Αφηρημένο

Ιστορικό

Διαγράφεται καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1) είναι ένα Rho ΟΤΡάσης-πρωτεΐνης ενεργοποίησης (RhoGAP) διαγράφεται συχνά και υποεκφράζεται σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), καθώς και σε άλλους καρκίνους. Πρόσφατες ανεξάρτητες μελέτες έχουν δείξει αλληλεπίδραση του DLC1 με μέλη της tensin εστιακής οικογένειας πρωτεϊνών προσκόλλησης σε ένα μηχανισμό που εξαρτάται από τον τομέα Src ομολογίας 2 (SH2). DLC1 και tensins αλληλεπιδρούν και συν-εντοπίζεται σε στικτή δομές σε εστιακές συμφύσεις. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ DLC1 και διάφορα tensins παραμένουν αμφιλεγόμενα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης να προσδιορίσει ένα προηγουμένως αδήλωτοι θέση πρόσδεσης στο 375-385 της DLC1 που κατά κύριο λόγο συναλλαγές με την (PTB) περιοχή πρόσδεσης φωσφοτυροσίνης της tensin2. αλληλεπίδραση DLC1-tensin2 είναι πλήρως καταργηθεί σε ένα μεταλλαγμένο DLC1 δεν έχουν αυτή την θέση πρόσδεσης του μυθιστορήματος PTB (DLC1ΔPTB). Ωστόσο, όπως αποδεικνύεται από ανοσοφθορισμό και συν-ανοσοκαταβύθιση, ούτε το εστιακό εντοπισμού προσκόλληση ούτε την αλληλεπίδραση με tensin1 και C-τερματικό tensin-σαν (cten) επηρεάστηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι, η λειτουργική σημασία αυτού νέα θέση εκτέθηκε από τη μερική μείωση της δραστηριότητας RhoGAP, η οποία, με τη σειρά του, εξασθένησε την αύξηση-κατασταλτική δράση του DLC1 κατά την αφαίρεσή του από DLC1.

Συμπεράσματα /Σημασία

η μελέτη προσέφερε νέα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι DLC1 αλληλεπιδρά επίσης με tensin2 σε PTB domain-εξαρτώμενο τρόπο. Εκτός από τη σωστή εντόπιση συμφύσεων και τη διατήρηση της δραστηριότητας RhoGAP, αλληλεπίδραση DLC1 με tensin2 μέσω αυτού του νέου εστιακό σημείο δέσμευσης πρόσφυση συμβάλλει στην ανάπτυξη-κατασταλτική δράση των DLC1

Παράθεση:. Chan LK, Ko FCF, Ng IO- L, Yam JWP (2009) Διαγράφεται Καρκίνος του ήπατος 1 (DLC1) χρησιμοποιεί μια νέα θέση σύνδεσης για αλληλεπίδραση Tensin2 PTB τομέα και απαιτείται για Tumor-Κατασταλτικός Λειτουργία. PLoS ONE 4 (5): e5572. doi: 10.1371 /journal.pone.0005572

Επιμέλεια: Neil Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 21 του Ιανουαρίου του 2009? Αποδεκτές: 15, Απριλίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: May 15, 2009

Copyright: © 2009 Chan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Συμβούλιο του Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας (HKU 7674 /06M και HKU 1 /06C) και τον Michael Kadoorie Καρκίνος Γενετική ερευνητικού προγράμματος του Φιλανθρωπικού Ιδρύματος Kadoorie. I.O.L. Ng είναι Loke Yew Καθηγητής Παθολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το μικρό, μονομερή G-πρωτεΐνες Rho έχει κλασικά ορίζεται ως βασική βιολογική ρυθμιστής της ακτίνης του κυτταροσκελετού [1] – [3]. Με τη σειρά του, ο κύκλος εργασιών δυναμική κυτταροσκελετού ελέγχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών αποκρίσεων που σχετίζονται, που κυμαίνονται από τον ορισμό του σχήματος του κυττάρου για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης, προσκόλλησης κυττάρου και την εξάπλωση των κυττάρων [4], [5]. Ωστόσο, ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδεικνύει ότι Rho εμπλέκεται επίσης στην ελέγχουν σημαντικές βιολογικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η κυτταρική εισβολή και τη μεταγραφή γονιδίων [6] – [11]. Rho εμπλέκεται στην καρκινογένεση, καθώς έχει βρεθεί ότι ενεργοποιείται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [12], [13].

διαγράφεται στον καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1)

είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8p21.3-22 και έχει δειχθεί ότι είναι συχνά ανέκφραστη σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [14] – [23].

DLC1

κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη RhoGAP πολλαπλών τομέα με εκλεκτική δράση προς RhoA, Β και C και λιγότερο προς CDC42 αλλά όχι Rac1 [23], [24]. Εκτεταμένες μελέτες έχουν δείξει ότι DLC1 χρησιμοποιεί αυτή τη δραστηριότητα RhoGAP να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [15], [18], [23], [25] – [29], η απόπτωση σκανδάλη [25] και για τη μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης [26], [28 ], εισβολή των κυττάρων και το προκύπτον καρκίνος μετάσταση σε κυτταρικές σειρές, καθώς και μοντέλα ποντικών με διαφορετικές προελεύσεις ιστού [29] – [31]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, ο ρόλος της DLC1 ως

καλόπιστους

ογκοκατασταλτικό στο HCC επιβεβαιώθηκε από ένα μοντέλο ποντικού με το συκώτι-ειδική, σύντομη-φουρκέτα RNA μεσολάβηση DLC1 νοκ ντάουν [32]. Αν και ο ρόλος της DLC1 στην προστασία των κυττάρων από καρκίνο σχετίζονται με τις ιδιότητες έχει καταστεί σαφές, ερωτήσεις σχετικά με τη βιολογική ρύθμιση του παραμένουν αναπάντητα.

