπως

ΒΑΧ

,

PUMA

,

NOXA

, και

Fas

[2], [3]. Όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες, p53 ενεργοποιεί επίσης τη μεταγραφή του sestrin, υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX), και αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ), παίζοντας έτσι έναν κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας οξειδοαναγωγής και γονιδιωματική σταθερότητα κάτω από οξειδωτικό στρες [4], [5 ]. Μετάλλαξη του γονιδίου ρ53 ή διάσπαση των οδών που οδηγούν στην ενεργοποίηση της ρ53 έχουν συχνά παρατηρηθεί στους περισσότερους τύπους ανθρώπινου καρκίνου [6].

Η ρ53-εξαρτώμενη επαγωγή της απόπτωσης σε απόκριση προς γενοτοξικό ζημιά είναι μια σημαντική πτυχή της καταστολής των όγκων. Έτσι, η απώλεια της ρ53 σε ανθρώπινους καρκίνους συνεισφέρει στην επιθετική συμπεριφορά του όγκου και συχνά προωθεί την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία και χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Για παράδειγμα, η επεξεργασία της ρ53 θυμοκυττάρων

+ /+ ποντικό με τα αποτελέσματα ακτινοβολία στην απόπτωση, ενώ ρ53

– /- είναι ανθεκτικές θυμοκυττάρων. Ομοίως, ρ53

+ /+ ποντικό εμβρυϊκών ινοβλαστών μεταμορφωθεί από πρωτεΐνη αδενοϊού Ε1Α και Ha-ras ογκογονίδιο υφίστανται απόπτωση σε απόκριση σε γ-ακτινοβολία ή χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, αλλά ρ53

– /- ινοβλάστες είναι ανθεκτικές σε δύο θεραπείες [7 ]. Επιπλέον, ορισμένες μεταλλάξεις ρ53 σε καρκίνους καταστείλουν την λειτουργία του ρ73, η οποία επάγει την απόπτωση μέσω p53-ανεξάρτητο μηχανισμό [8]. Έτσι, η κοινή απώλεια της λειτουργίας ρ53 σε καρκινικά κύτταρα παρουσιάζει ένα σημαντικό περιορισμό για αντικαρκινικών θεραπειών.

Plasma περιγράφεται ως οιονεί ουδέτερο μίγμα φορτισμένων σωματιδίων και ρίζες σε ένα μερικώς ιονισμένο αέριο. Πρόσφατα, πολλές μελέτες έχουν προσπαθήσει να επωφεληθούν από τη χαμηλή θερμοκρασία του πλάσματος μη θερμικών ατμοσφαιρική πίεση (NTAPPs) για βιοϊατρικές εφαρμογές από την δυνάμει της δυνατότητας ελέγχου της χημείας και της κινητικής του πλάσματος [9] – [11]. Υπάρχουν διάφοροι τύποι NTAPPs, όπως βελόνα πλάσματος, πίδακες πλάσματος, και διηλεκτρική απορρίψεις φραγμού (DBDs) [11]. Το συστατικό του φυσικού αερίου και η διάρκεια παλμού αντοχή και του ηλεκτρικού πεδίου καθορίζουν τις ακριβείς συνθέσεις πλάσματος. Η μελέτη των NTAPPs για κλινικές εφαρμογές έχει γίνει πρόσφατα ένα πολύ δραστήριο ερευνητικό θέμα? NTAPPs εύκολα δημιουργούνται στον αέρα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί χωρίς να προκαλέσει θερμική βλάβη στα κύτταρα. Οι επιδράσεις της NTAPPs επί ζώντων ιστών περιλαμβάνουν την αποστείρωση, την επούλωση των πληγών, και οι αλλαγές κυτταρική μετανάστευση (για επισκοπήσεις [10], [12]). Η ποικιλία των διαφορετικών επιδράσεων πλάσματος εξαρτάται από την δοσολογία του πλάσματος και πολύπλοκες χημικές συνθέσεις τους.

Προηγούμενες μελέτες σχετικά με την κλινική εφαρμογή των NTAPP για κύτταρα θηλαστικών έχουν επικεντρωθεί κυρίως στην επίδραση της επί του κυτταρικού θανάτου [13], [14] . Αρκετοί δυνατοί μηχανισμοί που σχετίζονται με την NTAPP μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο αναφέρθηκαν, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης της κυτταρικής προσκόλλησης [15], [16]. Συγκεκριμένα, διάφορες ερευνητικές ομάδες απέδειξαν ότι NTAPP διεγείρει απόπτωση σε μερικά καρκινικά κύτταρα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θεραπεία του καρκίνου [17], [18]. Υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που δείχνουν ότι τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι οι κύριοι παίκτες της NTAPP απόπτωση

in vitro

[19] – [22].

