Αφηρημένο

μυοσίνης IC είναι μια ενιαία επικεφαλής μέλος της υπερ-οικογένειας μυοσίνης. Εμείς εντοπίστηκαν πρόσφατα μια νέα ισομορφή και έδειξαν ότι το

MYOIC

γονιδίων σε κύτταρα θηλαστικών κωδικοποιεί τρία ισόμορφα (ισομορφών Α, Β, και Γ). Επιπλέον, αποδείξαμε ότι μυοσίνης ισομορφή IC Α αλλά όχι του ισόμορφου Β επιδεικνύει ένα συγκεκριμένο πρότυπο έκφρασης ιστού. Σε αυτή τη μελέτη, επεκτείναμε την ανάλυσή μας των προτύπων έκφρασης ισόμορφου της μυοσίνης IC αναλύοντας την πρωτεΐνη και mRNA έκφραση σε διάφορες κυτταρικές σειρές θηλαστικών και σε διάφορα δείγματα προστάτη και ιστούς όγκων από τον προστάτη διαγονιδιακό ποντίκι (TRAMP) μοντέλο με ανοσοστύπωση, qRT-PCR, και με έμμεση ανοσοϊστοχημική χρώση τομές παραφίνης δείγμα προστάτη. Ανάλυση ενός πάνελ κυτταρικών γραμμών θηλαστικών έδειξε μία αυξημένη έκφραση mRNA και πρωτεΐνης ειδικά μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπου και ποντικού προστάτη αλλά όχι σε προστάτη μη-καρκίνου ή άλλων (μη-προστάτη) κυτταρικές γραμμές καρκίνου . Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι η μυοσίνη IC ισόμορφο Α έκφραση αυξάνεται σημαντικά στα δείγματα προστάτη TRAMP ποντίκι με προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) αλλοιώσεις και σε απομακρυσμένες μεταστάσεις τοποθεσία στον πνεύμονα και το ήπαρ σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Οι παρατηρήσεις μας αποδεικνύουν συγκεκριμένες αλλαγές στην έκφραση των μυοσίνης IC ισόμορφο Α που είναι ταυτόχρονη με την εμφάνιση του καρκίνου του προστάτη στο μοντέλο TRAMP καρκίνου του προστάτη ποντικού που μιμείται στενά την κλινική του καρκίνου του προστάτη. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα της μυοσίνης IC ισομορφής Α μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Ihnatovych I, Sielski NL, Hofmann WA (2014) επιλεκτική έκφραση της μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε ποντίκι και Ανθρωπίνων Γραμμές κυττάρων και του καρκίνου του προστάτη ποντίκι ιστούς. PLoS ONE 9 (9): e108609. doi: 10.1371 /journal.pone.0108609

Συντάκτης: Craig Ν Robson, Βόρεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 11 Ιουλίου 2014? Δεκτές: 1 του Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 26η Σεπτεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Ihnatovych et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Άμυνας, Congressionally Σκηνοθεσία Ιατρικής Έρευνας Προγράμματα (https://cdmrp.army.mil/default.shtml) (επιχορήγηση # W81XWH -12-1-0234) να WAH και από το Πανεπιστήμιο στο Buffalo επιχορήγηση εκκίνησης για να WAH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου που διαγιγνώσκεται στους άνδρες σε όλο τον κόσμο και η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ [1], [2]. Ο καρκίνος του προστάτη μπορεί να είναι συχνά βραδείας αλλά μπορεί επίσης να είναι εξαιρετικά επιθετική και θανατηφόρα σε ορισμένους ασθενείς. Επί του παρόντος δεν υπάρχει καμία αξιόπιστη δείκτη που διατίθενται για την έγκαιρη ανίχνευση, επιβεβαίωση της διάγνωσης, ή πρόγνωση της νόσου διαθέσιμες [3]. Έτσι, η ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών που έχουν την ικανότητα να εντοπίσει με ακρίβεια και διάκριση του καρκίνου του προστάτη είναι σημαντική για την ακριβή διαχείριση της νόσου.

