Αφηρημένο

Νικοτιναμιδίου φωσφοριβοσυλτρανσφεράση (NAMPT) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική βιοενεργητική. Είναι υπεύθυνο για τη μετατροπή νικοτιναμίδη να δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης, ένα ουσιαστικό μόριο στον κυτταρικό μεταβολισμό. NAMPT έχει μελετηθεί εκτενώς κατά την τελευταία δεκαετία, λόγω του ρόλου της ως βασικό ρυθμιστή της νικοτιναμίδη αδενίνη ενζύμων δινουκλεοτίδιο που καταναλώνουν. NAMPT είναι επίσης γνωστή ως ένας πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση λόγω της εμπλοκής της στη νόσο. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταβολομική προσέγγιση παγκόσμια φασματομετρία μάζας με βάση τη διερεύνηση των επιδράσεων της FK866, ένα μικρό μόριο αναστολέα του NAMPT επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές, στις μεταβολικές διαταραχές σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Εμείς αγωγή Α2780 (καρκίνος των ωοθηκών) και HCT-116 (καρκίνου του παχέος εντέρου), κυτταρικές σειρές με FK866 με την παρουσία και απουσία του νικοτινικού οξέος. Σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν στο μεταβολισμό των αμινοξέων και της πουρίνης και πυριμιδίνης μεταβολισμό. Παρατηρήσαμε επίσης μεταβολικές μεταβολές σε γλυκόλυση, ο κύκλος του κιτρικού οξέος (TCA), και το μονοπάτι φωσφορικής πεντόζης. Να διευρυνθεί το φάσμα των ανιχνεύονται πολικούς μεταβολίτες και τη βελτίωση της εμπιστοσύνης των δεδομένων, εφαρμόσαμε μια παγκόσμια μεταβολισμική προφίλ πλατφόρμα με τη χρήση τόσο μη στοχευμένη και στοχευμένες υδρόφιλα (HILIC) -LC-MS και GC-MS ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε Ingenuity Knowledge Base για να διευκολύνει την προβολή των δεδομένων μεταβολισμική σε μεταβολικές οδούς. Αρκετές μεταβολικές οδούς έδειξαν διαφορική απαντήσεις σε FK866 βασίζεται σε πολλούς αγώνες στον κατάλογο των σχολιασμένη μεταβολιτών. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η παγκόσμια μεταβολισμική μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για φαρμακολογικές μελέτες του μηχανισμού δράσης των φαρμάκων σε κυτταρικό επίπεδο

Παράθεση:. Tolstikov V, Νικολάγιεφ Α, Dong S, Zhao G, Kuo MS (2014 ) Metabolomics Ανάλυση των μεταβολικές επιδράσεις των Νικοτιναμίδιο φωσφοριβοσυλτρανσφεράση (NAMPT) Αναστολή σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 9 (12): e114019. doi: 10.1371 /journal.pone.0114019

Επιμέλεια: Ramón Campos-Olivas, Ισπανικό Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ισπανία

Ελήφθη: 24, Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 4, Νοέμ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Tolstikov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Eli Lilly and Company. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συγγραφείς είναι υπάλληλοι της εταιρίας Eli Lilly and Company και, ως εκ τούτου, έχουν διασυνδέσεις, ή χρηματοδοτική συμμετοχή με την Eli Lilly and Company. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ως μια συνέχεια σε μια προηγούμενη μελέτη για τη φαρμακολογική αναστολή της νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλτρανσφεράση (NAMPT) που περιγράφει το μεταβολική βάση της αναστολής NAMPT [1], αναφέρουμε εδώ τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης παγκόσμιας μεταβολισμική που αποκάλυψε τις μεταβολικές μεταβολές της αναστολής NAMPT σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Το δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης (NAD) συμπαράγοντας είναι απαραίτητη για μια ποικιλία κυτταρικών διεργασιών. Στα θηλαστικά, NAD μπορεί να συντεθεί από νικοτιναμίδιο, νικοτινικό οξύ, ή τρυπτοφάνη [2] – [5]. Η συγκέντρωση in vivo του νικοτινικού οξέος είναι χαμηλή λόγω της ταχείας απέκκρισης και μεταβολισμού της, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χρησιμοποίηση του νικοτινικού οξέος για την βιοσύνθεση NAD σε σύγκριση με νικοτιναμίδιο περιορίζεται σε θηλαστικά [3]. Η de ηονο βιοσύνθεση των NAD από την τρυπτοφάνη εμφανίζεται κυρίως στο ήπαρ [4]. Ως εκ τούτου, η διάσωση μονοπάτι δύο σταδίων που μετατρέπει νικοτιναμιδίου σε NAD αντιπροσωπεύει την κύρια οδό για βιοσύνθεση NAD σε θηλαστικά [6] – [8]. NAMPT, αρχικά αναγνωρίστηκε ως παράγοντας αποικίας ενίσχυσης προ-Β-κυττάρων [9], είναι το ένζυμο που περιορίζει το ρυθμό που καταλύει το πρώτο στάδιο στη βιοσύνθεση της NAD από νικοτιναμιδίου [10], [11]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι NAMPT μεσολάβηση NAD βιοσύνθεσης σε καρκινικά κύτταρα διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, την παραγωγή ενέργειας, την επιβίωση, απόπτωση, την επιδιόρθωση του DNA, και η φλεγμονή [2], [12] – [14]. Αποδείχθηκε ότι NAMPT υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του πνεύμονα, του προστάτη, και άλλα καρκινώματα [15] – [18], και η έκφρασή του φαίνεται να σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου [19]. Στο κύτταρο, NAMPT είναι άφθονο στο κυτταρόπλασμα και το παρόν στον πυρήνα. Έχει αναφερθεί ότι η επαρκώς κύκλος εργασιών NAD σε καρκινικά ή πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα είναι σημαντικά αυξημένη πάνω από υγιείς ή μη-πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [1], [7]. Αυτές οι παρατηρήσεις σχετικά με την πιθανή εμπλοκή του NAMPT στη νόσο έχουν πλέον υποστηρίζεται από διάφορες προσεγγίσεις στα καρκινικά κύτταρα μελέτες [10] – [14]. Η προς τα κάτω ρύθμιση της NAMPT καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων in vitro και in vivo και ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε οξειδωτικό στρες και παράγοντες που βλάπτουν το DNA [8], [15], [18], [20] – [22]. Η αναστολή της NAMPT οδηγεί επίσης στην εξασθένηση της ανάπτυξης του όγκου και της επαγωγής της απόπτωσης λόγω της εξάντλησης NAD [8], [21] – [24]. Στο σύνολό τους, NAMPT χαρακτηριστικό παράδειγμα έναν υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για την ανάπτυξη του δυναμικού νέων φαρμάκων κατά του καρκίνου.