ROS είναι χημικά αντιδραστική ρίζες, τα ιόντα, ή μόρια που περιέχουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και ένα παραπροϊόν φυσιολογικό μεταβολισμό. Τα βασικά επίπεδα των ROS ενεργοποιούν πολλές καταρράκτες σηματοδότησης για την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κάτω από κανονικές φυσιολογικές συνθήκες [23] – [25]. Ωστόσο, η υπερβολική επίπεδα ROS επάγουν το οξειδωτικό στρες και επιτίθενται άμεσα DNA, πρωτεΐνες, λιπίδια, και άλλα κυτταρικά συστατικά, τελικά συμβάλλει στην κυτταρική γήρανση και την απόπτωση [26], [27].

Το πρώτο βήμα για την ανάπτυξη NTAPP ως μια πιθανή θεραπεία του καρκίνου είναι να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα επιλεκτικής της προς τα καρκινικά κύτταρα. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι NTAPP προκαλεί απόπτωση σε ρ53-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε πρωτεύοντα ή βλαστοκύτταρα. Δείχνουμε επίσης ότι NTAPP μεσολάβηση αυξήσεις στο ενδοκυτταρικό ROS επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Για την περαιτέρω αξιολόγηση της σκοπιμότητας των NTAPP για τη θεραπεία του καρκίνου, ελέγξαμε NTAPP στη δοξορουβικίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα και διαπίστωσαν ότι ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά το δυναμικό των NTAPP ως επιλεκτικό αντικαρκινική θεραπεία, ειδικά για ρ53 μεταλλαγμένη καρκίνους και κύτταρα τα οποία είναι ανθεκτικά στα υπάρχοντα αντικαρκινικά φάρμακα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και NTAPP θεραπεία

τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και οι πηγές τους συνοψίζονται στον πίνακα 1. HeLa και κύτταρα Hep G2 αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου ( FBS) και 10 mL /L πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. G361, HCT116, HCT116 ρ53

– /-, HCT15, MES-SA, Η1299, ΗΤ29, DLD-1, LoVo, δοξορουβικίνη ανθεκτικά HCT15 /CL02 και MES-SA κύτταρα /DX5 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και 10 mL /L πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. IMR90 και RKO κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Ελάχιστο Ουσιώδες Μέσο (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και 10 mL /L πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. YD-9 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM:DMEM /F12 (1:01) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και 10 mL /L πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Υποδόριο λιπώδη ιστό λήφθηκε κατά τη διάρκεια αιρετό χειρουργικές επεμβάσεις με τη συγκατάθεση των ασθενών, όπως εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο της Samsung Νοσοκομείο Institutional Review (IRB αρ. KBC11151). Ο λιπώδης ιστού βλαστικά κύτταρα (ASCs) απομονώθηκαν από τον ιστό [28] και αναπτύχθηκαν σε DMEM /Ham F-12 (DMEM /F12) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και 10 mL /L πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Η

Προκειμένου να εκθέσουν κύτταρα να NTAPP, 1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε 35 -mm καλλιεργημένα πλάκες και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν για την ενδεικνυόμενη δόση (5 πρότυπο L /min [SLM], 5 V) της NTAPP για 30 s σε 1 λεπτό κάθε φορά κάθε ώρα για ένα μέγιστο 10 φορές. Όταν είναι απαραίτητο, οι NTAPP εκτεθειμένα κύτταρα περαιτέρω επωάστηκαν για 15 ώρες πριν από άλλα πειράματα.

Western ανάλυση κηλίδος

NTAPP εκτεθειμένα τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν όπως περιγράφεται [29]. Οι ιστόνες εκχυλίστηκαν με 0,6 Ν HCI. Δείγματα της ολικής πρωτεΐνης (50 μg) ή ιστόνες αναλύθηκαν με αντι-κασπάση-3 (Cell Signaling Technology), αντι-πολυ ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP, Cell Signaling Technology), αντι-ακτίνης (Sigma-Aldrich) ορούς, και αντι -φωσφο-H2AX (γ-H2AX) ορούς (Millipore), φωσφο-ρ53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) και Bax (Santa Cruz Biotechnology). Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού (Jackson Immuno Research) δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν, και οι επεξεργασμένες μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ECL (Amersham Biosciences).

ανίχνευση Ενδοκυτταρική ROS

κύτταρα HeLa (1 × 10

5) σπάρθηκαν σε 35-mm δίσκο με γυάλινες καλυπτρίδες και επαναληπτικά εκτέθηκαν σε 5 V NTAPP για 30 s, κάθε h για ένα σύνολο επτά φορές πριν ενδοκυτταρικά αξιολογήθηκαν επίπεδα ROS χρησιμοποιώντας ένα ROS κιτ ανίχνευσης (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μη φθορισμού καρβοξυ-H

2DCFDA μπορεί εύκολα διαπερατά σε ζωντανά κύτταρα και οξειδώνεται με την ενδοκυτταρική ROS να εκπέμπει ένα φωτεινό πράσινο σήμα φθορισμού. Τριτ-βουτυλ υδροϋπεροξείδιο (ΤΒΗΡ), το οποίο είναι γνωστό ότι επάγει ενδοκυτταρική ROS, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) και πυροσταφυλικό νάτριο (SP) χρησιμοποιήθηκαν ως ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά καθαριστές ROS, αντίστοιχα.