μεταγραφικά,

DLC1

έκφρασης έχει βρεθεί να σιωπήσουν επιγενετικώς σε διάφορες ανθρώπινων καρκίνων. Η υπερμεθυλίωση της περιοχής του γονιδίου υποκινητή καταστέλλεται

DLC1

γονιδιακή μεταγραφή και έκφραση σε διαφορετικούς ιστούς [16], [17], [19], [22], [24], [33] – [35]. Μετα-μεταφραστικά, DLC1 αρουραίου έχει δειχθεί ότι να φωσφορυλιωθεί από κινάση Akt [36]? Ωστόσο, η εμφάνισή της στην ανθρώπινη DLC1 και η βιολογική σημασία του είναι ακόμα υπό εξέταση. Από την άλλη πλευρά, μια πρόσφατη μελέτη προσδιόρισε μεταλλάξεις DLC1 στον προστάτη και του μαστού σε συγκεκριμένα τυροσίνης και σερίνης. Αυτές οι μεταλλάξεις απενεργοποιούν δραστηριότητα DLC1 RhoGAP μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού [37]. Μέχρι σήμερα, το καλύτερα χαρακτηρισμένο ρύθμιση του DLC1 στο επίπεδο πρωτεΐνης είναι η αλληλεπίδρασή του με tensin πρωτεΐνες [27], [28], [38]. Tensins είναι εστιακής προσκόλλησης πρωτεΐνες που μεταφέρουν Src ομολογίας 2 (SH2) και δέσμευσης φωσφοτυροσίνης (ΡΤΒ) στα C-άκρα τους [39]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι DLC1 αλληλεπιδρά με πολλαπλά tensins. Σε γενικές γραμμές, DLC1 χρησιμοποιεί ένα μοτίβο δέσμευσης SH2 περιλαμβάνει την Y442 υπόλειμμα για να αλληλεπιδράσει με τον τομέα SH2 των tensin1 και C-τερματικό tensin-σαν (cten). Μετάλλαξη σε Y442 προκάλεσε DLC1 να χάσουν εστιακό εντοπισμό πρόσφυση και κατασταλτική του όγκου της δραστηριότητας. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι tensin σύνδεσης είναι ένας βασικά ρυθμιστικά εκδήλωση στον υποκυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία κατασταλτική του όγκου του DLC1 [27], [28]. Ωστόσο, έχουμε τεκμηριωμένη προηγουμένως αλληλεπιδράσεις μεταξύ DLC1 και tensin2 PTB τομέα [38]. Έτσι, ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ DLC1 και διάφορα tensins και βιολογικές επιπτώσεις της είναι ακόμα αμφιλεγόμενη.

Στην παρούσα μελέτη, ανακαλύψαμε ένα μηχανισμό μεταξύ DLC1 και tensin2 δεσμευτική μυθιστόρημα, εντοπίζοντας μια μη τεκμηριωμένη θέση πρόσδεσης στο DLC1, άλλα από το μοτίβο σύνδεσης SH2 περιγραφεί από άλλους, για την αλληλεπίδραση με τον τομέα tensin2 PTB. Αυτή η νέα ιστοσελίδα ήταν καλά συντηρημένο σε οικογένειες DLC. Πρέπει επίσης να παρέχουν την πρώτη απόδειξη για tensin2 αλληλεπίδρασης ως κοινό χαρακτηριστικό DLC1 και DLC2. Εκτός από το μηχανισμό δέσμευσης, αποδείξαμε επίσης τη λειτουργική σημασία αυτής της θέσης πρόσδεσης μυθιστόρημα στη ρύθμιση της δραστηριότητας κατασταλτική του όγκου των DLC1.

Αποτελέσματα

Η tensin2 περιοχή PTB απαιτήθηκε για την αλληλεπίδραση DLC1

Δείξαμε ότι το ο-άκρο tensin2 θραύσμα, συμπεριλαμβανομένων των τομέων SH2 και ΡΤΒ (SH2-PTB στο Σχ. 1 Β), ήταν αρκετή για να δεσμεύσει DLC1 (Εικ. 1Α). Για να αξιολογηθεί η σημασία των επιμέρους τομέων στην αλληλεπίδραση DLC1, έχουμε ετοιμάσει αρκετές μεταλλάξεις διαγραφής tensin2 συμπεριλαμβανομένων tensin2 ΔSH2ΔPTB, ΔSH2 και ΔPTB και δοκιμαστεί συγγένεια σύνδεσης τους προς DLC1 (Εικ. 1Β). Tensin2 ΔSH2ΔPTB έδειξαν σταθερά μια πλήρη απώλεια της δέσμευσης DLC1. Σε αντίθεση με άλλες εκθέσεις, βρήκαμε ότι η κατάργηση του τομέα SH2 στη tensin2 μείωσε εν μέρει μόνο δεσμευτική DLC1. Είναι ενδιαφέρον ότι, αφαιρώντας τον τομέα ΡΤΒ σε tensin2 ήταν επαρκής για την πλήρη κατάργηση της αλληλεπίδρασης DLC1, υποδεικνύοντας ότι ο τομέας ΡΤΒ απαιτείται για την πρόσδεση (Εικ. 1 C). Έχει αναφερθεί ότι DLC1 Y442 και S440 σχηματίζουν ένα μοτίβο πρόσδεσης φωσφο-ανεξάρτητος για τον τομέα SH2 των tensin1 και cten [27], [28]. Εμείς επόμενη ελέγχεται η διατήρηση αυτών των υπολειμμάτων σε σύνδεση στην περιοχή tensin2 SH2. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι DLC1 Y442F και μεταλλάξεις S440A έδειξε μόνο μια μερική μείωση tensin2 δεσμευτική. Για να ελεγχθεί αν Y442 και S440 μεσολαβήσει στην αλληλεπίδραση με τον τομέα tensin2 SH2, ελέγξαμε τη συγγένεια πρόσδεσης μεταξύ DLC1 και tensin2 R1165A, ένα μεταλλαγμένο τομέα SH2 με διαταραγμένη αναγνώριση και πρόσδεση του τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη στόχους. Βρήκαμε ότι η μετάλλαξη στο R1165A σε tensin2 οδήγησε σε πτώση της tensin2-DLC1 δεσμευτική. Παρόμοια συγγένεια σύνδεσης προς R1165A παρατηρήθηκε μεταξύ DLC1 άγριου τύπου, Y442F και S440A. Αυτό έδειξε ότι Y442 και S440 θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική μόνο όταν ο τομέας SH2 της tensin2 ήταν άθικτη (Εικ. 1D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι ένας μηχανισμός τομέα με τη μεσολάβηση SH2 συμβάλλει επίσης στην αλληλεπίδραση DLC1-tensin2.

