Αφηρημένο

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ΔΕΚ πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) σε σύγκριση με την κανονική του παχέος βλεννογόνο. DEK επίσης συσχετίστηκε σημαντικά με τις προγνωστικές χαρακτηριστικά των ασθενών με CRC, αποδεικνύοντας ότι DEK έπαιξε σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της CRC. Σε αυτή την εργασία, θα αξιολογήσει τις επιπτώσεις των ΔΕΚ στις βιολογικές συμπεριφορές σε CRC και να διερευνήσει τις σχετικές μοριακών μηχανισμών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DEK υπερεκφράστηκε σε ανθρώπινους ιστούς CRC, και συσχετίστηκε με το δείκτη Ki-67 και το αποπτωτικό δείκτη. εξάντληση DEK με RNAi στο SW-620 και HCT116 κύτταρα μειώθηκαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά αυξημένη κυτταρική απόπτωση. Προς τα πάνω ρύθμιση DEK συμμετείχε στα μονοπάτια p53 /MDM, την οικογένεια Bcl-2, και κασπάσης. Η μελέτη μας δείχνει ότι ΔΕΚ προωθεί την ανάπτυξη της CRC, και θα μπορούσε να είναι ένας θεραπευτικός στόχος στην CRC

Παράθεση:. Lin L, Piao J, Ma Υ, Jin Τ, Quan C, Κονγκ J, et al. (2014) Μηχανισμοί υποκείμενου καρκίνου ανάπτυξη και την απόπτωση από το ΔΕΚ υπερέκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (10): e111260. doi: 10.1371 /journal.pone.0111260

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26, Ιούν του 2014? Αποδεκτές: 24, Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23η Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ειδικό Ταμείο των 973 Prophase Έρευνα από το Εθνικό Υπουργείο Επιστήμης & amp? Τεχνολογίας της Κίνας (2014CB560708), τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Φυσικών Επιστημών ταμεία της Κίνας (61371067), και βασική επιστημονική Ταμείο Έρευνας του Πανεπιστημίου Jilin στην Κίνα (2013-01). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνή κακοήθεια και η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Η ποιότητα της ζωής και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι χαμηλά σε προχωρημένο CRCs ακόμα και με χειρουργική εκτομή συνοδεύεται από τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία. Η έγκαιρη ανίχνευση του CRC είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή θεραπεία, επειδή προχωρημένη νόσο υψηλής ποιότητας συσχετίζεται με αυξημένη μετάσταση και θνησιμότητας [2] – [4]. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση των νέων μεσολαβητών και βιοδείκτες CRC, ιδιαίτερα εκείνων που σχετίζονται με μετάσταση και την ανάπτυξη, παραμένει ζωτικής σημασίας για την καταπολέμηση της θνησιμότητας από υποτροπή της νόσου. Η πρόοδος στην παθογένεση του καρκίνου μπορεί να βοηθήσει ξετυλίξουν τα ζωτικά /έγκυρη μοριακοί βιοδείκτες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και βοηθούν στην ανάπτυξη και την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων, και προληπτικές στρατηγικές και παράγοντες. προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης DEK ρυθμίζεται αυξητικά σε CRC ιστούς [5]. Η υπερέκφραση είναι ιδιαίτερα έντονη σε υψηλής ποιότητας και προχωρημένου σταδίου CRCs, κάνοντας DEK ένα δυναμικό νέο βιοδείκτη για την πρόγνωση της CRC και ένα στόχο στον αγώνα κατά της επανεμφάνισης [5].

ΔΕΚ ανακαλύφθηκε αρχικά ως η στόχος ενός γεγονότος χρωμοσωμική μετάθεση t (6? 9) σε ένα υποσύνολο της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας [6] – [7]. Τώρα, DEK αναδύεται ως ένα μέλος μιας νέας κατηγορίας των ρυθμιστών τοπολογία του DNA που μπορεί να είναι στόχοι και τελεστές προ-ογκογόνων γεγονότα [8]. DEK τοποθετεί στο χρωμόσωμα 6p22.3 [9], και είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη νουκλεοπρωτεΐνη που μπορούν να φωσφορυλιωθούν. Αποτελείται από 375 αμινοξέα, DEK κατανέμεται κυρίως στην ευχρωματίνη πυρήνα, και κατά προτίμηση εκφράζει ενεργά πολλαπλασιαζόμενα και κακοήθων κυττάρων, όπου μπορεί να φθάσει έως και 4 έως 6 εκατομμυρίων αντιγράφων ανά πυρήνα [8]. Μεταγενέστερες μελέτες έχουν επανειλημμένα εντοπιστεί DEK ως συχνά υπερεκφράζεται γονιδίου σε έναν αριθμό νεοπλασμάτων [10] – [12]. Επιπλέον, μπορεί να ασκήσει DEK επιδράσεις στην ματίσματος mRNA, μεταγραφικό έλεγχο, επισκευή βλάβης του DNA, τη διαφοροποίηση, τη βιωσιμότητα των κυττάρων και κυττάρου-προς-κύτταρο σηματοδότηση [11], [13] – [15]. Ωστόσο, οι λειτουργίες του ΔΕΚ

