Αφηρημένο

μιτοχονδριακή σχάση είναι μια διαδικασία που περιλαμβάνει την διάσπαση των μιτοχονδρίων σε μικρότερα κομμάτια και ρυθμίζεται από την ΘΤΡάση Dynamin που σχετίζονται με πρωτεΐνη 1 (Drp1). Τα υψηλότερα επίπεδα των μιτοχονδριακών σχάσης που σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, οι τρέχουσες μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση ακρίβεια μιτοχονδριακή σχάση προκειμένου να συγκριθούν θεραπευτικών που στοχεύουν αυτή τη διαδικασία είναι συχνά ασαφείς ή βασίζονται σε υποκειμενική εκτίμηση. Τα μιτοχόνδρια είναι επίσης επιρρεπής σε συνάθροιση, κάνοντας ακριβή ανάλυση δύσκολη. Εδώ περιγράφουμε μία βελτιωμένη προσέγγιση για την ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών κατακερματισμού εμπλέκονται πολλές διαφορές από τη στιγμή υπάρχουσες μεθόδους. Τα κύτταρα πρώτα υποβλήθηκαν σε κυτταρολογική φυγοκέντρηση, η οποία μειώνει την κυτταρική ύψος z-άξονα και διασπείρει επιμέρους μιτοχόνδρια για ευκολότερη παρατήρηση. Τρία εμπορικά διαθέσιμα εργαλεία ανάλυσης φθορισμού εφαρμόζεται στη συνέχεια για την αποσαφήνιση υπόλοιπο μιτοχονδριακό συμπλέγματα που απαιτούν περαιτέρω εξέταση. Τέλος, cut-off βαθμολόγησης εφαρμόζεται, το οποίο μπορεί να προσαρμόζεται στις ατομικές κυτταρικό τύπο. Το προκύπτον προσέγγιση επιτρέπει την αποτελεσματική και αντικειμενική αξιολόγηση των μιτοχονδριακών κατακερματισμού σε απόκριση στη θεραπεία. Εφαρμόσαμε αυτή την τεχνική σε ένα πειραματικό ερώτημα που αφορούν νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών (OVCA). Η σισπλατίνη και η φυτοχημικές piperlongumine βρέθηκαν να επάγουν τόσο μιτοχονδριακή σχάση και απόπτωση σε νόσο ευαίσθητη κύτταρα, ενώ μόνο piperlongumine ήταν σε θέση να εκδηλωθούν αυτές κυτταρικές αποκρίσεις σε χημειοθεραπεία κύτταρα. Piperlongumine απόπτωση φαίνεται να διαμεσολαβείται από Drp1 εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση, καθώς η αποπτωτική απόκριση εξασθένησε με την παρουσία του αναστολέα Drp1 mDivi-1. Η μελέτη μας παρέχει βάσεις για μια πιο αντικειμενική προσέγγιση όσον αφορά την ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών κατακερματισμό, και ρίχνει περισσότερο φως σε ένα πιθανό μηχανισμό δράσης για piperlongumine στην αντιμετώπιση των χημειοθεραπεία OVCA

Παράθεση:. Farrand L, Kim JY, Im -Aram Α, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) Μια βελτιωμένη ποσοτική προσέγγιση για την εκτίμηση του μιτοχονδριακού θρυμματισμού κύτταρα στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10.1371 /journal.pone.0074008

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 29 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Farrand et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το πρόγραμμα World Class Πανεπιστήμιο (WCU) (R31-10056) μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας, που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας και τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (MOP-119381). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα μιτοχόνδρια είναι δυναμικές οργανίδια που βρίσκεται στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα που υφίστανται τις διαδικασίες της σχάσης (διαίρεση σε ξεχωριστές δομές) και σύντηξη (συγχώνευση δύο ή περισσότερων γειτονικών δομών). Σχάση είναι γνωστό ότι προηγείται απόπτωση σε έναν αριθμό κυτταρικών τύπων, και πιστεύεται ότι διευκολύνει μια πιο ταχεία απελευθέρωση του μιτοχονδριακού προ-αποπτωτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων κυτοχρώματος c και SMAC [1]. Ωστόσο, η ακριβής ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών σχάσης είναι τεχνικά δύσκολο λόγω του μεγάλου αριθμού παρόντες σε πολλούς τύπους κυττάρων, και μορφολογικά χαρακτηριστικά τους. Τα κύτταρα τυπικά επιδεικνύουν ποικίλους βαθμούς σχάσης ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και περιβαλλοντικό πλαίσιο [2]

Η πλειοψηφία των σημερινών προσεγγίσεων για την ποσοτική αξιολόγηση των μιτοχονδριακών σχάσης είναι παραλλαγές δύο πρωταρχικούς στρατηγικών [2] – [7]. . Η πρώτη προσέγγιση απαιτεί μέτρηση των μηκών των επιμέρους μιτοχόνδρια για να προσδιοριστεί ο βαθμός της σχάσης [3] – [5]. Έχουμε βρει ότι η συσσωμάτωση των μιτοχονδρίων [6], [7], ειδικά περιέλιξη και δέσιμο των δομών [8], καθώς και τον μεγάλο αριθμό των μιτοχονδριακών θραυσμάτων μέσα σε κάθε κύτταρο καθιστά αυτή την προσέγγιση μη πρακτική για τουλάχιστον ορισμένους τύπους κυττάρων. Επίσης δεν λαμβάνει υπόψη τη 3-διάστατο δομή των μιτοχονδρίων μέσα στα κύτταρα, το οποίο δεν επιτρέπει την μέτρηση κατά μήκος της άξονα z εάν χρησιμοποιείται ένα μόνο 2-διαστάσεων εικόνας. Μια άλλη προσέγγιση απαιτεί την υποκειμενική κρίση της μιτοχονδριακής μορφολογίας, και απαιτεί από τον φορέα εκμετάλλευσης για να δείξει εικόνες που θεωρούνται αντιπροσωπευτικές των κυττάρων με σωληνοειδή ή κατακερματισμένη μιτοχόνδρια (άλλοι όροι που χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν τη μορφολογία περιλαμβάνει επίμηκες, λιωμένο, ενδιάμεσα, σημεία στίξης και «κοκκώδη») . Ποσοτικοποίηση χρήση αυτής της προσέγγισης στηρίζεται ουσιαστικά στις απόψεις του παρατηρητή, και κάθε κύτταρο κατηγοριοποιούνται σύμφωνα με την οποία αντιπροσωπευτική εικόνα που περισσότερο μοιάζει με [9] – [11]. Μια σημαντική ανησυχία για την εφαρμογή αυτής της τεχνικής είναι η εξάρτησή της από την υποκειμενική απόφαση, που εισάγει η μεταβλητότητα μεταξύ των επιμέρους παρατηρητές. Παραδοσιακά ανοσοκυτταροχημεία σε θαλάμους σκάφη παράγει επίσης εικόνες που συνήθως περιέχουν τουλάχιστον κάποια μιτοχόνδρια που βρίσκονται εκτός εστίασης κατά την απεικόνιση φθορισμού, και ως εκ τούτου ελλιπή εκπροσώπηση του συνόλου του δείγματος.

Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αναπτυχθεί μια βελτιωμένη μέθοδος για την ποσοτικοποίηση του βαθμού της μιτοχονδριακής κατακερματισμού μέσα στα κύτταρα, και να εφαρμόζουν την προσέγγιση αυτή σε σύγκριση με την επίδραση της φυτοχημικές piperlongumine στη μιτοχονδριακή σχάση στη νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vitro

. Ενώ η ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών κατακερματισμού θα νοητό αντιπροσωπεύουν μικρό μιτοχονδριακή θραύσματα που εμφανίζονται λόγω της σύνθεση νέων μιτοχονδρίων και τον κατακερματισμό που προκαλείται από mitophagy, όταν συνδυάζεται με περαιτέρω επικύρωση με τη χρήση κατάλληλων δεικτών, μπορεί να γίνει πιο ακριβής εκτίμηση της έκτασης της μιτοχονδριακής σχάσης. Η μέθοδος μας περιλαμβάνει κυτταρολογική φυγοκέντρηση που συλλαμβάνει αποπτωτικά και υγιή κύτταρα χρησιμοποιώντας 3-διαστάσεων απεικόνισης (μέσω συνεστιακής λέιζερ μικροσκοπίας z-στοίβαγμα), και παράγει πεπλατυσμένο κυττάρων με διασκορπισμένη μιτοχόνδρια που είναι πιο εύκολο να διακρίνει κατά τη διάρκεια της απεικόνισης. Σε περιπτώσεις μιτοχονδριακής συνάθροισης, τα τρία εμπορικά διαθέσιμα εργαλεία λογισμικού (φθορισμού Ένταση Profiling, Ορθογώνια Τμηματισμός, και Χαρτογράφηση θερμότητας) που χρησιμοποιούνται για να αποσαφηνίζουν τις συστάδες και τον προσδιορισμό του αριθμού των μεμονωμένων μιτοχόνδρια. Επιπλέον, μια τεχνική βαθμολόγησης αποκοπής εφαρμόζεται για την αξιολόγηση πιο αποτελεσματικά κύτταρα είτε ως κατακερματισμένο ή σωληνοειδή.

Εμείς προσπάθησε να καταδείξει την πρακτική εφαρμογή της νέας μας προσέγγισης, με τη χρήση του να διερευνήσει το ρόλο του μιτοχονδριακού σχάση στην χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών (OVCA). Αντοχή σε CDDP (σισπλατίνη: cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος (II)) σε καρκίνο των ωοθηκών είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία [12]. Ενώ η εμπλοκή των μιτοχονδρίων σε κασπάση απόπτωση που διαμεσολαβείται έχει ερευνηθεί εκτενώς, ο ρόλος του μιτοχονδριακού μορφολογίας σε χημειοαντίσταση απομένει να γίνει πλήρως κατανοητή. Piperlongumine είναι ένα φυσικό συστατικό του Long Πιπεριά (

Piper longum

L.) και έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν έναν αριθμό βιοδραστικών αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων [13], προς τα κάτω ρύθμιση των υποδοχέων των ανδρογόνων [14] και ευρεία αποτελέσματα εναντίον μιας σειράς χημειοθεραπεία τύπων καρκινικών κυττάρων μέσω της επαγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου [15]. Έχουμε εφαρμόσει την παραπάνω περιγραφείσα ποσοτική προσέγγιση για να συγκρίνουν τα αποτελέσματα του CDDP και piperlongumine στη μιτοχονδριακή σχάση και την απόπτωση σε νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία OVCA κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

CDDP αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Piperlongumine αγοράστηκε από Tocris Βιοεπιστημών (Bristol, UK). Anti-GAPDH, αντι-Drp1 και (Ser637) αντισώματα-Drp1 αντι-φωσφο ήταν από την Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Αντι-TOM20 αντίσωμα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Alexa Fluor® 488 δευτερογενές αντίσωμα, TEMED, RPMI 1640 μέσο καλλιέργειας, ορό εμβρύου βοός και αντιδραστηρίου αντιξεθωριάσματος παρατείνει Χρυσό με DAPI ήταν από την Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε Dako αραιωτικό αντισώματος (Dako # s0809) από την Agilent Technologies (Glostrup, Δανία). Πλήρης μίνι πρωτεάσης δισκία κοκτέιλ αναστολέα και PhosStop αναστολέας φωσφατάσης δισκία κοκτέιλ ελήφθησαν από την Roche Applied Sciences (Penzberg, Γερμανία).

