Αφηρημένο

Τα microRNAs ρυθμίζουν διάφορες πτυχές της ογκογένεσης και της εξέλιξης του καρκίνου. Οι περισσότεροι ιστοί του καρκίνου αρχειοθετηθεί μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE). Ενώ microRNAs είναι μια πιο σταθερή μορφή του RNA πιστεύεται ότι αντέχουν FFPE επεξεργασίας και της υποβάθμισης υπάρχει μόνο περιορισμένες ενδείξεις για την τελευταία υπόθεση. Εξετάσαμε αν microRNA προφίλ μπορεί να διεξαχθεί με επιτυχία σε FFPE ιστούς του καρκίνου που χρησιμοποιούν στερεά απολίνωση αλληλουχίας βάση. χρόνους αποθήκευσης ιστού (2-9 ετών) δεν φαινόταν να επηρεάζει τον αριθμό των εντοπισμένων microRNAs σε δείγματα FFPE σε σύγκριση με συμφωνημένα κατεψυγμένα δείγματα (paired t-test p & gt? 0,7). Οι συσχετίσεις των αξιών έκφραση microRNA ήταν πολύ υψηλά σε ολόκληρη microRNAs σε ένα δεδομένο δείγμα (r του Pearson = 0,71 έως 0,95). Μεγαλύτερη διακύμανση των τιμών έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων που συνδέεται με υψηλότερους συντελεστές συσχέτισης μεταξύ FFPE και κατεψυγμένων ιστών. Ένα από τα δείγματα FFPE σε αυτή τη μελέτη αποικοδομήθηκε για άγνωστους λόγους, με αιχμή διαβάσει μήκος 17 νουκλεοτιδίων σε σύγκριση με 21 σε όλα τα άλλα δείγματα. Ο αριθμός των διαπιστωμένων microRNAs σε αυτό το δείγμα ήταν εντός του εύρους των microRNAs ανιχνεύθηκε σε όλα τα άλλα δείγματα. Απολίνωση με βάση το microRNA βαθιά αλληλουχίας σε FFPE ιστούς του καρκίνου είναι εφικτή και η υποβάθμιση του RNA στο βαθμό που παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας δεν φαίνεται να επηρεάζει τον αριθμό των microRNAs που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί

Παράθεση:. Meng W, McElroy JP, Volinia S, Palatini J, Warner S, Ayers LW, et al. (2013) Σύγκριση των microRNA Deep αλληλουχίας των Συμφωνήθηκε φορμόλη-Σταθερή εμπεδωθεί με παραφίνη και φρέσκο ​​κατεψυγμένο καρκινικούς ιστούς. PLoS ONE 8 (5): e64393. doi: 10.1371 /journal.pone.0064393

Επιμέλεια: Soheil Σ Dadras, Πανεπιστήμιο του Κονέκτικατ Κέντρο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 13 Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2013

Copyright: © 2013 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας και την Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, και, από την Βιοστατιστική Core και από μικροσυστοιχιών κοινόχρηστο πόρο στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το βραβείο Αριθμός Grant 8UL1TR000090-05 από το Εθνικό Κέντρο για την προώθηση Μεταγραφική Επιστημών. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του Εθνικού Κέντρου για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών ή το National Institutes of Health. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

τα microRNAs μη-κωδικοποίησης μικρά RNAs, με μήκος 22 έως 26 νουκλεοτίδια (nt). Τα microRNAs να οδηγήσει σε υποβάθμιση των συμπληρωματικών αγγελιοφόρου RNA σε πολλά είδη. Τα microRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων, του κυτταρικού θανάτου, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [1], η απόπτωση [2] και την αγγειογένεση [3]. Η έκφραση microRNA κυτταρομετρίας ροής μέθοδος δημιουργίας προφίλ πρωτοπόρος βάση σφαιρίδια αποκάλυψε ότι τα προφίλ microRNA αντανακλούν την αναπτυξιακή γενεαλογία και τη διαφοροποίηση των όγκων [4]. Φυσιολογικούς ιστούς και καρκινικούς ιστούς έδειξαν να έχουν διακριτά προφίλ έκφρασης και προφίλ microRNA μπορεί να περιγράψει microRNA καθοδηγείται μονοπάτια σε στερεούς όγκους [5]