(Α) Έκφραση tensin2 SH2-PTB κομμάτι (όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι και περιγράφεται στο Σχ. 1Β) ήταν επαρκής για την αλληλεπίδραση με DLC1. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged θραύσμα tensin2 και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. (Β) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη δομή του τομέα της Myc-tagged tensin2 και C-τελικό κουτσουρεμένο μεταλλάξεις του. Οι μεταλλάξεις είτε είχαν δύο τομείς SH2 και PTB (ΔSH2ΔPTB) ή είχαν μεμονωμένες περιοχές που αφαιρούνται (ΔSH2 και ΔPTB). Η SH2-ΡΤΒ ήταν η tensin2 Ο-άκρο που χρησιμοποιούνται στο Σχ. 1Α. (C) Χαρτογράφηση του θέση δέσμευσης DLC1 στην tensin2. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged tensin2 και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Απομάκρυνση του τομέα tensin2 SH2 (ΔSH2) είχε ως αποτέλεσμα τη μερική μείωση της δέσμευσης DLC1. Πλήρης απώλεια DLC1 δέσμευση παρατηρήθηκε κατά την αφαίρεση του τομέως tensin2 PTB (ΔPTB). Η ένταση μπάντα σε κάθε λωρίδα μετρήθηκε στα πάνελ IP και Co-IP και οι αναγνώσεις ομαλοποιήθηκαν σε λωρίδα 2. Οι σχετικές Co-IP-to-IP αναλογίες περιλαμβάνονται επίσης. (Δ) Χαρακτηρισμός της σύνδεσης μεταξύ tensin2 και εστιακή πρόσφυση εντοπισμό ελαττωματικών μεταλλάξεις DLC1. Άγριου τύπου tensin2 ή SH2 μεταλλαγμένο τομέα, R1165A, ήταν συν-επιμολυσμένα με DLC1 άγριου τύπου, Y442F και S440A. Το κυτταρόλυμα υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση με αντι-Μγο αντίσωμα, που ακολουθείται από ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Y442F και S440A έδειξε μερική μείωση tensin2 δεσμευτική, αλλά το μεταλλαγμένο τομέα SH2, R1165A, δεν το έκανε.

Η

Αναγνώριση της περιοχής δέσμευσης tensin2 PTB στο DLC1

επόμενο αμφισβήτηση που περιοχή της DLC1 απαιτείτο για αυτή την αλληλεπίδραση tensin2 τομέα που εξαρτώνται από PTB. Έχουμε στο παρελθόν είχε προτείνει το κέντρο περιοχή 375-509 της DLC1 να είναι η περιοχή που είναι απαραίτητη για την tensin2 αλληλεπίδρασης [38]. Για να εξετάσει ακριβώς αυτό που προτείνει δεσμευτική περιοχή, που κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε διάφορες μεταλλάξεις DLC1 με διαφορετικές αποκοπές που δημιουργούνται στην περιοχή αυτή (Εικ. 2Α). Βρήκαμε ότι η Ν-τέρματα των DLC1 1-400 και 1-440, και τα δύο που δεν έχει την αναφερόμενη θέση πρόσδεσης tensin SH2 (Y442 του DLC1), ήταν επαρκείς για να αλληλεπιδρούν με tensin2. Από την άλλη πλευρά, η αμοιβαία αποκλειστική θραύσμα C-τελικό άκρο 400 σταματά με ένα ανέπαφο θέση σύνδεσης SH2 δεν ήταν επαρκής για να αλληλεπιδρούν με tensin2 (Εικ. 2Β). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν 450-stop, το οποίο δεν περιέχει κανένα θέσεις δέσμευσης προβλέψει tensin, χρησιμοποιήθηκε (Εικ. 2Β). Για την παροχή περαιτέρω αποδείξεων ότι το Ν-άκρο της DLC1 αλληλεπιδράσει με tensin2 μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από τον τομέα ΡΤΒ, ελέγξαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ DLC1 1-400 και τα προαναφερθέντα μεταλλάγματα διαγραφής tensin2. Παρατηρήσαμε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ DLC1 1-400 και tensin2 δεν επηρεάστηκε, ακόμα και όταν ο τομέας SH2 της tensin2 αφαιρέθηκε. Σε αντίθεση, η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο ήταν και πάλι καταργήθηκε όταν απομακρύνθηκε ο τομέας ΡΤΒ του tensin2, υποδεικνύοντας ότι αυτή η σύνδεση ήταν μόνο ΡΤΒ domain-εξαρτώμενο (Σχ. 2C). Για να εντοπίσουμε περαιτέρω το θέση πρόσδεσης PTB σε DLC1, εξετάσαμε τη δέσμευση ενός πάνελ DLC1 θραύσματα Ν-άκρο έως tensin2. Μεταξύ αυτών των θραυσμάτων, βρήκαμε ότι DLC1 1-385 ήταν η μικρότερη θραύσμα που ήταν σε θέση να δεσμεύουν tensin2 (Σχ. 2D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιοχή DLC1 375-385 λειτουργεί ως tensin2 PTB θέση δέσμευσης και απαιτείται για tensin2 δεσμευτική.