Εξωκυτταρική νιτρώδες

ανίχνευση

Η παραγωγή εξωκυτταρικών νιτρικού οξειδίου (ΝΟ) μετά από έκθεση να NTAPP προσδιορίστηκε με μέτρηση της συσσώρευσης των νιτρωδών, ο σταθερός μεταβολίτης του ΝΟ, που εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας. Αφού τα κύτταρα είχαν εκτεθεί σε NTAPP, ελήφθη 50 μΐ μέσου καλλιέργειας, αναμιγνύεται με ίσο όγκο αντιδραστηρίου Griess του (1% σουλφανιλαμίδιο, 0.1% διυδροχλωρική ναφθυλαιθυλενοδιαμίνη, και 2% φωσφορικό οξύ), και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm με έναν αναγνώστη μικροπλακών (SoftMax Pro 4.0, Molecular Devices) με χρησιμοποίηση μιας καμπύλης βαθμονόμησης με ένα εύρος 0-100 μΜ συγκεντρώσεις νανο

2. Στο πείραμα ΝΟ καθαριστή, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 30, 50, ή 100 μΜ συγκεντρώσεις των καρβοξυ-ΡΤΙΟ (Sigma-Aldrich) που αντιδρά στοιχειομετρικά με ΝΟ πριν εκτέθηκαν σε NTAPP.

Η επιμόλυνση του pcDNA-p53 -HA

Προσθέσαμε 2 μg του πλασμιδίου pcDNA-p53-ΗΑ (ευγενώς από τον Dr. J. Song, Πανεπιστήμιο Yonsei, Σεούλ, Κορέα) σε 6 μl γραμμική L-ΡΕΙ (πολυαιθυλενοϊμίνη), αναμιγνύεται με 150 mM NaCl, και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Το μείγμα εφαρμόστηκε σε κύτταρα ΗΤ29 πριν από ολονύκτια επώαση.

Η κυτταρομετρία ροής

Μετά από 10 επαναλαμβανόμενης έκθεσης των 5 V NTAPP ακολουθήθηκε από 15 ώρες επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και σταθεροποιήθηκαν με 70 % ψυχρά αιθανόλη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml ΚΝάση επί 30 λεπτά σε 37 ° C και επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό σύνδεσης (10 mM Hepes ρΗ 7,4, 140 mM NaCl, 2.5 mM ΟαΟ

2). Τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.01 mg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich), ή διπλής χρωματίστηκαν με 5 μΙ FITC Annexin V (BD Biosciences) και 5 μΐ 7ΑΑΌ (eBioscience) ανά εκατομμύριο κύτταρα για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων σε κατάσταση. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με FACScalibur (BD Biosciences) και CellQuest λογισμικού.

Παγκόσμια μοντέλο ανάλυσης του πλάσματος χημείας

Επειδή είναι δύσκολο να μετρηθεί πειραματικά κάθε είδος που υπάρχει στο NTAPP, μηχανικοί πλάσμα αναπτυχθεί παγκόσμιο μοντέλο [30], [31] που υπολογίζει κατά μέσο όρο χωρικά χημικά είδη, καθώς φορτισμένα σωματίδια, σύμφωνα με μια δεδομένη κατάσταση οδήγησης των εξωτερικών κυκλωμάτων χρησιμοποιώντας εξαρτώμενη από το χρόνο εξισώσεις συνέχειας για κάθε είδος. Ο τομέας προσομοίωση χωρίζεται σε δύο περιοχές: την περιοχή πηγής πλάσματος και της περιοχής ουδέτερου αερίου χωρίς πλάσμα. Οι τελευταίες επαφές περιοχή το πιάτο που περιέχει τα κύτταρα. Οι θεωρούνται οι χημικές αντιδράσεις είναι το ίδιο με εκείνο στον πίνακα 2 με Sakiyama

et al.

[31], εκτός από την προσθήκη του ηλίου (He) είδη, τα οποία χρησιμοποιούνται ως το αέριο ρυθμιστικό της συσκευής NTAPP χρησιμοποιείται για αυτό το πείραμα. Ο συνολικός αριθμός των ειδών είναι 68, και ο συνολικός αριθμός των αντιδράσεων είναι 826.

Το παγκόσμιο μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη λυθεί εξισώσεις συνέχειας για τα είδη βαρέων σωματιδίων και μια εξίσωση του ενεργειακού ισοζυγίου για τα είδη των ηλεκτρονίων. Λόγω της οιονεί ουδετερότητα του πλάσματος, η πυκνότητα ηλεκτρονίων μπορεί να υπολογιστεί από το άθροισμα όλων των θετικών πυκνότητα ειδών και την αφαίρεση όλων των αρνητικών πυκνότητα ειδών. Οι εξισώσεις αυτές επιλύονται αριθμητικά με κωδικό in-house χρησιμοποιώντας ένα τέταρτης τάξης μέθοδο Runge-Kutta.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Εφαρμόσαμε

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ να αξιολογηθεί στατιστικά σημαντικές διαφορές.