in vitro

στο CRC κυτταρική συμπεριφορά δεν έχουν αξιολογηθεί. Προηγουμένως, δείξαμε ότι DEK πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε 109 περιπτώσεις ιστών CRC, συσχετίστηκε σημαντικά με τα χαρακτηριστικά πρόγνωση των ασθενών, και ήταν ένα ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για τη συνολική επιβίωση [5]. Αυτή η μελέτη παρατηρεί την έκφραση του ΔΕΚ σε μια νέα ομάδα που συλλέγονται πρωτοβάθμιας CRCs, και συσχετίζεται έκφραση ΔΕΚ με τις Ki-67 και αποπτωτικών δεικτών, οι οποίες αντικατοπτρίζουν τις εισφορές του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απώλεια κυττάρων, αντίστοιχα. Επίσης, έχουμε αποσαφηνίσει το ρόλο του ΔΕΚ στην CRC εξέλιξη με παρεμβολή ΔΕΚ RNA (RNAi) σε μια κυτταρική γραμμή που προέρχεται από ένα CRC.

DEK είναι ένας αναστολέας της p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την κυτταρική γήρανση και αποπτωτικών φαινοτύπους [ ,,,0],7], [14], [16], και μεταγραφικά αυξητικά από την Rb /E2F μονοπάτι, το οποίο είναι συχνά διαταράσσεται σε CRC [17] – [19]. Ως εκ τούτου, η έκφραση της είναι ενδεικτική της έντονα πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Εδώ ορίζουμε συγκεκριμένη ογκογόνο δραστηριότητες του ΔΕΚ στην CRCs

in vitro

, και να προσδιορίσει ένα μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου ΔΕΚ συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου.

Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη μελέτη που τηρείται με τη δήλωση του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από τις επιτροπές του Ανθρώπου Ηθικής και Δεοντολογίας Έρευνας του Πανεπιστημίου Yanbian Ιατρικό Κολέγιο στην Κίνα. Μέσα από το έντυπο συγκατάθεσης χειρουργική επέμβαση, όλοι οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν ότι οι εκτομή δείγματα αποθηκεύονται από το νοσοκομείο και ενδεχομένως χρησιμοποιούνται για την επιστημονική έρευνα, και ότι η προστασία της ιδιωτικής ζωής τους θα πρέπει να διατηρηθεί.

δείγματα ιστών

Φρέσκα δείγματα από τέσσερις περιπτώσεις του CRC έγιναν σε συνδυασμό με τα γειτονικά noncancerous ιστούς, και συμπεριλήφθηκαν με τις συνήθως υποβάλλονται σε επεξεργασία και διαγνωσθεί 55 περιπτώσεις ορθοκολικού ιστούς καρκίνου που επιλέχθηκαν τυχαία από τους ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση μεταξύ 2009 και 2012 στον όγκο ιστών Τράπεζα της Yanbian University Medical College . Οι παθολογικές παράμετροι εξετάζονται προσεκτικά σε όλες τις περιπτώσεις. συμπεριλήφθηκαν επίσης συνολικά 22 των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών βλεννογόνου του παχέος εντέρου από το περιθώριο εκτομής καρκίνου και 18 του ορθοκολικού αδενώματος ιστών. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση ή είχε απομακρυσμένες μεταστάσεις. Τα H & amp?. Ε-χρώση διαφάνειες εξετάστηκαν από δύο έμπειρους παθολόγους (Lin Ζ, Jin Τ) και ένα κατάλληλο πεδίο παραφίνης επιλέχθηκε για τη μελέτη αυτή

Η ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση για DEK και Ki-67

Η μέθοδος κηλίδωσης και τα κριτήρια ερμηνείας περιγράφηκαν προηγουμένως [5]. Εν συντομία, για την εξάλειψη της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης, 4 τμήματα μm πάχους ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη στους 95 ° C για 20 λεπτά τοποθετώντας τα πλακίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,01 Μ κιτρικό νάτριο (ρΗ 6.0). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίσωμα DEK (1:50, BD Biosciences Pharmingen, CA, USA) και ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι Ki-67-αντίσωμα (κλώνος: ΜΙΒ-1? Dako, Glostrup, Denmarkat 4 ° C όλη τη νύκτα μετά. επώαση με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα σε RT για 30 λεπτά, τα πλακίδια επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάσης σε RT για 30 λεπτά. η ανοσοχρώση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη, και αιματοξυλίνη Mayer χρησιμοποιήθηκε για αντικηλίδωση. Χρησιμοποιήσαμε IgG ποντικού ως ένα ισότοπο τους ελέγχους. Επιπλέον, θετική τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, ενώ παραλείπεται του πρωτογενούς αντισώματος ως αρνητικοί έλεγχοι.