Οι τρέχουσες μέθοδοι για microRNA προσδιορισμού είναι:. Σε πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ [ ,,,0],6], [7], μικροσυστοιχιών [8], Nanostring, και αλληλούχιση επόμενης γενιάς [9] – [11]. Ειδικά, τα νεοαποκτηθέντα τεχνολογίες αλληλουχίας επόμενης γενιάς έχουν τη δυνατότητα να ανακαλύψουν νέα microRNAs και άλλων μικρών RNAs. Οι περισσότεροι ιστοί υποβάλλονται σε επεξεργασία στο περιβάλλον της υγειονομικής περίθαλψης θα υποβληθεί σε φορμόλη-στερέωση και παραφίνη-ενσωμάτωση (FFPE). Οι περισσότερες κλινικές δοκιμασίες διεξάγονται σε εργαστήρια παθολογίας βελτιστοποιηθεί για ιστούς FFPE. Οι ιστοί FFPE αποθηκεύονται συνήθως σε θερμοκρασία δωματίου. Φορμαλίνη διατηρεί δείγματα ιστού με τη δημιουργία σταυροειδών δεσμών μεταξύ των πρωτεϊνών, DNA και RNA. DNA που εξάγεται από FFPE ιστούς έχει δειχθεί ότι είναι χρήσιμη για την ανάλυση αριθμού αντιγράφων και ανάλυση μετάλλαξης σε τουλάχιστον μία πλατφόρμα σε ορισμένες ρυθμίσεις [12]. Ωστόσο, η χημική τροποποίηση μεταξύ μακρομορίων και RNAs που προκαλούνται από φορμαλίνη στερέωση μπορεί να επιταχύνει την αποικοδόμηση του RNA [13] [14]. Η σταθερότητα των microRNAs είναι γενικά πολύ πιο ισχυρή από ό, τι αγγελιοφόρο RNA [15]. ανάλυση της έκφρασης microRNA βάση αλληλουχίας επόμενη γενιά έχει αναπτυχθεί σε διάφορες πλατφόρμες, συμπεριλαμβανομένων των Roche /454 πλατφόρμα, Genome Analyzer Illumina και σταθερή πλατφόρμα της ABI [16] [17], καθώς και διάφορα εμπορικά πρωτόκολλα για miRNA προετοιμασία της βιβλιοθήκης έχουν αναπτυχθεί από τις τρεις εταιρείες [ ,,,0],18]. Επί του παρόντος υπάρχει μόνο περιορισμένα διαθέσιμα αποδεικτικά στοιχεία ότι τα αποτελέσματα αλληλουχίας microRNA είναι αξιόπιστα και έγκυρα. Ma et al. κατέδειξε τη σκοπιμότητα της miRNA προφίλ με βάση αλληλουχίας Sanger στο 10-year-old αρχειοθετημένα ιστού [19]. Για τις γνώσεις μας υπάρχουν μόνο δύο κριτές μελέτες που δημοσιεύθηκαν ότι σε σύγκριση με τα αποτελέσματα αλληλούχισης microRNA της συμφωνημένα κατεψυγμένων και FFPE δείγματα, χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina [9], [20]. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν τα δείγματα FFPE μπορεί να χαρακτηριστεί επιτυχώς από βαθιά αλληλουχίας miRNA. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν συμφωνημένα κατεψυγμένα και FFPE ιστούς των διαφορετικών ιστολογίες για τα οποία λεπτομερείς πληροφορίες επεξεργασίας και αποθήκευσης ήταν διαθέσιμο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

δείγματα Ανθρώπινα κακοήθη ιστό αγοραστεί κατά την περίοδο 2003-2009 ελήφθησαν από το Δίκτυο Tissue Συνεταιρισμός Ανθρώπου (CHTN /NCI), Midwestern Division, το οποίο χρηματοδοτείται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, που βασίζεται σε μια εσωτερική επιτροπή δεοντολογίας (IRB) ενέκρινε το πρωτόκολλο της έρευνας (Ohio State University Ανθρώπινα Θέματα πρωτόκολλο – 2011E0377). Άλλοι ερευνητές μπορεί να έχουν λάβει δείγματα από τα ίδια θέματα.