NAD είναι ένα υπόστρωμα για αφυδρογονάσες, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσες, sirtuins, μονο (ADP-ριβοσυλ) τρανσφερασών, και κυκλάσες ADP-ριβοζυλ [2], [4], [12]. Στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση, μία βασική πρωτεΐνη που απαιτείται για την επισκευή του DNA που εμπλέκεται επίσης στην απόπτωση, ενεργοποιείται λόγω βλάβης του DNA και την αστάθεια του γονιδιώματος [2], [25] – [27]. Η ενεργοποίηση του πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης οδηγεί σε εξάντληση NAD σε καρκινικά κύτταρα [2], [8], [25] – [27]. Ως αποτέλεσμα, ο κάτω ρύθμιση NAMPT ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA και την απόπτωση [10], [21]. Παρομοίως, Sir2 πρωτεΐνη χρησιμεύει επίσης ως βασικό καθοδικός τελεστής του NAMPT που ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της επιβίωσης και φλεγμονής [28] – [30]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι Sir2 πρωτεΐνες ρυθμίζουν την παραγωγή κυτοκίνης [30], η οποία με τη σειρά του μειώνει τα επίπεδα NAD μέσω της αναστολής της NAMPT. Επιπλέον, ένας αναστολέας NAMPT έχει δείξει αντι-φλεγμονώδη αποτελέσματα σε ζωικά μοντέλα φλεγμονής [20], [30]. Τέλος, ο βασικός μηχανισμός της δράσης αναστολής NAMPT είναι ο αποκλεισμός της γλυκόλυσης στο στάδιο αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδες-3-φωσφορική αδενοσίνη υπεύθυνη για εξάντληση τριφωσφορική (ΑΤΡ), μεταβολικές διαταραχή, και την επακόλουθη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [1]. Ωστόσο, το πώς διαμόρφωση της δραστικότητας NAMPT σε καρκινικά κύτταρα επηρεάζει τον κυτταρικό μεταβολισμό, εκτός του μεταβολισμού της ενέργειας όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [1], παραμένει άγνωστη. FK866, ένα μικρό μόριο αναστολέα του NAMPT, υπήρξε το αντικείμενο εκτεταμένων μελετών [2], [21], [31]. Το μόριο έχει συν-κρυσταλλώνεται με και βρέθηκε να συνδέεται με την σύνδεση νικοτιναμιδίου τσέπη του NAMPT, καταδεικνύοντας έτσι το μηχανισμό της ως ανταγωνιστικός αναστολέας της NAMPT σε σχέση με νικοτιναμίδιο [32]. Αρκετές μελέτες δείχνουν επίσης ότι FK866 αναστέλλει ειδικά NAMPT στο κύτταρο και εμφανίζει αντικαρκινική δραστικότητα σε προκλινικά μοντέλα όγκων [11], [14], [20], [30], [32] – [35]. Έτσι, FK866 φαίνεται να είναι ένα ιδανικό εργαλείο μόριο για την αξιολόγηση της φυσιολογικής λειτουργίας του NAMPT στο κύτταρο. Στην παρούσα μελέτη, θέλαμε να αξιολογήσει περαιτέρω τις παγκόσμιες επιπτώσεις της αναστολής NAMPT από FK866 στο μεταβολισμό του καρκίνου με τη χρήση της παγκόσμιας φασματομετρία μάζας με βάση το μεταβολικό προφίλ. Έχουμε επιλέξει δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που διαφέρουν στον τρόπο που χρησιμοποιούν το νικοτινικό οξύ και νικοτιναμιδίου για το σχηματισμό NAD, υποθέτοντας ότι η προσθήκη του νικοτινικού οξέος στο μέσο αναπτύξεως μπορεί να καταργήσει την αναστολή NAMPT σε μία κυτταρική σειρά αλλά όχι στο άλλο. Έχουμε βρει ότι η αναστολή της NAMPT από τα αποτελέσματα FK866 στο μεταβολή πολλών μεταβολικών οδών πολύ πέρα ​​από το μεταβολισμό της ενέργειας. Ως εκ τούτου, η προσέγγιση μεταβολικό προφίλ φασματομετρίας με βάση την παγκόσμια μάζα είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για μηχανιστικές μελέτες των ενεργειών του φαρμάκου και για τον εντοπισμό πιθανών δεικτών φαρμακοδυναμική.

Υλικά και Μέθοδοι

Μελέτη

Καθένα από τα δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 και 50 ηΜ FK866 (σε 0,1% DMSO) και 0,1% DMSO με και χωρίς νικοτινικό οξύ (10 μΜ) για 24 ώρες. Κάθε ομάδα ήταν τροφοδοτείται με 6 βιολογική επαναλήψεις. Οι κυτταρικές γραμμές που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το φάρμακο και νικοτινικό οξύ χρησίμευσαν ως μάρτυρες.