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

CDDP ευαίσθητη ανθρώπινη κυτταρική σειρά OVCA (OV2008) [16] και ανθεκτικά ομόλογό (C13 *) του [17] ήταν δώρα από δρχ Rakesh Goel και Barbara Vanderhyden (Ottawa Νοσοκομείο Κέντρο Καρκίνου, Ottawa, ON, Καναδάς), και καλλιεργήθηκαν όπως έχει ήδη αναφερθεί [18]. Έχουν ωοθηκών ενδομητριοειδές αδενοκαρκίνωμα προέλευσης με πλακώδους διαφοροποίησης.

Δοκιμασία Απόπτωσης Annexin V

OVCA κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης V (Bioline, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο) και ιωδιούχο προπίδιο για να προσδιοριστεί η αναλογία των κυττάρων που ήταν στο πρώιμο και όψιμο στάδια της απόπτωσης [19]. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα BD FACSCalibur Κυτταρόμετρο Ροής (BD Biosciences) και το λογισμικό CellQuest /ModFit.

Ανοσοκηλίδωση και μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. πυκνότητες Band αναλύθηκαν και ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα BioRad XRS ChemiDoc + και Lab Image V3.0 (Hercules, CA, USA). Ον2008 κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε διαφάνειες θάλαμο 8 φρεατίων, επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με φθορισμό και χρωματίστηκαν με Αντιδραστήριο Gold παρατείνει αντιξεθωριάσματος με DAPI (μπλε, πυρηνική χρώση). Είχαν απεικονίστηκαν αμέσως με ένα Zeiss LSM700 ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης εξοπλισμένο με ένα Zeiss T-ΡΜΤ ψηφιακή κάμερα (Zeiss, Oberkochen, Germany).

Κυτταρολογική Φυγοκέντρηση και τη σταθεροποίηση του Cells

Τα κύτταρα σπάρθηκαν για 12 ώρες σε μέσα RPMI συμπληρωμένα με 10% FBS σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την κατεργασία με κατάλληλους παράγοντες δοκιμής, συλλέχθηκαν μετά από 2 λεπτά επώασης με 0.025% θρυψίνη (200 μl) στους 37 ° C. Η θρυψινοποίηση διεξήχθη ταχέως για να ελαχιστοποιηθεί μιτοχονδριακή βλάβη και η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 10% FBS σε μέσο RPMI 1640. Τα κύτταρα πλένονται απαλά με 1 ml PBS (900 ×

g

, 1 λεπτό? Όλα PBS διηθείται με ένα φίλτρο 0.45 μικρομέτρων σύριγγα? Sartorius Biotechnology, Goettingen, Germany) και το κυτταρικό ίζημα προσεκτικά επαναιωρήθηκε σε 500 μΐ φρέσκου PBS. Πενήντα μικρολίτρα του εναιωρήματος φυγοκεντρήθηκε (900 χ

g

, 4 λεπτά) χρησιμοποιώντας κυτταρολογική χοάνες μαζί με διαφάνειες σιλάνιο επικαλυμμένα γυαλί και Whatman χαρτί φίλτρου (Hanil Science Cytospin κυτταρολογική φυγοκέντρησης? Daejeon, Κορέα). Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια πλύθηκε (3 χ 5 λεπτά) σε PBS με ήπια ανάδευση, διαπερατά με 0,02% Triton-X αραιωμένο σε PBS (επωάστηκε για 10 λεπτά στους 4 ° C) και υποβλήθηκαν σε άλλο κύκλο πλύσης PBS (3 χ 5 λεπτά). Τα κύτταρα επωάστηκαν με TOM20 (μιτοχονδριακή υπομονάδα υποδοχέα εισαγωγής) αντίσωμα (1:250, 24 ώρες, 4 ° C), πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με Alexa 488 Fluor® δευτερεύον αντίσωμα (θερμοκρασία δωματίου, 1 ώρα). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται σε PBS πριν ολοκληρωθεί η σταθεροποίηση με καλυπτρίδα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI, και απεικόνισης συνεστιακού άρχισε αμέσως.