σ

& lt? 0,05 (*) και

σ

& lt?. 0.01 (**) υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τον έλεγχο

Αποτελέσματα

Ιδιότητες του σχεδιασμένη συσκευή NTAPP

Έχουμε σχεδιάσει μια συσκευή που παράγει NTAPP να εκθέσει σε ζωντανά κύτταρα. Αυτή η συσκευή NTAPP σχεδιάστηκε για να έχει το ηλεκτρικό πεδίο κάθετο προς την κατεύθυνση της ροής του αερίου, ώστε να μειωθεί η ποσότητα των φορτισμένων σωματιδίων μέσα στον πίδακα. Έτσι, η παραγόμενη ROS διαχυθεί ευρέως, αλλά φορτισμένα σωματίδια περιορίζεται εντός της περιοχής παραγωγής πλάσματος. Η μικρή αναλογία διαστάσεων της περιοχής πίδακα προς τον όγκο του πλάσματος έχει επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη ποσότητα UV φωτόνια από τη συσκευή. Επιπλέον, η μεγάλη απόσταση από τη συσκευή στα κύτταρα και τα μέσα καλλιέργειας να μειώσει τις επιπτώσεις των φωτονίων υπεριώδους που απορροφώνται από τα αέρια και υγρά φόντο πολύ καλά. Ως εκ τούτου, αναμένουμε ότι αυτή η συσκευή παρέχει κυρίως ROS από το πλάσμα, σε σύγκριση με την άμεση πίδακες πλάσματος που παραδίδουν τα φορτισμένα σωματίδια άμεσα με τους στόχους. Το Σχήμα 1 δείχνει μια σχηματική εικόνα της γεννήτριας πλάσματος που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα. Η συσκευή είναι ένας εκκένωσης δακτυλιοειδής τύπος διηλεκτρικού φραγμού (DBD) [32] που ορίζεται για την παραγωγή NTAPP υπό αέρα ή άλλα αέρια όταν υψηλής τάσης μορφές ημιτονοειδές κύμα ή παλμών βραχείας διάρκειας εφαρμόζεται μεταξύ δύο ηλεκτροδίων, τουλάχιστον ένα από τα οποία είναι μονωμένο. Ο μονωτής προλαμβάνει ρεύμα συσσώρευση μεταξύ των ηλεκτροδίων, δημιουργώντας ηλεκτρικά ασφαλής πλάσμα χωρίς ουσιαστική θέρμανση αερίου.

(Α) Σχηματική περιγραφή της διατάξεως NTAPP ροών χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ζωντανών κυττάρων. Το διηλεκτρικό υλικό που χρησιμοποιείται είναι Teflon (polytetrafluoroethyle), και το ηλεκτρόδιο είναι κατασκευασμένο από χαλκό. (Β) NTAPP παράγεται από τη συσκευή. Η πυκνότητα πλάσματος είναι της τάξης των 10

12 /cm

3, και η συνολική ισχύς που καταναλώνεται στο πλάσμα είναι 1.11 W για μια κορυφή σε κορυφή τάσης 7 kV με μια είσοδο DC τάση 5 V. Η οι ποσότητες υπολογίζονται ειδών ROS φαίνεται στο Σχήμα S1.

η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η συσκευή συνδυάζεται με ένα σύστημα Πέρασε αέριο-τροφοδότησης, έναν προμηθευτή εναλλασσόμενου ρεύματος, και η συσκευή DBD που καλύπτεται με πλαστικό περιπτώσεις για τη μείωση των ROS διάχυσης. Αυτός αέριο ρέει μέσα στην είσοδο της συσκευής σε ποσοστό 1 έως 5 στάνταρντ λίτρα ανά λεπτό (SLM), η οποία ελέγχεται από έναν ελεγκτή ροής μάζας (MKP, MPR-2000). εναλλασσόμενη τάση εφαρμόζεται στο εσωτερικό ηλεκτρόδιο της συσκευής DBD σε συχνότητα 11,4 kHz και ένα εφαρμοσμένο κορυφή σε κορυφή τάσης από 7 έως 20 kV, η οποία παράγεται χρησιμοποιώντας ένα κύκλωμα μετασχηματιστή που αποτελείται από διόδων ανόρθωσης και τρανζίστορ διπολικής ισχύος (Ramsey Electronics, PG13 κιτ γεννήτρια πλάσματος). Η τάση εισόδου DC κυμαίνεται από 5 έως 12 V, το οποίο έχει οριστεί ως παράμετρος ελέγχου για να αλλάξει την τάση που εφαρμόζεται στη συσκευή DBD. Για παράδειγμα, οι τάσεις εισόδου 5, 6, και 12 V αντιστοιχούν σε κορυφή σε κορυφή τάσεις εξόδου των 7,5, 8,9, και 18,8 kV, αντιστοίχως. Η συνολική ισχύς που καταναλώνεται στο πλάσμα είναι 14,11 W για την κορυφή σε κορυφή τάσης 7 kV με είσοδο τάσης DC 5 V, που είναι η προϋπόθεση για το μεγαλύτερο μέρος της πειραματικής μέτρησης.