Cancer Cells

Α2780 (NCI DCTD), ένα καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή, και HCT-116 (ATCC), μια καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή, καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen 30000000-2.001000000 εκατομμύρια) και McCoys 5a (Hyclone SH30200), αντίστοιχα, με την παρουσία 10% FBS. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1,0 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με FK866 σε DMSO σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. FK866 συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [37]. Ως μέρος του σχεδιασμού της μελέτης, τα κύτταρα επίσης αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν με νικοτινικό οξύ (10 μΜ) και FK866 για 24 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας ένα κιτ CytoScan SRB κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία (Cat Νο 786-213?. G-Biosciences, St. Louis, ΜΟ). Μετά από 24 ώρες κατεργασίας, το μέσο απομακρύνθηκε και προ-ψύχονται στους -20 ° C? Στη συνέχεια, 500 μL 80% μεθανόλης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα αποξέσθηκαν και συλλέχθηκαν στους -20 ° C σε σωλήνες eppendorf 1.5 κ.εκ.. Μετά από 60 λεπτά, οι σωλήνες Eppendorf φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 14.000 στροφές ανά λεπτό και τοποθετήθηκε το υπερκείμενο σε νέα σωληνάρια για περαιτέρω ανάλυση.

Μεταβολομική Ανάλυση

Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μη στοχευμένη και στοχευμένη πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας GC-ΤΟΡ-HRMS, υδρόφιλα (HILIC) -LC-HRMS και HILIC-LC-MS /MS όργανα την εφαρμογή αναφερθεί στο παρελθόν μεθοδολογία [38] – [40]. Ένα δείγμα πρότυπο ελέγχου ποιότητας (QC) που περιέχει ένα μίγμα αμινοξέων και οργανικά οξέα εγχύθηκε καθημερινά για την παρακολούθηση της μάζας απόκριση φασματόμετρου. Το συγκεντρωμένο δείγμα QC ελήφθη λαμβάνοντας ένα μέρος του ίδιου όγκου όλων των δειγμάτων από τη μελέτη. Το συγκεντρωμένο δείγμα QC εγχύθηκε καθημερινά με μια παρτίδα των δειγμάτων που αναλύθηκαν και χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βέλτιστη αραίωση των δειγμάτων της παρτίδας και την επικύρωση ταυτοποίηση του μεταβολίτη και ολοκλήρωσης κορυφή (S1 File). Τα υπερκείμενα των κυτταρικών εκχυλισμάτων χωρίζεται σε τρία μέρη: 75 μL για ανάλυση GC-TOF-MS, 175 μL για HILIC-LC /MS ανάλυση, και 175 μι για HILIC-LC /MS /MS ανάλυση

. η υποκατάσταση του δείγματος και GC-TOF-HRMS Ανάλυση

εκχυλίσματα ξηραίνονται χρησιμοποιώντας SpeedVac συγκεντρωτή Savant DNA120 (ThermoScientific, San Jose, CA) με τη θερμοκρασία σετ μπάνιου κάτω από τους 30 ° C. Προ-διατηρημένα με απλή ψύξη δείγματα περαιτέρω ξηραίνεται πάνω από 1 ώρα χρησιμοποιώντας μια ελεύθερη ζώνη λυοφιλιωτή (Labconco, Kansas City, MO). Αποξηραμένα παραγωγοποίηση του δείγματος με υδροχλωρική μεθοξυλαμίνη σε πυριδίνη και Ν-μεθυλο-Ν-τριμεθυλοσιλυλοτριφθοροακεταμίδιο πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από Tong et al. [37]. αέρια χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αέριο χρωματογράφο Agilent 7890A (Agilent, Palo Alto, CA) σε διασύνδεση με ένα υψηλής ευκρίνειας ώρα της πτήσης Pegasus GC-HRT φασματογράφο μάζας (Leco, Αγίου Ιωσήφ, ΜΙ). Αυτοματοποιημένη ενέσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός MPS2 προγραμματιζόμενων ρομποτικών δειγματολήπτη πολλαπλών χρήσεων (Gerstel, Mühlheim an der Ruhr, Γερμανία). Το σύστημα GC ήταν εξοπλισμένο με ένα Gerstel προγραμματισμού θερμοκρασίας έγχυσης, ψύχθηκε σύστημα ψεκασμού (μοντέλο CIS 4). Μια αυτοματοποιημένη ανταλλαγή τακτικών γραμμών (ALEX) (Gerstel) χρησιμοποιήθηκε για την εξάλειψη της διασταυρούμενης μόλυνσης από τη μήτρα του δείγματος που συμβαίνουν μεταξύ πίστες του δείγματος. χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλές απενεργοποιηθεί αμηχανία χιτώνια για την είσοδο του GC. Ο εγχυτήρας Gerstel προγραμματίστηκε για την ακόλουθη σειρά: αρχική θερμοκρασία 50 ° C, διατήρηση για 0,1 λεπτό, αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 10 ° Cs-1 σε μία τελική θερμοκρασία των 330 ° C, και κρατήστε χρόνος 15 λεπτά). Εγχύσεις με 1 μl έγιναν στη λειτουργία splitless. Η χρωματογραφία διεξήχθη σε στήλη Rtx-5Sil MS (μήκος: 30 m? ID: 0,25 mm? Df: 0,25 μm) με μια στήλη Integra-Guard (Restek, Bellefonte, ΡΑ). φέρον αέριο ήλιο χρησιμοποιήθηκε σε σταθερή ροή 1 mL min-1. Η θερμοκρασία του κλιβάνου GC ήταν programed για την ακόλουθη σειρά: 50 ° C αρχική θερμοκρασία με χρόνο παραμονής 1 λεπτό και στη συνέχεια αναδιατάσσουν στους 10 ° C ανά λεπτό σε θερμοκρασία 140 ° C, στη συνέχεια αναδιατάσσουν στους 4 ° C ανά λεπτό έως μια θερμοκρασία 240 ° C, και στη συνέχεια, αναδιατάσσουν στους 10 ° C ανά λεπτό σε θερμοκρασία 300 ° C με χρόνο παραμονής 8 λεπτά. Τόσο η γραμμή μεταφοράς και οι θερμοκρασίες πηγή ήταν 250 ° C. πηγή ιόντων λειτουργεί στην τάση kV νήμα -70. Μετά από μια καθυστέρηση διαλύτη 500 δευτερολέπτων, φάσματα μάζας αποκτήθηκαν σε 2.4 φάσματα ανά δευτερόλεπτο με συχνότητα εκχύλιση 2 kHz και εύρος μάζας από 60 έως 520 m /z. Ψήφισμα ορίστηκε σε 25 ακρίβεια Κ Μαζικής ελέγχθηκε με PFTBA συντονισμού σε επίπεδο υπο-ppm όλη τη διάρκεια της το χρόνο εκτέλεσης. Τα τυποποιημένα QC και ομαδοποιήθηκαν τα QC δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση απόκτηση GC-TOF-HRMS δεδομένα (S1 File) [41] – [43]. Μάζα βαθμονόμησης φασματόμετρο έγινε σε καθημερινή βάση, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του πωλητή. Μάζα ακρίβεια ήταν συνήθως διατηρείται σε ένα επίπεδο υπο-ppm σε ανάλυση των 30-40 ανάλυση Κ δεδομένων έγινε με το λογισμικό πωλητής ChromaTof (LECO, Αγίου Ιωσήφ, ΜΙ) και AnalyzerPro (SpectralWorks Ltd, Runcorn, Ηνωμένο Βασίλειο), χρησιμοποιώντας την τελευταία λέξη βάση δεδομένων NIST-MS (https://chemdata.nist.gov/).

