Αφηρημένο

Η ηπαρίνη δέσμευσης του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα-αυξητικού παράγοντα (HB-EGF) είναι ένα μέλος της οικογένειας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και έχει μια ποικιλία φυσιολογικών και παθολογικών λειτουργιών. Η διαμόρφωση της δραστικότητας ΗΒ-EGF μπορεί να έχει ένα θεραπευτικό δυναμικό στον τομέα της ογκολογίας. Ερευνήσαμε τις θεραπευτικές δυνατότητες χαρακτηρίζοντας το

in vitro

βιολογική δραστηριότητα των αντι-HB-EGF μονοκλωνικό αντίσωμα Υ-142. (EGFR) συνδέτη και είδος υποδοχέα EGF ιδιαιτερότητες του Υ-142 δοκιμάστηκαν. Η εξουδετέρωση δραστηριότητες του Υ-142 έναντι HB-EGF αξιολογήθηκαν σε EGFR και σηματοδότηση erbB4. Βιολογικές δραστηριότητες του Υ-142 αξιολογήθηκαν στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και δοκιμασίες αγγειογένεσης και σε σύγκριση με το cetuximab αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα, αναστολέα CRM197 HB-EGF, και του αντι-αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) bevacizumab αντίσωμα. Ο επίτοπος πρόσδεσης προσδιορίστηκε με σάρωση αλανίνης. Υ-142 που αναγνωρίζονται HB-EGF καθώς και την αμφιρεγουλίνη συνδέτη EGFR, και δεσμεύεται ειδικά με ανθρώπινο ΗΒ-EGF, αλλά όχι να τρωκτικών ΗΒ-ΕΟΡ. Επιπλέον, το Υ-142 εξουδετερώνονται HB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR και ErbB4, και μπλοκάρει κατάντη ERK1 /2 και ΑΚΤ σηματοδότηση τους. Βρήκαμε επίσης ότι το Υ-142 ανέστειλε HB-EGF-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, σχηματισμός σωλήνα, και η παραγωγή VEGF πιο αποτελεσματικά από ό cetuximab και CRM197 και ότι το Υ-142 ήταν ανώτερη bevacizumab σε αναστολή της HB-EGF- που προκαλείται από το σχηματισμό σωλήνα. Έξι αμινοξέα στην περιοχή που μοιάζει με EGF έχουν ταυτοποιηθεί ως η επιτόπου δέσμευσης Υ-142. Μεταξύ των έξι αμινοξέα, ο συνδυασμός του F115 και Y123 καθόρισαν την αμφιρεγουλίνη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα και ότι F115 αντιπροσώπευαν την επιλεκτικότητα είδους. Επιπλέον, προτάθηκε ότι η ισχυρή δράση εξουδετέρωσης των Υ-142 προήλθε από την αναγνώριση των R142 και Y123 και η υψηλή συγγένεια του να HB-EGF. Υ-142 έχει μια ισχυρή δραστικότητα εξουδετέρωσης HB-EGF που διαμορφώνει πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες του ΗΒ-ΕΟΡ συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και αγγειογόνο δραστηριότητες. Υ-142 μπορεί να έχει ένα δυναμικό να εξελιχθεί σε ένα θεραπευτικό μέσο για τη θεραπεία της HB-EGF-εξαρτώμενων καρκίνων

Παράθεση:. Sato S, Drake AW, Tsuji Ι, Fan J (2012) ένας ισχυρός αντι Ημιδιατροφή-EGF Μονοκλωνικό αντίσωμα αναστέλλει Cancer Cell διάδοσης και Πολλαπλές Αγγειογονικοί Δραστηριότητες HB-EGF. PLoS ONE 7 (12): e51964. doi: 10.1371 /journal.pone.0051964

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Αύγ 2012? Αποδεκτές: 9 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Sato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δεν υπάρχει τρέχουσα εξωτερικές πηγές χρηματοδότησης για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Takeda Σαν Φρανσίσκο, Inc. και Takeda Pharmaceutical Company Limited. Όλοι οι συγγραφείς ήταν υπάλληλοι της Takeda Σαν Φρανσίσκο, Inc. ή Takeda Pharmaceutical Company Limited και έχουν καταβληθεί ως τέτοια. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η ηπαρίνη δέσμευσης επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF ) -όπως αυξητικού παράγοντα (ΗΒ-ΕΟΡ) είναι ένα μέλος της οικογένειας EGF των αυξητικών παραγόντων που δεσμεύεται με τον υποδοχέα EGF (EGFR) και ErbB4 [1], [2]. HB-EGF συντίθεται ως δεσμευμένη στη μεμβράνη μορφή, proHB-EGF, το οποίο είναι γνωστό ότι είναι ένας παράγοντας ανάπτυξης juxtacrine [3], [4]. proHB-EGF υφίσταται εξωτομέα αποβολή από πρωτεάσες [5], και η απόπτωση επιταχύνεται όταν proHB-EGF-κύτταρα που εκφράζουν εκτεθεί σε ορισμένες συνθήκες στρες [6], [7]. Η προκύπτουσα διαλυτή μορφή του ΗΒ-EGF (SHB-EGF) έχει ισχυρή μιτογόνο δραστηριότητα μέσω της ενεργοποίησης του EGFR [1]. Κατά τη διάσπαση, το HB-EGF Ο-τερματικό θραύσμα μετατοπίζεται στον πυρήνα και επάγει γονιδιακή έκφραση κυκλίνη και cyclinD2 καταστέλλοντας τη λειτουργία του PLZF και Bcl6, αντίστοιχα [8], [9].

Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκάλυψαν μια ποικιλία από φυσιολογικές λειτουργίες του ΗΒ-ΕΟΡ, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης των ιστών [10] – [12], την επούλωση των πληγών του δέρματος [13], και η εγκυμοσύνη [14], [15]. HB-EGF έχει επίσης βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της καρδιακής υπερτροφίας [16], της πνευμονικής υπέρτασης [17], η αρτηριοσκλήρωση [18], [19], και τον ογκογόνο μετασχηματισμό [20]. Πιο πρόσφατα, αυξανόμενες ενδείξεις απέδειξε ότι HB-EGF υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνων [21] – [25] και η υπερ-έκφραση έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με φτωχή πρόγνωση [24], [26], [27 ]. Λόγω αυτών των ευρημάτων, έχουν αντι-HB-EGF έχει επιδιωχθεί ενεργά για θεραπευτικές εφαρμογές. Ένας αναστολέας HB-EGF της μεταλλαγμένης τοξίνης διφθερίτιδας, CRM197, είναι στη φάση Ι κλινική ανάπτυξη για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνων των ωοθηκών [28]. Anti-HB-EGF αντισώματα U3-1565 και KHK2866 είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές Φάσης Ι για τα στερεά καρκίνους [29]. Ένα αντι-HB-EGF θεραπευτικού μονοκλωνικού αντισώματος αναμένεται να έχει μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής σε σύγκριση με CRM197 [30], [31], αλλά η παραγωγή ισχυρά αντισώματα αντι-HB-EGF έχει πρόκληση και μερικές αντι-HB-EGF μονοκλωνικά αντισώματα με μια λειτουργική δραστηριότητα έχει αναφερθεί [29], [32], [33]. Πρόσφατα, ανέφεραν την παραγωγή εξουδετερωτικών αντι-HB-EGF μονοκλωνικών αντισωμάτων [34]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τον χαρακτηρισμό ενός από τα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-HB-EGF, Υ-142, αναλύοντας λειτουργικές δραστηριότητές του και δέσμευσης επιτόπου. Η ισχυρή βιολογική δράση του Υ-142 συγκρίθηκε με εκείνες του αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα cetuximab, του αναστολέα CRM197 HB-EGF και του αντι-VEGF bevacizumab αντίσωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

ανθρώπου, ποντικού, και αρουραίου SHB-EGF, και EGFR-HFC είχαν προηγουμένως παρασκευάζονται από το υπερκείμενο καλλιέργειας του 293F κυττάρων (Invitrogen) επιμολυσμένα με κάθε πλασμίδιο έκφρασης [34]. συνδετήρες EGFR, αντι-αμφιρεγουλίνη (-ARG αντι) μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-ΕΟΡΚ, αντι-erbB4, αντι-HB-EGF, και αντι-ARG πολύκλωνα αντισώματα, FITC-επισημασμένο αντι-CD31, αντι-VEGF, βιοτινυλιωμένο αντι-VEGF , σημασμένο με υπεροξειδάση (HRP-σημασμένο) αντι-φωσφοτυροσίνης αντισώματα χρένο αγοράστηκαν από την R & amp? D Systems. Anti-φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 και αντι-φωσφορυλιωμένη αντισώματα ΑΚΤ αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Alexa488-επισημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού ελήφθη από την Invitrogen. IgG έλεγχο του ποντικιού, HRP-σημασμένη στρεπταβιδίνη, HRP-σημασμένο αντι-ποντικού, τα αντισώματα IgG αντι-κατσίκας, Cy5-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας IgG Ρογ ειδικό αντίσωμα, και αντι-ανθρώπινης IgG Fc αντισώματος αγοράστηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories. Cetuximab και CRM197 ήταν από ImClone και Sigma Aldrich, αντίστοιχα. Σουλφο-tagged αντίσωμα αντι-ποντικού και σουλφο-tagged στρεπταβιδίνη αγοράσθηκαν από Meso Scale Discovery. Σουλφο-tagged αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα παρασκευάστηκε με επισήμανση αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα (Millipore) με αντιδραστήριο Tag MSD Σουλφο (Meso Scale Discovery).

Antibody Generation

Anti-HB-EGF μονοκλωνικό αντίσωμα Υ-142 παρήχθη προηγουμένως [34]. Εν συντομία, το Υ-142 παρασκευάστηκε με ανοσοποίηση BALB /c ποντίκια (Japan Clea) με υποδόριες ενέσεις αιμοκυανίνη πεταλίδας-συζευγμένο Shb-EGF και κοιλιακό ενέσεις 293F κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο έκφρασης proHB-EGF. Υ-142 καθαρίστηκε από το υπερκείμενο της καλλιέργειας υβριδώματος με rProteinA Sepharose (GE Healthcare). Η μελέτη σε ζώα πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Takeda Pharmaceutical Company Limited (Αριθμός Άδειας: 2802).

Cell Culture

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρική σειρά SK-OV-3, του μαστού κυτταρική σειρά καρκίνου T47D, και του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή SW480 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν με 5Α, RPMI1640 του McCoy, και Leibovit’z L-15 μέσα συμπληρωμένα με 10% ορό, αντίστοιχα. Κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF) και ανθρώπινης ομφάλιας φλέβας ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) αγοράστηκαν από την Lonza και διατηρήθηκε με FGM-2 και EGM-2 κιτ (Lonza), αντίστοιχα.

