Αφηρημένο

Ο σχηματισμός των ηπατικών μεταστάσεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενείς είναι η κύρια αιτία θανάτου των ασθενών. Οι τρέχουσες θεραπείες που απευθύνονται σε μετάσταση στο ήπαρ από ορθοκολικό καρκίνο είχαν ελάχιστη επίδραση στην έκβαση των ασθενών. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαία η ανάπτυξη εναλλακτικών θεραπευτικών στρατηγικών για μετάσταση στο ήπαρ. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη (α) kringle V, επίσης γνωστή ως rhLK8, επάγεται την αποπτωτική κύκλο εργασιών των ενδοθηλιακών κυττάρων

in vitro

μέσω της μιτοχονδριακής οδού απόπτωσης. Η αλληλεπίδραση του rhLK8 με πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από γλυκόζη 78 (GRP78) μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή της απόπτωσης, επειδή η αναστολή της GRP78 από GRP78-ειδικά αντισώματα ή siRNA knockdown ανέστειλε την rhLK8 απόπτωση των ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων

σε vitro

. Στη συνέχεια, για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της rhLK8 την αγγειογένεση και μετάσταση, ένα πειραματικό μοντέλο της ηπατικής μετάστασης ιδρύθηκε με την έγχυση ενός ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή, LS174T, στις σπλήνες των BALB /c γυμνά ποντίκια. Η συστηματική χορήγηση του rhLK8 κατέστειλε σημαντικά μετάσταση στο ήπαρ από ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα και βελτιωμένη επιβίωση ξενιστή σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Ο συνδυασμός των rhLK8 και 5-φθοριοουρακίλη αυξήθηκε σημαντικά αυτά τα οφέλη επιβίωση σε σύγκριση μόνο με τις δύο θεραπείας. Η ιστολογική παρατήρηση έδειξε σημαντική διέγερση απόπτωσης μεταξύ σχετίζονται με όγκους ενδοθηλιακών κυττάρων σε μεταστάσεις ήπατος από rhLK8 αγωγή ποντίκια σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο συνδυασμός rhLK8 με συμβατική χημειοθεραπεία μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία ασθενών με απειλητικές για τη ζωή του ορθοκολικού καρκίνου ηπατικές μεταστάσεις

Παράθεση:. Ahn JH, Yu HK, Lee HJ, το Χονγκ SW, Κιμ SJ, Kim JS (2014) καταστολή του ορθοκολικού καρκίνου μετάσταση στο ήπαρ από απολιποπρωτεΐνη (α) το δομικό μοτίβο V σε ένα μοντέλο Γυμνό ποντίκι μέσα από την επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά-Associated ενδοθηλιακά κύτταρα. PLoS ONE 9 (4): e93794. doi: 10.1371 /journal.pone.0093794

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου του 2013? Δεκτές: 7 του Μάρτη 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Απριλίου, 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Green Cross Corporation, μια επιχορήγηση από την Κορέα Υγείας 21 R & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A050905), επιχορήγηση από το Πρόγραμμα KRIBB Έρευνας Πρωτοβουλία, και από ένα Basic επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2012R1A1A2007994). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες. Εκτιμάται ότι κατά το έτος 2013, περίπου 142.820 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου διαγνώστηκαν και 50.830 ασθενείς πέθαναν από την ασθένεια αυτή [1]. Περίπου το 25% των ασθενών παρουσιάζουν μεταστατική νόσο κατά τη διάγνωση. Το υπόλοιπο 75% αντιμετωπίζονται χειρουργικά με θεραπεία ως στόχο [2], αλλά ακόμη και με πλήρη εκτομή η νόσος υποτροπιάζει τελικά σε 50% αυτών των ασθενών. Το ήπαρ είναι η κύρια θέση των μεταστάσεων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, πριν και μετά την χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς όγκου, και ο σχηματισμός μεταστάσεων ήπατος αποτελεί σημαντική αιτία θανάτου από τη νόσο [3]. Η χειρουργική επέμβαση είναι η κύρια θεραπευτική επιλογή για απομονωθεί μεταστάσεων, αλλά μόνο το 20-25% των ασθενών είναι κατάλληλοι για την εκτομή [4], και υποτροπή μετά την επέμβαση είναι συχνή. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ενός νέου τρόπου θεραπείας για αυτήν την απειλητική για τη ζωή ασθένεια απαιτείται επειγόντως.

Η αγγειογένεση είναι η ανάπτυξη νέων τριχοειδών από προϋπάρχοντα αιμοφόρα αγγεία. Επειδή η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την επεκτατική ανάπτυξη και μετάσταση των πρωτογενών όγκων, η αγγειογενετική διαδικασία θεωρείται ως ένα υποσχόμενο στόχο για νέες θεραπείες του καρκίνου [5], [6]. Πολυάριθμες αναστολείς αγγειογένεσης, όπως αγγειοστατίνη και ενδοστατίνη, που εμφανίζουν σημαντική αποτελεσματικότητες έναντι ποικιλίας όγκων, συμπεριλαμβανομένων μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο σε προ-κλινικά περιβάλλοντα, έχουν ταυτοποιηθεί [7], [8]. Η έγκριση του bevacizumab (Avastin), ένα εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα, από τις Ηνωμένες Πολιτείες Food and Drug Administration το 2004 ως θεραπεία πρώτης γραμμής για μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο επικυρωθεί περαιτέρω την ιδέα ότι η αναστολή της αγγειογένεσης είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την η θεραπεία του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου.