Οι πληροφορίες σχετικά με το πλάσμα συστατικά και η σύνθεση είναι απαραίτητη για την επαναληψιμότητα και μηχανισμός δράσης NTAPP. Ωστόσο, είναι δύσκολο να μετρηθεί κάθε στοιχείο που παράγεται από τη συσκευή πλάσματος, ειδικά σε ατμοσφαιρική πίεση, επειδή πολλοί ROS δεν εκπέμπουν φως που μπορεί να ανιχνευθεί σε φασματοσκοπία οπτικής εκπομπής, και φασματοσκοπία μάζας είναι επίσης δύσκολο να χρησιμοποιηθούν σε αυτή την πίεση. Παγκόσμια μοντελοποίηση χρησιμοποιείται γενικά για την ανάλυση των NTAPP κινητικής αντίδρασης και τη χημεία πλάσματος υπό τις δεδομένες συνθήκες λειτουργίας [30], [31]. Ως εκ τούτου, προκειμένου να αναλυθούν τα συστατικά και τη σύνθεση της συσκευής μας NTAPP, χρησιμοποιήσαμε παγκόσμια μοντελοποίηση, η οποία είναι πολύ παρόμοια με εκείνη του Sakiyama et al. [31], εκτός από την προσθήκη του He-σχετίζονται αντιδράσεις. Τα αποτελέσματα της παγκόσμιας μοντελοποίηση με τη διακύμανση του He γραμμομοριακό κλάσμα, καθώς και την υγρασία, σε σταθερή ισχύ εισόδου 80 W παρουσιάζονται στο Σχήμα S1.

Για ξηρό αέρα με υγρασία μηδέν, οι αντιδράσεις που σχετίζονται με το νερό αποκλείονται, και έτσι ο συνολικός αριθμός των ειδών και τους συνολικούς αριθμούς των αντιδράσεων μειώνονται σε 43 και 454, αντίστοιχα. Όπως Sakiyama et al. [31] έδειξε δύο διαφορετικές περιοχές της προσομοίωσης για το στρώμα απαλλαγής και τον τομέα ουδέτερο αέριο, οι τομείς προσομοίωση της περιοχής εκκένωσης και της περιοχής ουδέτερου αερίου εξετάζεται χωριστά. Σχήμα S1A και S1B είναι τα αποτελέσματα της περιοχής εκκένωσης, και το Σχήμα S1c και S1D είναι για την ουδέτερη περιοχή αέριο σε επαφή τα πιάτα. Το Σχήμα S1A δείχνει την πυκνότητα ROS εσωτερικό της συσκευής πλάσματος των διαφόρων κλασμάτων αερίου Αυτός που μπορεί να ελεγχθεί με την αλλαγή του ρυθμού ροής του αερίου. Επειδή οι ενέργειες κατωφλίου για αλληλεπιδράσεις με ROS είναι χαμηλότερα από εκείνα με He, οι πυκνότητες ROS καθορίζεται κυρίως από την ποσότητα του αέρα, και τα πιο κυρίαρχα είδη στο εσωτερικό της περιοχής εκφόρτισης είναι ατομικό οξυγόνο λόγω της διαδικασίας διαχωρισμού πρόσκρουσης ηλεκτρονίων από O

2 και O

3 [30]. Τα πιο άφθονα είδη είναι άτομα οξυγόνου, το μονοξείδιο του αζώτου, και το όζον όταν το μικτό κλάσμα αέρα είναι μεγαλύτερη από 1%. Το Σχήμα S1B δείχνει την επίδραση της υγρασίας στην πυκνότητα ROS για το μίγμα 99% Ο και 1% αέρα. Η εξέταση γραμμομοριακό κλάσμα του υδρατμού είναι 1%, που αντιστοιχεί σε 30% σχετική υγρασία σε θερμοκρασία δωματίου. Η αλλαγή στην πυκνότητα ROS δεν είναι σημαντική με τη συμπερίληψη της επίδρασης της υγρασίας εκτός από την επιπλέον ύπαρξη ΟΗ, Η, Η

2O

2, HNO

2, HNO

3, ΗΟ

2, και H

2. Η ROS που δημιουργούνται στη συσκευή πλάσματος διαχέονται έξω στον αέρα, και σχεδιάστηκαν στην Εικόνα S1c μετά το χρόνο διάχυση του 0,1 ms, που εκτιμήθηκε ως ο χρόνος άφιξης του είδους από το ακροφύσιο πλάσματος στο πιάτο. Μετά τη διαδικασία διάχυσης της ROS σε όλο τον αέρα, το πιο κυρίαρχο είδος είναι το όζον, αντί του ατομικού οξυγόνου, και προσαρμόζεται εύκολα σε O