εξειδίκευσης σύνδεσης Test

Ανθρώπου, ποντίκι ή αρουραίος SHB-EGF ακινητοποιήθηκε σε MSD πλάκα 384 φρεατίων (Meso Scale Discovery). Η μη ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε με PBS που περιέχει 1% BSA. Υ-142 προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Σουλφο-tagged αντίσωμα αντι-ποντικού IgG προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. MSD Διαβάστε Ρυθμιστικό Τ (Meso Scale Discovery) προστέθηκε και χημειοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα Τομέας Imager 6000 (Meso Scale Discovery). ειδικότητα συνδετήρα EGFR Υ-142 προσδιορίστηκε με επώαση διάφορες συγκεντρώσεις του Υ-142 για 1 ώρα σε μια πλάκα 384 φρεατίων συνδέτη ακινητοποιημένου EGFR που ακολουθείται από επώαση με HRP επισημασμένο αντίσωμα IgG αντι-ποντικού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. ΤΜΒ Peroxidase ΕΙΑ Substrate (BIORAD) στη συνέχεια προστέθηκε στην πλάκα 384 φρεατίων και η αντίδραση διακόπηκε μετά από 15 λεπτά με την προσθήκη 1 Ν H

2SO

4. δέσμευση με συνδέτη EGFR αντίσωμα στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα όργανο SPECTRA ΜΑΧ (Molecular Devices).

Biophysical Μέτρηση της K

D

ΚίηΕχΑ πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ένα ΚίηΕχΑ 3200 μέσο (Sapidyne) στους 22 ° C. SHB-EGF έχει ανασυσταθεί σε PBS. SHB-EGF και Υ-142 δείγματα παρασκευάστηκαν σε κενό απαεριωμένο ρυθμιστικό HBS-Ρ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, και 0.005% Tween-20) από την GE Healthcare με φιλτραρισμένο 0,01% BSA και 0,02% αζίδιο του νατρίου. Για το αντίσωμα ανίχνευσης, Cy5-επισημασμένο κατσίκα IgG αντι-ποντικού, χρησιμοποιήθηκε Ρογ συγκεκριμένο. Για κάθε πείραμα ΚίηΕχΑ, 20 μα SHB-EGF αραιώθηκε σε 1 mL 50 mM ανθρακικού νατρίου (ρΗ 9,2), το οποίο προστέθηκε απευθείας σε 50 mg σφαιριδίων αζλακτόνης (UltraLink Biosupport, Thermo Scientific), και στροβιλίστηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C . Μετά λίκνισμα, τα σφαιρίδια πλύθηκαν μία φορά με 1 Μ Tris-HCl (ρΗ 8.5) που περιέχει 1% BSA και ανακινείται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Σε συνδυασμό σφαιρίδια προστέθηκαν στην δεξαμενή χάντρα στο όργανο KinExA και αραιώνεται σε 30 mL με HBS-Ν (10 mM HEPES και 150 mM NaCl, GE Healthcare) που περιέχει 0,02% αζίδιο του νατρίου η οποία ήταν επίσης ο ρυθμιστικό διεξαγωγής για το όργανο KinExA. Όλα τα σφαιρίδια αντιγόνο συζευγμένο χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά την παρασκευή.

Για K

D-ελεγχόμενα πειράματα, 12 συγκεντρώσεις SHB-EGF σε ένα εύρος 4,04 FM-207 ρΜ εξισορροπήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 72 ώρες με 13:03 Υ-142 θέσεις δέσμευσης. Ο όγκος έρεε μέσα από το πακέτο σφαιριδίων για κάθε δείγμα στο K

D-ελεγχόμενη τιτλοδότηση ήταν 23 mL με ρυθμό ροής 0,25 ml /min. Για πειράματα αντίσωμα που ελέγχεται, 12 συγκεντρώσεις SHB-EGF σε ένα εύρος 4,67 FM-239 ρΜ εξισορροπήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες με θέσεις πρόσδεσης 35,6 ρΜ Υ-142. Ο όγκος έρεε μέσα από το πακέτο σφαιριδίων για κάθε δείγμα στην τιτλοδότηση αντισωμάτων ελεγχόμενη ήταν 3 mL σε ένα ρυθμό ροής 0.25 mL /min. Κ

D-ελεγχόμενα δεδομένα και δεδομένα αντίσωμα που ελέγχεται ήταν ταυτόχρονα ταιριάζει με ένα διπλής καμπύλης θετικό πρότυπο συνεργατικότητα χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΚίηΕχΑ (Έκδοση 3.13, Sapidyne).

SHB-EGF Σύνδεσης Αναστολής να EGFR

Η ανασταλτική δράση του Υ-142 κατά την πρόσδεση του SHB-EGF στον EGFR-HFC ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, αντι-ανθρώπινης IgG Fc αντίσωμα ακινητοποιήθηκε πάνω σε μία πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με PBS που περιέχει 20% Immunoblock (Dainippon Sumitomo Pharma), EGFR-HFC προστέθηκε και αντέδρασε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Υ-142 προστέθηκε στη συνέχεια και επωάζεται σε συγκέντρωση 6,7 ηΜ παρουσία 0,63 ηΜ βιοτινυλιωμένης SHB-EGF και 25 ng /mL ηπαρίνης νατρίου για 1 ώρα στους 37 ° C, που ακολουθείται από την προσθήκη HRP-σημασμένη στρεπταβιδίνη και επώαση για 1 ώρα στους 37 ° C. SureBlue ΤΜΒ Microwell Υποστρώματος στη συνέχεια προστέθηκε και η αντίδραση σταμάτησε μετά από 15 λεπτά με την προσθήκη 1 Ν H

2SO

4. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με τη χρήση SPECTRA ΜΑΧ. Η σύνδεση του SHB-EGF στον EGFR-HFC παρουσία Υ-142 υπολογίστηκε ως το ποσοστό της μέγιστης δέσμευσης ότι μετρήθηκε δεσμευτικών SHB-EGF στον EGFR-HFC απουσία Υ-142. Το σήμα ελέγχου δεσμευτικό ελάχιστο ανιχνεύθηκε απουσία SHB-EGF και Υ-142.