δείγματα ιστών

Οκτώ ζεύγη δειγμάτων κακοήθους ιστού ελήφθησαν. Remnant χειρουργικές ιστοί ελήφθησαν μετά διαγνωστικά δείγματα εξασφαλίστηκαν από ασθενείς (πέντε αρσενικά και θηλυκά τέσσερα? Διάμεση ηλικία 58 έτη, εύρος 39-78 έτη) με μαστού επεμβατικές πορογενές καρκίνωμα (2), καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων σαφής (2), αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα ( 1), αδενοκαρκίνωμα του προστάτη (1), το μεταστατικό μελάνωμα (1), και σάρκωμα του μηρού (1). Χειρουργικά δείγματα μεταφέρθηκαν από τα λειτουργικά δωμάτια ιστών για τις δημόσιες συμβάσεις, εξετάστηκαν υπό την επίβλεψη ενός παθολόγου και διατηρούνται μέσα σε 5-57 καταγράφονται λεπτά. Ζεύγη δειγμάτων ιστών που έχουν επιλεγεί για την έρευνα είτε αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και τοποθετήθηκε σε ένα καταψύκτη -80 ° C για παρακολουθούμενη αποθήκευση ή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία σε μία παραφίνη ενσωματωμένα μπλοκ και αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Όταν οι ερευνητικές δείγματα ελήφθησαν από CHTN, τα κωδικοποιημένα δείγματα συνοδεύονται από ένα κωδικοποιημένο τελική έκθεση παθολογίας και μια έκθεση αξιολόγησης της ποιότητας επαλήθευση συλλογή του καρκινικού ιστού. Τα δείγματα έχουν αναθεωρηθεί από έναν παθολόγο και 4 περιπτώσεις είχε 100% του όγκου, 3 περιπτώσεις 90-95% και 1 περίπτωση 50-60% των όγκων, και θα συνοδευτεί FFPE και κατεψυγμένα δείγματα ήταν γενικά συγκρίσιμη ως προς το περιεχόμενο και το μέγεθος του όγκου. Οι κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά των περιπτώσεων που χρησιμοποιούνται για microRNA αλληλουχίας και ανάλυση της έκφρασης που αναφέρονται στον πίνακα 1.

Η

Απομόνωση RNA, ποσοτικοποίηση και αξιολόγηση της ποιότητας

RNA από τα δείγματα FFPE εξήχθησαν χρησιμοποιώντας την ανάκτηση όλες τις συνολικές Nucleic Acid κιτ απομόνωσης (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Εν συντομία, τα δείγματα 5-10 mg κόπηκαν από τους κύβους παραφίνης και deparaffinizated με ξυλόλιο στους 50 ° C, που ακολουθείται από 100% πλύση αιθανόλης. Τα δείγματα ιστού στον αέρα υπέστησαν πέψη με πρωτεϊνάση Κ για 24 ώρες σε ένα μικροσωλήνα ανακίνηση επωαστήρα ρυθμισμένο στους 50 ° C. Τα πέψη δείγματα αναμίχθηκαν με κατάλληλο όγκο προσθέτου απομόνωση και 100% αιθανόλη. Μετά το πέρασμα του μίγματος μέσα από το φυσίγγιο φίλτρου, το DNA και το RNA συγκρατήθηκαν στο φίλτρο. Το DNA απομακρύνθηκε με πέψη ϋΝάσης επί του φίλτρου. Το RNA καθαρίστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και εκλούσθηκε με ύδατος άνευ νουκλεάσης.

Τα δείγματα microRNA από τα κατεψυγμένα δείγματα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης PureLink ™ miRNA (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Εν συντομία, 5 δείγματα mg φρέσκου κατεψυγμένου ιστού αναμίχθηκαν με 300 μΙ ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης (L3) και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή ιστών. Τα ομογενοποιημένα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν, και το υπερκείμενο αναμίχθηκαν με 300 μΙ 70% αιθανόλης. Το διάλυμα που περιέχει το RNA καθαρίστηκε με δύο στρογγυλά από στήλες spin καθαρισμού. Το RNA εκλούεται με 50-100 μl αποστειρωμένου RNase-free νερό