(Α) Το Ν-τελικό άκρο της DLC1 ήταν επαρκής για την αλληλεπίδραση με tensin2. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged θραύσμα tensin2 και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. (Β) Το C-τελικό άκρο της DLC1 δεν ήταν σε θέση να δεσμεύσει tensin2. Myc-tagged tensin2 συν-επιμολύνθηκε με δύο DLC1 θραύσματα C-άκρο FLAG-tagged όπως υποδεικνύεται. Αυτά τα θραύσματα DLC1 Ο-άκρο δεν θα μπορούσε να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με tensin2. (Γ) Ν-τερματικό θραύσμα 1-400 είχε εμπλακεί σε tensin2 δέσμευσης ΡΤΒ. FLAG-tagged DLC1 1-400 θα μπορούσε να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με tensin2. Η απομάκρυνση του πεδίου tensin2 SH2 δεν επηρέασε την συγγένεια σύνδεσης προς 1-400, αλλά ένα ανέπαφο πεδίο ΡΤΒ ήταν απαραίτητη για την πρόσδεση. (D) Πρόστιμο χαρτογράφηση η θέση πρόσδεσης PTB στο DLC1. Myc-tagged tensin2 συν-επιμολύνθηκε με ένα πάνελ DLC1 θραύσματα Ν-άκρο FLAG-tagged. θραύσματα FLAG-tagged στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Θραύσμα 1 έως 385 ήταν μικρότερου τμήματος ικανό να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με tensin2. Η ένταση μπάντα σε κάθε λωρίδα μετρήθηκε στα πάνελ IP και Co-IP και οι αναγνώσεις ομαλοποιήθηκαν σε λωρίδα 2. Οι σχετικές Co-IP-to-IP αναλογίες περιλαμβάνονται επίσης.

Η

Διατήρηση tensin2 PTB περιοχή σύνδεσης στο DLC2

Για να ελέγξετε τη βιολογική διατήρηση του χαρτογραφηθεί οι περιοχές δεσμευτικός ως προς όλα τα άλλα μέλη της οικογένειας DLC tensin2, πραγματοποιήσαμε ευθυγράμμιση αμινοξέων μεταξύ DLC1 και DLC2 [40], [41]. Βρήκαμε ότι τόσο οι θέσεις δέσμευσης SH2 και PTB είναι καλά συντηρημένα σε DLC2. Αντίστοιχες σερίνη (S457) και τυροσίνη (Y459) υπολείμματα στο πεδίο σύνδεσης SH2 βρέθηκαν στην DLC2. Η θέση δέσμευσης PTB σε DLC1 375-385 βρέθηκε να ταιριάζει με DLC2 400-410, προτείνοντας έναν πιθανό ρόλο αυτής της περιοχής στη μεσολάβηση ΡΤΒ domain-εξαρτώμενη δέσμευση μεταξύ μελών της οικογένειας DLC και tensin2 (Εικ. 3Α). Με βάση για τη διατήρηση των θέσεων δέσμευσης tensin στο DLC2, υποθέσαμε ότι DLC2 μπορεί να αλληλεπιδράσει με tensin2. Χρησιμοποιώντας συνανοσοκαθίζησης, αποδείξαμε ότι DLC2α και tensin2 αλληλεπιδρούν, η οποία επιβεβαίωσε την κερδοσκοπία μας. Όπως και με DLC1, η δραστηριότητα του RhoGAP DLC2 δεν απαιτείτο για tensin2 αλληλεπίδραση, όπως φαίνεται από τη θετική αλληλεπίδραση του μεταλλαγμένου DLC2 RhoGAP, R740E, με tensin2 (Σχ. 3Β). Εμείς το ερώτημα κατά πόσον DLC2 εντοπίζεται επίσης σε εστιακό συμφύσεις στην SMMC-7721 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η έκφραση του DLC2γ προκάλεσε σοβαρή συρρίκνωση κυττάρου. Για να διευκολυνθεί η παρατήρηση, θα χρησιμοποιηθεί αντί ένα λειτουργικά ανενεργό μετάλλαγμα, DLC2γ R622E, που έφεραν μια μετάλλαξη στο RhoGAP τομέα του [41]. Βρήκαμε ότι DLC2γ R622E μπορούσε συν-εντοπίζονται με βινκουλίνης (Σχ. 3C), υποδεικνύοντας ότι άλλες πρωτεΐνες DLC μπορεί επίσης να εντοπίζεται σε εστιακές συμφύσεις.