EGFR φωσφορυλίωση Δοκιμασία

EGFR φωσφορυλίωση ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, SK-OV-3 κύτταρα απλώθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο 5Α του McCoy που περιέχει 1% ορό σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από μια καλλιέργεια 1 ημέρας, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 ηΜ SHB-EGF ή 10 ηΜ ARG μαζί με Υ-142 ή αντι-ARG μονοκλωνικού αντισώματος για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσεως κυττάρων (Cell Signaling Technology) με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science) και ένα κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Sigma Aldrich). Τα κυτταρικά λύματα επωάστηκαν στη συνέχεια σε ένα αντι-ΕΟΡΚ πλάκα πολυκλωνικό αντίσωμα επικαλύφθηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούμενη από μία επώαση με HRP-σημασμένο αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μια επώαση με ΤΜΒ Peroxidase ΕΙΑ Substrate για 15 λεπτά, η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη 1 Ν H

2SO

4. φωσφορυλίωση του EGFR ανιχνεύθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας Envision (Perkin Elmer). φωσφορυλίωση του EGFR με την παρουσία του Υ-142 ή αντι-ARG αντίσωμα υπολογίστηκε ως το ποσοστό της μέγιστης φωσφορυλίωσης του EGFR μετράται απουσία του Υ-142. Η ελάχιστη έλεγχος φωσφορυλίωσης σήμα που ανιχνεύεται απουσία SHB-EGF, ARG, Υ-142, και αντι-ARG αντίσωμα.

ErbB4 Δοκιμασία Φωσφορυλίωσης

κύτταρα T47D σπάρθηκαν σε 2.5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 96-φρεατίων με μέσο ΚΡΜΙ1640 που περιέχει 10% ορό και καλλιεργήθηκαν για 1 ημέρα. Αφού επιμεταλλωμένα, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 1 ημέρα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ EGF SHB-μαζί με διάφορες συγκεντρώσεις Υ-142 για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως στη δοκιμασία φωσφορυλίωσης του EGFR που περιγράφηκε παραπάνω και μετά επωάστηκαν σε ένα αντι-erbB4 MSD πλάκα πολυκλωνικό αντίσωμα επικαλυμμένο με 384-φρεατίων επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα, αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης σουλφο-tagged επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. MSD Διαβάστε Ρυθμιστικό Τ στη συνέχεια προστέθηκε ως υπόστρωμα και χημειοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα Τομέα Imager 6000. ErbB4 φωσφορυλίωσης με την παρουσία του Υ-142 υπολογίστηκε ως το ποσοστό της μέγιστης φωσφορυλίωσης ErbB4 μετράται απουσία του Υ-142. Η ελάχιστη έλεγχος φωσφορυλίωσης σήμα που ανιχνεύεται απουσία SHB-EGF και Υ-142.

ERK1 /2 και ΑΚΤ φωσφορυλίωση Δοκιμασίες

Για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της ERK1 /2 ή ΑΚΤ , SK-OV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα επιμεταλλωμένα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 3,8% παραφορμαλδεΰδη επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS που περιείχε 0,05% Tween 20-(ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης) τρεις φορές, και αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό πλύσης που περιέχει 1% BSA, 2% ορό κατσίκας, 0,3% κρύο ζελατίνη δέρματος ψαριού, 0,1% TritonX-100, και 0.05% αζίδιο του νατρίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 αντίσωμα ή αντι-φωσφορυλιωμένης αντίσωμα ΑΚΤ όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και επωάστηκαν με Alexa488-σημασμένο αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Προκειμένου να μετρηθεί η ολική πρωτεΐνη σε κάθε φρεάτιο, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa647 ηλεκτριμιδυλο εστέρα (Invitrogen) σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 και AKT καθώς και της συνολικής πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ένα όργανο ImageXpress Micro (Molecular Devices). Τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης για ERK1 /2 και ΑΚΤ ομαλοποιήθηκαν με τη συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης σε κάθε φρεάτιο. επίπεδα φωσφορυλίωσης υπολογίστηκαν ως το ποσοστό των μέγιστων επιπέδων φωσφορυλίωσης ανιχνεύονται απουσία Υ-142. Το ελάχιστο σήμα ελέγχου ανιχνεύθηκε απουσία SHB-EGF και Υ-142.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

SK-OV-3 κύτταρα προστέθηκαν σε 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο 5Α του McCoy που περιέχει 1% ορό και HUVEC προστέθηκαν στην ίδια πυκνότητα σε ΕΒΜ-2 μέσο (Lonza) που περιέχει 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (Hyclone) σε πλάκες 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 1 ημέρα. Τα κύτταρα περαιτέρω καλλιεργήθηκαν παρουσία 10 ηΜ SHB-EGF με Υ-142, το cetuximab, ή CRM197 για 3 ημέρες. Διάφορες συγκεντρώσεις cetuximab και CRM197 χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες [35], [36]. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε με CellTiter-Glo (Promega) χρησιμοποιώντας Envision. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του SK-OV-3 κύτταρα και HUVEC υπολογίστηκε ως το ποσοστό του επιπέδου πολλαπλασιασμού μετράται απουσία του SHB-EGF, Υ-142, το cetuximab, και CRM197.

Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

NHDF σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο με ένα κιτ FGM-2 σε ένα διαυγές πυθμένα μαύρη πλάκα 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες. Χίλια HUVEC σπάρθηκαν πάνω στην μονοστιβάδα NHDF με μέσο ΕΒΜ-2 που περιείχε 2% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό με την παρουσία 50 ηΜ SHB-EGF με διάφορες συγκεντρώσεις Υ-142, το cetuximab, CRM197, ή bevacizumab. Το ευρύ φάσμα συγκέντρωσης του cetuximab, CRM197, ή bevacizumab χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [35] – [37]. Μετά από μία περίοδο επώασης 4 ημερών, HUVEC βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-σημασμένο αντίσωμα αντι-CD31. CD31-θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Acumen EX3 (TTP Labtech). Ο σχηματισμός σωλήνα με την παρουσία του Υ-142, το cetuximab, CRM197, ή bevacizumab υπολογίστηκε ως το ποσοστό του σχηματισμού σωλήνα ανιχνεύεται παρουσία SHB-EGF, Υ-142, το cetuximab, CRM197, και bevacizumab.

(Α) Η δραστικότητα δέσμευσης του Υ-142 με EGFR συνδετήρες με ELISA. Οι διάφορες συγκεντρώσεις του Υ-142 επωάστηκαν σε πλάκα συνδέτη ακινητοποιημένου EGFR. Η πρόσδεση στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με επισημασμένο με HRP αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν τις μέσες ± τυπική απόκλιση (SD) των τιμών που αποκτήθηκαν εις διπλούν. (Β) Η δραστηριότητα σύνδεσης του Υ-142 έως ανθρώπου, ποντικού, και αρουραίου ΗΒ-ΕΟΡ με ELISA. Η δραστικότητα δέσμευσης σε διαφορετικά είδη HB-EGF μετρήθηκε με ELISA χρησιμοποιώντας ένα τεχνολογία ηλεκτροφωταύγειας που βασίζονται. Οι διάφορες συγκεντρώσεις του Υ-142 επωάστηκαν σε SHB-EGF-ακινητοποιημένο πλάκα. Η δέσμευση ανιχνεύθηκε με σουλφο-tagged αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις διπλούν. ευθυγράμμισης (C) αμινοξέων της παρόμοιας με EGF περιοχής των συνδετήρων EGFR. Μια κουκίδα υποδεικνύει ένα αμινοξύ διαφορετικό από HB-EGF. Η παύλα αντιπροσωπεύει ένα κενό. Αιχμές βελών επισημασμένο με έναν αριθμό υποδεικνύουν τις δεσμευτικές επιτόπων Υ-142 προσδιορίζονται στο Σχ. 6. ευθυγράμμισης (d) αμινοξέος του EGF τομέα του ανθρώπου, ποντικού, και αρουραίου ΗΒ-ΕΟΡ. Μια κουκκίδα υποδεικνύει ένα αμινοξύ ταυτόσημη με τον ανθρώπινο ΗΒ-ΕΟΡ. Αιχμές βελών επισημασμένο με έναν αριθμό υποδεικνύουν τις δεσμευτικές επιτόπων Υ-142 προσδιορίζονται στο Σχ. 6.

Η

μονοκλωνικό αντίσωμα VEGF Μέτρηση

Anti-VEGF ακινητοποιήθηκε σε ένα υψηλό πλάκα δέσμευσης MSD διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε με PBS που περιείχε 1% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Υπερκείμενο καλλιέργειας από την δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα που περιγράφεται παραπάνω στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Βιοτινυλιωμένη αντι-νΕΟΡ αντέδρασε στη συνέχεια για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από επώαση με σουλφο-tagged στρεπταβιδίνη επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Διαβάστε Τ Buffer συνέχεια προστέθηκε ως υπόστρωμα και χημειοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα Τομέας Imager 6000 μέσο. Το ποσό VEGF στο υπερκείμενο καλλιέργειας υπολογίστηκε ως ποσοστό του ποσού VEGF παρουσία SHB-EGF.

Western Blot

SHB-EGF και ARG έβρασαν σε Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος ( BIORAD) με ή χωρίς 10 mM διθειοθρεϊτόλη για 5 λεπτά στους 95 ° C. Το μη μειώνεται ή μειωμένες SHB-EGF ή ARG στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο. SHB-EGF ανιχνεύθηκε είτε με 3 μg /mL του Υ-142 ή 3 μg /mL αντι-HB-EGF πολυκλωνικό αντίσωμα ως το πρωτογενές αντίσωμα, ακολουθεί επώαση με HRP-σημασμένο αντι-ποντικού IgG αντίσωμα ή HRP-επισημασμένο αντι -goat αντίσωμα IgG, αντίστοιχα, ως το δευτερεύον αντίσωμα. ARG ανιχνεύθηκε είτε με 3 μg /mL του Υ-142 ή 3 μg /mL αντι-ARG πολυκλωνικό αντίσωμα ως το πρωτογενές αντίσωμα, ακολουθεί επώαση με HRP-σημασμένο αντι-ποντικού IgG αντίσωμα ή HRP-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κατσίκας , αντίστοιχα, ως το δευτερεύον αντίσωμα.