Η ποσοτικοποίηση του μιτοχονδριακού σχάση

Μετά την κυτταρολογική φυγοκέντρηση, στερέωση και ανοσοχρώση της τα κύτταρα, 3-διαστάσεων εικόνες των μεμονωμένων κυττάρων ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία με υπέρθεση τουλάχιστον 12 διατομής εικόνες που λαμβάνονται σε προσαυξήσεις κατά μήκος του άξονα Ζ και περιλαμβάνει το σύνολο του όγκου των κυττάρων. Τυπικές ρυθμίσεις έκθεσης που εμπλέκονται ένα pixel παραμονής & gt? 50 μικροδευτερόλεπτα και τις διαστάσεις πεδίο 300 × 300 μικρόμετρα. Ένα ελάχιστο 100 κύτταρα ανά ομάδα θεραπείας αξιολογήθηκαν για μιτοχονδριακή σχάση σε κάθε επανάληψη, με στατιστικά στοιχεία που προέρχονται από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις. Κάθε μεμονωμένο κύτταρο αναλύονται είχε χαρακτηριστεί είτε ως κατακερματισμένο ή όχι κατακερματισμένη, σύμφωνα με το κατά πόσον πληρούνται οι cut-off βαθμολογία 8. Τα κύτταρα που πληρούσαν τον ορισμό της «κατακερματισμένη», επομένως, περιείχε 8 ή περισσότερες μεμονωμένες μιτοχονδριακό θραύσματα που ήταν κάθε & lt? 3 μικρόμετρα σε μήκος κατά μήκος του μακρύτερου άξονα. Σε περίπτωση αμφιβολιών λόγω συσσωμάτωσης των μιτοχονδρίων, τρία εμπορικά διαθέσιμα εργαλεία λογισμικού που περιλαμβάνονται στο πακέτο λογισμικού Zeiss LSM (φθορισμού Ένταση Profiling, Ορθογώνια Τμηματισμός και Χαρτογράφηση θερμότητας) χρησιμοποιήθηκαν για την επίλυση των αβεβαιοτήτων. Φθορισμού Ένταση προφίλ επιτρέπει την ανίχνευση της σημασμένο με φθορισμό μιτοχονδριακού όρια (επισημαίνονται με TOM20), όπως αντανακλάται από απότομες αυξήσεις ή μειώσεις στην ένταση φθορισμού [20]. Ο χειριστής τραβάει μια ευθεία γραμμή μέσω οποιαδήποτε περιοχή της εικόνας, και ένα αυτοματοποιημένο γράφημα της έντασης φθορισμού κατασκευάζεται. Ορθογώνια Τμηματισμός επιτρέπει σε κάθε περιοχή της εικόνας που πρέπει να ελεγχθούν από έναν x ή y-άξονα point-of-view (POV). Αυτό δημιουργεί μια εικονική προοπτική διατομής και παρέχει πληροφορίες σχετικά με το μιτοχονδριακό όρια που θα έπρεπε κανονικά να επηρεαστεί εάν βλέπουν από το παραδοσιακό top-down POV. Χαρτογράφηση Heat χρώμα-κωδικοί όλων φθορισμού αντικειμένων στο εσωτερικό ενός 3-διαστάσεων εικόνα ανάλογα με τη θέση του αντικειμένου κατά μήκος του άξονα Ζ. Σε οπτικοποίηση μιτοχόνδρια, το εργαλείο είναι πιο χρήσιμη για τη διάκριση χωριστών μιτοχόνδρια που βρίσκονται σε αντίθετες πλευρές του πυρήνα (και φαίνεται αλλιώς ως ενικό μιτοχόνδρια). Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα εργαλεία αυτά δεν ήταν αναγκαίες για να αναγνωρίσουν κατακερματισμένη μιτοχόνδρια, καθώς κυτταρολογική φυγοκέντρηση διασπείρονται τα οργανίδια για ευκολότερη θέαση. Το μιτοχονδριακό μορφολογία τουλάχιστον 80 κύτταρα ανά ομάδα αγωγής προσδιορίστηκε, με τον παρατηρητή τυφλωμένο στην ταυτότητα των ομάδων θεραπείας. Ποσοτικοποιήσεις ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη με μονόδρομη, αμφίδρομη ή τρίοδη ανάλυση της διακύμανσης, χρησιμοποιώντας λογισμικό SigmaPlot (εκδόσεις 12? Systat Software, Chicago, IL, USA). Οι διαφορές μεταξύ των πολλαπλών πειραματικές ομάδες προσδιορίζεται με τη δοκιμή post-hoc Bonferroni. Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Κυτταρολογικό φυγοκέντρηση Ενισχύει μιτοχονδριακού απεικόνισης με την αύξηση διαχωριστική αποστάσεις μεταξύ Ατομική μιτοχόνδρια

Πρέπει πρώτα σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της κυτταρολογικής φυγοκέντρησης για συνεστιακή ποιότητα απεικόνισης των μιτοχονδρίων. Βελτιστοποίηση αποκάλυψε ότι οι ιδανικές ρυθμίσεις του ρότορα της κυτταρολογικής φυγοκέντρησης για απεικόνιση κύτταρα Ον2008 περιελάμβανε 900 × g γύρισμα για 4 λεπτά. Όλα τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αυτές τις ρυθμίσεις. Σε περίπτωση απουσίας του σταδίου φυγοκέντρησης, μιτοχόνδρια παρατηρήθηκαν να συσσωματώνονται στενά προς τον πυρήνα και να κάμπτεται προς την γωνία του φακού προβολής (Σχήμα 1, Σχήμα S1 Α). Πλευρά των χαρακτηριστικών των κυττάρων χωρίς φυγοκέντρηση αποκάλυψε ένα μεγάλο ύψος άξονα z τουλάχιστον 8 μικρόμετρα, καθιστώντας ατομική διάκριση χωριστών μιτοχονδρίων δύσκολη. Με την ενσωμάτωση ενός σταδίου φυγοκέντρησης, τα μιτοχόνδρια διαχωρίστηκαν περαιτέρω από τον πυρήνα, και αυξημένες αποστάσεις προέκυψαν μεταξύ μεμονωμένων μιτοχόνδρια. Φυγοκεντρούμε τα κύτταρα παρουσίασαν μειωμένο ύψος z-άξονα περίπου 3 μικρόμετρα, με αποτέλεσμα την ευκολότερη παρατήρηση μεμονωμένων μιτοχονδριακών δομών (Σχήμα 1Β, Σχήματα S1B-C). Μια σύγκριση της ποιότητας εικόνας με και χωρίς φυγοκέντρηση, χρησιμοποιώντας ίδιες ρυθμίσεις απεικόνισης, αποκάλυψε ότι φυγοκέντριση βελτίωσε τη συνολική ευκρίνεια του μιτοχονδριακού χαρακτηριστικά (σχήμα 1Γ). Αυτό οφειλόταν, εν μέρει, στο γεγονός ότι χωρίς φυγοκέντρηση, οι εικόνες φθορισμού περιλαμβάνονται υψηλότερο βαθμό «out-of-εστίασης» υποβάθρου φθορισμού (δηλ. Από μιτοχόνδρια που δεν ήταν σαφώς ορατή μέσα στο επίπεδο άξονα Ζ στην οποία η εικόνα λήφθηκε). Η φυγοκέντρηση βελτιώνει την εστίαση της εικόνας από την ισοπέδωση χαρακτηριστικά των κυττάρων εντός του ιδίου επιπέδου εστίασης.