η μετάσταση είναι μια εξαιρετικά σύνθετη διαδικασία που αποτελείται από μια σειρά από μέτρα, συμπεριλαμβανομένης ενδαγγείωση κυττάρων όγκου από την πρωτογενή θέση μέσα στο αίμα ή το λεμφικό κυκλοφορία, η επιβίωση των κυττάρων στο κυκλοφορικό αίμα σύστημα, αποικισμός ενός δευτερεύοντος οργάνου, έναρξη και διατήρηση της ανάπτυξης, και η ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων για μεταστατικό όγκο [9], [10]. Οποιαδήποτε από αυτές τις βαθμίδες μετάστασης μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος, επειδή η βλάβη ενός ένα βήμα διαταράσσει το σύνολο του μεταστατικού καταρράκτη. Ωστόσο, από τη στιγμή που οι πρωτογενείς καρκίνους του παχέος ανιχνεύεται, υποκλινική ή κλινικά σχετικές ηπατικές μεταστάσεις έχουν ήδη συμβεί [11]. Κατά συνέπεια, η στόχευση των μετέπειτα στάδια της μετάστασης, όπως η ανάπτυξη νέων αγγείων, είναι πολλά υποσχόμενη επειδή η διαδικασία αυτή δεν μπορεί να έχει συμβεί κατά τη στιγμή της διάγνωσης του καρκίνου του παχέος. Επιπλέον, αυτό το στάδιο θεωρείται λιγότερο αποτελεσματική από προηγούμενα βήματα, όπως ενδαγγείωση, επιβίωση στην κυκλοφορία, και την αρχική αποικισμού στη δευτερεύουσα θέση. Βιολογικά αναποτελεσματικές διαδικασίες μπορούν να απευθύνονται εύκολα επειδή λιγότερα κύτταρα θα πρέπει να απευθύνονται. Εν όψει αυτών των σκέψεων, αντι-αγγειογενετική θεραπεία, η οποία στοχεύει πρωτίστως στην αγγειογένεση εξαρτώμενη ανάπτυξη των μεταστάσεων, είναι μια κλινικά προσβάσιμη και βιολογικώς σχετικό θεραπευτική στρατηγική για μετάσταση στο ήπαρ.

απολιποπρωτεΐνη (α) [αρο (α) ] είναι ένα συστατικό γλυκοπρωτεΐνη της ανθρώπινης λιποπρωτεΐνης (α) και έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με την ανάπτυξη της αρτηριοσκλήρωσης και της στεφανιαίας νόσου [12]. Αρο (α) αποτελείται από επαναλαμβανόμενες περιοχές kringle που μοιάζουν στενά πλασμινογόνου kringle 4, που ακολουθείται από αλληλουχίες που είναι ομόλογες με τις kringle 5 και τομείς πρωτεάσης του πλασμινογόνου [13]. Ο φυσιολογικός ρόλος (ες) του αρο (α) περιοχές kringle παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Ωστόσο, σύμφωνα με την προτεινόμενη ρόλο των kringles ως γενικά αναστολείς της ανάπτυξης των αιμοφόρων αγγείων [14], τα τρέχοντα στοιχεία δείχνουν ότι πλήρους μήκους ή συντετμημένες μορφές του αρο (α) kringles αναστέλλουν την αγγειογένεση τόσο

in vitro

και

in vivo

και καταστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου σε ζωικά μοντέλα [15], [16], [17]. Έχουμε επίσης καταδείξει ότι η ανασυνδυασμένη αρο (α) kringle V, που ονομάζεται rhLK8, αναστέλλει τη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιας φλέβας (HUVECs)

in vitro

, εν μέρει παρεμβαίνοντας στην ενεργοποίηση των κινασών εστιακής προσκόλλησης και ο επακόλουθος σχηματισμός ακτίνης ίνες στρες /εστιακές συμφύσεις [18]. rhLK8 ανέστειλε επίσης την νεοαγγείωση του νεοσσού χοριοαλλαντοϊκές μεμβράνες και τριχοειδή διείσδυση στα βύσματα Matrigel

in vivo

. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι η συστηματική χορήγηση rhLK8 σε συνδυασμό με ένα χημειοθεραπευτικό παράγοντα, η πακλιταξέλη, μπορεί να εξασθενίσει την ανάπτυξη των PC-3MM2 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη στον προστάτη και την κνήμη γυμνών ποντικών [19]. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με rhLK8, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικό παράγοντα, προκαλεί απόπτωση σε όγκους που συνδέονται ενδοθηλιακά κύτταρα, ακολουθούμενη από την απόπτωση των περιβαλλόντων κυττάρων του όγκου. Ωστόσο, ο ακριβής βιοχημικός μηχανισμός μέσω του οποίου rhLK8 επάγει απόπτωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα παρέμενε άγνωστη.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε το μηχανισμό της rhLK8 επαγόμενη απόπτωση σε σχετιζόμενο με τον όγκο ενδοθηλιακά κύτταρα και ελέγχθηκαν αν θεραπεία rhLK8, σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, καταστέλλει καρκίνου του παχέος εντέρου μετάσταση στο ήπαρ. Βρήκαμε ότι rhLK8 επάγει απόπτωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω της μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι

in vitro.

Αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από γλυκόζη 78 (GRP78) στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο σε αυτή τη διαδικασία. Δείξαμε επίσης ότι rhLK8, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με συμβατική χημειοθεραπεία, κατέστειλε σημαντικά μετάσταση στο ήπαρ μέσω επαγωγής της απόπτωσης του σχετιζόμενου με τον όγκο ενδοθηλιακά κύτταρα

in vivo

, με αποτέλεσμα βελτιωμένη επιβίωση του ξενιστή σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο ηπατικών μεταστάσεων.

Υλικά και Μέθοδοι

έκφραση και καθαρισμός rhLK8 και των παραγώγων του

Το

Saccharomyces cerevisiae

στέλεχος BJ3501 μετασχηματίστηκε με έναν φορέα έκφρασης για

rhLK8

, το οποίο κατασκευάστηκε για να εκφράσει rhLK8 ως πρωτεΐνη σύντηξης με μία αλληλουχία σήματος α παράγοντα κάτω από τον έλεγχο της μαγιάς

Gal

1 υποκινητή και στη συνέχεια επεξεργάζονται για να εκκρίνεται εντός του μέσου καλλιέργειας [20]. rhLK8 πρωτεΐνες καθαρίστηκαν έως ομοιογένεια από το υπερκείμενο καλλιέργειας του

S. cerevisiae

BJ3501 εκφράζουν rhLK8, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Καθαρισμένα rhLK8 πρωτεΐνες φυλάχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 100 mM NaCl και 150 mM L-γλυκίνη (ρΗ 4,2).

Το θραύσμα DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη rhLK8 συγχωνευμένο με ένα επίτοπο αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ) στο C-άκρο (rhLK8 -HA) ενισχύθηκε με δύο κύκλους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: rhLK8-εμπρός (5′-ΤΤΤ TTC CAT ATG GAA CAG GAC TGC ATG ΤΤΤ GGG ΑΑΤ GGG-3 ‘) και ΗΑ1-αντίστροφη (5 «-CAC ATC ΑΤΑ ΑΓΓ GTA AGA GCC CCC GCC AAA TGA AGA GGA TGC ACA GAG AGG-3 ‘) για τον πρώτο κύκλο χρησιμοποιώντας τον φορέα rhLK8 έκφρασης ως πρότυπο και rhLK8 προς τα εμπρός και ΗΑ2-πίσω (5’-GGA TCC TCA AGA CCC AGA GGC ΑΤΑ ATC ΤΟΟ CAC ATC ΑΤΑ ΑΓΓ GTA AGA GCC CCC-3 ‘) για τον δεύτερο κύκλο χρησιμοποιώντας το PCR προϊόν του πρώτου κύκλου ως πρότυπο. Το ενισχυμένο θραύσμα rhLK8-ΗΑ DNA κλωνοποιήθηκε στο προκαρυωτικό φορέα έκφρασης pET-15b (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία), το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να μετασχηματίσει

Escherichia coli

BL21 (DE3). Η έκφραση του διαγονιδίου προκλήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. rhLK8-ΗΑ εκφράστηκε ως 6 × His-tagged πρωτείνης, και η διαλυτή πρωτεΐνη καθαρίσθηκε δια συνάφειας με τη χρήση συστημάτων ρΕΤ His-Tag (Merck KGaA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανάλυση απόπτωσης με χρώση με Hoechst 33452

Συρρέοντα ανθρώπινα ομφάλιας φλέβας ενδοθηλιακού κυττάρου (HUVEC? Lonza, Walkersville, MD, USA) οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε ΕΒΜ-2 μέσο (Lonza) συμπληρωμένο με 1% FBS και διάφορες συγκεντρώσεις rhLK8 (0,1-5 μΜ) παρουσία ή απουσία 3 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF). Μετά από μια περίοδο επώασης 12 ή 24 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33452 (500 ng /ml? Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C, και η απόπτωση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας συμπύκνωση πυρηνικής χρωματίνης ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus BX51, Όλυμπος, Κέντρο Valley, PA, USA) [22]. Τυχαία μικροσκοπικά πεδία εξετάστηκαν για κάθε πειραματική συνθήκη, και το ποσοστό των κυττάρων που υπόκεινται σε απόπτωση σε κάθε πεδίο προσδιορίστηκε.