HILIC-LC-MS /MS ανάλυση

Αποσπάσματα χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω παραγώγων. HILIC-LC-MS /MS απόκτησης και επεξεργασίας δεδομένων ελέγχθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων τα QC [42], [43] και συγκεντρώνονται τα QC δείγματος (S1 αρχείου). Υγρή χρωματογραφία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα NEXERA UPLC (Shimadzu, Columbia, MD) σε συνδυασμό με το σύστημα Triple Quad 5500 (ΑΒ Sciex, Framingham, ΜΑ). HILIC διαχωρισμοί επιτεύχθηκαν χρησιμοποιώντας μια στήλη πολυμερικό πήγμα πολυαμίνης-πλεγμένα (apHera NH2 Polymer) με 150 χ 2 mm, 5-μm μέγεθος σωματιδίων, εφοδιασμένο με στήλη φύλακα (apHera NH2 Polymer) με 10 χ 2 mm, 5-μm το μέγεθος των σωματιδίων (Supelco, Bellefonte, ΡΑ). Οι κινητές φάσεις ήταν ακετονιτρίλιο (Α) και 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 9,4, ρυθμισμένο με υδροξείδιο του αμμωνίου) (Β) με βάση τις τιμές ροής 0,25 mL /λεπτό στους 30 ° C. Μετά από 3 λεπτά ισοκρατική τρέξιμο στο 15% Β, μια κλίση έως 30% Β συνάπτονται σε 12 λεπτά και μια κλίση έως 60% Β ολοκληρώθηκε σε 15 λεπτά. Μετά από αυτό, μία βαθμίδα έως 75% Β ολοκληρώθηκε στο 21 λεπτά και μία βαθμίδα έως 98% Β ολοκληρώθηκε στο 22 λεπτά. Μετά την πλύση της στήλης, το τρέξιμο ολοκληρώθηκε με 98% Β σε 29 λεπτά. Εξισορρόπηση της στήλης με ένα ρυθμιστικό έναρξης έλαβε 6 λεπτά πριν από την επόμενη ένεση. Η απόκτηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προγραμματιστεί MRMS. Σύνολο κατάλογος περιείχε περισσότερα από 200 μεταβάσεις MRM παράγεται με αυθεντικά πρότυπα θετικά και αρνητικά τρόπους [43] (S1 File).