Τόσο DEK και Ki-67 εκφράζεται συνήθως στον πυρήνα του κυττάρου. Η χρώση IHC για DEK ήταν ημι- ποσοτικά βαθμολογήθηκαν ως ‘-‘ (αρνητικό, καμία ή λιγότερο από 5% θετικά κύτταρα), ‘+’ (5-25% θετικά κύτταρα), «++» (26-50% θετικά κύτταρα) και «+++» ( περισσότερο από το 50% θετικά κύτταρα). Μόνο το πρότυπο πυρηνική έκφραση θεωρήθηκε ως θετική χρώση, και τα ισχυρώς θετικά μέσα «++» και «+++» θετικών κυττάρων. Ο δείκτης Ki-67 (ο αριθμός των Ki-67-θετικά κύτταρα όγκου διαιρεμένο με το συνολικό αριθμό των καρκινικών κυττάρων χ 100%) καθορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων του όγκου σε 20 τυχαίως επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος (Χ 400).

αποπτωτικά δοκιμασία σε τομές ιστών του CRC

Το αποπτωτικό δείκτη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα in situ κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Takara Bio, Οτσού, Ιαπωνία). Οι διαδικασίες χρώσης εκτελέσθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά ρουτίνα αποπαραφίνωση, το τμήμα ιστού υπέστη πέψη με πρωτεϊνάση Κ (20 mg /ml σε PBS) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν με PBS. Τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 5 λεπτά και πλύθηκαν με PBS. ενζύμου TdT και υποστρώματος μεταφέρθηκαν με πιπέτα πάνω στις τομές, οι οποίες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά. Μετά το πλύσιμο, συζυγές HRP anti-FITC προστέθηκε στα πλακίδια επί 30 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν, χρωματίστηκαν με diaminobenzine (Nichirei, Tokyo, Japan), και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Το αποπτωτικό δείκτη (ο αριθμός των θετικών κυττάρων όγκου διαιρεμένο με τον συνολικό αριθμό των καρκινικών κυττάρων χ 100%) καθορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων του όγκου σε 20 τυχαίως επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος (Χ 400) [20]. Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης ΔΕΚ και του δείκτη Ki-67 ή αποπτωτικών αξιολογήθηκαν σε πάνω από ανθρώπινους ιστούς CRC.

κηλίδωση Western

Πρωτοβάθμια αντισώματα για να ΔΕΚ (1:1000, BD, Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA), μεταλλαγμένο-p53 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), MDM2 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), Bcl-2 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), Βαχ (1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), PARP (1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), κασπάσης-3 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), 8 κασπάσης-(1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), και κασπάσης-9 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν.

Φρέσκα δείγματα ιστού του CRC αλέστηκαν σε σκόνη σε υγρό άζωτο και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE. Συρρέοντα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 0,5 mM EDTA, 0,09 μονάδες /mL απροτινίνη, 1 mg /mL πεπστατίνη, 10 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 1 mg /mL λευπεπτίνη) . Δείγματα Ίσες πρωτεΐνης (20μg) διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε 3 φορές με TBST και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP κατσίκας αντι-ποντικού IgG. (Cwbiotech, Πεκίνο, Κίνα) και συζευγμένο με HRP IgG αίγας αντι-κουνελιού (Cwbiotech, Πεκίνο, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Στη συνέχεια, η έκφραση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Prime δυτική αντιδραστήριο κηλίδωσης ανίχνευσης ECL (Amersham Biosciences, Uppsala, Σουηδία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. β-ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εικόνες συλλήφθηκαν με το επαγγελματικό σύστημα ανάλυσης εικόνας Champchemi (Sagecreation, Πεκίνο, Κίνα), και ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού LANE 1D (Sagecreation, Πεκίνο, Κίνα).

Η αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφής-πολυμεράσης (RT- PCR) και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

για RT-PCR, ολικό RNA από δείγματα CRC και κυτταρικές σειρές εξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Takara, Shiga, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. CDNA πρώτου κλώνου συντέθηκε από τον Πρωθυπουργό Script ανάστροφης μεταγραφάσης (Takara Bio, Dalian, Κίνα) και ολιγο (dT) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλες οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε 20 μΐ μίγματος της αντίδρασης, ξεκινώντας με 4 λεπτά στους 94 ° C για μετουσίωση cDNA, τότε η PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε για 23~36 κύκλους των 94 ° C για 15 s και 53~58 ° C για 30 s να αναδιαταχθεί τους εκκινητές, και την επέκταση των εκκινητών στους 72 ° C για 1 λεπτό. Κλάσματα της αντίδρασης PCR αφαιρέθηκαν μετά από διάφορους αριθμούς κύκλων και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης 3%. Εικόνες συλλήφθηκαν με το επαγγελματικό σύστημα ανάλυσης εικόνας Champchemi (Sagecreation, Πεκίνο, Κίνα), και ποσοτικοποίηση έγινε με το λογισμικό LANE 1D (Sagecreation, Πεκίνο, Κίνα).

Σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη με βιο σύστημα ανίχνευσης Rad αλληλουχία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τη χρήση της διπλής έλικας του DNA-ειδικό κιτ SYBR Premix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japan). Οι Primer σύνολα για ειδικά γονίδια φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι αντιδράσεις PCR πραγματικού χρόνου έγιναν εις τριπλούν, και οι αριθμοί κύκλος κατωφλίου (Ct) προσδιορίσθηκαν στο επίπεδο που έδειξε τα καλύτερα κινητικές παράμετροι της PCR. No-πρότυπο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, και οι καμπύλες τήξης λήφθηκαν για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του PCR προϊόντος. Μια συγκριτική μέθοδο CT (2

-ΔΔCt) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η σχετική ποσοτικοποίηση του γονιδίου ΔΕΚ.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές SW-620 , ΗΤ29, SW-480 και HCT116 αγοράστηκαν από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), και διατηρείται από το Cancer Research Center του Πανεπιστημίου Yanbian. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 ή ϋΜΕΜ μέσο (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη, και 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο 5% CO

2 στους 37 ° C

DEK siRNA (Sidek) στοχοθετημένες το ανθρώπινο γονίδιο DEK, και siRNA δίπολα με μη ειδικές αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι (siControl).? όλες οι αλληλουχίες σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν με RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Κίνα) (Πίνακας S1). Η Sidek χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή φαίνονται στον Πίνακα 1.

ΜΤΤ δοκιμασία

Χίλια κύτταρα ανά φρεάτιο επωάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων. Είκοσι-τέσσερις ώρες αργότερα, siControl και Sidek επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι αλληλουχίες Sidek προστέθηκαν σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα 30 ηΜ, 50 ηΜ και 100 ηΜ. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, 5 mg /mL ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν προσεκτικά. Στη συνέχεια, 200 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα φρεάτια αναμείχθηκαν επιμελώς για 10 λεπτά. Η τιμή απορρόφησης (OD) στα 560 nm εκάστου φρεατίου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός (TECAN-άπειρο M200 pro, Μάνερντορφ, Ελβετία).

ανοσοφθορισμού χρώση

Η κυτταρική γραμμή CRC, sw- 620, αναπτύχθηκε σε καλυπτρίδες σε 70% συρροή και, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0.5% TritonX-100 για 10 λεπτά μετά από 24 ώρες. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε με 3% αλβουμίνη ορού βοοειδών κλάσμα V (Solarbio, Beijing, Κίνα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου DEK (1:50, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με Alexa Fluor 568 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (H + L) (A11004, 1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με 49 με 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) και οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με αντιξεθωριάσματος Τοποθέτηση Medium (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα). Τέλος, τα σήματα ανοσοφθορισμού έγιναν ορατές και καταγράφονται χρησιμοποιώντας Leica SP5II ομοεστιακό μικροσκόπιο [21].

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Ομελέτα Sidek (SiControl) και Sidek επιμολυσμένα SW620 κυτταρική γραμμή απλώθηκαν σε δίσκους των 10 cm σε η πυκνότητα των 5 × 10

4 κύτταρα ανά πιάτο. Επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει 800-1000 μg /ml του G418 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Μετά από περίπου 7 ημέρες, το μέσο αντικαταστάθηκε. Η δοκιμασία σταμάτησε όταν οι αποικίες ήταν σαφώς ορατές ακόμη και χωρίς να κοιτάξει κάτω από το μικροσκόπιο, και ήταν περίπου 2~3 εβδομάδες επώασης στους 37 ° C, 5% CO2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 0,5% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και κατόπιν μετρήθηκαν σύμφωνα με καθορισμένο μέγεθος των αποικιών [22].

Hoechst33342 χρώση

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /mL και καλλιεργήθηκαν για 2 έως 4 ημέρες μέχρις ότου 80% έως 90% συρροή. Ένα κυψελοειδές πυκνότητα 0,5-3,0 × 10

6 κύτταρα /mL επιτεύχθηκε και σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 3% παραφορμαλδεΰδη (50 μΙ) πριν από τη θεραπεία με Hoechst 33342. Hoechst 33342 διαλύθηκε σε αποσταγμένο νερό σε 25 mg /mL και προστέθηκε σε DMEM (τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco) με 2% FBS σε τελική συγκέντρωση 16 μg /ml για 15 λεπτά. Το ποσοστό απόπτωσης υπολογίζεται μετρώντας 500 κύτταρα σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Η κυτταρομετρία ροής

SW-620 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων, και διαμολύνθηκαν με το siRNA που στοχεύει DEK ή η αγωνίζομαι siRNA για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψίνη (0,25%) – EDTA και συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 1000 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό σύνδεσης, πριν να επισημανθούν με Αννεξίνη V-FITC και 7ΑΑΌ για 20 λεπτά. Φθορισμού (περιεχόμενο DNA) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με χρήση τυπικού λογισμικού. Τα κύτταρα που ήταν Annexin V-FITC (-) και 7ΑΑΌ (-) θεωρήθηκαν βιώσιμα κύτταρα, ενώ τα κύτταρα που ήταν αννεξίνης V-FITC (+) και 7ΑΑΌ (-) θεωρήθηκαν πρώιμου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα. Τα κύτταρα που ήταν Annexin V-FITC (+) και 7ΑΑΌ (+) θεωρήθηκαν όψιμου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα.

Στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS 17.0 στατιστικό πακέτο (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA), και οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Οι συσχετίσεις των επιπέδων έκφρασης ΔΕΚ με CRC και ιστολογική παράγοντες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

πρωτεΐνη ΔΕΚ υπερεκφράζεται σε CRCs

Για να καταδειχθεί ο ρόλος του ΔΕΚ για CRC , μετρήσαμε τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΔΕΚ σε τέσσερις περιπτώσεις του CRC με συμφωνημένα παρακείμενες μη-όγκου φρέσκα ιστούς. δεδομένα κηλίδας Western έδειξε ισχυρή έκφραση της πρωτεΐνης DEK σε CRC ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς μη-όγκου (Σχ. 1).

(Α) Εικόνες κηλίδες Western έκφρασης πρωτεΐνης DEK σε τέσσερα ζεύγη του CRC ( Τ) και γειτονικούς ιστούς μη-όγκου (ΝΤ). (Β) Οι σχετικές αναλογίες Τ /NT των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης DEK σε ζεύγη CRC και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου εμφανίζονται (αυξημένη αλλαγή φορές, **

P

& lt? 0,01).

Η

έκφραση πρωτεΐνης DEK έδειξε ένα πυρηνικό πρότυπο χρώσης IHC σε CRCs (Εικ. 2). Ο αριθμός των κυττάρων που περιέχουν πρωτεΐνη DEK (θετικός ρυθμός) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε ιστούς CRC (80,0%, 44/55) σε σχέση με την κανονική γειτονικό βλεννογόνο (36,4%, 8/22), και του παχέος αδενώματα (16,7%, 3/18) . Ομοίως, το έντονα θετικό ρυθμό DEK πρωτεΐνης ήταν 50,9% (28/55) σε CRCs, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (18.2%, 4/22), και του παχέος αδενώματα (16,7%, 3/18) (Τόσο

P

& lt? 0.001). (Πίνακας 2)

(Α) χρώση πρωτεϊνών ΔΕΚ ήταν αρνητική σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου. (Β) ΔΕΚ πρωτεΐνης έδειξε διάχυτα και ισχυρά πυρηνικά θετική χρώση στα τέλη του σταδίου CRC. (Γ) DEK πρωτεΐνη είναι θετική σε διηθητικό καρκίνο κύτταρα στο ορογόνο του παχέος εντέρου. (D) DEK πρωτεΐνη είναι αρνητική στην CRC, χωρίς μετάσταση.

Η

Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης ΔΕΚ και του δείκτη δείκτη και απόπτωση Ki-67 σε ανθρώπινους ιστούς CRC

Εμείς αξιολογηθεί η συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης DEK και το Ki-67 και αποπτωτικών δεικτών σε ανθρώπινους ιστούς CRC. Ο δείκτης Ki-67 ήταν 26,60 ± 8,12% σε ιστούς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης DEK και 48.17 ± 7.87% σε ιστούς με υψηλά επίπεδα έκφρασης DEK (Σχ. 3Α). επίπεδα έκφρασης DEK και ο δείκτης Ki-67 ήταν θετικά (

P

= 0.030). Η αποπτωτική δείκτης ήταν 0,78 ± 0,10% σε ιστούς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης DEK και 0.30 ± 0.16% σε ιστούς με υψηλά επίπεδα έκφρασης DEK (Σχ. 3Β). Υπήρξε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης ΔΕΚ και το αποπτωτικό δείκτη (

P

= 0,010).