μυοσίνης IC είναι μέλος της μυοσίνης υπερ [4] που εντοπίζεται στην κυτταρόπλασμα και ο πυρήνας και εμπλέκεται σε μία ποικιλία διεργασιών σε αμφότερα τα διαμερίσματα. Στο κυτταρόπλασμα, μυοσίνης IC εμπλέκεται στο σχηματισμό των λιπιδικών σχεδιών [5], μεταφορά των κυστιδίων που περιέχουν πρωτεΐνες μεμβράνης [6], και ρύθμιση διαύλων ιόντων σε τριχωτά κύτταρα του έσω ωτός [7] – [9]. Στο πυρήνα, μυοσίνης IC εμπλέκεται σε διάφορες πτυχές της μεταγραφής [10] – [13], στη χρωματίνη αναδιαμόρφωση [14], [15], και δυναμική οργάνωση των χρωμοσωμικών δομών [16]. Εμείς εντοπίστηκαν πρόσφατα μια προηγουμένως άγνωστη ισομορφή της μυοσίνης IC και έδειξαν ότι το

MYOIC

γονιδίων σε κύτταρα θηλαστικών κωδικοποιεί τρία ισόμορφα που ονομάζεται μυοσίνη IC ισομορφών Α, Β, και Γ [17].

προηγούμενη ανάλυσή μας της μυοσίνης IC έκφρασης ισόμορφου σε ιστούς ποντικού αποκάλυψε ένα πρότυπο έκφρασης ιστο-ειδική του ειδικά μυοσίνης IC ισόμορφο Α με υψηλά επίπεδα έκφρασης στον νεφρό, επινεφρίδια, το πάγκρεας, και της επιδιδυμίδας και οπισθοπεριτοναϊκή λιπώδη αποθήκες [18]. Σε αντίθεση, η μυοσίνη IC ισομορφή Β δείχνει μια πανταχού παρούσα πρότυπο έκφρασης σε όλους τους ανέλυσε ιστούς και κυτταρικές σειρές [17] – [19]

Αυτός ο ιστός ειδική έκφραση της μυοσίνης IC ισομορφής Α μας οδήγησε να εξερευνήσουν τα προφίλ έκφρασης. η μυοσίνη IC ισομορφές περαιτέρω. Αναφέρουμε εδώ την αξιολόγηση της μυοσίνης IC ισομορφών έκφραση Α και Β σε μια ποικιλία κυτταρικών γραμμών καλλιέργειας ιστού θηλαστικού. Έχουμε αποδείξει ότι η έκφραση του μυοσίνης IC ισόμορφο Α είναι σημαντικά αυξημένη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με άλλες (μη προστάτη) καρκινικές κυτταρικές γραμμές ή σε μία κυτταρική σειρά προστάτη μη-καρκίνου. Μεταγενέστερη ανάλυση ιστών όγκου καρκίνου του προστάτη από το μοντέλο ποντικού TRAMP που αντικατοπτρίζει στενά την παθογένεση του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη [20] – [23] αποκαλύπτει μια σημαντική αύξηση στην ισομορφή Μια έκφραση όταν συγκρίνεται με τους φυσιολογικούς ιστούς. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας εμπλέκουν συγκεκριμένες μεταβολές σε μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφρασης που συμπίπτουν με την εμφάνιση του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες ισομορφές μυοσίνης IC: 1. το αντίσωμα αντι-ΕΙΜ είναι ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού που εγείρεται έναντι του 16 αμινοξέων μακρύ Ν-τερματικού πεπτιδίου του NMI, εδώ ονομάζεται ισομορφή Β [5], [24] (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ)? 2. Η μυοσίνη IC-ισόμορφο Α αντίσωμα είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού που εγείρεται έναντι του μυοσίνης IC ισόμορφο Α ειδική Ν-τερματικό πεπτίδιο και αναγνωρίζει αποκλειστικά μυοσίνης IC ισόμορφο Α [17] (Σχήμα 1Α). Τα μονοκλωνικά αντισώματα σε β-ακτίνη και το SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο (SV40-tag) ελήφθησαν από την Sigma (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) και EMD Millipore (EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ), αντίστοιχα. Η συζευγμένη υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού λήφθηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, ΡΑ).