microRNA αλληλουχίας

Μικρές RNAs από FFPE και κατεψυγμένα δείγματα προετοιμάστηκαν για τα στερεά αλληλουχίας ως εξής:. Οι συνολικές δείγματα RNA ήταν επεξεργασία από το flashPAGE κλασμάτωσης (Ambion) και flashPAGE Clean-Up Kit (Ambion). Το εμπλουτισμένο μικρό RNA μετά σε επεξεργασία σύμφωνα με το στερεό Small πρωτόκολλο Έκφραση RNA Kit (Applied Biosystems). Τα καθαρισμένα μικρά RNAs συνδέθηκαν με 5 ‘και 3’ mix προσαρμογέα χρησιμοποιώντας RNA λιγάση. Τα συνδεδεμένα προϊόντα (40-60 βάσεων σε μήκος) μεταγράφηκαν ανάστροφα και καθαρίστηκαν σε Νονβχ 10% ΤΒΕ γέλη-ουρία. Ακολούθως, 15-18 κύκλοι PCR διεξήχθησαν με ενίσχυση του καθαρισμένου cDNA με γραμμωτό κωδικό σύνολα εκκινητών PCR που παρέχεται στο κιτ, το οποίο διέφερε από μια μοναδική αλληλουχία 6 νουκλεοτιδίων. Τα ενισχυμένα προϊόντα φορτώθηκαν σε Νονβχ 6% ΤΒΕ γέλη (Invitrogen) και τις ζώνες του πηκτώματος που περιέχει 110 να 130 θραύσματα bp αποκόπηκαν. Τα ενισχυμένα προϊόντα σε καθαρισμό από αποκομμένες μπάντα γέλη, ενισχύεται με γαλάκτωμα PCR, στη συνέχεια φορτώνονται επί στερεών σύστημα προσδιορισμού αλληλουχίας Applied Biosystems 4 επόμενη γενιά υψηλής απόδοσης για την απόκτηση των δεδομένων. Η ποιότητα των δειγμάτων και βιβλιοθήκες επαληθεύεται στη Agilent Bioanalyzer [21], [22]. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα στερεά αλληλουχίας είχαν ανεβάσει στο γονιδιακής έκφρασης Omnibus του NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE45740 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45740).

RT-qPCR για microRNA επικύρωση

Το RNA από κατεψυγμένα και FFPE ιστούς επικυρώθηκαν από πραγματικού χρόνου (RT) ποσοτική PCR. έκφραση microRNA κανονικοποιήθηκε στη μικρή U6 πυρηνικό RNA χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασία κιτ (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Ένα δείγμα 30 ng του RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Εν συντομία, 5 μΙ RNA αναμίχθηκε με 1 mmol /l από κάθε τριφωσφορικού δεοξυριβονουκλεοτιδίου, 50 μονάδες Multiscribe ανάστροφης μεταγραφάσης, 5 × ρυθμιστικά αντίδρασης, 4 μονάδες αναστολέα ΚΝάσης, και 5 × ειδικών γονιδίων RT εκκινητές μίγμα σε τελικό όγκο αντίδρασης 15 μλ. Οι αντιδράσεις στη συνέχεια επωάστηκαν στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, 85 ° C για 15 λεπτά με μια τελική διατήρηση στους 4 ° C. Κατόπιν, 15 μΙ του διαλύματος cDNA αραιώθηκε με ύδατος άνευ νουκλεάσης σε ένα τελικό όγκο 100 μΙ. Ποσοτικού PCR διεξήχθη επί ΗΤ PCR μηχάνημα 7900 με βήμα μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους από ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και ένα στάδιο ανόπτησης /επιμήκυνση στους 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα . Fold αλλαγή για microRNA σε δείγματα ιστού στην συνέχεια υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την εξίσωση 2-ΔCt δοκιμή /2-ΔCt ελέγχου.

Ανάλυση δεδομένων

Οι συνδετικές αλληλουχίες των μικρών βιβλιοθηκών RNA απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό cutadapt ( https://code.google.com/p/cutadapt/) σύμφωνα με προκαθορισμένες παραμέτρους. Η κατανομή του μήκους των microRNA κατασκευάστηκε από αποτύπωση διαβάζει μετρήσεις κατά 0-30 μήκη νουκλεοτιδίων. Το μικρό RNA Ανάλυση Pipeline Tool από την Applied Biosystems χρησιμοποιήθηκε με τις ακόλουθες παραμέτρους ώστε να περιλαμβάνει μόνο επαρκώς υψηλής ποιότητας διαβάζει στη μελέτη μας: 1) μέση ελάχιστη όριο ποιότητας ανάγνωσης ήταν 20 (η τιμή QV υπολογίζεται χρησιμοποιώντας Phred σαν αποτέλεσμα q = -10 × log10 (p), όπου q είναι η αξία της ποιότητας και της (p) είναι η προβλεπόμενη πιθανότητα ότι η κλήση χρώμα είναι λανθασμένη.), 2) να είναι αυστηροί είμαστε επιτρέπεται μόνο 1 αναντιστοιχία μεταξύ διαβάζει και miRBase έκδοση 16 χτυπήματα για κάθε καταμέτρηση διαβάσει 3 ) το ελάχιστο μήκος των ευθυγραμμισμένων διαβάζει έπρεπε να είναι 17 βάσεις. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν ως διαβάζει ανά εκατομμύριο (RPM). Ακολουθίες με την τιμή της έκφρασης κάτω από 5 στροφές θεωρήθηκαν δεν ανιχνεύθηκε για τη συσχέτιση μεταξύ των κατεψυγμένων και FFPE τμήμα ανάλυσης