(Α) 3-διαστάσεων κάτοψη και πλευρικά προφίλ των μη επεξεργασμένων κυττάρων Ον2008, με και χωρίς κυτταρολογική φυγοκέντριση προ της καθήλωσης. Κίτρινα βέλη δείχνουν τυπικές περιοχές του διαχωρισμού που εμφανίζονται μεταξύ των μιτοχονδρίων μετά τη φυγοκέντρηση. (Β) Ορθογώνια τμήματα των ίδιων εικόνων φαίνεται στο (Α) που λαμβάνονται με τις ίδιες ρυθμίσεις έκθεσης της κάμερας. Κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν για τα πυρηνικά (DAPI, μπλε) και μιτοχονδριακή (TOM20, πράσινο) σήμα. (Γ) Η σύγκριση του μιτοχονδριακού ποιότητα της εικόνας μεταξύ των συμβατικών ανοσοκυτταροχημεία και κυτταρολογική προσεγγίσεις φυγοκέντρηση. Εικόνες της κλασικής σωληνοειδή και κατακερματισμένη μιτοχονδριακή μορφολογία γίνεται εμφανώς πιο έντονη μετά τη φυγοκέντρηση, λόγω της ελαχιστοποίησης του φθορισμού που προέρχονται από πηγές φόντο πέρα ​​από το εστιακό επίπεδο. Η διεύρυνση του πυρήνα μετά τη φυγοκέντρηση οφείλεται επιπέδωση των κυττάρων από την κεντρομόλο δύναμη. μπαρ Κλίμακα = 5 μm.

Η

φθορισμού Ένταση Profiling, Ορθογώνια Τμηματισμός και Χαρτογράφηση θερμότητας Εργαλεία επιτρέψει την ταχεία Διάκριση των Ατομικών μιτοχονδριακού θραύσματα μέσα Αδρανή

σημειωθεί ότι αν και το βήμα φυγοκέντρησης ενισχυμένη μας ικανότητα να διακρίνουν τα μιτοχόνδρια, σε ορισμένες περιπτώσεις συνυπολογισμού των μιτοχονδρίων φαίνεται αναπόφευκτη, παρά τις προσπάθειες για την επίλυση του ζητήματος. Υιοθετήσαμε τρία εργαλεία ανάλυσης φθορισμού (Ένταση Φθορισμού Profiling, Ορθογώνια Τμηματισμός και Χαρτογράφηση θερμότητας) να συμπληρώσει την ποσοτικοποίηση των μιτοχονδρίων παρουσίας εντός αδρανών υλικών. Τα εργαλεία αυτά παρέχουν μεγαλύτερη πληροφόρηση σχετικά με το χωρικό προσανατολισμό των μιτοχονδριακών μεμβρανών, επιτρέποντας αποσαφήνιση του σήματος φθορισμού που μπορεί διαφορετικά να προκαλέσει σύγχυση. Ένταση Φθορισμού Profiling (Zeiss LSM πακέτο λογισμικού) είναι ένα εργαλείο που χρησιμοποιείται κανονικά για τον προσδιορισμό αναλογίες σήματος προς φόντο απέναντι φθορισμού περιοχές μιας εικόνας [20]. Αυτό το εργαλείο μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά να προσδιοριστεί ο αριθμός των μεμονωμένων μιτοχονδρίων μέσα σε ένα συσσωμάτωμα, όπως η ένταση του φθορισμού είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των μιτοχονδριακών μεμβρανών. Χρησιμοποιώντας διαφανή επικαλύψεις, ο αριθμός των μιτοχονδρίων μπορεί να προεκταθεί σε μεγάλες ομάδες με απλή διαίρεση του σήματος κορυφής από την ένταση του φθορισμού που λαμβάνεται από ένα μόνο μιτοχόνδριο (Σχήμα 2Α). Χαρτογράφηση θερμότητας παρέχει πληροφορίες σχετικά με τον άξονα z μιτοχονδριακή τοποθεσίες χρησιμοποιώντας ένα φάσμα χρωματική κωδικοποίηση (Σχήμα 2Β, Σχήματα S2A-C) [21]. Τα μιτοχόνδρια που είναι επάλληλα ή ισοπέδωσε πίσω ή μπροστά από τον πυρήνα μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί σύμφωνα με την ανάθεση το χρώμα τους. Τέλος, Ορθογώνια Τμηματισμός (Zeiss LSM) παρέχει διατομής απόψεις του κάθε x-y θέση από την άποψη κάθετα προς τον άξονα z, επιτρέποντας στενή επιθεώρηση του μιτοχονδριακού όρια που διαφορετικά θα επισκιαστεί από μια παραδοσιακή άποψη πάνω προς τα κάτω (Σχήμα 2C). Σε αρκετά υψηλής ανάλυσης, και με τη βέλτιστη επέκταση κυτταρόπλασμα μέσω του βήματος φυγοκέντρησης, βρήκαμε ότι αυτά τα εργαλεία φθορισμού απαιτείται μόνο σε & gt? 10% των περιπτώσεων, όπου δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί μια απόφαση που οφείλεται σε παράτυπες μιτοχονδριακή συνάθροιση. Η αποτελεσματική χρήση των εργαλείων αυτών εξαρτώνται σε διάφορες υποθέσεις, για παράδειγμα, ότι όλες οι μιτοχόνδρια σε συγκεντρωτική είναι εξίσου χρωματισμένο, ότι φθορίζον σήμα έχει επαρκή λόγο σήματος προς θόρυβο και ότι οι μιτοχονδριακές μεμβράνες διακρίνονται από αντίστοιχες αλλαγές στο σήμα φθορισμού.