Ανίχνευση μυοσίνης IC ισομορφών Α και Β πρωτεΐνη σε διάφορες κυτταρικές σειρές θηλαστικών με ανάλυση ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για μυοσίνης IC ισομορφές Α, Β ισομορφή, SV40 μεγάλο Τ-αντιγόνο (Tag) και ακτίνη (έλεγχος). Α) Σχηματική ειδικών αλληλουχιών μυοσίνης ισομορφή IC και θέση αναγνώρισης των αντισωμάτων. Απεικονίζεται είναι η 5 ‘περιοχή του

MYOIC

γονιδίων θηλαστικών με τα εξώνια που κωδικοποιούν ισομορφή συγκεκριμένη Ν-τερματικό πεπτίδια. Οι θέσεις έναρξης της μετάφρασης για τις ισομορφές αναφέρονται ως οι Ν-τερματικές ακολουθίες αμινοξέων. Υπογραμμισμένα είναι οι αλληλουχίες πεπτιδίου που χρησιμοποιήθηκε ως ανοσογόνο για τη δημιουργία ισομορφή-ειδικά αντισώματα. Β) Αντιπροσωπευτικά ανοσοστύπωμα εκχυλισμάτων κυττάρων που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Οι δείκτες σχετικές μοριακού βάρους υποδεικνύεται στα αριστερά σε kD. Γ) Ιστόγραμμα που παρουσιάζει το μέσο όρο πυκνομετρική ένταση της μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με ακτίνη. Α) Ιστόγραμμα που παρουσιάζει το μέσο όρο πυκνομετρική ένταση της έκφρασης ισομορφής Β ομαλοποιήθηκε σε ακτίνη. Μυοσίνης IC ισόμορφο Α πρωτεΐνη εκφράζεται έντονα σε κύτταρα COS-7 και το ανθρώπινο και του προστάτη ποντικού καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και TRAMP-C2. Σε αντίθεση, μυοσίνη IC πρωτεΐνη ισομορφή Β εκφράζεται σε συγκρίσιμα επίπεδα σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση? n = 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Οι κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια ιστών

COS-7, A-431, MCF-7, TRAMP-C1, DU 145, 22Rv1, RWPE-1 , και τα κύτταρα PC-3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). OVCAR-3 κύτταρα, αρχικά λαμβάνονται από την ATCC, ήταν γενναιόδωρα από τον Dr. Arthur M. Edelman (Τμήμα Φαρμακολογίας και Τοξικολογίας του Πανεπιστημίου στο Buffalo, Buffalo, NY, USA). κύτταρα As4.1 [25] ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Kenneth W. Gross [Τμ Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY, USA]. κύτταρα TRAMP-C2 [26] ήταν ένα είδος από το Δρ Μπάρμπαρα Foster (Τμήμα Φαρμακολογίας και Θεραπευτικής, RPCI, Buffalo, NY, USA). COS-7, Α431, και As4.1. κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). MCF-7 και DU 145 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και 0,01 mg /ml ινσουλίνη (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ). PC-3 και 22Rv1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. OVCAR-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI μέσα συμπληρωμένα με 20% FBS και 0,01 mg /ml ινσουλίνη. TRAMP-C1 και TRAMP-C2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένου με 5% FBS, 5% ορό Νυ IV (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 5 mg /ml ινσουλίνη και 10 nmol /L διυδροτεστοστερόνη (Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA). κύτταρα RWPE-1 αναπτύχθηκαν σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Invitrogen Carlsbad, CA, USA? Kit Catalog # 17005-042) συμπληρωμένο με 0.05 mg ml εκχύλισμα /υπόφυσης βοοειδούς (ΒΡΕ) και 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF ). Επιπλέον, όλα τα κύτταρα συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Δείγματα ιστών

Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού από 22 εβδομάδες της ηλικίας TRAMP ποντικών καθώς και η ηλικία συμφωνημένα ποντικούς άγριου τύπου αγοράστηκαν από τον όγκο Mouse Model Resource στο RPCI (Buffalo, ΝΥ, USA). Οι ιστοί συλλέχθηκαν σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο 890M του όγκου του τραπεζικού πρωτόκολλο RPCI για το Ποντίκι μοντέλα όγκου των πόρων. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από IACUC Roswell Park Cancer Institute του (Θεσμικές Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης). Τα ζώα θανατώθηκαν με υπερβολική δόση αναισθησία ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Όλα προστάτη και καρκινικών ιστών είχαν μικροδιατομή κατά τη νεκροψία, flash-κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Πέντε-micron-παχύ τομές παραφίνης συμφωνημένα τομές ιστών αγοράστηκαν από την ίδια πηγή.