(Α) Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν σε συσχετισμό έκφραση ΔΕΚ και το δείκτη Ki-67 (

P

= 0.030). (Β) Υπήρξε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΔΕΚ και αποπτωτικό δείκτη (

P

= 0,010). . (ΔΕΚ χαμηλό, «-» και «+»?. DEK υψηλή, «++» και «+++»)

Η

έκφραση ΔΕΚ στα κύτταρα CRC με RT-PCR και Western Blot

Τα δεδομένα IHC εμφανίζεται παραπάνω και μας προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα [5] δείχνουν ότι DEK μπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη του ΚΕΣ και ένα καλό δείκτη του πολλαπλασιασμού και της μετάστασης. Έτσι, ανιχνεύονται τα επίπεδα έκφρασης του DEK mRNA και της πρωτεΐνης σε αρκετές κυτταρικές σειρές CRC, συμπεριλαμβανομένων SW-620, SW-480, HCT116 και ΗΤ29. δεδομένα RT-PCR επέδειξε ότι το σύνολο της SW-620, SW-480, ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης του mRNA DEK (Σχ. 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για τα επίπεδα πρωτεΐνης αυτών των κυτταρικών σειρών με δοκιμασίες κηλίδος western (Σχ. 4Β). Εδώ επιλέξαμε SW-620 κύτταρα, τα οποία έχουν υψηλό πολλαπλασιασμό και τις δυνατότητες μετάσταση επιβεβαιωθεί από προηγούμενες εκθέσεις [23], για τα ακόλουθα πειράματα.

Η

Επιπτώσεις των ΔΕΚ RNAi για πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή , SW620

επιμολυσμένα SW-620 κυττάρων με DEK RNAi, και βρήκαν ότι DEK RNAi μειωτικά αποτελεσματικά τα επίπεδα του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης του DEK σε SW-620 κύτταρα με χρώση ανοσοφθορισμού, RT-PCR, και αναλύσεις κηλίδος western (Εικ. 5Α-C).

(Α) Πυρηνική εντοπισμός του ΔΕΚ πρωτεΐνης παρατηρείται σε siControl και Sidek κύτταρα SW-620. DEK (κόκκινο) εντοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων SW-620 με χρώση ανοσοφθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο παρατήρησης. χρώση DAPI (μπλε) συμπεριλήφθηκε για να απεικονίσει τον πυρήνα. (Β) έκφραση DEK mRNA στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC SW-620 μετά siControl και Sidek. έκφραση της πρωτεΐνης (C) DEK στην ανθρώπινη κυτταρική γραμμή CRC SW-620 μετά siControl και Sidek.

Η

Τα αποτελέσματα της έκφρασης πρωτεΐνης DEK στην κυτταρική ανάπτυξη ελέγχθηκαν με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως ΜΤΤ. Ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων 100 ηΜ Sidek κατεργασμένα μειώθηκε σε μία δόση-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 6Α). Οι τιμές απορρόφησης της δοκιμασίας ΜΤΤ μετά από 72 ώρες και 96 ώρες ήταν 0,43 ± 0,02 και 0,62 ± 0,03 για την siControl, και 0,35 ± 0,03 και 0,39 ± 0,02 για τις Sidek-επιμολυσμένα SW-620 κύτταρα, τόσο

P

& lt? 0,05, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β).. Επιπλέον, μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε SW-620 κύτταρα αποτελεσματικά μειώνεται με την παρουσία του Sidek (100 ηΜ). Σε σύγκριση, Sidek ανέστειλε το σχηματισμό αποικιών σε SW-620 κυττάρων κατά περίπου 70% (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 6C). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων στα Sidek-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα siControl.

(Α) δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε την Sidek (100 ηΜ) μιμείται μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των sw- 620 κυττάρων σε σχέση με την ομάδα siControl (

P

= 0,034). (Β) ανάλυση ΜΤΤ μετά από 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες και 96 ώρες για siControl και Sidek επιμολυσμένα SW-620 κύτταρα, *

P

& lt? 0,05, αντίστοιχα. (C) δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξαν θεραπεία ανέστειλε το σχηματισμό αποικιών Sidek στο SW-620 κυττάρων κατά περίπου 70% (

P

& lt? 0.001).

Η

Επιπτώσεις της έκφρασης ΔΕΚ σχετικά με την απόπτωση του SW-620 κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, μετά SW-620 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ Sidek ή siControl, ο αποπτωτικός ρυθμός ήταν σημαντικά αυξημένη σε Sidek SW-620 κύτταρα σε σύγκριση με siControl-επιμολυσμένα κύτταρα SW-620. Το ποσοστό των αννεξίνης V-FITC + /7AAD- κυττάρων ήταν 13.13% στην ομάδα Sidek, και 4,99% στην ομάδα siControl, υποδεικνύοντας ότι η εξάντληση DEK αύξησε την πρώιμη απόπτωση των SW-620 κύτταρα (Σχ. 7Β).

χρώση (Α) Hoechst33342 έδειξε ότι knockdown του γονιδίου DEK απόπτωση. (Β) Επιμολυσμένα Sidek για 48 ώρες αύξησε σημαντικά πρώιμα στάδια αποπτωτικά κύτταρα υποδεικνύεται από μια υψηλότερα ποσοστά αννεξίνης + /7AAD- κυττάρων V-FITC συγκριτικά με την ομάδα siControl.