HILIC-LC-HRMS Ανάλυση

Αποσπάσματα χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω παραγωγοποίηση. Οι QC που πρότυπα και συνενώθηκαν τα QC δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση απόκτηση HILIC-LC-HRMS δεδομένα όπως περιγράφηκε προηγουμένως (S1 File) [42] – [44]. Υγρή χρωματογραφία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Waters UPLC (Waters, Milford, ΜΑ) σε συνδυασμό με το σύστημα Triple TOF 5600 (ΑΒ Sciex). HILIC διαχωρισμοί επιτεύχθηκαν με τη χρήση των παραπάνω περιγραφέντα πρωτόκολλα. Οι πληροφορίες Εξαρτημένη πείραμα Απόκτηση χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση δεδομένων εντός 70 σε 800 m /z εύρος μάζας για θετικά και αρνητικά ιόντα χωριστά. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας οπτική στίγματος έκδοση 1.2.1 του λογισμικού (ΑΒ Sciex). Κεντρίσματος ομαδοποιημένα δείγματα με εμπορικώς διαθέσιμα αυθεντικά πρότυπα επέτρεψε την ταυτοποίηση των στοιχείων του δείγματος. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν για θετικά και αρνητικά ιόντα ξεχωριστά μέσα σε ένα εύρος μάζας 70 – 800 m /z, την εφαρμογή του πειράματος προορίζεται να κατακερματίσει το σύνολο των ιόντων που υπερβαίνει επιλεγμένο όριο κατά την εφαρμογή του τροχαίου ενέργειας κατακερματισμό. Μάζα βαθμονόμηση φασματόμετρο πραγματοποιήθηκε σε ημερήσια βάση χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του πωλητή για θετικά και αρνητικά ιόντα. Μάζα ακρίβεια ήταν συνήθως διατηρείται σε 5 επίπεδα ppm σε ανάλυση 20 έως 30K. Συστατικό αναγνώριση επιτεύχθηκε με καρφώσει αυθεντικά πρότυπα, όταν υπάρχουν. Άγνωστη συστατικά ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας επαναβαθμονομημένου φασματικά δεδομένα με τη βοήθεια του PeakView έκδοση 1.2.0.3 του λογισμικού (ΑΒ Sciex). Παρτίδα εκ νέου βαθμονόμηση έγινε χρησιμοποιώντας προηγουμένως εντοπιστεί συστατικά που έχουν διαφορετικές μάζες και οι χρόνοι κατακράτησης ως εσωτερικά πρότυπα. Αυτό το πρωτόκολλο επέτρεψε την ρουτίνα επίτευξη ενός 2 έως 5 ppm μάζα απόκλιση ακρίβειας για μητρικά ιόντα και τα θραύσματά τους (S1 File). METLIN (https://metlin.scripps.edu/index.php), HMDB (https://www.hmdb.ca/), MASSBANK (https://www.massbank.jp/), NIST-MS (http : //chemdata.nist.gov/), IDEOME (https://mzmatch.sourceforge.net/ideom.php), mzCloud (https://mzcloud.org/), και in-house δημιουργείται HRMS και HRMS /MS βάσεις δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για την εκχώρηση στοιχειακή σύνθεση, φασματική συγκρίσεων δεδομένων, και λεπτομερής εγχειρίδιο ερμηνεία. Αυτό το πρωτόκολλο ανακάλυψη επέτρεψε την σχολιασμό των μεταβολιτών, τα οποία δεν ήταν διαθέσιμα στο εμπόριο (S1 αρχείου). Σχολιασμένη δεδομένα περαιτέρω επεξεργασία με οπτική στίγματος έκδοση 1.2.1 του λογισμικού (ΑΒ Sciex) για τον υπολογισμό της περιοχής κορυφής μεταβολίτη. Αγνώστων χαρακτηριστικά αποκλείστηκαν συστηματικά από τη λίστα αιχμής. δεδομένα HILIC-LC-HRMS χρησιμοποιήθηκαν για να αποσαφηνιστεί η cross-talk παρατηρούνται κατά την ανάλυση HILIC-LC-MS /MS, και χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των μεταβολιτών που είχαν συγκεντρώσεις άνω γραμμική περιοχή κατά την ανάλυση HILIC-LC-MS /MS . Είναι επίσης χρησιμοποιείται για την χρόνοι κατακράτησης αποστολή για ισομερή (S1 File).

Επεξεργασία Δεδομένων και Στατιστική Ανάλυση

GC-MS ανάλυση δεδομένων με τη χρήση ChromaTof επιτρέπεται για την παραγωγή καταλόγων αιχμής, οι οποίες περαιτέρω εξάγεται σε όλη την δελτία και συνδυάζονται σε ένα κύριο κατάλογο. Επιπλέον, η επεξεργασία δεδομένων έγινε με AnalyzerPro και ένας αναλυτής μήτρα πρόσθετο χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή μιας βιβλιοθήκης στόχος μήτρας. Η βάση δεδομένων NIST-MS χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή αυτής της βιβλιοθήκης. Αυτό το πρωτόκολλο είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή πολλών χιλιάδων χαρακτηριστικά. Τα δεδομένα περαιτέρω διηθούνται όπως περιγράφεται στο Chan et al. [41] και Dunn et al. [42] και συγχωνεύεται με τα δεδομένα που παράγονται με τη βοήθεια ChromaTof. Εγχειρίδιο ελέγχου και εις διπλούν αφαίρεσης διεξήχθη για να σχηματίσουν ένα τελικό τραπέζι κορυφή μεταβολίτες εντοπίστηκαν και μετρήθηκαν με τη μέθοδο GC-MS. Διάμεση κανονικοποίηση των δεδομένων (γραμμή κλιμάκωση), λογαριθμική μετατροπή, και την κλιμάκωση των δεδομένων (Pareto) για GC-MS και τα δεδομένα LC-MS πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση MetaboAnalyst έκδοση 2.0 του λογισμικού [45], προκειμένου να αντισταθμίσει δια- και ενδο-οργανική μεταβολή. Ένα τελικό τραπέζι κορυφή μεταβολίτη κατασκευάστηκε συνδυάζοντας τα δεδομένα που αποκτήθηκαν με όλες τις μεθόδους. Peak λίστα, που παράγεται με τη μέθοδο LC-MS /MS, χρησίμευσε ως βάση για τη συγχώνευση των δεδομένων και την ένταξη (S1 αρχείου). Διπλότυπα εισάγονται με τις συμπληρωματικές μεθόδους (GC-HRMS και HILIC-LC-HRMS) αφαιρέθηκαν μετά από οδηγίες ελέγχου. Ο μεταβολίτης εντάσεις από μεμονωμένα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε αντίστοιχη συγκέντρωση πρωτεΐνης πριν από την περαιτέρω στατιστική ανάλυση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική προσέγγιση. MetaboAnalyst έκδοση 2.0 [45] και JMP έκδοση 11 πακέτα χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις. Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett διεξήχθη για συγκρίσεις δεδομένων μεταξύ των ομάδων, οι οποίες ορίζονται με τον σχεδιασμό της μελέτης ως εξής: έλεγχος (ορίζεται ως -Να) και τα επεξεργασμένα κύτταρα (που ορίζεται ως + NA, 50 ηΜ-NA, 5 nM-NA, 50 ηΜ + NA, 5 ηΜ + Νa). Τα σχήματα που περιέχουν απεικονίσεις των αποτελεσμάτων ANOVA έχουν γραφικές πληροφορίες εξηγείται ως εξής: οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05. Μεγάλο μέση απεικονίζεται ως οριζόντια γραμμή που βρίσκεται μέσα στον πίνακα (Εικ. 1). Ο άξονας y δείχνει κανονικοποιημένα, συνδεθείτε μεταμορφωθεί, και κλιμακώνεται εμβαδόν κορυφής. Πειραματικές ομάδες στις διάφορες θεραπείες περαιτέρω ταξινομούνται χρησιμοποιώντας ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση, ανάλυση κύριο συστατικό, και εποπτεύεται πολυπαραγοντική ανάλυση μερική ελαχίστων τετραγώνων-διακριτική ανάλυση (S3 File).