Αποτελέσματα

Συνέπειες της υποβάθμισης δείγμα FFPE:. MicroRNA διαβάσετε μήκος

διανομή

μονιμοποίηση φορμαλίνης και μακροχρόνια αποθήκευση φορές είναι γνωστό ότι έχει ως αποτέλεσμα την υποβάθμιση του RNA [23]. Αυτή η υποβάθμιση οδηγεί σε ένα βραχύτερο μέσο μήκος RNA [24]. Να εντοπίσει τις πιθανές επιπτώσεις της υποβάθμισης των microRNAs, αναλύσαμε την κατανομή του μήκους ανάγνωσης της αντίστοιχα δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου και FFPE καρκινικού ιστού. Μετά κόπηκαν οι 3 ‘αλληλουχίες προσαρμογέα από κάθε διαβάσει, αλληλουχία διαβάζει κατανομής μήκους εξετάστηκε (σχήμα 1). Διαβάστε μήκη παρατηρήθηκαν να επικεντρώνονται στα 21 nt σε όλα τα κατεψυγμένα δείγματα και όλα εκτός από ένα δείγματα FFPE. Υπήρχε ένα δείγμα FFPE των οποίων αιχμή μήκους microRNA βρέθηκε σε 17 nt, υποδεικνύοντας σημαντική υποβάθμιση. Στη συνέχεια εξέτασε προσεκτικά τις μικρές προφίλ ταξινόμησης RNA και συσχέτιση των τιμών έκφραση microRNA των φρέσκων κατεψυγμένων και FFPE δείγματα. Βρήκαμε ότι υπάρχουν αμελητέα ή καθόλου επιδράσεις σε αυτές τις αναλύσεις. Οι χρόνοι αποθήκευσης ή μέθοδοι παρασκευής δεν ήταν διαφορετικά μεταξύ αυτού υποβαθμισμένων δείγμα FFPE και τα άλλα δείγματα που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Επίσης, το ποσοστό των μικρών RNAs στην κλίμακα 20-22 nt ήταν χαμηλότερη για αρκετές περιπτώσεις στο FFPE σε σύγκριση με τα συμφωνημένα κατεψυγμένα δείγματα (μία περίπτωση νεφροκυτταρικό καρκίνωμα, αδενοκαρκίνωμα περίπτωση πνεύμονα, και στην περίπτωση του καρκίνου του προστάτη). Αυτό είναι, επίσης, πιθανό να οφείλεται στην υποβάθμιση σε δείγματα FFPE, αν και μικρές διακυμάνσεις κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας της βιβλιοθήκης θα μπορούσε να συμβάλει εν μέρει με τις παρατηρούμενες διαφορές

Η

Συνέπειες της υποβάθμισης δείγμα FFPE:. Αποθήκευσης φορά

Η χρόνος αποθήκευσης των δειγμάτων κυμαίνονταν από 2 έως 9 ετών. 624 micoRNAs και των προδρόμων τους εντοπίστηκαν στις 8 ζεύγη δειγμάτων ιστού. Μερικά microRNAs δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί είτε κατεψυγμένα ή FFPE δείγματα. Το Σχήμα 2 δείχνει τα ποσοστά των microRNAs που ανιχνεύθηκαν στα δύο κατεψυγμένα και FFPE δείγματα, μόνο σε κατεψυγμένα δείγματα και μόνο σε δείγματα FFPE τη διάρκεια του έτους της συλλογής δείγματος. Δεν υπήρχαν αποθήκευσης απασχόλησης εξαρτάται από τις αλλαγές σε αυτά τα ποσοστά, που δείχνει ότι δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ του χρόνου αποθήκευσης και του αριθμού των microRNAs παρόντες κατά τη διάρκεια αυτής χρονικό παράθυρο 9 χρόνια.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε το ποσοστό των microRNA διαβάζει μεταξύ των συνολικών διαβάζει (εικόνα 3) για να καταλάβουμε αν η καθαρότητα των microRNAs μειώθηκε στα δείγματα FFPE. Περίπου το 70% και το 85% των διαβάζει σε FFPE και κατεψυγμένα δείγματα, αντίστοιχα, προσδιορίστηκαν ως αλληλουχίες microRNA. Μια πιθανή αιτία για αυτή τη διαφορά θα μπορούσε να είναι η παρουσία των θραυσμάτων του lncRNAs και mRNAs στο κλάσμα του RNA μικρότερα από 40 νουκλεοτίδια (nt) σε ιστούς FFPE (εικόνα 4).