(Α) φθορισμού ένταση των χαρακτηριστικών ενός μόνο κυττάρου με κατακερματισμένο μιτοχόνδρια. Ένταση των μιτοχονδριακών σήματος κατά μήκος ενός γραμμικού προφίλ που επιλέγεται από τον χειριστή (γαλάζιο βέλος) εκπροσωπείται ποσοτικά. αιχμής (i) Εκπομπή ενός ενιαίου μιτοχονδρίου ενδείκνυται γραφικά (κίτρινο βέλος). (Ii) Χωρισμένος μιτοχόνδρια είναι εμφανείς ως ανεξάρτητες κορυφές. (Iii) Υψηλότερη κορυφές (κίτρινο βέλος) υποδηλώνουν την παρουσία πολλαπλών μιτοχόνδρια, προεξέχοντας κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης. 3D δεδομένα εικόνας επιστρώνεται με διαφάνεια, με ατομικό αριθμό μιτοχονδριακή είναι ευθέως ανάλογη προς την ένταση του φθορισμού. χαρτογράφηση (Β) Θερμική ενός μόνο κυττάρου επεξεργάστηκε με CDDP (10 μΜ, 12 ώρες). Οι διαφορές στις τιμές των τοποθεσιών άξονα Ζ του μιτοχονδριακού θραυσμάτων αντιπροσωπεύεται ως χρώματα. (I) Μεγέθυνση (κίτρινο κουτί) αποκαλύπτοντας ξεχωριστή μιτοχόνδρια σε διάφορα ύψη z-άξονα (πράσινο εναντίον πορτοκαλί). (Ii) Το αντίστροφο άποψη του ίδιου κυττάρου σε (i), υποδεικνύοντας περαιτέρω επιμέρους τεμάχια (κυανό vs μπλε, κίτρινο βέλος). (C) Ορθογώνια εργαλείο ενότητα δείχνει διατομές από ένα μόνο κύτταρο κατά μήκος του y-άξονα (ένθετο διάστικτη κίτρινο κουτί, μεγεθύνεται ως πράσινο κουτί) και το x-άξονα (μεγεθύνεται ως κόκκινο πλαίσιο). Γ (i) Μεγέθυνση (πράσινο κουτί) του y-άξονα ορθογώνιο τμήμα. (Ii) μεγέθυνση (κόκκινο κουτί) x-άξονα ορθογώνιο τμήμα. Κίτρινα βέλη δείχνουν τους χώρους που χωρίζει ατομική μιτοχόνδρια.

Η

Εφαρμογή Cut-off Scores Επιτρέπει Διάκριση μεταξύ των κυττάρων που περιέχουν διαφορετικούς βαθμούς μιτοχονδριακή σχάση

Αν και είναι δυνατόν να προσδιοριστεί επακριβώς ο αριθμός των μιτοχονδρίων σε οποιοδήποτε δεδομένο κύτταρο, είναι χρονοβόρα και μη πρακτική εάν αξιολόγηση ενός μεγάλου αριθμού κυττάρων. Είμαστε δίπλα επινοήσει μια ημι-ποσοτική προσέγγιση για μια πιο αποτελεσματική και λιγότερο εντάσεως εργασίας αξιολόγησης των εικόνων. Προχωρήσαμε με την αξιολόγηση της μιτοχονδριακής φαινότυπο (σωληνοειδές ή αποσπασματική) βασίζεται σε μια cut-off βαθμολογίας που ορίζεται από ένα ελάχιστο αριθμό των μιτοχονδρίων θραύσματα ενός ορισμένου μήκους που υπάρχει σε κάθε κύτταρο. Η αυστηρότητα της κατηγοριοποίησης καθορίζεται από το cut-off βαθμολογία επιλέξει (Εικόνα 3). Εάν 8 ή περισσότερα μιτοχόνδρια που ήταν το καθένα λιγότερο από 3 μικρόμετρα σε μήκος βρέθηκαν πουθενά στο κελί, το σύνολο των κυττάρων θα μπορούσε να χαρακτηρισθεί ως «κατακερματισμένη». Εκπλήρωση των κριτηρίων καθιστά περαιτέρω αξιολόγηση των υπολοίπων μιτοχόνδρια περιττές (φαίνεται στο Σχήμα 3).

Σχήμα δείχνει τρία κύτταρα με ποικίλους βαθμούς σχάσης. (I) Ένα cut-off βαθμολογία του 2 (το αποτέλεσμα είναι «ναι», εάν 2 ή περισσότερα μιτοχονδριακό θραύσματα Διαπιστώσαμε ότι είναι & lt? 3 μικρόμετρα σε μήκος κατά μήκος του μακρύτερου άξονα) βάζει τα 3 τύπους κυττάρων στην ίδια κατηγορία. (Ii) Ένα cut-off βαθμολογία αυξάνεται σε 5 ξεχωρίζει κυττάρων Α ως διαφορετικό από τα κύτταρα Β και C (ένα κριτήριο για την ταξινόμηση των κυττάρων Α ως «σωληνοειδή») (γ) Ένα cut-off βαθμολογία 10 θέσεις κύτταρα Α και Β στο ίδια κατηγορία, η οποία διακρίνεται από την Cell C. η χρήση περισσότερων του ενός cut-off βαθμολογία επιτρέπει τη διάκριση των διαφόρων βαθμών της μιτοχονδριακής σχάσης.