Μεγάλο μέση εμφανίζεται ως μια οριζόντια γραμμή που βρίσκεται στο εσωτερικό του πίνακα . Ο άξονας y δείχνει κανονικοποιημένα, συνδεθείτε μεταμορφωθεί, και κλιμακώνεται εμβαδόν κορυφής. Τελείες αντιπροσωπεύουν δείγματα. Ομάδα σημαίνει εμφανίζεται ως οριζόντια γραμμή μέσα στο κουτί.

Η

Pathway και Δικτύων Ανάλυση

γνωστούς μεταβολίτες υποβλήθηκαν σε ανάλυση ΙΡΑ (Ingenuity System, Redwood City, CA). αριθμούς προσχώρησης της ανιχνεύονται μεταβολίτες (HMDB, PubChem και KEGG αναγνωριστικά) εισήχθησαν στο MS Excel και εισάγονται στην ΙΡΑ για να χαρτογραφήσει τις κανονικές οδούς και να δημιουργήσουν δίκτυα αλληλεπίδρασης βιολογικών οντοτήτων. Υποβλήθηκαν στοιχεία ως φορές τιμές μεταβολής (αναλογίες) που υπολογίζεται από την ομάδα ελέγχου (που ορίζεται ως -Να). Συνολικές αναλύσεις της οδού και του δικτύου πραγματοποιήθηκαν. Οι μεταγενέστεροι βιολογικές διεργασίες βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με την υποστήριξη οντολογία χρησιμοποιώντας Ingenuity της Γνωσιακής Βάσης (https://www.ingenuity.com/science/knowledge-base). ρυθμίσεις ανάλυσης ΙΡΑ ήταν ως εξής:

σύνολο αναφοράς:. Ingenuity Γνωσιακής Βάσης (ενδογενή χημικά)

Σχέση με περιλαμβάνουν:.. άμεσες και έμμεσες

Περιλαμβάνει ενδογενών χημικών

σύνοψη Φίλτρο: Σκεφτείτε μόνο τις σχέσεις όπου η εμπιστοσύνη είναι πειραματικά παρατηρηθεί ή υψηλή (προβλεπόμενης)

ρύθμιση ανάλυση περιελάμβανε δεδομένα που συλλέγονται από ανθρώπινα κύτταρα

η

P-value εξήγηση είναι.. ως εξής: ένα μέτρο της πιθανότητας ότι η σχέση μεταξύ ενός συνόλου των μεταβολιτών στο σύνολο δεδομένων και μια σχετική λειτουργία οφείλεται στην τυχαία σύνδεση. Όσο μικρότερη είναι η τιμή p, τόσο λιγότερο πιθανό είναι ότι η ένωση είναι τυχαία και η πιο σημαντική η ένωση. Σε γενικές γραμμές, οι τιμές ρ & lt? 0.05 δείχνουν μια στατιστικά σημαντική, μη τυχαία σύνδεση. IPA χρησιμοποιεί την ενεργοποίηση αλγόριθμο z-score για να κάνουν προβλέψεις. Ο αλγόριθμος z-score έχει σχεδιαστεί για να παράγουν είτε μια πρόβλεψη της ενεργοποίησης ή αναστολής (ή καμία πρόβλεψη), καθώς και να μειώσει την πιθανότητα ότι η τυχαία δεδομένα θα δημιουργήσει σημαντικές προβλέψεις.

Αποτελέσματα

για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της αναστολής NAMPT στο μεταβολισμό του καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές: Α2780, μία NARPT-αρνητική κυτταρική σειρά που μπορεί να χρησιμοποιήσει μόνο το NAMPT μεσολάβηση νικοτιναμίδιο μονοπάτι για βιοσύνθεση NAD, και HCT-116, ένα NAPRT-θετικού κυττάρου γραμμή που μπορούν να χρησιμοποιήσουν τόσο NAMPT μεσολάβηση νικοτιναμίδη και NAPRT μεσολάβηση μονοπάτια νικοτινικό οξύ για τη βιοσύνθεση NAD. Επειδή HCT-116 μπορεί να χρησιμοποιήσει νικοτιναμίδιο και νικοτινικό οξύ για τον σχηματισμό NAD, η προσθήκη του νικοτινικού οξέος στο μέσο αναπτύξεως μπορεί να καταργήσει την αναστολή NAMPT σε HCT-116, αλλά όχι σε Α2780. Ως εκ τούτου, το νικοτινικό οξύ χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για την αξιολόγηση της ειδικότητας των αναστολέων NAMPT.