Η

Επιδράσεις FFPE υποβάθμιση του δείγματος: ταξινόμηση των μικρών RNAs

Για να κατανοήσουμε καλύτερα αν η διαφορά στο ποσοστό των μικρών αλληλουχιών RNA μεταξύ όλων διαβάζει μεταξύ κατεψυγμένα και FFPE δεδομένων ιστού εξετάσαμε την κατανομή των κατηγοριών RNA σε ένα από τα δείγματα καρκίνου του μαστού . Υπήρχαν συνολικά 11563414 και 10273837 αλληλουχίας διαβάζει, στα δύο εξέτασε αντίστοιχα δείγματα και το διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19, Εθνικό Κέντρο βιοτεχνολογίας κτιρίου πληροφοριών) χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες δέσμες ενεργειών Python. Η διαβάζει ταξινομήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες RNA σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ensembl. Η πλειονότητα των μικρών RNAs στα δύο κατεψυγμένα και FFPE βιβλιοθήκες ήταν microRNAs (σχήμα 4). Συγκρίνοντας τα στοιχεία από συμφωνημένα κατεψυγμένα δείγματα με δεδομένα από δείγματα FFPE υπήρχαν lincRNA και ακολουθίες άγνωστο μαθήματα σε δεδομένα που λαμβάνονται από δείγματα FFPE. Δεδομένου ότι τα RNA μόνο μικρότερα από 40 nt εξήχθησαν και επεξεργασία για αλληλούχιση αυτό δείχνει ότι υπάρχει κατακερματισμός των lincRNA και άλλες μεγάλες RNA σε FFPE ιστούς, τα οποία είναι περισσότερο από 40 nt.

Ένα σύνολο από 469 έως 548 ( σημαίνει 519) διαφορετικά microRNAs και των προδρόμων τους εντοπίστηκαν σε δύο κατεψυγμένα και FFPE δείγματα. Έχουμε καθορίζεται τα ποσοστά των microRNAs που έχουν περισσότερα από ένα 2 φορές διαφορά της έκφρασης μεταξύ συμφωνημένα κατεψυγμένα και FFPE δείγματα (Σχήμα 5). Μεταξύ των διαφόρων υποθέσεων, 69-145 μεταγραφές microRNA ήταν περισσότερο από 2 φορές υπερεκφράζεται σε κατεψυγμένα δείγματα. 73-186 μεταγραφές microRNA είχαν υπερεκφράζεται περισσότερο από 2 φορές σε ιστούς FFPE (σχήμα 5).

Η

Συσχέτιση των τιμών έκφραση microRNA του ταιριάζει FFPE και κατεψυγμένα δείγματα

Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η συσχέτιση αξιών έκφραση microRNA από αντίστοιχα δείγματα FFPE και κατεψυγμένα δείγματα. Υπήρχαν 250 microRNAs ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα σε αυτή τη μελέτη. Υπήρξε μια ισχυρή συσχέτιση των τιμών έκφραση microRNA σε συμφωνημένα FFPE και snap κατεψυγμένα ιστούς σε όλα τα microRNAs και όλες τις περιπτώσεις (r = 0,85? σχήμα 6). Συσχετίσεις σε όλη ανιχνεύθηκε microRNAs από τον ίδιο όγκο /ασθενή ήταν υψηλά, με r κυμαίνονται 0,71 – 0,95 (σχήμα 7) [25].

χρησιμοποιήθηκαν μόνο τα 250 Mirs χωρίς δεδομένα που λείπουν.

Κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει τις αξίες έκφραση ενός microRNA σε ένα φρέσκο ​​ζευγάρι κατεψυγμένο-FFPE.

Η

Η μέση τιμή του Pearson συντελεστές συσχέτισης των ατομικών αξιών έκφραση microRNA της FFPE και κατεψυγμένων ιστών ήταν 0,46 (σχήμα 8), με μόνο 41 ώριμα microRNAs και πρόδρομες ουσίες που έχουν συντελεστές συσχέτισης μεγαλύτερο από 0.8 (πίνακας 2). Εμείς αναζήτησε να προσδιορίσει τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με υψηλότερους συντελεστές συσχέτισης δείχνει αναλλοίωτο με τη μέθοδο διατήρησης των ιστών. Για να δοκιμαστεί εάν το επίπεδο έκφρασης ενός δεδομένου microRNA συνδέεται με την συσχέτιση μεταξύ του νωπού κατεψυγμένου και FFPE ιστούς, Fisher μετασχηματισμένα (arctanh) συσχετίσεις υποχώρησαν σε μέση έκφραση FFPE (σχήμα 9). Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των τιμών της έκφρασης και συσχετίσεις μεταξύ των δεδομένων από κατεψυγμένα και FFPE ιστού παρατηρείται. Στη συνέχεια αναζήτησε να καταλάβουμε αν μια πιθανή έλλειψη μεταβολής των επιμέρους microRNAs μεταξύ των βιολογικών επαναλήψεων έχει ως αποτέλεσμα κακή συσχετισμοί. Fisher μετατραπεί συσχετίσεις υποχώρησε πάνω καταγραφής μετατραπεί FFPE διακυμάνσεις. Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε ότι microRNAs με μεγαλύτερη διακύμανση έχουν σημαντικά υψηλότερες συσχετίσεις των δεδομένων από FFPE και κατεψυγμένων ιστών (σχήμα 10? Arctanh (r) = 0,47 + 0,59 × log10 (διακύμανση FFPE)), που μπορεί να οφείλεται στην παρουσία της αληθινής βιολογικής διακύμανση παρόντες σε αυτά τα microRNAs.

