Abstract

Εισαγωγή

LDH-Α, το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη μετατροπή πυροσταφυλικού σε γαλακτικό, έχει αποδειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πολλούς τύπους καρκίνου και να οδηγήσει σε πιο επιθετική συμπεριφορά με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και αντι-απόπτωσης. Ωστόσο, η έκφραση της σε γαστρικό καρκίνο (GC) δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινισθεί η έκφραση και τις πιθανές επιπτώσεις της LDH-Α στο GC.

Μέθοδοι

Εξετάσαμε LDH-Α έκφραση με ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστού GC (TMA) και χρησιμοποιώντας κηλίδα Western φρέσκα ιστούς GC και κυτταρικές σειρές. Προγνωστική αξία και συσχέτιση με άλλους παράγοντες κλινικοπαθολογική αξιολογήθηκαν. Εμείς επιμολύνονται siRNA σε GC κυττάρων έναντι LDH-A. LDH-Α αναλύθηκε με κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε in vitro και in vivo. Γαλακτικού οξέος και την παραγωγή ΑΤΡ από τα κύτταρα προσδιορίστηκαν.

Αποτελέσματα

Υπήρχε σημαντικά υψηλότερη LDH-Α έκφρασης σε καρκίνωμα σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικές βλεννογόνου (NNM). Υπήρξε θετική συσχέτιση της LDH-Α έκφραση με την ηλικία, ιστολογικό τύπο και λεμφαδενικές μεταστάσεις. Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η υψηλή έκφραση της LDH-Α σε GC συνδέθηκε με χαμηλότερη συνολική επιβίωση (OS). Όταν στρωματοποιημένη κατά Lauren βαθμό και ιστολογική ταξινόμηση, τη σημασία εμφανίστηκε στο διάχυτο τύπο και αδιαφοροποίητο τύπο GC. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η LDH-Α έκφρασης σε GC ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα κινδύνου για OS (αναλογία κινδύνου = 1,829, 95% CI 1,375 έως 2,433, P Σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της LDH-Α στο επίπεδο του mRNA ανιχνεύθηκε μετά siLDH-Μια μόλυνση (β).

Η

Νοκ ντάουν της LDH-Α ανέστειλε την ανάπτυξη των Γραμμών GC κυττάρων MGC-803

Για την εκτίμηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ΜΤΤ και προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Στην δοκιμασία ΜΤΤ, αποσιώπηση της έκφρασης της LDH-Α ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των MGC-803 κύτταρα (Σχ. 5a, b). Η ανάπτυξη των MGC-803 κύτταρα που εκφράζουν LDH-A siRNA μειώθηκε κατά 64%, μετά από 168 ώρες επώασης σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Ρ & lt? 0,05). Σταθερά, αποσιώπηση της έκφρασης της LDH-Α εξασθένησε την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του MGC-803 κύτταρα (Εικ. 5c, d). LDH-Α knockdown σε αυτά τα κύτταρα εμπόδισαν το σχηματισμό αποικιών, υποδεικνύοντας ότι η εξαρτώμενη από αγκύρωση ανάπτυξη αποκαταστάθηκε. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν περαιτέρω την ογκογόνο ρόλο της LDH-A στον καρκίνο GC.

Η ανάπτυξη των κυττάρων που εκφράζουν siRNA μειώθηκαν κατά 64%, μετά από 168 ώρες επώασης σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου σε προσδιορισμό ΜΤΤ (α και β, Ρ & lt? 0,05). Αποσιώπηση της έκφρασης του LDH-Α εξασθενημένο τον σχηματισμό αποικίας των MGC-803 κύτταρα (γ και δ). Η in vivo ογκογόνο ικανότητα της κυτταρικής σειράς MGC-803 μειώθηκε σημαντικά με siRNA νοκ ντάουν της LDH-Α (ε και στ, σ & lt? 0,05).