Immunohistrochemistry

παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα ιστού-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν με το αλκοόλ, και τοποθετήθηκαν σε dH

2O πριν να υποστούν πρότυπο ανάκτησης αντιγόνου (κιτρικό ρυθμιστικό, ρΗ 6). Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με τη χρήση 3% Η

2O

2 πριν από την επώαση είτε με μυοσίνη IC ισόμορφο Α ή αντισώματα SV40-tag για ανοσοϊστοχημεία σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους. Εικόνες ελήφθησαν με ένα Zeiss Axio Imager Ζ1 (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY, USA) και υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού Adobe Photoshop.

ανοσοκηλίδας ανάλυση

Για την παρασκευή του αργού κυτταρικού εκχυλίσματος, μια ίση αριθμός των κυττάρων λύθηκαν σε SDS δείγμα ρυθμιστικό διάλυμα. Για κάθε ανάλυση που βασίζεται κυτταρική γραμμή, εκτελέστηκαν τρία ανεξάρτητα πειράματα. εκχύλισμα ιστών παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για κάθε ανάλυση που βασίζεται ιστού, αναλύθηκαν οι ιστοί από τρία έως έξι ποντικούς. Ίσοι όγκοι ακατέργαστο εκχύλισμα κυττάρου ή ίσες ποσότητες εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ιστού (40 μg) διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE (ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά την μεταφορά, η μεμβράνη κόβεται σε κατάλληλα μεγέθη και επωάζονται με ειδικά αντισώματα. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στις επιλεγμένες ζώνες με βάση τις σχετικές εντάσεις τους χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα ή δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 μg ολικού RNA από κάθε κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε για να αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript III αντίστροφη μεταγραφάση και ολίγο dT εναρκτήρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του iCycler iQ Real-Time PCR σύστημα ανίχνευσης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και αστάρι που αναγνωρίζουν ειδικά το ποντίκι και την ανθρώπινη μυοσίνη IC ισομορφή Α (

ο homo sapiens:

NM_033375. 4?

mus musculus

: XM_006532429.1) και το ποντίκι και την ανθρώπινη μυοσίνη IC ισομορφή Β (

homo sapiens:

NM_001080950.1?

mus musculus:

NM_001080775). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, εις τριπλούν ομαλοποιήθηκαν με το μέσο όρο του γονιδίου GAPDH καθαριότητας. Ο εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε για qRT-PCR περιγράφονται στο [18].

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα δίνονται ως μέσοι ± τυπικές αποκλίσεις. Η κανονικότητα των δεδομένων ελέγχθηκε με τη δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov. Η διαφορά μεταξύ συνόλων δεδομένων ελέγχθηκε με t-test του Student. Οι αποκλίσεις θεωρούνται σημαντικές στο επίπεδο του

σ

& lt? 0.01.