Η

Η

επικύρωση PCR της έκφρασης microRNA

Έχουμε επιλέξει δύο microRNAs (miR-21 και miR-19a) που ήταν εξέφρασε την υψηλότερη σε κατεψυγμένα δείγματα από ό, τι σε δείγματα FFPE στα αποτελέσματα αλληλουχίας microRNA μας για την επικύρωση χρησιμοποιώντας PCR (Taqman). Τόσο miR-21 και miR-19a βρέθηκαν επίσης να είναι υψηλότερες εκφράζεται σε κατεψυγμένου ιστού σε σχέση με αντίστοιχα δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία PCR (σχήμα 11), σύμφωνα με τα αποτελέσματα αλληλούχισης μας.

δείγματα RNA από νωπό κατεψυγμένο ( n = 8) και FFPE (n = 8) ιστοί αναλύθηκαν. Μικρές U6 πυρηνικό RNA χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. MiR-21 και miR-19a είχαν υψηλότερη έκφραση σε κατεψυγμένα δείγματα από ό, τι σε δείγματα FFPE, σύμφωνα με τα αποτελέσματα αλληλούχισης.

Η

Συζήτηση

Τα microRNAs ως ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης φαίνεται να έχουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο κύτταρο διαφοροποίηση [4], του πολλαπλασιασμού [26], μετάσταση [27] και την απόπτωση [28]. Έχουν υπάρξει πολλές προσπάθειες microRNA προφίλ χρησιμοποιώντας κατεψυγμένο καρκινικούς ιστούς [29] [30] [31]. Τα δείγματα καρκινικού ιστού συνήθως αρχειοθετούνται μετά την καθήλωση φορμόλης και παραφίνη ενσωμάτωση (FFPE) και κατεψυγμένων ιστών είναι διαθέσιμη μόνο για μια μειοψηφία των περιπτώσεων στα αρχεία παθολογία και τράπεζες ιστών. Μια καλύτερη κατανόηση της ποιότητας των microRNA αποτελέσματα αλληλουχίας των ιστών FFPE θα επιτρέψει μια πιο τεκμηριωμένη απόφαση ως προς το πότε η χρήση της FFPE ιστού για μικρά πειράματα αλληλουχίας RNA θα ήταν κατάλληλο.

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε μικρά RNA προφίλ αλληλουχίας των οκτώ ζεύγη αντίστοιχα δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου και FFPE καρκινικού ιστού χρησιμοποιώντας το στερεό 4 πλατφόρμα ΑΒΙ. χρόνο αποθήκευσης μέχρι και εννέα χρόνια φάνηκε να μην επηρεάζει τον αριθμό των ανιχνεύσιμων microRNAs είτε κατεψυγμένα των FFPE ιστό σε αυτή τη μελέτη. Η παρουσία υψηλότερα ποσοστά μη microRNAs στο κλάσμα των νουκλεοτιδίων μικρότερες από 40 nt πρότεινε ότι FFPE ιστούς είναι πιο υποβαθμισμένη, όμως. Ωστόσο, αυτή η φαινομενική αποικοδόμηση δεν οδήγησε σε λιγότερες microRNAs να ανιχνεύεται σε ιστούς FFPE, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας μπορεί να ξεπεράσει την υποβάθμιση του δείγματος σε κάποιο βαθμό. Ενώ τα μικρά RNAs σε μία από τις οκτώ δείγματα FFPE εμφανίστηκε αποικοδομείται όπως προτείνεται από τις μειωμένες μήκη ανάγνωσης με κέντρο στα 17 nt σε σύγκριση με την άλλη οκτώ FFPE και οκτώ κατεψυγμένα δείγματα επικεντρωμένη στους 21 nt, ο αριθμός των ευθυγραμμισμένων διαβάζει και ο αριθμός των διαπιστωμένων microRNAs σε Αυτή η υποβαθμισμένη δείγμα ήταν παρόμοια με τα δεδομένα από άλλα δείγματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται από δείγματα με την ανωτέρω περιγραφείσα βαθμό υποβάθμισης δεν θα πρέπει αναγκαστικά να αφαιρεθεί από όλους τους τύπους ανάλυσης.