(Α) Σχηματική δείχνει το SH2 tensin2 και PTB θέσεις σε DLC1 πρόσδεσης. Μέσα από την ελάχιστη περιοχή 375 έως 509 δεσμευτικές tensin2, τα ξεχωριστά στοιχεία που εμπλέκονται στη διαμεσολάβηση tensin2 δεσμευτική μέσω PTB ή SH2 μηχανισμούς. Αυτά τα στοιχεία είναι καλά συντηρημένες στο παράλογο DLC1, DLC2. Συντηρημένα κατάλοιπα υπογράμμισε. (Β) Η αλληλεπίδραση μεταξύ DLC2 και tensin2 σε RhoGAP-ανεξάρτητο τρόπο. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged tensin2 και GFP-κατασκευάσματα με επισύναψη DLC2 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2. DLC2 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. (C) GFP-DLC2γ έδειξε εστιακό εντοπισμό πρόσφυση σε RhoGA-ανεξάρτητο τρόπο. Έκφραση της GFP-DLC2γ προκάλεσε σοβαρή συρρίκνωση κυττάρων όταν εκφράζεται σε SMMC-7721 κύτταρα. Εστιακή εντόπιση πρόσφυση του DLC2γ RhoGAP μετάλλαξη R622E ανιχνεύθηκε. Η ενδογενής βινκουλίνης έγινε ορατή με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα. μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

DLC1ΔPTB μεταλλαγμένο έδειξε ειδική απώλεια της δέσμευσης tensin2 αλλά διατηρείται εστιακής προσκόλλησης εντοπισμό

της

Για να μελετήσει το ρόλο του tensin2 περιοχή πρόσδεσης PTB της DLC1, έχουμε κλωνοποιημένα τρεις ξεχωριστές μεταλλάξεις DLC1 που είχε ελάχιστη μεταβολές στα ακόλουθα δομικά στοιχεία: Δ375-390 (ΔPTB # 1), Δ375-385 (ΔPTB # 2) και Δ380-390 (ΔPTB # 3), καθένα από αυτά φέρει μια ειδική εσωτερική διαγραφή εντός του PTB τομέα (DLC1ΔPTB) (Σχ. 4Α). Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της περιοχής PTB σε tensin2 δέσμευσης, ελέγξαμε πρώτα την σύνδεση αυτών των μεταλλάξεων με tensin2. Με μία δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθιση, βρήκαμε ότι όλοι οι μεταλλάκτες DLC1ΔPTB έδειξαν απώλεια tensin2 δέσμευσης (Σχ. 4Β). Η απώλεια δέσμευσης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από μειωμένη συν-εντοπισμό μεταξύ DLC1ΔPTB # 1 και tensin2 (Εικ. 4C). Για την αντιμετώπιση της ειδικότητας της αντιστοιχισμένη μοτίβο δέσμευσης ΡΤΒ προς άλλους tensin πρωτεΐνες, εκτελέσαμε έναν προσδιορισμό συν-ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας ένα C-τελικό άκρο του θραύσματος tensin1, 648-stop. Tensin1 648-stop καλύπτει το C-τέρμα SH2 και ΡΤΒ τομέων, τα οποία έχουν αποδειχθεί ότι είναι σημαντικές στην DLC1 δέσμευσης [28]. Έχουμε επιβεβαίωσαν το ρόλο τους στην αλληλεπίδραση DLC1 με μας σύστημα συνανοσοκαθίζησης (Εικ. S1). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι tensin1 648-stop έδειξε συγκρίσιμη συγγένεια δέσμευσης με DLC1 άγριου τύπου και DLC1ΔPTB (Εικ. 4D). Μια θετική αλληλεπίδραση με DLC1 παρατηρήθηκε επίσης όταν cten ανοσοκατακρημνίσθηκε στην δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθισης (Εικ. 4Ε). Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ειδική συμμετοχή αυτού του μοτίβου δέσμευσης PTB με tensin2. Για την αντιμετώπιση κατά πόσον η απομάκρυνση του πεδίου PTB θα μπορούσε να επηρεάσει το εστιακό εντοπισμό πρόσφυση του DLC1, μελετήσαμε τον εντοπισμό του DLC1ΔPTB σε SMMC-7721 κύτταρα HCC με ανοσοφθορισμό. Βρήκαμε ότι DLC1ΔPTB μεταλλάκτες διατηρείται εστιακής προσκόλλησης εντοπισμός τους, όπως υποδεικνύεται από τους συν-εντοπισμό με το εστιακό πρόσφυσης που σχετίζεται με πρωτεΐνη βινκουλίνης. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι η απομάκρυνση της θέσης σύνδεσης PTB σε DLC1 επηρεάζει δέσμευσης του με tensin2 αλλά διατηρεί εστιακό εντοπισμός προσκόλληση της, ενδεχομένως μέσω της αλληλεπίδρασης με άλλους tensins μέσω ενός ΡΤΒ-ανεξάρτητο μηχανισμό πρόσδεσης (Εικ. 4στ).

( Α) Σχηματική δείχνει τη δομή τριών FLAG-tagged μεταλλάκτες DLC1ΔPTB: Δ375-390, Δ375-385 και Δ380-390 (ΔPTB # 1-3). (Β) DLC1ΔPTB έδειξαν μειωμένη tensin2 δεσμευτική. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged tensin2 και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Απομάκρυνση του τομέα δέσμευσης PTB σε DLC1 οδήγησε σε απώλεια της tensin2 δέσμευσης. (C) DLC1ΔPTB έδειξε μειωμένη συν-εντοπισμός με tensin2. SMMC-7721 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με φορέα GFP ή GFP-tensin2 και την ένδειξη της Myc-tagged DLC1. DLC1 οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντι-Μγο αντίσωμα, που ακολουθείται από την Texas Red συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα. μπαρ κλίμακας = 10 μm. (D) DLC1ΔPTB μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με tensin1. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged tensin2 SH2-ΡΤΒ (όπως περιγράφεται στο Σχ. 1 Β) ή Myc-tagged tensin1 C-τελικό άκρο 648-stop (όπως περιγράφεται στην Εικ. S1) και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2 ή tensin1. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Απομάκρυνση του τομέα δέσμευσης PTB σε DLC1 δεν επηρέασε τη δέσμευση tensin1. (Ε) DLC1ΔPTB μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με cten. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-tagged tensin2 ή Myc-tagged cten και FLAG-tagged κατασκευάσματα DLC1 όπως υποδεικνύεται. Εγκεκριμένο κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει tensin2 ή cten. DLC1 στα ιζήματα ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Απομάκρυνση του τομέα δέσμευσης PTB σε DLC1 δεν επηρέασε τη δέσμευση cten. (F) DLC1ΔPTB έδειξε εστιακό εντοπισμό πρόσφυση σε SMMC-7721 κύτταρα. SMMC-7721 κύτταρα παροδικά συν-επιμολυσμένα με GFP-tensin2 και την FLAG-tagged DLC1 όπως υποδεικνύεται. DLC1 οπτικοποιήθηκε με τη χρησιμοποίηση αντι-DLC1 αντίσωμα, που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Η ενδογενής βινκουλίνης έγινε ορατή με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα, που ακολουθείται από την Texas Red-συζευγμένο αντίσωμα. μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