Αποτελέσματα

Έχουμε προηγουμένως αναλύσει τα πρότυπα έκφρασης της μυοσίνης IC ισομορφών σε 33 όργανα και τους ιστούς του ποντικιού και διαπίστωσε ότι μυοσίνης IC ισομορφή Α αλλά δεν ισόμορφου Β εκφράζεται σε ένα ιστό ειδικό τρόπο [ ,,,0],18]. Έχουμε επεκταθεί τώρα ανάλυσή μας για την έκφραση της πρωτεΐνης και του mRNA της μυοσίνης IC ισομορφών σε ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών θηλαστικών. Για την ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης, εκτελέσαμε ανάλυση ανοσοστυπώματος των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων χρησιμοποιώντας μυοσίνη IC ισομορφής ειδικά αντισώματα (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β και C, εκτός του πράσινου Αφρικανικού πιθήκου νεφρική κυτταρική σειρά COS-7 (όπου ήταν αρχικά ανιχνευθεί και που χαρακτηρίζεται από [18]) μυοσίνης IC ισόμορφο Α πρωτεΐνη εκφράζεται έντονα στον ανθρώπινο και του προστάτη ποντικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές TRAMP -C1, TRAMP-C2, DU 145, 22Rv1, και PC-3, αλλά όχι στην κυτταρική σειρά προστάτη μη καρκινικό RWPE-1. Επιπλέον, η μυοσίνη IC ισόμορφο Α δείχνει μόνο χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε άλλα καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων ανθρώπινο δέρμα (Α-431), του μαστού (MCF-7), και των ωοθηκών (OVCAR-3) καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επειδή η κυτταρική γραμμή COS-7 που προέρχονται από μετασχηματισμό με μία αρχή ατελές μετάλλαγμα του SV40 που εξακολουθούν να κωδικοποιεί το SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο (SV40-tag) [27], ελέγξαμε επίσης την As4.1 κυτταρική σειρά που δημιουργήθηκε από τα κύτταρα του ένα διαγονιδιακό ποντίκι με ενδοπαρεγχυματική όγκος νεφρού που επάγεται από στοχευμένες ογκογένεσης με ένα κατασκεύασμα σύντηξης SV40-Tag και επίσης εκφράζει SV40-Tag [25]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, COS-7 και As4.1, εκφράζουν SV40-tag αλλά μόνο COS-7 κύτταρα δείχνουν ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης της μυοσίνης IC ισομορφής A. Σε αντίθεση με αυτή την κυτταρική σειρά-ειδική έκφραση της μυοσίνης IC ισόμορφο Α, μυοσίνη IC ισομορφή Β εκφράζεται παντού σε συγκρίσιμα επίπεδα σε όλες αναλύθηκαν κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α & amp? Β).

Για να προσδιοριστεί εάν η έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίζεται με την έκφραση mRNA, εμείς επόμενο αναλύθηκαν mRNA έκφραση των ισομορφών χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) με ισομορφής-ειδικό εναρκτήρα (Σχήμα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, βρήκαμε ότι τα προφίλ έκφρασης του mRNA της μυοσίνης IC ισομορφών Α και Β συσχετίζονται με το προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης. Συγκρίσιμα με τα δεδομένα πρωτεΐνη, η έκφραση του mRNA της μυοσίνης IC ισομορφής Α είναι μόνο πλούσια σε COS-7, TRAMP-C1, TRAMP-C2, DU 145, 22Rv1, και PC-3 κύτταρα ενώ μυοσίνης IC ισόμορφου Β mRNA εκφράζεται παντού σε όλα αναλύθηκαν κυτταρικές σειρές.

Ανίχνευση μυοσίνης IC ισομορφών επίπεδα Α και Β mRNA σε διάφορες κυτταρικές σειρές θηλαστικών με qRT-PCR χρησιμοποιώντας ισομορφή-ειδικό αρχικό τεμάχιο. Α) Σχηματική παράσταση περιοχή 5 ‘του

MYOIC

γονίδιο και η προκύπτουσα ισομορφή Α και Β mRNAs. Η θέση αλληλουχίας στόχου του εκκινητή που χρησιμοποιείται για qRT-PCR για την ανίχνευση μυοσίνη IC ισομορφών υποδεικνύονται με βέλη. Β) Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR των επιπέδων έκφρασης mRNAs του μυοσίνης IC ισόμορφο Α κανονικοποιημένη προς GAPDH. Γ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση των επιπέδων έκφρασης mRNAs του μυοσίνης IC ισομορφής Β ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Μυοσίνης IC ισόμορφο Α mRNA έκφρασης έχει υψηλή περιεκτικότητα σε COS-7 κύτταρα και του ανθρώπινου και του προστάτη ποντικού καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και TRAMP-C2. Σε αντίθεση, η μυοσίνη IC ισομορφή Β mRNA εκφράζεται σε συγκρίσιμα επίπεδα σε όλες τις ανέλυσε τις γραμμές ell. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο για