2 για να δημιουργήσει O

3. Τέλος, το Σχήμα S1D δείχνει το mole αριθμό των ROS που φθάνουν στο πιάτο ανά μονάδα επιφάνειας και μονάδα χρόνου. Ο συνολικός αριθμός mole μπορεί να εκτιμηθεί από τον πολλαπλασιασμό του εμβαδού επιφανείας του πιάτου και το συνολικό ποσό του χρόνου αλληλεπίδρασης. Για παράδειγμα, με μια διάμετρο πιάτο 3,5 cm και με χρόνους λειτουργίας των 30 δευτερολέπτων, ο συνολικός συντελεστής πολλαπλασιασμού είναι 289. Ως εκ τούτου, ο μέγιστος αριθμός mole του όζοντος παραδίδεται στο μέσο είναι περίπου 30 mmol. Η μεταφορά των ROS εντός των υγρών μέσων δεν είναι καλά κατανοητός και είναι πολύ δύσκολο να υπολογιστεί, αλλά υπάρχουν κάποιες αναφορές για τους ρυθμούς αντίδρασης των ενυδατωμένα ηλεκτρόνια και ρίζες υδροξυλίου, καθώς και για πρωτονίων μεταφορές hopping σε υδατικό διάλυμα [31]. Αν υποθέσουμε ότι το 10-30% των αέριων ROS παραδίδονται σε υγρό περιβάλλον, ο συνολικός αριθμός mole εντός των υγρών κυμαίνεται από 3-9 mmol.

επιδράσεις Διαφορικές NTAPP σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων κυττάρων

για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών έκθεσης του NTAPP να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, η αρχική πείραμα αξιολόγησε τα αποτελέσματα διαφορετικών εντάσεων NTAPP στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Κατά την πρώτη, εφαρμόσαμε NTAPP με μια σειρά από τάσης εισόδου (5-10 V) μία φορά την κυτταρική σειρά καρκίνου HepG2, η φυσιολογική εμβρυϊκή πνεύμονα κυτταρική σειρά ινοβλαστών WI38, και ASCs για 1 λεπτό, στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες πριν από την έχουμε ποσοτικά βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Η δοκιμασία ΜΤΤ είναι για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων που αντανακλά τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων που υπάρχουν. Η αυξημένη βιωσιμότητα υποδηλώνει ότι τα επεξεργασμένα κύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχύτερα από τα κύτταρα ελέγχου. Μειωμένη βιωσιμότητα σημαίνει ότι τα επεξεργασμένα κύτταρα πολλαπλασιάζονται πιο αργή από τον έλεγχο ή κάποια των κατεργασμένων κυττάρων υφίστανται κυτταρικό θάνατο. Σε αυτό το πείραμα, η απόσταση (3 cm) μεταξύ της συσκευής NTAPP και τα κύτταρα και η ροή του αερίου (5 SLM) σταθεροποιήθηκαν.

Όπως φαίνεται στο σχήμα S2, ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην βιωσιμότητα μεταξύ θεραπεία και μη επεξεργασμένα κύτταρα HepG2, οι αριθμοί των WI38 νΑ13-και τα κύτταρα ASC ελαφρώς πιο αυξημένη από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκθεση μπορεί να προκαλέσει NTAPP διαφορετικές φυσιολογικές αποκρίσεις σε μη-καρκινικά και καρκινικά κύτταρα. Διαπιστώσαμε επίσης ότι οι αλλαγές στην βιωσιμότητα των κυττάρων οφείλεται στην έκθεση NTAPP και όχι από το αέριο Αυτός χρησιμοποιείται για την παραγωγή NTAPP (Σχήμα S3).

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να συναγάγει τις κατάλληλες συνθήκες NTAPP να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Όταν τα κύτταρα HeLa εξετέθησαν σε 5 V NTAPP για 30 s, κάθε h για μέγιστη 9 ώρες (10 επαναλαμβανόμενης έκθεσης NTAPP), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, το σχετικό ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων ήταν ελαφρά μικρότερη αυξήθηκε σε εκτεθειμένα κύτταρα (134%) σε σύγκριση να μη εκτεθέντα κύτταρα ελέγχου (145%). Επιπλέον, η διαφορά στις σχετικές βιώσιμων κυττάρων μεταξύ NTAPP επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα HeLa έγινε πιο έντονη όταν τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 15 ώρες μετά από 10 ανοίγματα NTAPP: το σχετικό ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων ήταν μόνο 106% σε κύτταρα που εκτίθενται σε 10 επαναληπτικών NTAPP με 15 ώρες περαιτέρω επώαση, σε σύγκριση με 200% το δείγμα αναφοράς άνευ αγωγής (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν εφαρμόσαμε τις ίδιες συνθήκες NTAPP σε πρωτογενή ινοβλαστών IMR90 κύτταρα και ASCs, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων επαυξημένης σε NTAPP-εκτεθειμένων κυττάρων σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχήμα 2C και Ε). Τα σχετικά ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων σε ASC και IMR90 κύτταρα που εκτέθηκαν σε NTAPP 10 φορές και περαιτέρω επωάστηκαν για 15 ώρες ήταν 178% και 168%, αντίστοιχα, ενώ εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων ήταν περίπου 150% (Σχήμα 2C και Ε). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έντονα ότι θα χρησιμοποιηθούν οι σωστές συνθήκες έκθεσης NTAPP (επαναλαμβανόμενη έκθεση των 5 V εισόδου NTAPP με περαιτέρω επώαση) να αναστέλλει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa και ενεργοποιεί τον πολλαπλασιασμό σε IMR90 κύτταρα και ASCs.