η

χημειοευαισθησία να CDDP και Piperlongumine σχετίζεται με μιτοχονδριακή σχάση

επόμενο εφαρμόσει αυτή την τεχνική για να διερευνήσει την επίδραση της piperlongumine και CDDP (0 και 10 μΜ, 12 ώρες) στη μιτοχονδριακή σχάση στη νόσο ευαίσθητη (Ον2008) και χημειοθεραπεία (C13) OVCA κύτταρα (Σχήμα 4). Και οι δύο ενώσεις προκάλεσε αυξήσεις στην μιτοχονδριακή σχάση και απόπτωσης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο Ον2008. Ωστόσο, μόνο piperlongumine είχε το ίδιο αποτέλεσμα σε C13, γεγονός που υποδηλώνει ότι η τελευταία όχι μόνο προάγει την απόπτωση αλλά επάγει επίσης μιτοχονδριακή σχάση σε χημειοθεραπεία OVCA κύτταρα. Τουλάχιστον 100 κύτταρα ανά ομάδα θεραπείας αξιολογήθηκαν για μιτοχονδριακή σχάση σε κάθε αντίγραφο με τα στατιστικά στοιχεία που προέρχονται από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες σωληνοειδή και κατακερματισμένη μιτοχόνδρια σε νόσο ευαίσθητη κύτταρα (OV2008) και ανθεκτική τους ομολόγους (C13). Τα μιτοχόνδρια και οι πυρήνες βάφτηκαν με TOM20 (πράσινο) και DAPI (μπλε), αντίστοιχα. (Β) Επίδραση των piperlongumine και CDDP στη μιτοχονδριακή σχάση σε κύτταρα Ον2008 και C13, όπως αξιολογήθηκε με μια ενιαία βαθμολογία αποκοπής του 8 (κύτταρα που περιέχουν 8 ή περισσότερες μιτοχονδριακό θραύσματα & lt? 3 μικρόμετρα σε μήκος ταξινομήθηκαν ως έχουν κατακερματισμένο μιτοχόνδρια). (C) Επίδραση της CDDP και piperlongumine σε απόπτωση, όπως εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία αννεξίνη V (*,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001 έναντι αντίστοιχων μη επεξεργασμένο έλεγχο)

Η

CDDP και Piperlongumine που προκαλείται μιτοχονδριακού σχάση και απόπτωση είναι Drp1 που εξαρτώνται σε νόσο ευαίσθητη OVCA

σε απάντηση σε διάφορες τύπους κυττάρου στρες, Drp1 ενεργοποιείται από αποφωσφορυλίωση στο Ser637. Αυτό ακολουθείται από την πρόσληψη της στα μιτοχόνδρια, όπου oligomerizes να παρέχει την μηχανική αντοχή που απαιτείται για τη σχάση να συμβεί [22]. Υποθέσαμε ότι εάν Drp1 εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της χημειοευαίσθητων ανταπόκριση, τόσο CDDP και piperlongumine η θεραπεία θα πρέπει να οδηγήσει σε αποφωσφορυλίωση Drp1. Αυτή ήταν πράγματι η περίπτωση στα κύτταρα Ον2008 (Σχήμα 5Α). Το πιο σημαντικό, η θεραπεία των κυττάρων Ον2008 με φαρμακολογική αναστολέα Drp1, mDivi-1, εξασθενημένα σημαντικά τόσο μιτοχονδριακή σχάση και απόπτωση που επάγεται από τις δύο ενώσεις (Σχήμα 5Β). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν μια αιτιολογικός σύνδεσμος μεταξύ σχάσης και απόπτωση. Ένα ελάχιστο 100 κύτταρα ανά ομάδα θεραπείας αξιολογήθηκαν για μιτοχονδριακή σχάση σε κάθε αντίγραφο με τα στατιστικά στοιχεία που προέρχονται από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις.

(Α) CDDP (10 μΜ) και piperlongumine (10 μΜ) κάτω ρυθμισμένα της φωσφο -Drp1 περιεχόμενο (Ser637) σε κύτταρα Ον2008

in vitro

. (Β) (i) Επίδραση mDivi-1 (0-10 μΜ) επί CDDP- και piperlongumine επαγόμενη μιτοχονδριακή σχάση και (ii) την απόπτωση όπως αξιολογείται με προσδιορισμό αννεξίνης V (**

ρ

& lt? 0,01? ***

ρ

& lt? 0,001 έναντι αντίστοιχων ελέγχου DMSO υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πανομοιότυπο συγκέντρωση mDivi-1, #,

ρ

& lt? 0,05 έναντι αντίστοιχων θεραπεία PL ή CDDP σε απουσία mDivi-1).

η

Drp1 εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της Piperlongumine απόπτωση σε χημειοθεραπεία OVCA

προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι η μιτοχονδριακή σχάση συνδέεται με τηςχημειοευαισθησίας, ενώ αντίσταση CDDP χαρακτηρίζεται από την έλλειψη της εν λόγω δραστηριότητας (Σχήμα 4). Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν piperlongumine προκαλούσε απόπτωση σε χημειοθεραπεία C13 * κύτταρα μέσω Drp1-εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση. ανάλυση συγκέντρωσης-απόκρισης έδειξε ότι piperlongumine, αλλά όχι CDDP, επαγόμενη αποφωσφορυλίωση Drp1 σε Ser637 (Σχήμα 6Α). Η προσθήκη του αναστολέα Drp1 mDivi-1 επίσης μερικώς εξασθενημένα piperlongumine επαγόμενη μιτοχονδριακή σχάση και την απόπτωση (Σχήμα 6Β). Τουλάχιστον 100 κύτταρα ανά ομάδα θεραπείας αξιολογήθηκαν για μιτοχονδριακή σχάση σε κάθε αντίγραφο με τα στατιστικά στοιχεία που προέρχονται από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις.

(Α) Piperlongumine αλλά δεν CDDP (0-10 μΜ) ρυθμίζει προς τα κάτω φωσφο-Drp1 περιεχόμενο (Ser637). (Β) (i) Επίδραση mDivi-1 (0-10 μΜ) επί piperlongumine επαγόμενη μιτοχονδριακή σχάση και (ii) την απόπτωση, όπως εκτιμήθηκε με προσδιορισμό αννεξίνης V (**, ρ & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001 σε σχέση με τις αντίστοιχες του ελέγχου DMSO αντιμετωπίζονται με τα ίδια συγκέντρωση mDivi-1, #,

σ

& lt? 0,05? ##,

σ

& lt? 0,01? ###,

p

& lt? 0.001 έναντι αντίστοιχων θεραπεία PL ή CDDP απουσία mDivi-1))

η

Συζήτηση

Αν και η ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών σχάσης έχει αναλάβει σε αρκετές καλά σχεδιασμένες.. μελέτες, οι περιγραφές των δημοσιευμένων προσεγγίσεις είναι κάπως ασαφή και υποκειμενική [2] – [7]. Σημειώνουμε δύο σημαντικές δυσκολίες στην ακριβή ποσοτικοποίηση σχάσης. Το πρώτο είναι συσσωμάτωση των μιτοχονδρίων, ιδιαίτερα γύρω από τον πυρήνα, η οποία κάνει διάκριση χωριστών οργανιδίων δύσκολη. Ο δεύτερος είναι ο χρόνος που απαιτείται για την ποσοτικοποίηση του μιτοχόνδρια, ακόμη και αν όλα τα επιμέρους τμήματα μπορούν να διακριθούν χρησιμοποιώντας προηγμένες τεχνικές 3-διαστάσεων χαρτογράφηση.