±

τυπική απόκλιση? n = 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ένα εντυπωσιακό παρατήρηση της ανάλυσής μας του μυοσίνης IC έκφρασης ισόμορφου σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές είναι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε ποντικού και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη, όταν σε σύγκριση με την κανονική (μη-καρκίνου) κυτταρική σειρά προστάτη RWPE-1 και σε άλλες (μη προστάτη) καρκινικές κυτταρικές γραμμές, όπως συνοψίζονται στον πίνακα 1. Αυτό είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, επειδή προηγούμενες αναλύσεις μας των ιστών και των οργάνων ποντίκια έδειξε μια πολύ χαμηλή έκφραση μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε φυσιολογικό προστάτη ποντικού [18]. Σε συνδυασμό με τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης της ισομορφής Α στον ανθρώπινο φυσιολογικό κυτταρική σειρά προστάτη RWPE-1, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στη μυοσίνη IC ισόμορφο Α έκφραση θα μπορούσε να συσχετιστεί με την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη.

Η

Για να διερευνήσουν τη δυνατότητα αυτή, αναλύσαμε μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφρασης σε διάφορους ιστούς από το ποντίκι TRAMP. TRAMP είναι μια διαγονιδιακή γραμμή του C57BL /6 ποντίκια που εκφράζουν ένα κατασκεύασμα που περιέχει το ελάχιστο -426 /+ 28 ρυθμιστικό στοιχείο του υποκινητή probasin αρουραίου να στοχεύσει την έκφραση του SV40 μεγάλου Τ αντιγόνου σε προστάτη επιθήλιο [21]. Το μοντέλο TRAMP είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο καρκίνου του προστάτη καθώς μιμείται στενά ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Αυθόρμητη προόδου των όγκων στον προστάτη TRAMP ξεκινά από 8 έως 12 εβδομάδες ηλικίας, και το 100% των ποντικών αναπτύξουν καρκίνο του προστάτη από την ηλικία των 20 εβδομάδων. Στη συνέχεια, η μετάσταση μπορεί να συμβεί σε απομακρυσμένες θέσεις, όπως την εξέλιξη των όγκων [20], [28], [29].

Σχήμα 3 δείχνει την ανοσοϊστοχημική ανάλυση αντιπροσωπευτικών άγριου τύπου και TRAMP προστάτη ποντικού από ποντικούς από 22 εβδομάδων ηλικία. Οι ιστοί TRAMP εμφανίζουν τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με βλάβες PIN και χρωματίζονται θετικά για την πυρηνική SV40-Tag [23] (Σχήμα 3Α & amp? Β). Η ανάλυσή μας της μυοσίνης IC έκφρασης ισόμορφου σε αυτούς τους ιστούς έδειξε μια σημαντικά αυξημένη παρουσία μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε κύτταρα που σχετίζονται με χαρακτηριστικές αλλοιώσεις PIN ποντικών TRAMP όταν συγκρίνονται με κύτταρα του άγριου ιστού τύπου προστάτη στην οποία η μυοσίνη IC ισόμορφο Α είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη (Εικόνα 3C & amp? D). Σε αντίθεση, τόσο φυσιολογικό και TRAMP προστάτη λεκέ ιστός θετικά για ισομορφή Β (Σχήμα 3 Ε & amp? F).

αντιπροσωπευτική εικόνα των ανοσοϊστοχημική ανάλυση του SV40-tag (amp A &? Β), μυοσίνης IC ισόμορφο Α (C & amp? D), και ισόμορφο Β (Ε & amp? F) έκφραση σε αδένες προστάτη του 22 εβδομάδες της ηλικίας άγριου τύπου (αριστερή στήλη) και TRAMP (δεξιά στήλη) ποντικούς. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 20χ. Οι ιστολογικές μεταβολές του προστάτη ποντικού TRAMP που σχετίζονται με βλάβες PIN είναι προφανείς (αριστερή στήλη, Β, D, F). Όπως αναμενόταν, SV40-tag ανοσοχρώση είναι αρνητική σε άγριου τύπου προστάτη (Α) και έντονα πυρηνική σε TRAMP προστάτη (Β). Μυοσίνης ισομορφή IC Α δείχνει πολύ αδύναμο ανοσοχρώση σε άγριου τύπου προστάτη ιστού (C), αλλά ισχυρή, κυρίως κυτταροπλασματική χρώση σε TRAMP προστάτη με βλάβες PIN (D). Μυοσίνης IC ισομορφή Β δείχνει ισχυρή χρώση στα δύο, άγριου τύπου και TRAMP, προστατικό ιστό (Ε & amp? F).