(Α-ΣΤ) (Α, Β) HeLa, (C, D) λιπώδη ιστό προερχόμενα αρχέγονα κύτταρα (ASCs), και (Ε, F) IMR90 κύτταρα εκτέθηκαν με 5 V εισόδου NTAPP για 30 s ανά ώρα επί 10 φορές, και η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν αξιολογείται σε κάθε υποδεικνύεται συχνότητα έκθεσης. Ο χρόνος επώασης υποδηλώνει το χρόνο μετά την αρχική έκθεση σε NTAPP. Το δείγμα επώασης 24-h παρασκευάστηκε με 10 επαναλαμβανόμενης έκθεσης NTAPP ακολουθούμενη από περαιτέρω επώαση για 15 ώρες. (A, C, E) τα σχετικά ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων δείχνονται συγκρίνοντας τον αρχικό αριθμό των κυττάρων πριν την έκθεση και επώαση ως 100%. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με προσδιορισμούς ΜΤΤ, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

σ

& lt? 0,05 (*) και

σ

& lt? 0.01 (**) δείχνουν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την κατάσταση ελέγχου. (B, D, F) Για τους ίδιους NTAPP εκτεθειμένων δειγμάτων (Α), (Γ), (Ε), αντίστοιχα, γ-Η2ΑΧ, κασπάσης-3, διασπασμένη κασπάση 3, PARP, και διασπασμένη PARP εκτιμήθηκαν με αναλύσεις western blot. Actin παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε αν μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa ακόλουθη επαναλαμβανόμενη έκθεση NTAPP οφειλόταν σε απόπτωση μέσω της παρακολούθησης της διάσπασης της κασπάσης-3 και κατάντη PARP τελεστή του, δύο εκ των οποίων ενεργοποιούνται από απόπτωση. Όταν εκτίθεται σε 10 επαναληπτικών 5 V NTAPP για 30 δευτερόλεπτα η κάθε μία, διασπασμένη κασπάση-3 και PARP ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα HeLa, αλλά όχι σε IMR90 ή ASC κύτταρα (Σχήμα 2Β). Συνεπής με τους αριθμούς σχετική κυττάρων εμφανίζονται (Σχήμα 2Α, C, και Ε), διασπασμένη κασπάση-3 και PARP αυξήθηκαν σημαντικά κατά την πρόσθετη επώαση 15 ώρες σε κύτταρα HeLa αλλά δεν παρατηρήθηκαν σε ASCs ή IMR90 κυττάρων (Σχήμα 2Β, D, και F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία με NTAPP επάγει απόπτωση σε κύτταρα HeLa, αλλά όχι σε φυσιολογικά ASC ή IMR90 κύτταρα. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι επαναλαμβανόμενη έκθεση NTAPP επάγει απόπτωση σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με Annexin-V /χρώση 7ΑΑΌ (Σχήμα S4).

Θεωρώντας ότι γενωμική αστάθεια που οφείλεται σε βλάβη του DNA είναι μια σημαντική αιτία της απόπτωσης, ερευνήσαμε έκθεση είτε NTAPP προκαλούμενη βλάβη του DNA σε αποπτωτικά κύτταρα HeLa. Η φωσφορυλίωση ιστόνης Η2ΑΧ είναι ένα από τα πρώτα κυτταρικά γεγονότα που συμβαίνουν σε απόκριση DNA δίκλωνα σπασίματα [7]. Ενώ τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των HeLa, δείχνουν συνήθως χαμηλή βασική έκφραση γ-Η2ΑΧ χωρίς άγχος, ήταν σημαντικά αυξημένη σε NTAPP-εκτεθειμένα κύτταρα HeLa (Εικόνα 2Β). Δεν αποτελεί έκπληξη, όχι έκφραση γ-Η2ΑΧ ανιχνεύθηκε σε ASCs ή πρωτογενή κύτταρα IMR90 (Σχήμα 2D και F). Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι η έκθεση NTAPP επάγει εκλεκτικά βλάβης του DNA που οδηγεί σε απόπτωση των κυττάρων HeLa.

Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του NTAPP επί μελανώματος και κύτταρα καρκινώματος του στόματος

επειδή η έκθεση του NTAPP επάγει εκλεκτικά απόπτωση σε κύτταρα HeLa, αλλά όχι στην πρωτογενή IMR90 ή ASCs, εξετάσαμε την επίδρασή της σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των G361 μελανώματος και του στόματος πλακωδών καρκίνωμα YD-9 κύτταρα, τα οποία προέρχονται από καρκίνους που βρέθηκαν στην επιφάνεια του σώματος όπου επεξεργασίας πλάσματος θα μπορούσε να είναι εφαρμόζεται εύκολα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και C, 10 επαναλαμβανόμενης έκθεσης των 5 V NTAPP ακολουθούμενο από 15 h επώαση είχε ένα αντι-πολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα επί G-361 και YD-9 κύτταρα σε σύγκριση με το μη-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου. έκθεση NTAPP επάγεται επίσης έκφραση γ-Η2ΑΧ από βλάβη του DNA και απόπτωση σε G-361 και YD-9 κύτταρα (Σχήμα 3Β και Δ). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι όπως στα κύτταρα HeLa, έκθεση NTAPP οδηγεί σε σημαντική αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε μελάνωμα και προφορικές κύτταρα πλακώδους καρκινώματος, γεγονός που υποδηλώνει τη δυνατότητα εφαρμογής του πλάσματος στο δέρμα και από του στόματος μορφές καρκίνου.