Η

Η έκφραση του p53 /MDM2, οικογένεια κασπάσης, και Bcl-2 πρωτεϊνών /Bax σε Sidek-επιμολυσμένα κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχ. 8Α, τα επίπεδα έκφρασης του μεταλλαγμένου-p53 και έκφραση ΜΌΜ2 σε Sidek επεξεργασμένου SW-620 κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε αναλύσεις κηλίδος Western, υποδεικνύοντας ότι DEK διεγείρει την ανάπτυξη των SW-620 κύτταρα μέσω της οδού του ρ53 /MDM2. Επιπλέον, η έκφραση του Bcl-2 ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά τη θεραπεία Sidek. Αντίθετα, η έκφραση Bax ρυθμίζεται αυξητικά υπό τις ίδιες συνθήκες. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι ο /Bax μονοπάτι Bcl-2 παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της SW-620 κυττάρων που ρυθμίζεται από DEK (Εικ. 8Β).

(Α) πρωτεΐνες Mutant-ρ53 και ΜΌΜ2 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε Sidek-επιμολυσμένα SW-620 κύτταρα. (Β) Η αναλογία του Bcl-2 /Bax ήταν σημαντικά μειωμένη σε Sidek-επιμολυσμένα κύτταρα SW-620. (C) έκφραση της πρωτεΐνης ΡΑΚΡ ήταν πολύ υψηλότερη σε κύτταρα Sidek, και της κασπάσης-3 και -9 πρωτεΐνες ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε Sidek-επιμολυσμένα SW-620 κύτταρα από εκείνες στην ομάδα siControl. Η κασπάση-8 επίπεδα πρωτεΐνης παρέμεινε αμετάβλητη.

Η

Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι διασπασμένης κασπάσης-3 και διασπασμένη κασπάση-9 μειώθηκαν στα κύτταρα Sidek, ενώ το επίπεδο έκφρασης της κασπάσης-8 δεν το έκανε αλλαγή. Ωστόσο, η ADP επίπεδα έκφρασης διασπαστεί πολυ ριβόζη πολυμεράση (PARP) αυξήθηκε με την εφαρμογή Sidek. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι κασπάσης-3 και κασπάσης-9, αλλά όχι κασπάσης-8, εμπλέκονται στην απόπτωση των κυττάρων SW-620 μετά Sidek επιμόλυνση, υποδεικνύοντας ότι Sidek ενεργοποιημένα επίσης τα κασπάσης-εξαρτώμενες οδούς (Εικ. 8C).

Ο μηχανισμός της λειτουργίας του ΔΕΚ στην CRC επιβεβαιώθηκε επίσης σε ένα άλλο CRC κυτταρική σειρά HCT116, και βρήκε τα παρόμοια αποτελέσματα με εκείνη στα κύτταρα SW620. Τα δεδομένα παρέχονται ως τα συμπληρωθεί σχήματα (Σχ. S1-S3).

Συζήτηση

ενίσχυση γονιδίου

DEK και υπερέκφραση έχουν περιγραφεί σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και μελάνωμα [7], [16], [24]. Τα έργα του Khodadoust et [7] al έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης ΔΕΚ μπορεί να διακρίνει καλοηθών σπίλων από κακοήθη μελανώματα, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη αυτή μπορεί να αποδειχθεί ιδιαίτερα χρήσιμη για την διαφορική διάγνωση. Πρόσφατα, Datta et al. [24] ανέφεραν ότι η ογκοπρωτεΐνη DEK ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τα κανονικά αντίστοιχά όπως προσδιορίζεται με στυπώματα Western. Πράγματι, DEK πρωτεΐνης ήταν παρούσα στο ακυρώνονται ούρα ασθενών με χαμηλής και υψηλής ποιότητας κύστη καρκίνους, γεγονός που υποδηλώνει ότι DEK θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης με χρήση ασθενή δείγματα ούρων. τρέχουσα μελέτη μας είναι η πρώτη που υποβάλει έκθεση σχετικά με τις δραστηριότητες των ογκογόνων ΔΕΚ στην CRC με τη μείωση ΔΕΚ, και να καθορίσουν λειτουργικές και μοριακοί μηχανισμοί για ΔΕΚ στην CRC παθογένεια.

προηγούμενη μελέτη μας [5] έδειξε ότι το έντονα θετικό ποσοστό DEK πρωτεΐνης ήταν 48,62% (53/109) στην παχέος εντέρου, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή είτε γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (9,17%, 10/109) ή αδενώματα του παχέος εντέρου (13,46%, 7/52). DEK υπερέκφραση σε ΚΕΣ συσχετίζεται θετικά με το μέγεθος του όγκου, το βαθμό, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, ορογόνο εισβολή, το προχωρημένο στάδιο, και την ελεύθερη νόσου επιβίωση και 5 χρόνια τα ποσοστά επιβίωσης. Περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι οι ασθενείς με τελικού σταδίου CRC και υψηλή έκφραση ΔΕΚ είχε χειρότερα ποσοστά επιβίωσης από εκείνους με χαμηλή έκφραση ΔΕΚ. Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε υψηλή έκφραση ΔΕΚ, ορογόνο εισβολή, και αργά το στάδιο είναι σημαντικό ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου για θνησιμότητα σε CRC. Σε αυτό το έργο, Western Blot και χρώση IHC αναλύσεις έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση ΔΕΚ ήταν σημαντικά συχνότερη στους ιστούς CRC από ό, τι είτε σε γειτονικό φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνο ή αδενώματα του παχέος εντέρου.