χαρτογράφηση επιτόπου

μελέτη χαρτογράφησης επιτόπων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Εν συντομία, πλασμίδια έκφρασης μεταλλάξεων αλανίνης proHB-EGF παρασκευάστηκαν με ΚΩΔ Plus Mutagenesis Kit (ΤΟΥΟΒΟ). Κάθε πλασμίδιο έκφρασης μορφομετατράπηκε εντός SW480 κυττάρων με Lipofectamine LTX με Plus αντιδραστήριο (Invitrogen) σε πλάκες 96 φρεατίων. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS (+) (PBS με 0,5 mM ΟαΟ

2 και 0.5 mM MgCl

2) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 1% BSA που περιέχει PBS για 30 λεπτά στους 4 ° ΝΤΟ. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS (+) και επωάστηκαν με 200 ηΜ Y-142 ή αντι-HB-EGF πολυκλωνικό αντίσωμα επί 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά τα στάδια πλύσης, HRP-επισημασμένο αντι-ποντικού IgG ή HRP-σημασμένο αντι-κατσίκας IgG-αντίσωμα προστέθηκε για να ανιχνεύσει το Υ-142 ή αντι-HB-EGF πολυκλωνικό αντίσωμα, αντίστοιχα. Μετά από πλύσιμο δύο φορές με PBS (+), ΤΜΒ Peroxidase ΕΙΑ Substrate προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 15 λεπτά. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 1 Ν H

2SO

4. Δέσμευση του αντισώματος ανιχνεύεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα όργανο Envision. Για να ληφθούν υπόψη οι διαφορές μεταξύ των επιπέδων έκφρασης proHB-EGF, η πρόσδεση του Υ-142 σε κάθε μεταλλαγμένο proHB-EGF ομαλοποιήθηκε με εκείνη του αντι ΗΒ-ΕΟΡ-πολυκλωνικό αντίσωμα από κάθε μεταλλάκτη. Η πρόσδεση του Υ-142 τοις εκατό στη συνέχεια υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Y-142 σύνδεσης (%) = (Α /Β) /(C /D) × 100, όπου το Α παριστάνει την απορρόφηση στα 450 nm του Υ-142 σε μεταλλαγμένο proHB-EGF, Β αντιπροσωπεύει η απορρόφηση (450 nm) της αντι HB-EGF-πολύκλωνο αντίσωμα στο μεταλλαγμένο proHB-EGF, C αντιπροσωπεύει την απορρόφηση (450 nm) του Y-142 στην άγριου τύπου proHB-EGF, και D αντιπροσωπεύει η απορρόφηση (450 nm) της αντι ΗΒ-EGF-πολύκλωνο αντίσωμα σε άγριου τύπου proHB-EGF.

Αποτελέσματα

Εξειδίκευση η σύνδεση του Υ-142

η εξουδετέρωση αντι- αντισώματα ΗΒ-ΕΟΡ είχαν προηγουμένως παράγεται από μια προσέγγιση υβριδώματος [34]. Στη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται ένα από τα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-HB-EGF, Υ-142. Δοκιμάσαμε πρώτα το προφίλ πρόσδεσης του Υ-142 προς EGF συνδέτες χρησιμοποιώντας ELISA (Σχ. 1Α). Υ-142 έδειξε συγκρίσιμη δεσμευτική για την HB-EGF και αμφιρεγουλίνη (ARG), αλλά όχι για τις άλλες τέσσερις συνδέτες του EGFR. Στη συνέχεια εξετάστηκε η ειδικότητα είδος Υ-142 δοκιμάζοντας την σύνδεση του με ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου ΗΒ-ΕΟΡ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, Υ-142 συνδέεται με την ανθρώπινη SHB-EGF, αλλά όχι σε ποντικούς και αρουραίους HB-EGF.

Βιοφυσική Μέτρηση της Κ

D για Y-142 για να HB-EGF

Η K

D τιμή του Υ-142 σε ανθρώπινη HB-EGF μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κινητική δοκιμασία αποκλεισμού (ΚίηΕχΑ). K

D-ελεγχόμενα δεδομένα τιτλοδότηση ελήφθησαν με τη χρήση ενός φάσματος συγκεντρώσεων SHB-EGF έχει εξισορροπηθεί με μία σταθερή πρόσδεσης συγκέντρωση Υ-142 θέση (2 φορές το μοριακό συγκέντρωση) 1,03 ρΜ. Για πειράματα αντίσωμα που ελέγχεται, αρκετές συγκεντρώσεις SHB-EGF εξισορροπήθηκαν με σταθερή Υ-142 πρόσδεσης συγκέντρωση θέση του 35,6 ρΜ. Σε μια ανάλυση διπλής καμπυλότητας, το K

D-ελεγχόμενη καμπύλη περιέχει το μεγαλύτερο μέρος του Κ

D πληροφορίες, ενώ η καμπύλη αντίσωμα που ελέγχεται επιστρέφει μια τιμή για τον δεσμευτικό συγκέντρωση θέση του μονοκλωνικού αντισώματος. Η τελευταία παράμετρος μπορεί να συγκριθεί με την ονομαστική πρόσδεσης συγκέντρωση θέση του μονοκλωνικού αντισώματος που μπορεί να καθορίσει εάν η εκτιμώμενη Κ

D θα πρέπει να προσαρμόζεται για την δραστικότητα του αντιγόνου, σε ορισμένες περιπτώσεις [38]. Το K