DLC1ΔPTB έδειξε μερική μείωση της δραστηριότητας RhoGAP, αλλά ήταν αρκετή για να καταστείλει το σχηματισμό ινών έντασης ακτίνης

Ενεργά RhoA είναι γνωστός για το ρόλο του στην προσομοίωση ακτίνης ινών στρες σχηματισμός. Όντας ένας αρνητικός ρυθμιστής του RhoA, DLC1 καταστέλλει τον σχηματισμό ινών στρες ακτίνης σε ένα RhoGAP-εξαρτώμενο τρόπο [26]. Χρησιμοποιώντας ακτίνη ίνες στρες ως έμμεση βιολογική ανάγνωση, ρωτήσαμε αν θα επηρεαστεί η δραστηριότητα RhoGAP των μεταλλάξεων DLC1ΔPTB. Βρήκαμε ότι DLC1ΔPTB κύτταρα μεταλλαγμένη επιμολυσμένα έδειξε μειωμένο σχηματισμό ινών έντασης ακτίνης σε σύγκριση με τις γειτονικές μη επιμολυσμένα κύτταρα. Αυτή η παρατήρηση ήταν παρόμοια με εκείνα των εστιακών προσκόλλησης εντοπισμού ελαττωματικού μεταλλάκτες DLC1, Y442F και S440A, καθένα από τα οποία φέρει μία σημειακή μετάλλαξη στο tensin πεδίο σύνδεσης SH2 (Εικ. 5Α). Για την ποσοτικοποίηση άμεσα την αδρανοποίηση RhoA, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία pull-down Rhotekin να καθορίσει τα επίπεδα δραστηριότητας Rho-GTP σε κύτταρα που εκφράζουν διαφορετικές μεταλλάξεις DLC1. Παρά το γεγονός ότι βρήκαμε ότι το μεταλλαγμένο DLC1ΔPTB θα μπορούσε να καταστείλει δραστικότητα Ρο-GTP, ήταν ενδιαφέρον ότι αυτή η καταστολή ήταν λιγότερο αποτελεσματική όταν συγκρίθηκε με εκείνη του άγριου τύπου DLC1 (Εικ. 5Β). Από την άλλη πλευρά, πρέπει να σημειωθεί ότι οι μεταλλάκτες Y442F και S440A έδειξε επίσης μια μείωση στην καταστολή των επιπέδων δραστηριότητας Rho-GTP. Συνολικά, βρήκαμε ότι το μεταλλαγμένο DLC1ΔPTB έδειξε μια μερική μείωση ενδογενή δραστηριότητα RhoGAP, αλλά ότι η δραστηριότητα αυτή ήταν επαρκής για να καταστείλει το σχηματισμό ινών στρες ακτίνης.

(Α) κύτταρα SMMC-7721 HCC διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη Myc σημασμένο με επισύναψη κατασκευάσματα DLC1 και οι ίνες στρες ακτίνης βάφτηκαν με TRITC-συζευγμένο φαλλοειδίνη 1 ώρα μετά την επαγωγή του ορού. Ο αστερίσκος (*) σημειώνει τις DLC1-επιμολυσμένα κύτταρα. DLC1 Y442F, S440A, ΔPTB # 1 και # 2 θα μπορούσε να καταστείλει το σχηματισμό ινών έντασης ακτίνης τόσο αποτελεσματικά όσο DLC1 WT. μπαρ κλίμακας = 10 μm. (Β) κύτταρα ΗΕΚ293Τ διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη FLAG-tagged πλασμίδιο DLC1 για 24 ώρες. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα τον ορό επί 24 ώρες και διεγέρθηκαν με 5 μΜ Λυσοφωσφατιδικό οξέος για 30 λεπτά. Κυτταρόλυμα στη συνέχεια συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε GST-RBD pull-down για RhoA-GTP. Τα δείγματα pull-down υποβλήθηκαν σε ανάλυση SDS-PAGE και ανοσοανιχνεύτηκε με αντι-RhoA αντισώματα. Η ένταση της ζώνης του ενεργού RhoA σε κάθε λωρίδα μετρήθηκε και οι αναγνώσεις ομαλοποιήθηκαν στα κύτταρα μορφομετατραπέντα με φορέα. Η DLC1, τουμπουλίνης και RhoA συνολικά λύμα κυττάρων ανοσοανιχνεύθηκε με αντι-FLAG, αντι-τουμπουλίνης και αντισώματα αντι-RhoA, αντίστοιχα. κύτταρα (C) HeLa επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα μορφώματα DLC1 και επιλέγονται με G418 για 2 εβδομάδες. Οι αποικίες που σχηματίζονται οπτικοποιήθηκαν με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Η μέση διαφορά στην αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικιών μεταξύ των ομάδων βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντική (

ρ

& lt? 0,001? Μονόδρομη δοκιμή ANOVA).