Η

Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία της μυοσίνης IC ισομορφής Α σε ιστούς που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη, αναλύσαμε διάφορους ιστούς TRAMP όγκο του προστάτη που αποτελείται είτε από πλευρική και κοιλιακό (LV) ή της ραχιαίας, αργότερα, και κοιλιακό προστάτη (DLV). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η μυοσίνη IC ισόμορφο Α τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ιστούς όγκων του προστάτη από TRAMP ποντικών σε σύγκριση με τους ιστούς του προστάτη άγριου τύπου που δείχνουν μόνο ελάχιστα ανιχνεύσιμη μυοσίνης IC ισόμορφο Α επίπεδα έκφρασης (Σχήμα 4Α & amp? Β και [18] ). Επιπλέον, αναλύσαμε ιστούς όγκων από απομακρυσμένη μετάσταση θέση, δηλ πνεύμονα και όγκους του ήπατος. Παρόμοια με τους ιστούς του προστάτη, του ήπατος και των πνευμόνων όγκους παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε μυοσίνη IC ισόμορφο Α έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης σε άγριου τύπου φυσιολογικού πνεύμονα και το ήπαρ τους ιστούς [Σχήμα 4Α & amp? Β και [18]]. Περαιτέρω εξέταση μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφραση με qRT-PCR επιβεβαίωσε ότι η αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης σε TRAMP προστάτη και απομακρυσμένων μεταστάσεων τοποθεσία συσχετίζεται με σημαντική αύξηση του μυοσίνης IC ισόμορφο Α mRNA έκφρασης σε αυτούς τους ιστούς (Σχήμα 4C).

εκχυλίσματα προστάτη ιστός που αποτελείται από ραχιαία, πλευρική, και κοιλιακά (DLV) ή πλευρική και κοιλιακό (LV) του προστάτη από 22 εβδομάδων TRAMP ηλικία ή αντίστοιχης ηλικίας ποντικοί άγριου τύπου αναλύθηκαν για πρωτεΐνη και mRNA έκφραση όπως και εκχυλίσματα ιστού από πνεύμονα και το ήπαρ μεταστάσεις των TRAMP και συμφωνημένα ιστούς των ποντικών άγριου τύπου. Α) Αντιπροσωπευτική ανοσοστυπώματα εκχυλισμάτων ιστού ποντικού που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Οι δείκτες σχετικές μοριακού βάρους υποδεικνύεται στα αριστερά σε kD. Β) Ιστόγραμμα που παρουσιάζει το μέσο όρο πυκνομετρική ένταση της ισομορφής Μια έκφραση κανονικοποιημένη να ακτίνης. Γ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση των επιπέδων έκφρασης mRNAs του μυοσίνης IC ισόμορφο Α κανονικοποιημένη προς GAPDH. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση? n = 3-6 (αριθμός ιστούς που ελέγχθηκαν το καθένα από ένα διαφορετικό ζώο). * P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό

Η

Συζήτηση

Μια ανάλυση της μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφρασης σε ιστό προστάτη και απομακρυσμένες μεταστάσεις ιστοσελίδα σε ποντίκια TRAMP ή αντίστοιχης ηλικίας ποντίκια άγριου τύπου έδειξαν ότι μυοσίνης IC ισόμορφο Α είναι σημαντικά μεγαλύτερο εκφράζεται σε όγκους του προστάτη σε σχέση με την κανονική ποντικού προστάτη, του πνεύμονα, του ήπατος ή ιστούς. Αυτό είναι, εξ όσων γνωρίζουμε, η πρώτη έκθεση που τεκμηριώνουν την αλλαγή ενός μυοσίνης IC έκφραση ισομορφή σε σχέση με τον καρκίνο. Οι πιθανές βιολογικές και φυσιολογικές συνέπειες της υπερέκφραση της μυοσίνης IC ισόμορφο Α σε ιστούς όγκων είναι επί του παρόντος υπό εξέταση στο εργαστήριο μας.