D-ελεγχόμενη δεδομένων τιτλοδότηση και τα δεδομένα τιτλοδότηση αντισωμάτων που ελέγχονται αρχικά ταιριάζει σε μια ανάλυση διπλής καμπύλης με ένα πρότυπο μοντέλο σύνδεσης 1:01 ισορροπίας. Παρατηρήθηκε, ωστόσο, ότι οι καμπύλες τιτλοδότησης που συλλέγονται στο πλαίσιο τόσο της Κ

D- και προϋποθέσεις αντίσωμα που ελέγχεται μειώθηκε με κλίση πιο απότομη από εκείνη που περιγράφεται από το πρότυπο 1:01 μοντέλο. Αυτή η απότομη κλίση μπορεί να εξηγηθεί μόνο με τη χρήση ενός θετικού προτύπου συνεργατικότητα. Στο θετικό μοντέλο συνεργατικότητα, η πρόσδεση του ΗΒ-ΕΟΡ σε ένα μονοκλωνικό θέση σύνδεσης αντισώματος προκαλεί την συγγένεια του δεύτερου θέση σύνδεσης του αντισώματος για να αυξηθεί [39]. Ως εκ τούτου, ένα μοντέλο ισορροπίας θετική συνεργατικότητα χρησιμοποιήθηκε για να χωρέσει τα δεδομένα τιτλοδότηση διπλής καμπύλης που παρέχεται βελτιωμένη εφαρμογή στη συσκευή διπλής δεδομένα της καμπύλης, αποδίδοντας ένα αποτελεσματικό K

D = 1,50 μ.μ. (Εικ. 2). Επιπλέον, η προκύπτουσα συντελεστής Hill (n = 1.68) ήταν μεγαλύτερη από 1, η οποία αναφέρεται επίσης θετική συνεργατικότητα (n = 1 σημαίνει ανεξάρτητη δέσμευσης) [39].

Dual-καμπύλη ΚίηΕχΑ ισορροπία τιτλοδότηση του SHB-EGF δέσμευσης στο Y-142. Κ

D-ελεγχόμενη δεδομένων (κάτω προσαρμοσμένη καμπύλη) αποκτήθηκαν από την εξισορρόπηση SHB-EGF σε μια περιοχή συγκέντρωσης των 4,04 FM-207 μ.μ. με θέσεις πρόσδεσης 13:03 Υ-142. δεδομένων αντίσωμα που ελέγχεται (top τοποθετηθεί καμπύλη) αποκτήθηκαν από την εξισορρόπηση SHB-EGF σε μια περιοχή συγκέντρωσης 4.67 FM-239 μ.μ. με θέσεις πρόσδεσης 35,6 ρΜ Υ-142. Όλα τα σημεία δεδομένων αποκτήθηκαν εις διπλούν. Αμφότερες οι καμπύλες ήταν ταυτόχρονα ταιριάζει σε μια τυπική θετικό μοντέλο ισορροπίας συνεργασιμότητα, αποδίδοντας ένα αποτελεσματικό K

D = 1,50 μ.μ. (0,31), όπου ο αριθμός στην παρένθεση είναι το διάστημα εμπιστοσύνης 95% του ταιριάζει, και συντελεστή HILL n = 1.68.

η

εξουδετέρωση της δραστικότητας του Υ-142 έναντι SHB-EGF και ARG Σηματοδοσίας

Καθώς η υπερέκφραση της HB-EGF έχει αναφερθεί σε ιστούς του καρκίνου [21] – [25] , η εξουδετέρωση της λειτουργικότητας SHB-EGF, αναμένεται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική δυνατότητα. Εξουδετερωτική δραστηριότητα του Υ-142 έναντι SHB-EGF επομένως αξιολογήθηκε σε δύο βιοχημικές και βασιζόμενες σε κύτταρα δοκιμασίες. EGFR είναι ένας από τους υποδοχείς ΗΒ-EGF, και η σύνδεση του SHB-EGF στον EGFR οδηγεί σε φωσφορυλίωση του EGFR και την ενεργοποίηση των κατάντη σηματοδότησης της. Βρήκαμε ότι η σύνδεση του SHB-EGF στον EGFR-HFC πλήρως αποκλεισμένη με Υ-142 (Σχ. 3Α). Η δραστηριότητα αποκλεισμού SHB-EGF της Y-142 μεταφράστηκε με την πλήρη αναστολή της SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR (Σχ. 3Β). Εκτός από EGFR, SHB-EGF δεσμεύει και ενεργοποιεί ErbB4 μονοπατιού σηματοδότησης [2]? Πράγματι δείξαμε ότι το Υ-142 θα μπορούσε να εξουδετερώσει την SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του ενδογενώς εκφράζονται ErbB4 στα κύτταρα T47D (Σχ. 3C). Σημαντικά, η δραστικότητα εξουδετέρωσης του Υ-142 επηρεάζεται EGFR καθοδικά συμβάντα σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D και 3Ε, Υ-142 εξουδετερώνονται Shb-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και ΑΚΤ, αντίστοιχα. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι SHB-EGF δεσμεύει και ενεργοποιεί EGFR και ErbB4, και το Υ-142 μπορούν να εξουδετερώσουν SHB-EGF που προκαλείται EGFR και erbB4 σηματοδότηση.