Η

DLC1ΔPTB επέδειξαν μειωμένη δραστικότητα καταστολής της ανάπτυξης

Η ικανότητα της DLC1 να καταστείλει την ανάπτυξη των όγκων έχει τεκμηριωθεί καλά. Εμείς το ερώτημα κατά πόσον οι προαναφερθείσες μεταλλάξεις DLC1ΔPTB εμφανίζεται καμία διαφορά στην DLC1 που προκαλείται από την καταστολή της ανάπτυξης. Σε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των κυττάρων HeLa, άγριου τύπου DLC1 κατέστειλε σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα. Σε αντίθεση, έκτοπη έκφραση των μεταλλαγμένων DLC1ΔPTB οδήγησε σε σημαντικά αυξημένο αριθμό αποικιών, σε σύγκριση με την άγριου τύπου DLC1 (Εικ. 5C). Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι ακόμα και όταν DLC1ΔPTB δείχνει κατάλληλη εστιακή εντόπιση προσκόλληση, η απώλεια αυτής της tensin2 μοτίβο δέσμευσης PTB θα οδηγήσει σε μειωμένη καταστολή της ανάπτυξης, πιθανόν λόγω της μερικής μείωση της δραστηριότητας RhoGAP. Είναι πιθανό ότι η ορθή tensin2 ΡΤΒ συμβάλλει στην DLC1 επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης δεσμευτικός.

Συζήτηση

DLC1 έχει αποδειχθεί ότι ασκεί βιολογικές λειτουργίες που μοιάζουν με αυτές της κλασσικής ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Οι διαφορετικές όγκου-κατασταλτικές επιδράσεις των DLC1 εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία ενός λειτουργικού τομέα RhoGAP [26], [28]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η δραστηριότητα RhoGAP από μόνη της δεν είναι αρκετή για ογκο-κατασταλτική λειτουργία της [26] – [28], [42]. Προηγούμενο δομική ανάλυση από την ομάδα μας παρείχε την πρώτη απόδειξη ότι αυτές οι λειτουργίες της DLC1 θα μπορούσε να αποκατασταθεί μόνον όταν η περιοχή μεταξύ των περιοχών SAM και RhoGAP συμπεριλήφθηκε [26]. Η ταυτοποίηση των tensin2 ως η πρώτη δεσμευτική πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με αυτό λειτουργικά σημαντική περιοχή περαιτέρω υπαινιχθεί τη σχέση μεταξύ της αλληλεπίδρασης tensin2 και λειτουργία DLC1 [38]. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την ανακάλυψη της cten και tensin1 ως δεσμευτικές εταίρους της DLC1 στις μεταγενέστερες μελέτες, πράγμα που σημαίνει ότι είναι βιολογικά σημαντικό για tensin οικογένεια πρωτεϊνών να εργαστούν συνεργατικά με DLC1 [27], [28].

Έχουμε ήδη προτείνει να DLC1 375-509 είναι η ελάχιστη περιοχή δέσμευσης του tensin2. Η περιοχή αυτή καλύπτει τα βασικά κατάλοιπα Y442 και S440, τα οποία προτάθηκαν από άλλες μελέτες ότι αποτελεί θέση πρόσδεσης SH2 για cten και tensin1 [27], [28]. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να παρέχουν άμεση απόδειξη ότι ο τομέας tensin2 SH2 ήταν επαρκής για DLC1 δεσμευτική [38]. Σε αυτή τη μελέτη και την προηγούμενη έκθεσή μας, τα ευρήματά μας με συνέπεια έδειξαν ότι tensin2 PTB, παρά SH2, τομέα αλληλεπιδράσει άμεσα με DLC1.

Υπάρχουν μερικές πιθανές εξηγήσεις για τα αντιφατικά ευρήματα. Πρώτον, αν και οι τομείς SH2 και ΡΤΒ σε tensin πρωτεΐνες έχουν υψηλή ομολογία αλληλουχίας, οι διαφορές στις αλληλουχίες τους μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικούς μηχανισμούς δέσμευσης για DLC1 και άλλα μέλη της οικογένειας tensin. Δεύτερον, διαφορετικές δοκιμασίες πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκαν από διαφορετικές ομάδες για τη μελέτη του μηχανισμού της δέσμευσης μεταξύ tensin και DLC1. Για παράδειγμα, βασιζόμενο σε ζυμομύκητες που δεσμεύσεως και GST προσδιορισμοί pull-down χρησιμοποιήθηκαν από Liao et al. και Qian et al., αντίστοιχα, ενώ η

in vivo

συνανοσοκαθίζησης χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη μας. Τρίτον, θραύσματα C-τελικό άκρο της tensin που περιείχαν είτε μία είτε και οι δύο από τις περιοχές SH2 και PTB χρησιμοποιήθηκαν στην χαρτογράφηση της θέσης δέσμευσης DLC1 στις μελέτες με Liao et al. και Qian et al. Αυτό το πειραματικό σχέδιο υποτίθεται ότι η περιοχή Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης tensin ούτε είχε εμπλακεί στην πρόσδεση ούτε συνέβαλε στην κανονική αναδίπλωση πρωτεϊνών του C-τελικό άκρο της περιοχής.