Αμινοξέα Μεταβολισμός

Χρησιμοποιώντας παγκόσμια πρωτόκολλα μεταβολισμική, παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στον μεταβολισμό αμινοξέων στην αναστολή NAMPT με FK866 σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, με την εξαίρεση της γλυκίνης και σερίνης του μεταβολισμού, αργινίνη μεταβολισμό, και το μεταβολισμό ιστιδίνης (S2-S5 αρχεία). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, η αλανίνη και ασπαρτικό μεταβολισμός ήταν σημαντικά επηρεαστεί. Παρατηρήθηκαν δόση ναρκωτικών εξαρτώμενες μεταβολές που προκαλούνται σε ασπαρτικό, αλανίνης, και τα επίπεδα Ν-καρβαμοϋλο-ασπαρτικό. Η προσθήκη νικοτινικό οξύ καταργηθεί τελείως αυτά τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε HCT-116 αλλά όχι σε Α2780 (Εικ. 1, S4 αρχείων και S5 Files), υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα αυτά οφείλονταν σε αναστολή NAMPT. Είναι ενδιαφέρον ότι τα επίπεδα ασπαραγίνης και γλουταμικού δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά. Παρατηρήθηκε επίσης οριακή μείωση στα επίπεδα γλουταμικού και γλουταμίνης στο HCT-116 κύτταρα. Αυξήσεις σε θρεονίνη επίπεδα παρατηρήθηκαν (S2 File) και αντιστρέφεται με αγωγή νικοτινικό οξύ σε HCT-116 κύτταρα, υποστηρίζοντας την σύνδεση σε ασπαρτικό, το οποίο είναι μια πηγή για βιοσύνθεση θρεονίνη.

Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα των Ν-acetylglutamine ήταν αυξημένα στις δύο κυτταρικές σειρές όταν έλαβαν θεραπεία με FK866 και μόνο τις επιδράσεις σε HCT-116 διασώθηκαν με προσθήκη νικοτινικό οξύ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για τη λυσίνη, Ν-ακετυλο-λυσίνη, φαινυλαλανίνη, τρυπτοφάνη, τυροσίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, μεθειονίνη, SAM, και προλίνη (S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία). SAM είναι γνωστό ότι συμμετέχουν σε κυστεΐνη και μεθειονίνη μεταβολισμό, αργινίνη και το μεταβολισμό προλίνη, τη βιοσύνθεση των αμινοξέων, και σε τρανσμεθυλίωσης, transsulfuration, και aminopropylation. Διαπιστώθηκε ότι οι μεταβολές των επιπέδων του SAM είναι εντυπωσιακά παρόμοια με αλλαγές στα επίπεδα ασπαρτικό (S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία). Τέλος, η αναστολή NAMPT οδηγεί επίσης σε αλλαγές του μεταβολισμού πολυαμίνης επειδή τα επίπεδα σπερμίνη και σπερμιδίνη ήταν αυξημένα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σχετικά με τη θεραπεία με FK866. Η προσθήκη του νικοτινικού οξέος κατήργησε πλήρως τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε HCT-116 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα Α2780 (S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία). Έτσι, η αναστολή NAMPT φαίνεται να διαταράσσουν διάφορες οδούς αμινοξέων και μερικά από τα αποτελέσματα φαίνεται να είναι κυτταρική σειρά ειδικών.

πουρίνης και πυριμιδίνης του μεταβολισμού

Επειδή τα διάφορα στάδια της βιοσύνθεσης πουρίνης και πυριμιδίνης απαιτούν NAD και ενδιάμεσα τα οποία προέρχονται από τον μεταβολισμό των υδατανθράκων, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της αναστολής NAMPT επί metabolism.As νουκλεοτιδίου που σχετίζονται φαίνεται στο Σχ. 2 και S3 αρχείου, S4 αρχείων και S5 Files, παρατηρήσαμε αλλαγές στα επίπεδα των πουρινών σε απόκριση σε θεραπεία FK866 επειδή υπήρχε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα της αδενίνης, κυτιδίνης, κυτοσίνη, αδενοσίνη, 1-μεθυλαδενοσίνη, ινοσίνη, αδενοσίνη μονοφωσφορικής (ΑΜΡ), διφωσφορική αδενοσίνη (ADP), ινοσίνη μονοφωσφορική (ΟΘΠ), ινοσίνη διφωσφορικά (IDP), κυτιδίνης διφωσφορικά (CDP), δεοξυγουανοσίνη διφωσφορικά (dGDP), 5-αμινοϊμιδαζολο-4-καρβοξαμίδιο ριβονουκλεοτίδιο (AICAR), AICAR 3 ‘ , 5’-κυκλική φωσφορική, Ν-formylglycinamide ριβονουκλεοτιδίου, οροτιδίνης, πουρίνη, θυμιδίνη, και ουριδίνη σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, παρόμοια με την αύξηση των επιπέδων αμινο οξέα. Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του νικοτινικού οξέος μείωσε σημαντικά τα αυξημένα επίπεδα ινοσίνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2, S2 Αρχείο, S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία). Επίπεδα ξανθίνη δεν άλλαξαν σε Α2780 κύτταρα αλλά αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε HCT-116 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει μια κυτταρική γραμμή ειδική διαφορά στο μεταβολισμό ξανθίνης που σχετίζονται. Υπήρξε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην 7-μεθυλογουανοσίνη, δεοξυαδενοσίνη, δεοξυουριδίνη, μονοφωσφορική γουανοσίνη (GMP), μονοφωσφορική κυτιδίνη (CMP), δεοξυκυτιδίνη μονοφωσφορική (dCMP), δεοξυαδενοσίνη μονοφωσφορική (dAMP) και τριφωσφορική ουριδίνη (UTP) επίπεδα. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν λόγω της αναστολής NAMPT επειδή η προσθήκη του νικοτινικού οξέος, καταργούνται αυτά τα αποτελέσματα σε HCT-116 κύτταρα αλλά όχι σε Α2780 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με 5 ηΜ FK866 αυξημένα επίπεδα dCMP συγκρίσιμα με εκείνα των 50 ηΜ FK866 σε κύτταρα Α2780. Και πάλι, υπήρξε μια κυτταρική γραμμή ειδική επίδραση παρατηρήθηκε επειδή η αναστολή NAMPT προκάλεσε μείωση στα επίπεδα κυκλικού ΑΜΡ και AICAR ριβοτίδιο σε Α2780 κύτταρα αλλά όχι σε HCT-116 κύτταρα (S2 Αρχείο, S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία).