Western Blotting Απόπτωσης σχετικών πρωτεϊνών

Τα κύτταρα λύθηκαν σε Triton λύσης ρυθμιστικό [137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100, και 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0)] που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Ένα κλάσμα του κάθε προϊόντος λύσης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας γέλες πολυμερίζεται από 4-20% ακρυλαμιδίου σε Tris /ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), και ανοσοστύπωση πραγματοποιήθηκε με αντισώματα ενάντια procaspase-3, procaspase-9 ( Cell Signaling, Beverly, ΜΑ, USA), που διασπάται κασπάσης-3 και procaspase-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Εκλούεται δείγματα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης επίσης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, και οι ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Κάθε μεμβράνη επωάστηκε με αντισώματα αντι-GRP78 ποντικού (BD Biosciences? 1:1,000) ή κουνελιού αντι-His αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA? 1:1,000) και στη συνέχεια με συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού ή αντισώματα αντι-κουνελιού (KPL, Gaithersburg, MD, USA? 1:5,000).

η κλασματοποίηση της κυτοσολικής και εδραζόμενες στη μεμβράνη πρωτεΐνες

κυτοσολίου και μεμβράνης κλάσματα παρασκευάστηκαν με διαπερατοποίηση μεμβράνης επιλεκτικής πλάσματος με διγιτονίνη, που ακολουθείται από διαλυτοποίηση μεμβράνης [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05% διγιτονίνη σε ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα Α [10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, και 1 mM EGTA (ρΗ 7.4)] που περιέχει αναστολείς πρωτεασών [1 mM 4- (2- αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο υδροχλωρική, 0,8 μΜ απροτινίνης, 50 μΜ βεστατίνης, 15 μΜ Ε-64, 20 μΜ leupeptin, και 10 μΜ πεπστατίνη Α] για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα διαπερατά κύτταρα συλλέχθηκαν στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση στα 15.000 χ g για 10 λεπτά, το υπερκείμενο (κυτοσολικό κλάσμα) και το σφαιρίδιο (κλάσμα μεμβράνης) συλλέχθηκαν ξεχωριστά. Για την απελευθέρωση membrane- και οργανίδιο δεσμευμένες πρωτεΐνες, το σφαιρίδιο εκχυλίστηκε περαιτέρω με παγωμένο 1% Nonidet Ρ-40 σε ρυθμιστικό διάλυμα Α που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης για 60 λεπτά στους 4 ° C. Αμφότερα τα κλάσματα κυτοσολίου και μεμβράνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι του κυτοχρώματος c (BD Biosciences).

Κατασκευή του φορέα έκφρασης για Γλυκόζη ρυθμιζόμενες Protein 78 (GRP78) και παροδικής επιμόλυνσης σε κύτταρα ΗΕΚ293

Το

GRP78

γονίδιο ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: προς τα εμπρός (5′-ΤΤΤ ΤΤΤ GGA TCC ΑΤΟ ΑΑΟ CTC TCC CTG GTG GCC-3 ‘) και αντίστροφη (5’-ΤΤΤ ΤΤΤ GCG GCC GCT CTA CAA CTC ATC ΤΤΤ ΤΤΟ TGC-3 ‘), και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcDNA3.1-myc-his (-) β (Invitrogen). Παροδική διαμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ-293 με τα αντιδραστήρια

GRP78

φορέας έκφρασης διεξήχθη χρησιμοποιώντας lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), συλλέχθηκαν με απόξεση, και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στα 500 χ g. Τα συλλεχθέντα κύτταρα υπέστησαν λύση χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό IP (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6) που περιέχει 1% ΝΡ-40, και κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Co-ανοσοκαταβύθιση rhLK8- δεσμευτικές πρωτεΐνες

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με

GRP78

φορείς έκφρασης συλλέχθηκαν και εξήχθη χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% ΝΡ-40, αναστολέα πρωτεάσης 1 ×, και 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, ρΗ 7.6). Τα κυτταρικά εκχυλίσματα αναμίχθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C με 10 μg μονοκλωνικού αντισώματος αντι-ΗΑ, 2 μg ΗΑ-tagged rhLK8, και πρωτεΐνη G-αγαρόζης (Sigma). Τα ανοσοπροσροφητικά ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 700 χ g, πλύθηκαν τρεις φορές, και φυγοκεντρήθηκε (5 λεπτά στις 700 χ g) σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,1% ΝΡ-40, ρΗ 7.6). Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 30 μι ρυθμιστικού διαλύματος SDS-PAGE φόρτωσης (Sigma) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

siRNA Επιμόλυνση

HUVECs θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και αραιώθηκαν σε ελεύθερο αντιβιοτικών EGM- 2 μέτρια έως 2,5 × 10

5 κύτταρα /ml για την επιμόλυνση με Ντάρμα

τέλειες

1 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, HUVECs απλώθηκαν σε δίσκους 100 mm και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2 την διάρκεια της νύχτας. Ένα χιλιοστόλιτρο 2 μΜ ON-TARGETplus SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific) έναντι