Στην παρούσα μελέτη, παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι ειδική απομάκρυνση των τομέων SH2 και ΡΤΒ σε tensin2 επηρεάζει δέσμευσης σε διάφορους βαθμούς (Εικ. 1C) DLC1. Να παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η περιοχή PTB διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη σύνδεση DLC1-tensin2, έχουμε χαρτογραφήσει την περιοχή PTB-δέσμευσης στο Ν-τελικό άκρο της DLC1 (Εικ. 2) και επιβεβαίωσε το ρόλο του χαρακτηρίζοντας τις εσωτερικές μεταλλάξεις διαγραφής DLC1ΔPTB (Εικ. 4Α). Εντοπίσαμε ένα χωρίς χαρτιά περιοχή 375-385 της DLC1 ως περιοχή PTB-domain-δεσμευτικές και την αλληλεπίδραση DLC1-tensin2 χάθηκε όταν η περιοχή αυτή αφαιρέθηκε (Εικ. 4Β). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η περιοχή ΡΤΒ αναγνωρίζει μια NPXY μοτίβο, όπως απεικονίζεται στη σύνδεση του με ιντεγκρίνη β [43]. Ωστόσο, αυτό το μοτίβο δεν βρέθηκε σε χαρτογραφήθηκαν περιοχή μας σε DLC1, υποδηλώνοντας ότι ο τρόπος αλληλεπίδρασης PTB μεσολάβηση είναι μια μάλλον άτυπα. Παρά το γεγονός ότι DLC1ΔPTB έδειξε απώλεια της δέσμευσης tensin2, ήταν ακόμη σε θέση να εντοπίσουν με εστιακές συμφύσεις (Σχ. 4C και 4F). Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο τομέας ΡΤΒ ήταν αναγκαία για τον κεντρικό εντοπισμό προσκόλληση των tensin2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, εκτός από ενεργεί ως φυσική θέση δέσμευσης για DLC1, ο τομέας ΡΤΒ μπορεί επίσης να είναι σημαντική για την άσκηση tensin2 κοντά στο DLC1 σε εστιακές συμφύσεις και διευκόλυνσης της αλληλεπίδρασης τους. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι DLC1 χρησιμοποιεί την περιοχή 375-385 στη διαμεσολάβηση tensin2 δεσμευτική, ενώ χρησιμοποιεί υπολείμματα Y442 και S440 για την εστιακή πρόσφυση στόχευση (Εικ. 6).

DLC1 στόχευε στις εστιακές συμφύσεις και απαιτείται υπολείμματα Y442 και S440. Στο εστιακό πρόσφυσης, εκτός από το μηχανισμό πρόσδεσης SH2, DLC1 χρησιμοποιηθούν περιοχή 375-385 για να αλληλεπιδράσει με τον τομέα ΡΤΒ του tensin2, όπως υποδεικνύεται από την διακεκομμένη γραμμή. Ο σχηματισμός αυτού του συμπλέγματος δέσμευσης ήταν σημαντικό για DLC1 να ασκήσει ανάπτυξης λειτουργία καταστολής.

Η

Αυτή τη στιγμή είναι άγνωστο εάν η περιοχή πρόσδεσης προτεινόμενη tensin PTB στο DLC1 εμπλέκεται στη σύνδεση με άλλα tensins. Αυτό μένει να διερευνηθεί. Υπήρξαν αναφορές ότι η έκφραση του tensin1 τομέα PTB είναι επαρκής για την αλληλεπίδραση με DLC1. Επίσης, διαγράφοντας ολόκληρο το μοτίβο (440 έως 448) δεσμευτική SH2 tensin, αντί της εισαγωγής ενός σημείου μετάλλαξης Y442F στο DLC1, αρκεί για την αλληλεπίδραση με tensin1 [28]. Αυτό δείχνει ότι PTB-εξαρτώμενη δέσμευσης μπορεί να υπάρχουν μεταξύ DLC1 και tensin1, αλλά παίζει μια λεπτή ρόλο, σε αντίθεση με το DLC1 και tensin2 αλληλεπίδραση. Με βάση την παρούσα ευρήματά μας, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο μηχανισμός δέσμευσης PTB είναι tensin2-ειδική (Σχ. 4Β, 4D και 4Ε), ενώ άλλες tensins χρησιμοποιούν ένα μηχανισμό SH2 δεσμευτική [27], [28]. Ενδεχόμενη αποζημίωση από άλλες tensins μπορεί να εξηγήσει γιατί DLC1ΔPTB μπορεί να εντοπίζεται σε εστιακές συμφύσεις εν απουσία αλληλεπιδράσεων tensin2. Επιπλέον, βρήκαμε ότι DLC1ΔPTB έδειξε μερική μείωση της δραστηριότητας RhoGAP, η οποία οδήγησε σε μερική μείωση στην καταστολή της ανάπτυξης (Εικ. 5Β και 5C).

Ένας περιορισμός στην παρούσα μελέτη μας είναι η χρήση των εκτοπικά εξέφρασε tensin2. Ανίχνευση της ενδογενούς tensin2 δεν ήταν δυνατή, καθώς το αντίσωμα tensin2 δεν ήταν διαθέσιμη στο εργαστήριο μας. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ενδογενούς DLC1 και tensin2 πρέπει να εξετάζονται για να αντικατοπτρίζουν τους σύνδεσης στο πραγματικό βιολογικό πλαίσιο. Από την άλλη πλευρά, πραγματοποιήσαμε προκαταρκτική ποσοτική ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του mRNA του DLC1 και tensin2 σε ανθρώπινους ιστούς HCC. αδημοσίευτα στοιχεία μας έδειξαν ότι υποέκφραση τόσο DLC1 και tensin2 συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους που είχαν φυσιολογική έκφραση του ενός ή αμφοτέρων των γονιδίων, που υποστηρίζουν την πιθανή λειτουργική σύνδεση των DLC1-tensin2 με ηπατοκαρκινογένεσης.

Συνολικά , έχουμε εντοπίσει μια νέα θέση δέσμευσης tensin2 PTB στο DLC1 και απέδειξε τη συμμετοχή της σε αλληλεπιδράσεις tensin2. Αν και η απομάκρυνση της θέσης σύνδεσης PTB δεν επηρέασε το εστιακό εντοπισμός πρόσφυση, μείωσε εν μέρει την δραστικότητα RhoGAP του DLC1, η οποία εξασθενημένη λειτουργία καταστολής της ανάπτυξης.