Αναγνωρίζουμε την ύπαρξη πολλών δημοσιεύονται αυτοματοποιημένες μεθόδους που έχουμε διερευνήσει και βρέθηκε να είναι ενδιαφέρων. Ωστόσο, πιστεύουμε ότι αυτές οι μέθοδοι απαιτούν εκτεταμένη γνώση φόντου σε υπολογιστικών αλγορίθμων για να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά. Μία μέθοδος χρησιμοποιεί αυτοματοποιημένη φθορισμού πάλλεται στα 30 Hz και την απασχόληση με τη βοήθεια υπολογιστή ανάλυση [23]. Στην προσπάθειά μας να ακολουθήσουν τα βήματα που παρέχονται από τους ερευνητές, βρήκαμε σημαντική δυσκολία στην ερμηνεία ενός αριθμού των οδηγιών που απαιτούν σημαντικές γνώσεις, και δεν ήταν σε θέση να πετύχει στην παραγωγή σημαντικών δεδομένων. Η παραγωγή ενός συνθετικού δυαδικής εικόνας ως μοντέλο δοκιμής απαιτεί επίσης εκτεταμένη εξοικείωση με κατάλληλες διαστάσεις των μιτοχονδρίων σε κάθε κυτταρικό τύπο, μια απαίτηση που δεν απαιτούνται για την προσέγγισή μας.

Μια άλλη ενδιαφέρουσα υπολογιστική προσέγγιση [24] περιλαμβάνει αυτοματοποιημένη υποκατηγοριών της μιτοχονδριακής μορφολογίας. Έχουμε, επίσης, προσπάθησαν να χρησιμοποιήσουν το λογισμικό MicroP γράφτηκε από τους συγγραφείς για πειραματικούς τις ανάγκες μας, όμως, ήταν ομοίως πολύ δύσκολο για μας να μάθουμε, λόγω της τεχνικής (υπολογιστικές γνώσεις) που απαιτούνται. MicroP απαιτεί από το χρήστη για τη βαθμονόμηση με επιτυχία το λογισμικό πριν από τη χρήση.

Στις παρούσες μελέτες, που έχουν ασχοληθεί με το ζήτημα του συνυπολογισμού εφαρμόζοντας ένα βήμα κυτταρολογική φυγοκέντρησης, που ισοπεδώνει το κυτταρόπλασμα κατά μήκος του επιπέδου της διαφάνειας και καθιστά διάκριση μεμονωμένων μιτοχονδρίων σημαντικά ευκολότερη. Το ζήτημα του χρονικού περιορισμού αντιμετωπίστηκε με την εφαρμογή της αποκοπής βαθμολόγησης για να επιτρέψει για λιγότερο εντάσεως εργασίας κατηγοριοποίηση των μιτοχονδριακών φαινοτύπων. Αν και η πιο ακριβής μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό της σχάσης θα ήταν μια απόλυτη μέτρηση του συνολικού αριθμού των μεμονωμένων τεμαχίων, ο χρόνος που απαιτείται καθιστά αυτή την προσέγγιση μη πρακτική, ειδικά για τις μελέτες με μεγάλο μέγεθος δείγματος. προτεινόμενη προσέγγιση μας επιτρέπει την απόκτηση του μιτοχονδριακού δεδομένων σχάσης συγκρίσιμη με εκείνη που απαιτείται στο σχεδιασμό προηγούμενη μελέτη [2] – [7], αλλά με πιο συγκεκριμένες κατευθυντήριες γραμμές για την ανεξάρτητη επαναληψιμότητα. Μια επισκόπηση της νέας προσέγγισης φαίνεται στο Σχήμα 7.

Η

Αν και η προσέγγισή μας προσφέρει προφανή πλεονεκτήματα, μπορούμε επίσης να σημειωθεί αρκετές πιθανές παγίδες. Η ποικιλομορφία στη μιτοχονδριακή μορφολογία κατά μήκος των κυτταρικών τύπων είναι σημαντική και μπορεί να απαιτούν ακριβή ρύθμιση και την επικύρωση του πρωτοκόλλου. Για παράδειγμα, ορισμένοι τύποι κυττάρων μπορεί να έχει ένα μεγάλο αριθμό μιτοχόνδρια και ένα σχετικά μικρότερο όγκο του κυτταροπλάσματος. Σε τέτοιες περιπτώσεις, μπορεί να χρειάζεται προσεκτική βελτιστοποίηση του σταδίου φυγοκέντρησης και έναν μεγαλύτερο αριθμό άξονα z εικόνες ανά κύτταρο. Υψηλότερες ταχύτητες φυγοκέντρησης ενισχύσει μιτοχονδριακή διασπορά, αλλά μπορεί επίσης να προωθήσει ρήξη του πυρήνα (που φαίνεται στο Σχήμα S3). Έχουμε επίσης προσπαθήσει να χρησιμοποιήσουν την προσέγγισή μας με

in vivo

δείγματα όγκων OVCA χρωματίζονται με TOM20, και διαπίστωσε ότι η ανικανότητα προς τη φυγόκεντρο συμπαγείς όγκους σε συνδυασμό με την υπερβολική μη ειδικό σήμα υποβάθρου κατέστησε ανέφικτη.