Εκτός από τη δημιουργία ενός συνδέσμου μεταξύ της μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφρασης και του καρκίνου, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι παρεκκλίνουσα μυοσίνης IC ισόμορφο Α αλλαγές έκφραση μπορεί να συνδέονται ειδικά με μεταγραφικές αλλαγές που σχετίζονται με την εμφάνιση του καρκίνου του προστάτη. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από διάφορες παρατηρήσεις. προηγούμενη ανάλυσή μας της μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφραση σε δείγματα ιστού ποντικού [18] έδειξε ότι αυτή η συγκεκριμένη ισομορφή δείχνει υψηλή έκφραση μόνο στο νεφρό, επινεφρίδια, το πάγκρεας, και ένα υποσύνολο λιπώδεις ιστοί. Δείχνουμε τώρα σημαντικά αυξημένη έκφραση σε προστάτη, του πνεύμονα, και ιστοί όγκου του ήπατος καρκίνο του προστάτη από το ποντίκι TRAMP όταν συγκρίνεται με τους ιστούς αγρίου τύπου.

Το μοντέλο καρκίνου του προστάτη TRAMP βασίζεται στον προστάτη-ειδική έκφραση του η ογκοπρωτεΐνη SV40-tag [21]. Το μεγάλο Τ αντιγόνο του SV40 δρα μέσω διαφόρων οδών συμπεριλαμβανομένης αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών ρ53 και Rb, καθώς και τη μεταγραφική ενεργοποίηση ενός αριθμού πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ογκογένεση [22]. Επειδή SV40-Tag είναι μια καθολική και όχι ένα καρκίνο του προστάτη-ειδικού ογκογονιδίου που έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως ένα μοντέλο πολλών άλλων τύπων καρκίνου [30], θα μπορούσε να ήταν δυνατό ότι οι αλλαγές στην μυοσίνη IC ισόμορφο Α έκφραση επάγονται μέσω των ενεργειών του SV40-Tag ανεξάρτητα από τον τύπο του καρκίνου. Ωστόσο, η ανάλυση μας έδειξε ότι ισόμορφο Α έκφραση δεν αλλοιώθηκε στη As4.1 κυτταρική σειρά που δημιουργήθηκε από το υγρό ασκίτη ενός εξάμηνος παλαιός διαγονιδιακό ποντίκι με ένα ενδοπαρεγχυματική όγκος νεφρού που επάγεται από διαγονίδιο στοχευμένες ογκογένεση μέσω SV40-tag συντηγμένη με τον υποκινητή της ρενίνης [25]. Επιπλέον, βρήκαμε μυοσίνης IC ισόμορφο Α έκφραση μεταβάλλεται στις κυτταρικές γραμμές TRAMP-C2 ότι TRAMP-C1 και, αν και προέρχονται από ποντίκια TRAMP, δεν εκφράζουν SV40-Tag [26]. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης αυξημένη ισομορφή Μια έκφραση στο SV40-tag ανεξάρτητος ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC-3, DU 145, και 22Rv1 αλλά όχι στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη μη καρκινικό RWPE-1 ή σε οποιαδήποτε από τις άλλες μη -prostate καρκινικές κυτταρικές σειρές. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η μυοσίνη IC ισόμορφο Α αλλαγές έκφρασης είναι ταυτόχρονη με τον καρκίνο του προστάτη συγκεκριμένη τροποποίηση σε κυτταρικά προφίλ έκφρασης αντί-ειδική SV40-Tag αλλαγές έκφρασης.

Ενώ το πρότυπο έκφρασης του μυοσίνης ΙΑ ισόμορφο Α σε πρέπει να αναλυθεί περαιτέρω, ο καρκίνος του προστάτη ποντικού ανθρώπου και των αποτελεσμάτων μας εδώ, που δείχνουν μια υπερέκφραση σε ανθρώπινο και του προστάτη κύτταρα ποντικού σειρές καρκίνου και σε καρκίνο του προστάτη που σχετίζεται ιστούς ποντικού, υποδεικνύουν έντονα ότι ειδικά μυοσίνης IC ισόμορφο α θα μπορούσε να είναι μια πιθανή διαγνωστικός δείκτης για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη.

Ευχαριστίες

με ιδιαίτερη χαρά ανακοινώνουμε την κα Ellen Karasik για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια της με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Wade Sigurdson και ο Δρ Joan Baizer για βοήθεια σχετικά με μικροσκοπική απεικόνιση.