Το αντιγόνο Ki-67 εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα κατά τη διάρκεια της η G1, S, G2, και Μ φάσεις, αλλά όχι κατά τη φάση G0 (ηρεμίας κύτταρα) [25]. Ki-67 χρησιμοποιείται ως δείκτης του πολλαπλασιασμού των όγκων και την επιθετικότητα, και μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στην πρόγνωση των ασθενών με CRC [26] – [27]. προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης DEK ήταν πολύ παρόμοια με το αντιγόνο Ki-67 ως δείκτη πολλαπλασιάζονται μήτρας καρκίνων του τραχήλου [28]. Μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΔΕΚ και του δείκτη Ki-67 ή αποπτωτικών σε ιστούς CRC βρέθηκε επίσης στη μελέτη αυτή.

Wise-Draper et al. [29] χρησιμοποιούνται RNAi προσεγγίσεις για την ειδική στόχευση σε καρκινικά DEK και πρωτογενή κύτταρα, και βρήκαν ότι η εξάντληση DEK σε HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου ως αποτέλεσμα την επαγωγή απόπτωσης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα, ενοχοποιώντας DEK ως καρκίνος και πρωταρχικό παράγοντα κυτταρικής επιβίωσης. Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύσαμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ DEK υπερέκφραση και περισσότερο κακοήθεις συμπεριφορές του CRC χρησιμοποιώντας SW-620 και ανθρώπινα κύτταρα CRC HCT116 με και χωρίς θεραπεία RNAi. Η ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης αποκάλυψε ότι η εξάντληση ΔΕΚ αύξησε την πρώιμη απόπτωση των SW-620 και τα κύτταρα HCT116. Παρά το γεγονός αυτό, παρατηρήσαμε επίσης ότι η εξάντληση DEK ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε μία δοκιμασία ΜΤΤ δοκιμασία και τον σχηματισμό αποικιών. Αυτά τα αποτελέσματα συμφώνησαν με τα αποτελέσματα του δείκτη Ki-67 και απόπτωση σε δείγμα ιστού CRC. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι DEK ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων και CRC επιβίωση

in vitro

.

Η ανθρώπινη πρωτεΐνη ρ53 είναι η πιο συχνά απενεργοποιημένο ογκοκατασταλτικό γονίδιο στον καρκίνο του ανθρώπου και εμπλέκεται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε απάντηση στο στρες [30]. Ωστόσο, ρ53 έχει μια σύντομη ημιζωή και διατηρείται σε χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα με συνεχείς πρωτεολυτική αποικοδόμηση σε φυσιολογικά κύτταρα. Η συνεχής υποβάθμιση του p53 διαμεσολαβείται κυρίως από το Ε3 λιγάση MDM2 [31]. Με τη δέσμευση ρ53, MDM2 μπλοκ ο τομέας διενεργοποίησης του ρ53 και συνεπώς αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα του [32]. Προκλήθηκαν με σήματα στρες όπως υποξία ή βλάβη στο DNA, ο βρόχος ανάδρασης του MDM2-p53 έχει διαταραχθεί, οδηγώντας σε απόπτωση ή κακοήθεια [33]. μελέτη Khodadoust πρότεινε μία νέα ρόλο για DEK στην επιβίωση των κυττάρων, που περιλαμβάνει την αποσταθεροποίηση της ρ53 με έναν τρόπο που είναι πιθανό να συμβάλλουν στην ανθρώπινη καρκινογένεση [7]. Επιπλέον, Wise-Draper et al. θεωρείται επίσης ότι ο θάνατος κυττάρου σε απόκριση προς εξάντληση DEK συνοδεύτηκε από αυξημένη σταθερότητα της πρωτεΐνης και μεταγραφική δραστικότητα του καταστολέα όγκων ρ53, και επακόλουθη προς τα πάνω ρύθμιση των γνωστών γονιδίων στόχων του ρ53 όπως Bax [29]. Βαχ, ένα προ-αποπτωτικό παράγοντα της οικογένειας Bcl-2, βρίσκεται σε μια μονομερή μορφή στο κυτταρόπλασμα ή χαλαρά προσκολλημένο στις μεμβράνες υπό κανονικές συνθήκες. Μετά από ένα ερέθισμα θανάτου, του κυτταροπλάσματος και μονομερής Bax μετατοπίζονται στα μιτοχόνδρια, όπου γίνονται αναπόσπαστο μεμβρανικών πρωτεϊνών.