Η

Νοκ ντάουν της LDHA Σαθεροποιημένο η Ογκογονικότητα σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού

στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την ογκογόνο ικανότητα της LDH-Α in vivo. Η ογκογονικότητα ίη νίνο των MGC-803 κύτταρα siLDH-Α και κύτταρα ελέγχου εκτιμήθηκε με υποδόρια ένεση των κυττάρων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Σε συμφωνία με τις in vitro μελέτες, αποσιώπηση της έκφρασης της LDH-Α εξασθενημένο δραματικά την ογκογονικότητα των κυττάρων LDH-Α στο μέγεθος του όγκου. Για όλα τα συμφωνημένα ξενομοσχεύματα, όγκους siLDH-Α ήταν σημαντικά μικρότερα από εκείνα των ελέγχων (Εικ. 5e, ί).

Knockdown της LDH-Α με siRNA μειώνει το γαλακτικό οξύ και ΑΤΡ σε ανθρώπινα GC Κυτταρικές Γραμμές MGC- 803

Επειδή LDH-Α είναι το ένζυμο κλειδί για τη μετατροπή πυροσταφυλικού σε γαλακτικό, αλλοίωση της έκφρασης του στα κύτταρα GC θα πρέπει να επηρεάσει παραγωγής γαλακτικού οξέος και το μεταβολισμό της ενέργειας. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, συγκρίναμε γαλακτικού και ΑΤΡ παραγωγής μεταξύ LDH-Α siRNA knockdown κύτταρα και κύτταρα ελέγχου μετά από 48-ωρών επώαση. Όταν LDH-Α χτυπήθηκε κάτω από siRNA, η ικανότητα του κυττάρου να παράγει γαλακτικό και ΑΤΡ δραματικά μειώθηκαν κατά 61.5% και 63.3% στις 48 ώρες, αντίστοιχα (Σχ. 6α, β).

Μετά από 48 ώρες επώασης, LDH-α νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη γαλακτικό (α) και την παραγωγή ATP (β) σε MGC-803 κύτταρα (p & lt? 0,05).

η

Συζήτηση

το 1920, Warburg απέδειξε πρώτος ότι τα καρκινικά κύτταρα καταλαμβάνουν τα υψηλότερα ποσοστά γλυκόζης από τα φυσιολογικά κύτταρα και παράγουν ενέργεια σχεδόν από αερόβια γλυκόλυση για την ενέργεια τους απαίτηση για την προσαρμογή των περιβαλλοντικών περιορισμών, όπως η διαλείπουσα υποξία [10], [11]. Ωστόσο, αυτή η μεταβολική αλλαγή δεν είναι απλώς μια προσαρμογή σε ένα υποξικό περιβάλλον, αλλά είναι ένα ενεργό κυψελοειδές στρατηγική που προσδίδει ένα σημαντικό πλεονέκτημα για πολλαπλασιασμό και κακοήθεια. Τώρα Vegran

et al

. [12] ανέφεραν ότι το γαλακτικό μπορούν να διαμορφώσουν άμεσα το φαινότυπο των ενδοθηλιακών κυττάρων, πιθανώς αντιπροσωπεύει σημαντικό μηχανισμό με τον οποίο οι όγκοι ελέγχουν τη δική τους παροχή αίματος μέσω αγγειακή μορφογένεση. Επειδή αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι φυσικά υποπροϊόντα της μιτοχονδριακής αναπνοής, έχει προταθεί ότι η μετατροπή της γλυκόζης σε γαλακτικό θα μπορούσε να προστατεύσει τα καρκινικά κύτταρα από το οξειδωτικό στρες [13]. Πρόσφατα, τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση της κανονικής οξειδωτική φωσφορυλίωση σε καρκινικά κύτταρα μπορεί μόνο να μην αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, αλλά επίσης μειώνουν την μεταστατική ικανότητα των κακοήθων κυττάρων [14]. Ως εκ τούτου, η σημασία της ιδιοσυστατικά up-ρυθμιζόμενη αερόβια γλυκόλυση αναγνωρίστηκε πρόσφατα σε εξέλιξη του όγκου, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν σε αυτό το φαινότυπο και τη συμβολή τους στην ανάπτυξη του καρκίνου δεν είναι καλά κατανοητοί.