GRP78

αραιωμένο σε 1 × siRNA Buffer (σωλήνας-1) και Dharma

fect

1 (σωλήνας-2) αραιωμένο με μέσο χωρίς ορό τοποθετήθηκαν σε χωριστούς σωλήνες, επωάστηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, αναμιγνύονται μαζί, και στη συνέχεια επωάζονται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι επωάζονται μίγματα siRNA και Ντάρμα

fect

1 αραιώθηκαν σε 8 ml μέσου χωρίς ορό και εν συνεχεία προστίθεται στο τρυβλίο 100 mm, με HUVEC μονοστοιβάδες. Μετά από 24 ώρες, το μέσο διαμολύνσεως αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο που περιέχει FBS και αυξητικούς παράγοντες. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, HUVECs χωρίστηκαν, και την 4η ημέρα συλλέχθηκαν ή ανακαλλιεργήθηκαν για άλλα πειράματα.

Ανάλυση rhLK8 Σύνδεση προς GRP78 στο HUVECs με Κυτταρομετρία Ροής

Για να μετρηθεί η σύνδεση του rhLK8 με την πρωτεΐνη GRP78 στην επιφάνεια των HUVEC, rhLK8 σημάνθηκε με FITC χρησιμοποιώντας ένα κιτ FITC-επισήμανση (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. HUVECs που είχαν υποστεί μεταγωγή με μπερδεμένο siRNA ή GRP78 ειδικό siRNA τρυψινοποιήθηκαν και εξουδετερώθηκε με θρυψίνη διάλυμα εξουδετέρωσης (Lonza). 5 × 10

5 HUVECs βάφτηκαν χρησιμοποιώντας FITC-επισημασμένο rhLK8 ή GRP78 αντισωμάτων για 1,5 ώρες στους 4 ° C, πλύθηκαν με PBS 3 φορές, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής με ένα FACS Caliber (BD Biosciences).

Animal Model Πειραματικής μετάσταση στο ήπαρ

αθυμικά BALB /c γυμνά ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ip) κεταμίνης /ξυλαζίνης (Sigma). Η σπλήνα ακολούθως εξωτερικοποιήθηκαν μέσω μιας πλάγια αριστερά πλευρική τομή. Περίπου 3 × 10

5 LS174T κυττάρων καρκινώματος ανθρώπινου ορθοκολικού (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) σε 100 μΙ ισορροπημένου διαλύματος άλατος του Hank εγχύθηκαν στο παρέγχυμα σπλήνα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 27-gauge. Το περιτόναιο και το δέρμα έκλεισαν σε δύο στρώσεις με μεταλλικά κλιπ. Από την ημέρα του εμβολιασμού των καρκινικών κυττάρων, τα ποντίκια είχαν καθημερινή ε.π. διοικήσεων των 2, 10 και 50 mg /kg rhLK8 για δύο εβδομάδες. Επιπλέον, ο έλεγχος και rhLK8 (2, 10 ή 50 mg /kg) κατεργασμένα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα επιβίωσης (n = 10 /κάθε ομάδα).

Για να διερευνηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της θεραπείας rhLK8 σε συνδυασμό με μια συμβατική χημειοθεραπεία, τα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα LS174T τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες (η = 5 ανά ομάδα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία ως ακολούθως: (1) ημερησίως ip χορήγηση οχήματος (100 mM NaCl, 150 mM L-γλυκίνη, ρΗ 4,2)? (2) ε.π. ένεση 5-φθοριοουρακίλη (5-FU? 8 mg /kg /ημέρα) για τις πρώτες πέντε ημέρες μετά ενδοσπληνική ένεση? (3) καθημερινή ε.π. ένεση του rhLK8 (10 mg /kg)? και (4) ημερησίως ε.π. χορήγηση rhLK8 (10 mg /kg) και ί.ρ. ένεση 5-FU (8 mg /kg /ημέρα) για τις πρώτες πέντε ημέρες μετά ενδοσπληνική ένεση. Έλεγχος και rhLK8-ποντίκια με αγωγή χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε πειράματα επιβίωσης (η = 10 ποντικοί ανά ομάδα) ή υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή 2 εβδομάδες μετά τη θεραπεία, κατά την οποία συλλέχθηκαν τα συκώτια φορά, ζυγίζονται και αναλύονται για να προσδιοριστεί η επιφάνεια αριθμούς οζίδιο όγκου ή υποβλήθηκαν σε ιστολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση.

Ηθική Δήλωση

Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας ζώων της Mogam Βιοτεχνολογίας Ινστιτούτο Ερευνών ή την Κορέα Ερευνητικό Ινστιτούτο Bioscience και Βιοτεχνολογίας (KRIBB-AEC-13011) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Φροντίδα χορηγούνται στα ζώα ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας.