το Grand μέση εμφανίζεται ως μια οριζόντια γραμμή που βρίσκεται στο εσωτερικό του πίνακα. Ο άξονας y δείχνει κανονικοποιημένα, συνδεθείτε μεταμορφωθεί, και κλιμακώνεται εμβαδόν κορυφής. Τελείες αντιπροσωπεύουν δείγματα. Ομάδα σημαίνει απεικονίζεται ως οριζόντια γραμμή μέσα στο κουτί.

Η

Κρεατίνη Μεταβολισμός

αναστολή NAMPT οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα κρεατίνης και κρεατινίνης σε δύο κυτταρικές σειρές που είναι παρόμοια με τα αμινοξέα επίπεδα. Σε συμφωνία με αυτό, η προσθήκη του νικοτινικού οξέος, καταργούνται αυτά τα αποτελέσματα σε HCT-116 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα Α2780 (S2 Αρχείο, S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία).

Lipid Metabolism

βιοσύνθεση λιπαρών οξέων απαιτεί ένα μεγάλο ποσό του NADP /NADPH που προέρχεται από NAD και κιτρικό (α TCA ενδιάμεσο)? παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στον μεταβολισμό των λιπιδίων σε απόκριση σε θεραπεία FK866. επίπεδα παλμιτικού και στεατικού οξέος ήταν αυξημένα κατά τρόπο που εξαρτάται από τη δόση και στις δύο κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του νικοτινικού οξέος, καταργούνται αυτές οι επιδράσεις σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η θεραπεία με FK866 οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της χολίνης, φωσφορυλοχολίνη, και phoshatydylglycerol σε HCT-116 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα Α2780. Αυτές οι επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε HCT-116 κύτταρα ήταν αποτέλεσμα της αναστολής NAMPT επειδή οι συνέπειες καταργήθηκαν με την προσθήκη του νικοτινικού οξέος στο μέσο αναπτύξεως. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια ισχυρή εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στα επίπεδα γλυκεροφωσφοχολίνης και γλυκερόλη-3-φωσφορική σε Α2780 κύτταρα αλλά όχι σε HCT-116 κύτταρα. Η θεραπεία FK866 οδήγησε επίσης σε σημαντική δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα λυσο-PC και PC ανιχνεύθηκε σε κύτταρα Α2780 αλλά οριακές αλλαγές σε HCT-116 κύτταρα (S2 Αρχείο, S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία).

αυτές οι παρατηρήσεις θα μπορούσαν να αντικατοπτρίζεται μια γραμμή ειδικά διαφορά κυττάρων σε αυτές τις συγκεκριμένες μεταβολικές οδούς. Τέλος, η αναστολή NAMPT επίσης επηρέασε σημαντικά το μεταβολισμό καρνιτίνης με έναν τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση (Εικ. 3).

Μεγάλες μέση απεικονίζεται ως οριζόντια γραμμή που βρίσκεται εντός του πίνακα. Ο άξονας y δείχνει κανονικοποιημένα, συνδεθείτε μεταμορφωθεί, και κλιμακώνεται εμβαδόν κορυφής. Τελείες αντιπροσωπεύουν δείγματα. Ομάδα σημαίνει απεικονίζεται ως οριζόντια γραμμή μέσα στο κουτί.

Η

καρνιτίνη είναι ένα σημαντικό μόριο για τη ρύθμιση της κυτταρικής ενέργειας μεταβολισμό των λιπαρών οξέων και της γλυκόζης. Η καρνιτίνη συμμετέχει σε μεταφορά λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας σε όλη την εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων, και διευκολύνει την μεταφορά του ακυλομάδων αλυσίδας συντομευθεί παράγεται στο υπεροξυσωμάτων στα μιτοχόνδρια για την περαιτέρω παραγωγή ενέργειας. Κυττάρου-ειδικές μεταβολές στον μεταβολισμό καρνιτίνη παρατηρήθηκαν, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό αντίκτυπο της διοίκησης FK866 για τη βιοσύνθεση καρνιτίνης και την υποβάθμιση. Ακετυλκαρνιτίνη προέρχεται από ακετυλο-CoA, το καθολικό προϊόν αποδόμησης όλων των μεταβολικών υποστρωμάτων. Ακετυλκαρνιτίνη αλλαγές βρέθηκαν να είναι παρόμοια σε ακετυλο-CoA αλλαγές (S2 Αρχείο, S3 Αρχείο, S4 αρχείων και S5 αρχεία). Βουτυλκαρνιτίνη μπορεί να προέρχεται τόσο από λιπαρά οξέα και αμινοξέα. αλλοιώσεις του βρέθηκαν να είναι δοσοεξαρτώμενη, η οποία μπορεί να αντανακλά παρατηρούμενη μεταβολές σε αμινοξέα και μεταβολισμό λιπαρών οξέων.

γλυκόλυση, πεντόζης Φωσφορικό Pathway και ο κύκλος TCA

Πρόσφατα αποδειχθεί ότι αναστολή NAMPT εξασθενεί δραστηριότητα γλυκεραλδεΰδες-3-φωσφορική αφυδρογονάση, η οποία με τη σειρά του επηρεάζει γλυκόλυση, το μονοπάτι φωσφορικής πεντόζης, και τον κύκλο TCA και κατάντη οδούς τους σε καρκινικά κύτταρα [1]. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι σε στενή συνεννόηση με εκείνα της προηγούμενης μελέτης [1] (S2-S5 Filess).

Ομαδοποίηση Ανάλυση

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω το μεταβολικό συνδεσιμότητα και να συλλάβει την παγκόσμια αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε μια ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση συστάδων. Σύκο. 4 απεικονίζει τους επιλεγμένους χάρτες θερμότητας μεταβολίτες. Οι εντάσεις των χρωμάτων τους χάρτες δείχνουν ότι η αναστολή NAMPT με FK866 είναι συγκεκριμένες και σχήμα των κυττάρων. 4 δείχνει κατεργασία νικοτινικό οξύ. Σύκο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.