(Α-Δ) (Α , Β) Στοματικό πλακώδες καρκίνωμα YD-9 και (C, D) κύτταρα μελανώματος G361 εκτέθηκαν με 5 V εισόδου NTAPP για 30 s ανά ώρα επί 10 φορές, και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε σε κάθε υποδεικνύεται συχνότητα έκθεσης. Ο χρόνος επώασης υποδηλώνει το χρόνο μετά την αρχική έκθεση σε NTAPP. Το δείγμα επώασης 24-h παρασκευάστηκε με 10 επαναλαμβανόμενης έκθεσης NTAPP ακολουθούμενη από περαιτέρω επώαση για 15 ώρες. (A, C) τα σχετικά ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων δείχνονται συγκρίνοντας τον αρχικό αριθμό των κυττάρων πριν την έκθεση και επώαση ως 100%. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με προσδιορισμούς ΜΤΤ, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

σ

& lt? 0,05 (*) και

σ

& lt? 0.01 (**) δείχνουν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την κατάσταση ελέγχου. (Β, D) Για τους ίδιους NTAPP εκτεθειμένων δειγμάτων (Α) και (C), αντίστοιχα γ-Η2ΑΧ, κασπάσης-3, διασπασμένη κασπάση 3, PARP, και διασπασμένη PARP εκτιμήθηκαν με αναλύσεις western blot. Actin παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Εξαιρετικά προτιμησιακή αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του NTAPP επί p53-ανεπαρκή κύτταρα καρκίνου

Υπό τις ίδιες συνθήκες NTAPP, αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ήταν μεγαλύτερο σε κύτταρα HeLa από ό, τι στο G-361 και YD-9 κύτταρα (Σχήμα 2Α και 3), αν και όλοι οι τύποι κυττάρων υποβλήθηκαν τελικά σε απόπτωση. γ-Η2ΑΧ φωσφορυλίωση και απόπτωση παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HeLa όταν εφαρμόστηκαν 10 επαναληπτικών διεγέρσεις ΝαΤΡΡ, αλλά αυτό παρατηρήθηκε μόνο σε G-361 και YD-9 κύτταρα όταν τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 15 ώρες μετά την έκθεση NTAPP. HeLa, G-361, και YD-9 είναι όλα τα καρκινικά κύτταρα, αλλά μόνο τα κύτταρα HeLa δεν έχουν λειτουργικό ρ53 [33] – [35]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι NTAPP προκαλεί απόπτωση από τη βλάβη του DNA και ότι η ρ53 είναι το κλειδί ογκοκατασταλτικό σε απόκριση σε γενοτοξικό στρες, έχουμε ως αίτημα εάν η παρουσία ή η απουσία λειτουργικής ρ53 σε HeLa, YD-9, και τα κύτταρα G361 κάνει τη διαφορά στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του NTAPP.

προκειμένου να αποδειχθεί η σχέση μεταξύ της λειτουργίας της ρ53 και της ευαισθησίας των καρκινικών κυττάρων να NTAPP, συγκρίναμε την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των NTAPP σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές HCT116 (ρ53

+ /+) και HCT116-E6 (ρ53

– /-), και τα δύο εκ των οποίων έχουν ακριβώς το ίδιο γενετικό υπόβαθρο εκτός για λειτουργική ρ53. Όταν HCT116 (ρ53

+ /+) και HCT116-E6 (ρ53

– /-) έλαβαν 10 επαναληπτικών 5 V NTAPP διεγέρσεων που ακολουθείται από 15 ώρες περαιτέρω επώασης, την ίδια συνθήκη που χρησιμοποιήθηκε στην προηγούμενη θεραπεία NTAPP, η σχετική ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκαν τόσο σε HCT116 (ρ53

+ /+) και HCT116-E6 (ρ53

– /-) σε σύγκριση με το μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Α και Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, HCT116-E6 (ρ53

– /-) κύτταρα έδειξαν υπερευαισθησία στην NTAPP σύγκριση με HCT116 (ρ53

+ /+)? το σχετικό ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων ήταν μόνο κατά 80% σε HCT116-Ε6 και 140% σε HCT116, σε σύγκριση με 180% και στις δύο ομάδες ελέγχου χωρίς αγωγή (Σχήμα 4Α και Β). Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την επίδραση του NTAPP παρατηρήθηκε για HeLa, YD-9, και τα κύτταρα G361 και υποδεικνύουν έντονα ότι τα καρκινικά κύτταρα χωρίς λειτουργική ρ53 είναι σημαντικά πιο ευαίσθητα στην NTAPP από ότι κύτταρα που με λειτουργική ρ53.

(Α