Ιστολογίας και Ανοσοϊστοχημείας

Για να μετρήσετε ενδο-ηπατική οζίδια, την από όγκο που φέρουν τα συκώτια αποκόπηκαν, στερεώθηκαν με 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για όλη τη νύχτα, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε φέτες 4 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) και υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Για τα κατεψυγμένα μπλοκ, δείγματα όγκου αποκόπηκαν από ποντικούς, ενσωματωμένα αμέσως σε ορνιθίνης καρβαμοϋλο-τρανσφεράσης (OCT? Miles, Elkhart, ΙΝ, USA) ένωση, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C. Κατεψυγμένα ιστοί για CD31 /PECAM-1 και /ή τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) χρώση παρασκευάσθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη. Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη με ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Promega, Madison, WI, USA) με κάποια τροποποίηση. διαδικασίες Ανοσοϊστοχημεία διεξήχθησαν και όλα τα αντισώματα και παράγοντες για ανοσοϊστοχημεία αγοράσθηκαν από πηγές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Τα δείγματα ελέγχου που εκτίθενται σε δευτερεύον αντίσωμα μόνο δεν έδειξε καμία ειδική χρώση. Οι τομές εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Olympus BX51 (Όλυμπος) εξοπλισμένο με την Olympus DP71 12,5 megapixel ψηφιακή φωτογραφική μηχανή μικροσκόπιο.

ανοσοφθορισμού διπλή χρώση για CD31 /PECAM-1 (ενδοθηλιακά κύτταρα) και TUNEL

Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη ακολουθώντας PECAM-1 χρώση ανοσοφθορισμού CD31 /όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Δείγματα ιστών επωάστηκαν με 300 μg /ml του Hoechst 33342 λεκέ για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Προπυλγαλατικό τοποθετήθηκε σε κάθε διαφάνεια και στη συνέχεια καλύπτεται με καλυπτρίδα γυάλινη (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα έγιναν ορατά με κόκκινο φθορισμό, και κατακερματισμένη DNA (δοκιμασία TUNEL) οπτικοποιήθηκε με πράσινο φθορισμό. Συν-εντοπισμό του κόκκινου και του πράσινου σήματα που παράγονται κίτρινο σήματα (αποπτωτικών ενδοθηλιακά κύτταρα).

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με τη χρήση του μαθητή

t-test

, εκτός από τις

in vivo πειράματα

επιβίωση, για την οποία χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση log-rank μιας καμπύλης επιβίωσης Kaplan-Meier. Η τιμή του

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της rhLK8 για απόπτωσης ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro

Για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων του rhLK8 για απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, HUVEC μονοστοιβάδες επωάστηκαν σε ΕΒΜ-2 που περιέχει 1% FBS παρουσία ή απουσία 3 ng /ml bFGF και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις rhLK8 (0.1-5 μΜ) για 12 ή 24 ώρες. Τα αποπτωτικά ενδοθηλιακά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με πυρηνική μορφολογία μετά από χρώση με Hoechst 33452 (Σχ. 1Α). Η θεραπεία με rhLK8 επάγεται σημαντικά την απόπτωση των HUVECs σε έναν χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με την απουσία (Εικ. 1 Β) ή παρουσία (Εικ. 1C) αγγειογόνων παραγόντων όπως 3 ng /ml bFGF.

HUVEC μονοστοιβάδες επωάστηκαν σε ΕΒΜ-2 που περιέχει 1% FBS παρουσία ή απουσία 3 ng /ml bFGF και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις rhLK8 (0.1-5 μΜ) για 12 ή 24 ώρες. Ενδοθηλιακή απόπτωση αξιολογήθηκε από την πυρηνική μορφολογία μετά από χρώση με Hoechst 33452.

(Α)

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες του ελέγχου (

αριστερά

) ή rhLK8 (5 μΜ) κατεργασμένους HUVECs (

δεξιά

) παρουσία του 3 ng /ml bFGF για 12 ώρες. Τα αποπτωτικά ενδοθηλιακά κύτταρα υποδεικνύονται με βέλη.

B

και

C

, το ποσοστό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση προσδιορίστηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις rhLK8 απουσία (

B

) ή παρουσία (

C

) του bFGF μετά από 12 (

συμπληρώθηκε μπαρ

) ή 24 ώρες (

ανοιχτό μπαρ

). Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD. (

D-F

) HUVECs επωάζονται με rhLK8 (5 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση, και ολόκληρο κυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. (

D

) Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι procaspase-3 ή ένα 20 kDa επεξεργασμένη μορφή της κασπάσης-3, όπως υποδεικνύεται. (

E

) κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι procaspase-9 διεξήχθη για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση της κασπάσης-9. Ακτίνης (

κάτω πίνακα

) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. (

F

) κυτοσολίου και δεσμευμένες σε μεμβράνη πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι του κυτοχρώματος c για να προσδιοριστεί η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα. Τα δείγματα πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε

λωρίδα C-16

παρασκευάστηκαν από κύτταρα που επωάστηκαν χωρίς rhLK8 για 16 ώρες. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Αντίγραφα των Σχ. 1Δ, 1Ε και 1F είναι διαθέσιμα στην Εικ. S1).