(Α) Ανασταλτική δραστικότητα του Υ-142 σε SHB-EGF σύνδεση με EGFR. EGFR-HFC επωάστηκε σε μία πλάκα επικαλυμμένα με αντίσωμα αντι-ανθρώπινης IgG Fc. Υ-142 στη συνέχεια επωάστηκε σε συγκέντρωση 6,7 ηΜ παρουσία 0,63 ηΜ βιοτινυλιωμένης SHB-EGF επί 1 ώρα στους 37 ° C. SHB-EGF συνδέεται με EGFR-HFC ανιχνεύθηκε με ΗΚΡ-επισημασμένη στρεπταβιδίνη. σύνδεση με EGFR-HFC παρουσία Υ-142 SHB-EGF υπολογίστηκε ως ποσοστό του «ελέγχου» SHB-EGF σύνδεσης προς EGFR που συνέβησαν χωρίς Y-142. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν. (Β) εξουδετερωτική δράση του Υ-142 έναντι φωσφορυλίωση του EGFR. SK-OV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 ηΜ SHB-EGF και 67 ηΜ Y-142. Τα κυτταρικά λύματα επωάστηκαν σε πλάκα αντι-ΕΟΡΚ-επικαλυμμένα, ακολουθούμενη από επώαση με HRP-σημασμένο αντίσωμα αντι-phosphorytosine. φωσφορυλίωση του EGFR με την παρουσία του Υ-142 υπολογίστηκε ως ποσοστό του «ελέγχου» φωσφορυλίωση του EGFR που συνέβησαν χωρίς Y-142. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν. (Γ) εξουδετέρωση δραστικότητα του Υ-142 έναντι φωσφορυλίωση erbB4. Τα κυτταρολύματα των κυττάρων T47D όπως παρασκευάσθηκε στο Σχ. 3Α επωάστηκαν σε πλάκα αντι-ErbB4 επικαλυμμένο με αντίσωμα. Η φωσφορυλίωση του ErbB4 ανιχνεύθηκε με ένα αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης σουλφο-tagged. φωσφορυλίωση ErbB4 παρουσία Υ-142 υπολογίστηκε ως ποσοστό του «ελέγχου» φωσφορυλίωση ErbB4 που συνέβησαν χωρίς Y-142. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις διπλούν. (Δ) και (Ε) εξουδετερωτική δραστηριότητα του Υ-142 κατά (D) ERK1 /2 φωσφορυλίωση και (Ε) ΑΚΤ φωσφορυλίωση. Στο (D) και (Ε) SK-OV-3 κύτταρα σε επεξεργασία με 10 ηΜ SHB-EGF και 200 ​​ηΜ Y-142 χρωματίστηκαν με αντι-φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 αντίσωμα ή ένα αντι-φωσφορυλιωμένης αντίσωμα ΑΚΤ, αντίστοιχα, που ακολουθείται από ένα Alexa488-επισημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού. Φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ ήταν τόσο ανιχνεύεται με ένα όργανο ImageXpress Micro και υπολογίζεται ως ποσοστό των επιπέδων φωσφορυλίωσης «ελέγχου» που συνέβη χωρίς Υ-142. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις διπλούν. (F) εξουδετερωτική δράση του Υ-142 προς ARG. SK-OV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 ηΜ ARG συν διάφορες συγκεντρώσεις του Υ-142 (2 ηΜ, 6,7 ηΜ, 20 ηΜ, και 67 ηΜ). μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ARG (67 ηΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα κυτταρικά λύματα επωάστηκαν σε πλάκα αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα επικαλυμμένων ακολουθούμενη από μία επώαση με HRP-σημασμένο αντίσωμα αντι-phosphorytosine. φωσφορυλίωση του EGFR υπολογίστηκε ως ποσοστό του «ελέγχου» φωσφορυλίωση του EGFR που συνέβησαν χωρίς Υ-142. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Σε μια δεσμευτική δοκιμή εξειδίκευση, το Υ-142 που αναγνωρίζονται ARG καθώς SHB-EGF, οι οποίες είναι και οι δύο συνδετήρες EGFR (Εικ. 1Α) . Στη συνέχεια δοκιμάζονται εάν το Υ-142 θα μπορούσε να εξουδετερώσει τη βιολογική δραστικότητα του ARG. Υποθέσαμε ότι το Υ-142 θα είναι σε θέση να εξουδετερώσει την λειτουργικότητα του ARG εξαιτίας της εξουδετέρωσης της δραστηριότητα έναντι SHB-EGF και διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με ARG. Ωστόσο, δεν ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η φωσφορυλίωση του EGFR που επάγεται από ARG ήταν μόνο εν μέρει εξουδετερώθηκε με Υ-142 (Σχ. 3F), ενώ το Υ-142 μπλοκάρει πλήρως την SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Υ-142 θα μπορούσε να εξουδετερώσει τόσο SHB-EGF και ARG λειτουργικές δραστηριότητες, αν και δραστηριότητα ARG στο EGFR έχει αποκλειστεί μόνο εν μέρει από το Υ-142.

Σύγκριση της SHB-EGF δραστικότητας εξουδετέρωσης του Υ-142 με εκείνες του cetuximab, CRM197, και Bevacizumab

η δραστηριότητα εξουδετέρωσης του Υ-142 έναντι SHB-EGF συγκρίθηκε με δύο γνωστούς αναστολείς της οδού EGFR: cetuximab και CRM197. Cetuximab, ένα αντι-EGFR μονοκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιείται ως θεραπευτικό του καρκίνου παράγοντα, καταστέλλει EGFR-εξαρτώμενη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με αναστολή της ενεργοποίησης EGFR. CRM197, μια μεταλλαγμένη τοξίνη διφθερίτιδας, δεσμεύεται σε proHB-EGF και η επακόλουθη εσωτερικοποίηση CRM197 προκαλεί την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.