σε γενικές γραμμές, υπήρξε άριστη συσχέτιση μεταξύ των τιμών της έκφρασης των miRNAs μεταξύ συμφωνημένα κατεψυγμένα και FFPE όταν συνδυάζει όλα τα δείγματα και όλα τα microRNAs (εικ. 6), ή κατά την ανάλυση όλων των microRNAs στο πλαίσιο των επιμέρους ζεύγη δείγμα ασθενούς (εικ. 7). Αυτά τα ευρήματα αποτελούνταν με προηγούμενες αναφορές, χρησιμοποιώντας διάφορες πλατφόρμες αλληλουχίας που υποδηλώνει ότι οι προσεγγίσεις αλληλουχίας μπορεί να οδηγήσει σε καλές συσχετίσεις μεταξύ FFPE και κατεψυγμένα δείγματα όταν συμπεριλαμβανομένων αρκετών εκατοντάδων microRNAs [32] [33] [9] [34].

συσχετίσεις αξιών έκφραση των μεμονωμένων microRNAs (βλέπε εικ. 8, 9, 10) ήταν χαμηλότερα από συσχετίσεις συμπεριλαμβανομένων όλων των microRNAs (σύκα 6, 7). Ο βασικός λόγος για αυτή την παρατήρηση πιθανότατα προέρχεται από την προσδιοριζόμενη ένωση των συντελεστών συσχέτισης των επιμέρους microRNAs και της διακύμανσης των τιμών έκφραση microRNA (εικ 10). Πολύ παρόμοιες τιμές έκφραση ενός ατόμου microRNA μεταξύ των οκτώ περιπτώσεις (ίση με χαμηλή διακύμανση στην εικ. 10) τυπικά οδηγούν σε χαμηλούς συντελεστές συσχέτισης επειδή η διακύμανση μεταξύ κατεψυγμένα και FFPE δεδομένων είναι μεγαλύτερη από την μεταβολή της έκφρασης μεταξύ των οκτώ περιπτώσεις περιλαμβάνονται σε αυτό μελέτη. Ως εκ τούτου, δεν είναι κατ ‘ανάγκην προκαλεί έκπληξη το γεγονός να έχουν μια ευρεία κατανομή των συσχετισμών των επιμέρους microRNAs όπως αναλύεται λεπτομερώς στα σχήματα 8, 9 και 10.

Οι περιορισμοί αυτής της ανάλυσης περιλαμβάνουν περιορισμένη μικρού μεγέθους του δείγματος και των δυνητικών ολισθήματα PCR και PCR προκαταλήψεις επιλογή κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης στην πολύπλοκη κατασκευή που βασίζεται στην PCR βιβλιοθήκη [35] [36]. Αυτό το μειονέκτημα πρέπει να ξεπεραστεί από την 3

ης γενιάς της τεχνολογίας προσδιορισμού αλληλουχίας, η οποία πιστεύεται να μην απαιτούν ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου πια, αλλά ανιχνεύει μονά μόρια νουκλεϊκών οξέων [37]. Επιπλέον, η χρήση του παρακείμενου ιστού για τη δημιουργία συμφωνημένα δείγματα για την ανάλυση αυτή εισάγει ορισμένες επιδράσεις ετερογένεια ιστού και πιθανόν συμβάλλει τις παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ συμφωνημένα κατεψυγμένα και FFPE δείγματα. Συνοπτικά, microRNA αλληλουχίας των ιστών FFPE είναι εφικτή με τη χρήση προσδιορισμού αλληλουχίας απολίνωση με βάση και τις αξίες έκφραση microRNA των μεμονωμένων ασθενών συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με τα δεδομένα από την έκφραση συμφωνημένα κατεψυγμένων ιστών. Τα microRNAs με μεγαλύτερη διακύμανση φαίνεται να έχουν υψηλότερη συσχέτιση των τιμών έκφρασή τους σε συμφωνημένα κατεψυγμένα και FFPE δεδομένων ιστού.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Carlo M. Croce για τις χρήσιμες συζητήσεις.