Η

κασπάσης-3 και κασπάσης-9 Ενεργοποίηση και κυτόχρωμα C Τύπου στο κυτταρόπλασμα από rhLK8

για την εξέταση των βιοχημικών χαρακτηριστικών του rhLK8 επαγόμενη απόπτωση HUVECs, ελέγξαμε πρώτα τις επιδράσεις της rhLK8 στην ενεργοποίηση μιας κασπάσης τελεστή, κασπάσης-3, το οποίο είναι ένα βασικό βήμα στην απόπτωση. HUVECs σε επεξεργασία με rhLK8 (5 μΜ) έδειξαν μειωμένα επίπεδα των procaspase-3 αλλά αυξημένα επίπεδα των 32 kDa του 20-kDa σε επεξεργασία θραύσμα της κασπάσης-3 (Εικ. 1 D και Εικ. S1 Α), υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 . Η διάσπαση του υποστρώματος κασπάσης-3, πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση, ανιχνεύθηκε επίσης σε rhLK8 επεξεργασμένου HUVECs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι κασπάσες δράστες ενεργοποιημένα κατάντη της κασπάσης-8 ή κασπάσης-9, οι οποίες είναι οι κασπάσες έναρξης που εμπλέκονται στην σηματοδότηση μέσω δύο διακριτών αποπτωτικών οδών, του υποδοχέα θανάτου και μιτοχονδριακή μονοπάτια, αντίστοιχα [25]. Για να καθοριστεί ποια οδός είναι υπεύθυνη για rhLK8 επαγόμενη απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, εξετάσαμε τις επιδράσεις της rhLK8 (5 μΜ) στην ενεργοποίηση της κασπάσης-8 ή κασπάσης-9. Το επίπεδο της procaspase-9 ήταν σημαντικά μειωμένη σε rhLK8 επεξεργασμένο HUVECs σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 1 Ε και Σχ. S1B), ενώ καμία διαφορά στο επίπεδο του procaspase 8-παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η μιτοχονδριακή οδού (επίσης γνωστό ως το ενδογενές μονοπάτι) περιλήφθηκε. Επειδή το μιτοχονδριακό μονοπάτι αρχίζει με την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και άλλα πολυπεπτίδια από χώρο των μιτοχονδρίων στο κυτοσόλιο, εξετάσαμε το κυτόχρωμα απελευθέρωση c στα rhLK8 επεξεργασμένο HUVECs. rhLK8 (5 μΜ) προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση του επιπέδου του κυτοχρώματος c στη μιτοχονδριακή μεμβράνη, ενώ το επίπεδο της κυτοσολικής κυτοχρώματος c ήταν ταυτόχρονα αυξήθηκε (Εικ. 1 F και Εικ. S1c).

rhLK8 αλληλεπιδρά με GRP78

Πρόσφατα, πλασμινογόνου kringle V (PK5) έχει αναφερθεί να επάγει την κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με σύνδεση προς GRP78 στην κυτταρική επιφάνεια [26]. Με βάση την υψηλή ομολογία αλληλουχίας μεταξύ PK5 και rhLK8, ελέγξαμε την πιθανότητα ότι μπορεί να επάγει rhLK8 την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω αλληλεπίδρασης με GRP78. Αναμίξαμε τα εκχυλίσματα από κύτταρα HUVECs ή ΗΕΚ293 που εκφράζουν σημασμένη με His GRP78 με 10 μg μονοκλωνικού αντισώματος αντι-ΗΑ, 2 μg ΗΑ-tagged rhLK8, και πρωτεΐνη G-αγαρόζη και οι ανοσοκατακρήμνιση ανοσοστυπώθηκαν με αντι-GRP78 ή αντι-His αντισώματα. Τόσο ενδογενή GRP78 σε HUVECs (Σχ. 2Α και το σχ. S2A) και με επισύναψη His GRP78 σε κύτταρα ΗΕΚ293 (Εικ. Σχ. 2Β και S2B) σαφώς συνδέεται με το rhLK8 προστίθεται στο μίγμα συν-ανοσοκαταβύθιση. Ωστόσο, δεν πρωτεΐνη GRP78 ανιχνεύθηκε όταν η δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη υπό την απουσία του ΗΑ-tagged πρωτείνης rhLK8.

Για ανοσοκαταβύθιση (

ΙΡ

) πειράματα, κυτταρικά εκχυλίσματα από (

Α

) HUVECs ή (

B

) ΗΕΚ293 κύτταρα που εκφράζουν 6 × His-tagged πρωτείνης GRP78 αναμίχθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C με 10 μα μονοκλωνικού αντισώματος ΗΑ, 2 μg ΗΑ-tagged rhLK8, και πρωτεΐνη G-αγαρόζης. Εκλούεται δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. GRP78 συνδέεται προς rhLK8 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western (

WB

) χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-GRP78 ή αντι-Ηίδ αντίσωμα. Για τον προσδιορισμό της δέσμευσης του rhLK8 με την πρωτεΐνη GRP78 στην επιφάνεια των HUVEC, HUVECs που είχαν υποστεί μεταγωγή με μπερδεμένο siRNA ή

GRP78-

συγκεκριμένες siRNA συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με (

C

) FITC -επισημασμένο rhLK8 ή (

D

) αντι-GRP78 αντισωμάτων και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μη βαμμένα κύτταρα ή κύτταρα βάφονται με ΡΙΤΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν μόνο ως αρνητικός έλεγχος. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Αντίγραφα των Εικ. 2Α και 2Β είναι διαθέσιμα στην Εικ. S2).

Η

rhLK8 Δεσμεύει να GRP78 εκφράζονται πάνω στην επιφάνεια των HUVECs

Για να προσδιορίσετε αν rhLK8 συνδέεται με GRP78 εκφράζεται σε η επιφάνεια του HUVECs, HUVECs έλαβαν θεραπεία είτε με το ειδικό siRNA για

GRP78

ή ομελέτα siRNA, χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο rhLK8 ή αντι-GRP78 αντισώματα, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αμφότερες rhLK8 και GRP78 αντισώματα δεσμεύονται στην επιφάνεια του HUVECs μεταγωγή με έλεγχο siRNA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ η σύνδεση του rhLK8 και GRP78 αντισωμάτων ήταν μειωμένη σε HUVECs μεταγωγή με

GRP78

-ειδικές siRNA (Σχ. 2C και 2D).

rhLK8 επάγει την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro με την αλληλεπίδραση με GRP78

Για να καθοριστεί εάν οι πρωτεΐνες GRP78 εμπλέκονται στην rhLK8 επαγόμενη απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, HUVECs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα αντίσωμα έναντι GRP78 πριν από τη θεραπεία με rhLK8. Η αγωγή με ένα αντίσωμα GRP78 μείωσε σημαντικά το επίπεδο της δραστικής κασπάσης-3 σε HUVECs σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι GRP78 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην rhLK8 μεσολάβηση απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Σχ. 3Α και το σχ. S3A). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζονται περαιτέρω από τα αποτελέσματα που δείχνουν ότι η απόπτωση σε HUVECs με GRP78 siRNA knockdown δεν ήταν διαφορετική με ή χωρίς αγωγή με rhLK8 (Σχ. 3Β και Σχ. S3b-D), ενώ η απόπτωση των HUVECs επιμολυσμένα με το περιπλεγμένο siRNA ήταν σημαντικά που επάγεται με αγωγή με rhLK8, όπως προσδιορίζεται από την αύξηση των δραστική κασπάση-3 και τη μείωση procaspase-9 (Σχ. 3Β και Σχ. S3b-D). Συνέπεια, η θεραπεία GRP78 αντίσωμα ή

GRP78

knock-down με siRNA επιμόλυνση καταργηθεί rhLK8-επαγόμενη απόπτωση των HUVECs σε κυτταρικό επίπεδο, όπως εκτιμάται από τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων (Σχ. 3C).

(

A

) για να προσδιοριστεί αν GRP78 μπορεί να εμπλέκεται σε rhLK8 διαμεσολαβείται ενδοθηλιακού κυττάρου απόπτωση, HUVEC μονοστοιβάδες υπέστησαν αγωγή με rhLK8 (1 ή 5 μΜ) μετά από προκατεργασία με 5 μg GRP78 αντισώματος για 30 λεπτά. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (

B

) HUVECs επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή

GRP78

-ειδικές siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του rhLK8. Η επακόλουθη επαγωγή της απόπτωσης ανιχνεύθηκε με αντισώματα έναντι δραστική κασπάση-3 ή procaspase-9. Η έκφραση του GRP78 ανιχνεύθηκε με αντι-GRP78 μονοκλωνικό αντίσωμα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) HUVECs σε επεξεργασία με αντίσωμα GRP78 ή επιμολυσμένα με

GRP78

-ειδικές siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rhLK8 (5 μΜ) και τα ενδοθηλιακά απόπτωση εκτιμήθηκε με πυρηνική μορφολογία μετά από χρώση με Hoechst 33452. Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες δείχνονται. Τα αποπτωτικά ενδοθηλιακά κύτταρα υποδεικνύονται με βέλη. Οι μεγεθύνσεις είναι × 100. (Αντίγραφα των Σχ. 3Α και 3Β είναι διαθέσιμα στην Εικ. S3).

Η

Η θεραπεία με rhLK8 καταστέλλει την ανάπτυξη των ενδοσπληνικά χύτευση LS174T κύτταρα στο ήπαρ

Η αγγειογένεση είναι κρίσιμη για μετάσταση όγκου των κυττάρων και ανάπτυξη στερεού όγκου, εξετάσαμε τις επιδράσεις της rhLK8 στο ήπαρ μετάσταση ενδοσπληνικά εγχέονται κύτταρα LS174T. Οι ποντικοί στην ομάδα θεραπείας rhLK8 που έλαβαν ημερησίως ί.ρ. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.