LDH-Α, το ένζυμο υπεύθυνη για τη μετατροπή πυροσταφυλικού σε γαλακτικό, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της γλυκόλυσης. Αρκετές ερευνητικές έχουν αναφέρει ότι η έκφραση του LDH-Α θα μπορούσε να προκληθεί από έναν αριθμό των ογκογονιδίων [15]. Οι εκθέσεις αυτές υποστηρίζουν την ιδέα ότι LDH-A επαγωγής είναι κρίσιμη για την ογκογόνο δράση αυτών των ογκογονιδίων σε καρκινικά κύτταρα.

Το ογκογόνο δραστικότητα της LDH-Α έχει αναφερθεί σε οισοφαγικό καρκίνωμα, παγκρεατικό καρκίνο και καρκίνο του στομάχου κυττάρων [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang

et al

. ανέφεραν ότι LDH-Α αναγωγή μπορεί να καταστείλει την ογκογονικότητα των κυττάρων εντερικού τύπου γαστρικό καρκίνο (ITGC) με προς τα κάτω ρύθμιση Oct4 [17]. Και Zhiyu Wang

et al

. ανέφεραν ότι LDH-Α σίγηση καταστέλλει ογκογονικότητα του καρκίνου του μαστού μέσω της επαγωγής του οξειδωτικού στρες που προκαλείται μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι [18]. Εδώ, εξετάσαμε μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό όγκου από 264 ασθενείς για την έκφραση της LDH-Α και ανέφερε το χαρακτηρισμό των LDH-Α έκφρασης σε ανθρώπινα GC, και να παρουσιάσει συσχέτισή του με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και την πρόγνωση των ασθενών. Πρώτον, βρήκαμε ότι η έκφραση της LDH-Α ανυψώθηκε σε δείγματα GC σε σχέση με τα συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να είναι συνεπής με προηγούμενη μελέτη ότι σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, η έκφραση της LDH-Α ρυθμιζόταν up-[4], [5]. Στον ιστό του όγκου, η μελέτη μας έδειξε ότι η LDH-Α έκφραση συσχετίζεται έντονα με GC κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά: ηλικία, μετάσταση στους λεμφαδένες και ιστολογική κατάταξη. Γι ‘αυτό προτείνω να ρυθμίζεται προς τα πάνω LDH-Α έκφραση μπορεί να συμβάλει στον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των GCs. Δεύτερον, αναλύσαμε περαιτέρω την προγνωστική ρόλο της LDH-Α στη συνολική επιβίωση των ασθενών με GC. Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ LDH-Α έκφραση και τη συνολική επιβίωση των ασθενών, και οι ασθενείς με ισχυρότερη LDH-Α χρώση είχαν χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης. Όταν στατιστική ανάλυση έγινε στρωματοποιημένη από Lauren βαθμό και ιστολογική ταξινόμηση, τη σημασία εμφανίστηκε στη διάχυτη GC τύπο και αδιαφοροποίητο τύπου GC, αλλά όχι σε εντερική ή διαφοροποιημένα αυτά. Ειδικά siRNA κατά LDH-Α διεξήχθη σε MGC803 κύτταρα και καθυστερημένη ανάπτυξη των κυττάρων in vitro και σε μοντέλα ποντικών. LDH-Α νοκ ντάουν μείωσε επίσης το γαλακτικό και παραγωγή ΑΤΡ στα κύτταρα GC. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση της LDH-Α ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα του OS, και δήλωσε ότι LDH-A ενδέχεται να έχουν ογκογόνο ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων, ιδιαίτερα σε διάχυτη GC τύπο ή ασθενείς με αδιαφοροποίητο τύπο GC. Σύμφωνα με τη μελέτη μας, έχει αναφερθεί ότι χτυπήσει κάτω την έκφραση της LDH-Α σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος θα μπορούσε να επάγει απόπτωση [8], και προς τα κάτω ρύθμιση των LDH-Α θα μπορούσαν να αυξήσουν την παραγωγή των ROS και κυτοσολικού Ca2 + σηματοδότηση, η οποία μειώθηκε ο εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό και οδήγησε στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος C σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

στο σύνολό τους, η μελέτη μας δείχνει ότι τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση των LDH-Α παρέχει γαστρικών καρκινικών κυττάρων με τα πλεονεκτήματα της ανάπτυξης. Ταυτόχρονα, η μελέτη μας δείχνει LDH-Α ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο.