Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ), κατατάσσει την τέταρτη κύρια κακοήθειας και τον καρκίνο θανάτου σε ανδρικό πληθυσμό στην Ταϊβάν. Παρά τις πρόσφατες θεραπευτικές εξελίξεις, η πρόγνωση για τους ασθενείς ΕΘΕΓ εξακολουθεί να είναι θλιβερή. Νέες στρατηγικές χρειάζονται επειγόντως να βελτιώσουν την χημειοευαισθητοποίηση με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα και κλινικές αποκρίσεις των ασθενών ΕΘΕΓ. Μελέτες έχουν δείξει ότι η τοπική 5-αμινολεβουλινικό οξύ με τη μεσολάβηση της φωτοδυναμικής θεραπείας (ALA-PDT) χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων ανθρώπινων προκακοήθων και κακοήθων αλλοιώσεων με μερικά ενθαρρυντικά κλινικά αποτελέσματα. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί της ALA-PDT στο θεραπευτικό αποτέλεσμα σε HNC ογκογένεση και αν ALA-PDT ως χημειοευαισθητοποιητή για θεραπεία HNC παραμένουν ασαφείς. Συσσωρευμένα στήριξη δεδομένα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) συμβάλλει χημειο-αντίσταση στην ΕΘΕΓ. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες, ο σκοπός της μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίδραση της ALA-PDT για ΚΕΠ και την περιουσία χημειοευαισθητοποίηση στην ΕΘΕΓ.

Μεθοδολογία /Principal εύρεση

ΚΕΠ δείκτη δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ1 του ΕΘΕΓ κύτταρα με τη θεραπεία ALA-PDT, όπως εκτιμάται από τη ροή δοκιμασία Aldefluor ανάλυση κυτταρομετρίας. Δευτεροβάθμια Σφαίρα σχηματίζουν αυτο-ανανέωση, την έκφραση βλαστική ικανότητα των δεικτών, και εισβολής του ΕΘΕΓ-ΚΕΠ με τη θεραπεία με ALA-PDT παρουσιάστηκαν. Παρατηρήσαμε ότι η επεξεργασία των ALA-PDT σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται τη δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 θετικότητα του ΕΘΕΓ-ΚΕΠ. Επιπλέον, ALA-PDT μειωμένη ιδιοκτησία αυτο-ανανέωσης και της έκφρασης βλαστική ικανότητα υπογραφές (Oct4 και Nanog) στη σφαίρα που σχηματίζει ΕΘΕΓ-ΚΕΠ. ALA-PDT ευαισθητοποιηθεί ιδιαίτερα ογκογόνο ΕΘΕΓ-ΚΕΠ με τις συμβατικές χημειοθεραπείες. Τέλος, συνεργιστική δράση του ALA-PDT και θεραπεία Cisplatin εξασθενημένο εισβολής /ακίνητο colongenicity στην ΕΘΕΓ-ΚΕΠ.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματα μας προσφέρουν πληροφορίες για την κλινική προοπτική της ALA-PDT ως δυναμικό χημειο-επικουρική θεραπεία κατά του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, με εξάλειψη ιδιοκτησίας ΚΕΠ

Παράθεση:. Yu CH, Yu CC (2014) Η φωτοδυναμική θεραπεία με 5-αμινολεβουλινικό οξύ (ALA) μειώνει όγκου Έναρξη και χημειοθεραπείες-Αντίσταση Ακίνητα καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, προερχόμενο από καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10.1371 /journal.pone.0087129

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Δεκέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 22 Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Yu, Yu. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται από την έρευνα επιχορήγηση από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (100-2632-B-040-001-my3, 101 – 2314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) .Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (HNC) είναι ένας από τους συχνότερους καρκίνους στον κόσμο και μία από τις αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται λόγω συχνών υποτροπή μετά από χημειοθεραπεία αντίσταση [1]. Παρά τις βελτιώσεις στη διάγνωση και τη διαχείριση του ΕΘΕΓ, τα ποσοστά μακροπρόθεσμης επιβίωσης έχουν βελτιωθεί οριακά μόνο κατά την τελευταία δεκαετία [1]. Νέα φάρμακα ή στρατηγικές χρειάζονται επειγόντως να βελτιώσουν την χημειοευαισθητοποίηση με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα και κλινικές αποκρίσεις των ασθενών ΕΘΕΓ [2].

Πρόσφατες μελέτες έχουν επισημάνει την αντίσταση στη θεραπεία συμβατικά radiotherapies /χημειοθεραπείες είναι μια σημαντική κλινικά κριτήρια για τον χαρακτηρισμό καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) με την αυτο-ανανέωση και εξαιρετικά tumorigenenic ικανότητα σε κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων HNC [2] – [4] Τόσο ενδοκυτταρική ΑΙ_ϋΗ1 + και CD44 + κύτταρα έχουν προταθεί για να εμφανίζουν ΚΕΠ ιδιότητες και έχουν χρησιμοποιηθεί ως ΚΕΠ λειτουργικοί δείκτες για το κεφάλι και τραχήλου προερχόμενα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (HNC-ΚΕΠ) [5] – [7]. Παρ ‘όλα αυτά, αναζητώντας μια αποτελεσματική προσέγγιση με στόχο ΕΘΕΓ-ΚΕΠ για τη βελτίωση της ΕΘΕΓ-σχετικών κακοήθειες απαιτείται επειγόντως [7].

Η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT) περιλαμβάνει δύο ξεχωριστά μη-τοξικά συστατικά, το φως και φωτοευαισθητοποιητή [8]. PDT είναι μια νέα θεραπεία και κατέχει σημαντική υπόσχεση για πολλούς συμπαγείς όγκους [9]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η τοπική 5-αμινολεβουλινικό οξύ με τη μεσολάβηση PDT (ALA-PDT) χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων ανθρώπινων προκακοήθων και κακοήθων αλλοιώσεων με μερικά ενθαρρυντικά κλινικά αποτελέσματα [10] – [13]. PDT μπορεί να έχει τη δυνατότητα αναστολής της μετάστασης του ελλιπώς αγωγή HNC [14]. Σε ένα μοντέλο καρκινώματος πνεύμονα ποντικών Lewis, ALA-PDT μείωσε την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων in vivo [15]. Επιπλέον, ALA-PDT αυξάνει την ικανότητα αποπτωτική του στόματος καρκινικών κυττάρων μέσω του ΝΡ-κΒ /JNK σηματοδότησης [16]. ALA-PDT καταργηθεί επίσης την ικανότητα της μετανάστευσης από του στόματος καρκινικών κυττάρων από τα κάτω ρύθμιση των FAK και ERK [17].

Με βάση τις προηγούμενες μελέτες, ο σκοπός της μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίδραση της ALA-PDT για χημειοευαισθητοποίηση και την περιουσία ΚΕΠ σε ΕΘΕΓ. Συνολικά, δείξαμε πρώτη ALA-PDT μειώνουν αποτελεσματικά CSC-όπως ιδιοκτησίας, συμπεριλαμβανομένων των δραστηριοτήτων ΑΙ_ϋΗ1, CD44 θετικότητα, αυτο-ανανέωση, εισβολή, και ενίσχυσε την χημειοευαισθησία στην ΕΘΕΓ. ALA-PDT θα ήταν μια πιθανή χημειο-επικουρική θεραπεία και μπορεί να είναι ευεργετική για την αντι-ΚΕΠ μεταχείριση στην ΕΘΕΓ.

Υλικά και Μέθοδοι

Πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα από ιστούς ΕΘΕΓ

χειρουργικά δείγματα ιστών από ασθενείς ΕΘΕΓ συλλέχθηκαν μετά από γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο κριτική Θεσμική στην Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH No: CS10249). Πρωτογενή κύτταρα HNC καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [18]. Εν συντομία, μετά την χειρουργική αφαίρεση των ιστών HNC, οι ιστοί πλύθηκαν 3 φορές σε γλυκόζη που περιέχει HBSS, στη συνέχεια, τα δείγματα σε φέτες σε ένα πάχος 300 μm και οι φέτες ιστοί βυθίστηκαν σε 0,1% (β /β) που περιέχουν κολλαγενάση γλυκόζη που περιέχει HBSS για 15 λεπτά στους 37 ° C και υποβλήθηκε σε περιστροφή αναδευτήρα ανακίνηση σε 125 rpm. HNC πρωτογενή καλλιέργεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, συμπληρωμένο με 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, μη απαραίτητα αμινοξέα, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (37 ° C, 95% υγροποιημένο αέρα, 5% CO

2).

Χημικά

5-ALA ελήφθη από την Sigma (St . Louis, ΜΟ, USA). Ακριβώς πριν από τη χρήση, 5-ALA περαιτέρω αραιωμένο σε μέσο καλλιέργειας σε κατάλληλες τελικές συγκεντρώσεις.

ΕΘΕΓ κυτταρικές σειρές καλλιέργειας και φωτοδυναμική θεραπεία με 5-ALA με βάση

Για τις μελέτες ALA-PDT, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5-ALA για 3 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με ερυθρό φως των 635 ± 5 nm σε διάφορες δόσεις.

Εμπλουτισμός σχηματισμού σφαίρας HNC καρκινικά βλαστικά κύτταρα (HNC-ΚΕΠ)

Σφαίρες από κύτταρα HNC απομονώθηκαν σε μέσο που αποτελείται από DMEM /μέσου χωρίς ορό F12 (GIBCO), συμπλήρωμα Ν2 (GIBCO), 10 ng /ανθρώπινο ανασυνδυασμένο βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών mL (βασικός FGF), και 10 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (R & amp? D Systems, Minneapolis, MN). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 10

4 ζώντα κύτταρα /χαμηλή πιάτα προσάρτησης 10-mm, και το μέσο αλλάχθηκε κάθε δεύτερη ημέρα μέχρι να παρατηρηθεί ο σχηματισμός σφαίρα όγκου σε περίπου 1 εβδομάδα. [2]

Aldefluor

δοκιμασία

Aldefluor κιτ δοκιμασίας αγοράστηκε από StemCell Technologies, Inc. (Vancouver, BC, Canada) 1 × 10

5 κύτταρα θα ανασταλεί σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού και προστέθηκε Aldefluor έως τελική συγκέντρωση 1 μΜ. Για τον έλεγχο αναστολέα ΑΙ_ϋΗ1, ϋΕΑΒ θα προστεθεί σε τελική συγκέντρωση 150 μΜ. Τα κύτταρα θα επωάζονται στους 37 ° C για 45 λεπτά και χρωματίστηκαν με 7-AAD σε πάγο για άλλα 5 λεπτά. Μετά πλύση με PBS, πράσινο φθορισμό θετικά κύτταρα σε ζώντα κύτταρα (7AAD-) θα αναλυθούν με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur ™, Βϋ Bioscience) συγκρίνοντας την ένταση φθορισμού του δείγματος σε επεξεργασία ϋΕΑΒ και αυτά τα κύτταρα θα αντιπροσωπεύεται ως κύτταρα με υψηλή δραστηριότητα ALDH (ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα) [2].

SYBR πραγματικό χρόνο ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Το ολικό RNA των κυττάρων καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το ολικό RNA (1 μα) από κάθε δείγμα αντίστροφα μεταγράφεται από Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Στη συνέχεια, η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ που περιείχε 0.5 μΜ του κάθε εκκινητή, 4 mM MgCl

2, 2 μΐ LightCycler ™ -FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Molecular Systems, Alameda, CA, USA ) και 2 μλ 1:10 αραιωμένου cDNA. Η

GAPDH

γονίδιο καθαριότητας ενισχύθηκε ως πρότυπο αναφοράς.

GAPDH

εκκινητές σχεδιάστηκαν:

GAPDH

(προς τα εμπρός): GGGCCAAAAGGGTCATCATC (. Nt 414-434, GenBank με καμία BC059110.1),

GAPDH

(reverse): ATGACCTTGCCCACAGCCTT (nt 713-733). Οι αντιδράσεις PCR παρασκευάστηκαν εις διπλούν και θερμαίνεται στους 95 ° C για 10 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 ° C για 5 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 20 δευτερόλεπτα. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Πρότυπες καμπύλες (τιμές κατωφλίου κύκλου έναντι της συγκέντρωσης εκμαγείου) παρασκευάστηκαν για κάθε γονίδιο στόχο και για την ενδογενή αναφοράς (

GAPDH

) σε κάθε δείγμα. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της αντίδρασης PCR, τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1,2% [3]. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα 1, [3].

Η

κηλίδος Western

Η εκχύλιση των πρωτεϊνών από τα κύτταρα και ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται. Δείγματα (15 μί) έβρασαν στους 95 ° C για 5 λεπτά και διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες υγρής μεταφέρθηκαν σε χαρτί νιτροκυτταρίνης Hybond-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: κουνελιού αντι-ανθρώπινο Oct4, κουνελιού αντι-ανθρώπινης Nanog (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)? αντι-GAPDH κουνέλι (MDBio, Inc., Ταϊπέι, Ταϊβάν)? και ποντικού αντι-β-ακτίνης (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με το σύστημα ανίχνευσης ECL (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA).

In vitro

κύτταρο εισβολή Δοκιμασία

Για επικοινωνούντα προσδιορισμούς μετανάστευσης , 2 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή θάλαμο ενός transwell (Corning, Acton, ΜΑ, USA) με μια πορώδη μεμβράνη (μέγεθος 8,0 μm πόρου). Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μέσο με χαμηλότερο ορού (0,5% FBS), και μέσο συμπληρωμένο με υψηλότερες ορό (10% FBS) χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρα στους 37 ° C και τα κύτταρα που δεν μεταναστεύουν μέσα από τους πόρους απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ΜΟ, USA) για να δείξει τις πυρήνες? φθορισμός ανιχνεύθηκε σε μεγέθυνση 100χ χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). μετρήθηκε ο αριθμός των φθοριζόντων κυττάρων σε ένα σύνολο πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία. Ιη vitro ανάλυση των κυττάρων εισβολής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Soft αποικίας agar δοκιμασία σχηματισμού

Κάθε φρεάτιο (35 mm) από δίσκο καλλιέργειας έξι φρεατίων επικαλύφθηκε με 2 ml πυθμένα άγαρ (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ΜΟ, USA) μίγμα (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0,6% (w /v) άγαρ). Μετά το κάτω στρώμα στερεοποιήθηκε, μίγμα άγαρ-μέσης κορυφή 2 ml (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0.3% (β /ο) άγαρ) που περιέχει 2 × 10

4 κύτταρα προστέθηκε, και τα πιάτα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 εβδομάδες. Οι πλάκες βάφτηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες τότε οι αποικίες μετρήθηκαν. Ο αριθμός του συνόλου των αποικιών με μm διάμετρο ≥100 μετρήθηκε πάνω από πέντε τομείς ανά καλά για συνολικά 15 τομείς σε πειράματα τριπλούν [3].

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστική Πακέτο Κοινωνικών Επιστημών λογισμικού (έκδοση 13.0) (SPSS Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των πειραματικών ομάδων?

σ

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05 για όλες τις δοκιμές.

Αποτελέσματα

Η αναστολή της δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ1 στα κύτταρα ΕΘΕΓ υπό θεραπεία ALA-PDT

ΑΙ_ϋΗ1, ένα κυτοσολικό ισοένζυμο ότι είναι υπεύθυνη για την οξείδωση της ρετινόλης στο ρετινοϊκό οξύ κατά την πρώιμη βλαστικών κυτταρική διαφοροποίηση έχουν αμφότερα δειχθεί ότι είναι δείκτες CSC σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [20], [21]. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα προσδιορισμού δραστικότητας ALDH in vitro με βάση τα κύτταρα, η οποία έχει αποδειχθεί ως ένας δείκτης HNC-ΚΕΠ, να εξετασθούν τα αποτελέσματα του ALA-PDT στη δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 σε κυτταρικές σειρές HNC και πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα HNC με κυτταρομετρία ροής περιγράφεται σε υλικό και μεθόδους. Τα δεδομένα μας προτεινόμενη θεραπεία ALA-PDT μειώνει σημαντικά την δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1 των κυττάρων ΕΘΕΓ (Εικ. 1).

(Α) ΕΘΕΓ κυτταρικές σειρές (SAS και Ca9-22) και τα πρωτογενή κύτταρα ΕΘΕΓ (ΕΘΕΓ-1 και HNC- 2) εμβολιάστηκαν ως 1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεατίων πλάκας και στη συνέχεια προκατεργασία 1 mM ALA για 3 ώρες που ακολουθείται από PDT με κόκκινο φως σε μια δόση των 4 J /cm2 ή ALA μόνο ομάδα ελέγχου θεραπεία . ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα προσδιορίστηκαν με Alderfluor δοκιμασίας και τα βιώσιμα κύτταρα (7-AAD αρνητικά) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. κύτταρα ϋΕΑΒ επεξεργασμένα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. (Β) Τα αποτελέσματα ποσοτικοποίηση παρουσιάστηκαν στο ραβδόγραμμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD *, p & lt?. 0.05

Η

ALA-PDT εξαλείφει αποτελεσματικά την ικανότητα αυτο-ανανέωσης, CD44 θετικότητα, και βλαστική ικανότητα υπογραφές σε ΕΘΕΓ-ΚΕΠ

Προηγουμένως, εξετάσαμε την επιτυχή σχηματισμό σφαίρας πάνω από συνεχή περάσματα του πολιτισμού, ένας από τους δείκτες για την αξιολόγηση της επίμονης ιδιοκτησία αυτο-ανανέωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, και έδειξε ότι η ικανότητα αυτο-ανανέωσης όλων των ΕΘΕΓ-ΚΕΠ [22]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της ALA-PDT στη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης HNC-ΚΕΠ, αξιολογήσαμε τη δευτερεύουσα δυνατότητα σχηματισμού σφαίρας με θεραπεία ALA-PDT σε κύτταρα HNC. Θεραπεία των κυττάρων ΕΘΕΓ με ALA-PDT παρενέβαινε με το μέγεθος και τον αριθμό των ΕΘΕΓ-ΚΕΠ (Εικ. 2Α) σφαίρες σώμα. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD44 έδειξαν ότι η θεραπεία ALA-PDT μείωσε το ποσοστό των δύο CD44 + κύτταρα σε HNC-ΚΕΠ (Σχ. 2Β). Για να προσδιοριστεί περαιτέρω κατά πόσον η μείωση του όγκου της αποδοτικότητας σχηματισμό σφαίρα με τη θεραπεία με ALA-PDT οφείλεται στη μειωμένη βλαστική ικανότητα έκφρασης δεικτών, βλαστική ικανότητα γονίδια (Οκτώβριος-4 και Nanog) του σχηματισμού σφαίρας ΕΘΕΓ-ΚΕΠ με τον έλεγχο και τη θεραπεία ALA-PDT προσδιορίστηκαν από ανάλυση κηλίδας western. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι ALA-PDT κατεργασμένους ΕΘΕΓ-ΚΕΠ μείωσε σημαντικά τη μεταγραφή έκφρασης (Εικ. 2C) και το επίπεδο της πρωτεΐνης (Εικ. 2D) του βλαστική ικανότητα γονιδίων.

(Α) Για την ανάλυση των αυτο-ανανέωση, ενιαία κυτταρικό αιώρημα λήφθηκε από πρωτογενή σφαίρες HNC-ΚΕΠ με Accutase πέψη και το σχηματισμό δευτερογενών σφαίρα ικανότητα προσδιορίσθηκε με διαδικασία καλλιέργεια πρωτογενών σφαίρα, εκτός από την πυκνότητα επιμετάλλωσης κύτταρο ως 10000 κύτταρα /ml. (Β) Η έκφραση του CD44 θετικότητα του ελέγχου και της ALA-PDT-θεραπεία ΕΘΕΓ-ΚΕΠ προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. SAS ή Ca9-22 που προέρχονται ΕΘΕΓ-ΚΕΠ που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο ή ALA-PDT και αναλύονται μεταγραφές και το επίπεδο πρωτεΐνης Oct-4 και Nanog με πραγματικού χρόνου RT-PCR (C) και ανάλυση ανοσοκηλίδωσης (D), αντίστοιχα. *, P & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

παροχής θεραπείας ALA-PDT ενισχύει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας στην ΕΘΕΓ-ΚΕΠ

ΚΕΠ είναι σχετικά ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία [6]. Τα ευρήματα που μεταχείρισης ALA-PDT ρυθμίζονται ιδιότητες ΚΕΠ πρότεινε έναν ρόλο για ALA-PDT ως πιθανή χημειο-επικουρική θεραπεία. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων έδειξαν ότι η κυτταροτοξική δράση επί HNC-ΚΕΠ για σισπλατίνη και φθοριοουρακίλη (5-FU) ήταν σημαντικά αυξημένη με τη θεραπεία συνδυασμού ALA-PDT (Σχ. 3Α). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των γονιδίων αντοχής πολυφαρμάκου (MDR) έδειξε ότι η μειωμένη χημειοαντίσταση με επεξεργασία ALA-PDT μπορεί να αποδοθεί στη μειωμένη έκφραση του ABCG2 (Σχ. 3Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με ALA-PDT βελτιώνεται η αντοχή στα φάρμακα της ΕΘΕΓ-ΚΕΠ σε σισπλατίνη και φθοριοουρακίλη (5-FU) θεραπεία μέσω ABCG2 ρύθμιση προς τα κάτω.

(Α) ΕΘΕΓ-ΚΕΠ με ALA-PDT ή τον έλεγχο θεραπεία υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης ή 5-FU. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) κυτταρομετρία ροής ανάλυση του επιπέδου έκφρασης της έκφρασης ABCG2 δείκτη ανθεκτικών στα φάρμακα στην ΕΘΕΓ-ΚΕΠ, όπως αναφέρεται.

Η

Η συγχορήγηση της θεραπείας ALA-PDT και σισπλατίνη καταργηθεί εισβολής και ικανότητας κλωνισμού του ΕΘΕΓ -CSCs

από ΚΕΠ φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην προώθηση του όγκου έναρξης δραστηριότητας [3], επιδιώξαμε να μετρήσει τα συνεργιστικά αποτελέσματα της ALA-PDT σε συνδυασμό με τη θεραπεία με σισπλατίνη στην εισβολή /κλωνογενοποιήσεως του ΕΘΕΓ-ΚΕΠ. Ενιαία κυτταρικό εναιώρημα του ALA-PDT-αγωγή HNC-ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνη θεραπεία χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση της εισβολής /κλωνογονικότητας τους

in vitro

όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Η θεραπεία με σισπλατίνη μόνο του δεν επηρέασε την ικανότητα εισβολής σε HNC-ΚΕΠ (Εικ. 4Α), ο συνδυασμός του ALA-PDT και τη θεραπεία cisplatin ενίσχυσε την αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών (Σχ. 4Α). Εν τω μεταξύ, παρόμοια συνεργική επίδραση της αγωγής ALA-PDT και χημειο-θεραπεία παρατηρήθηκε επίσης σε προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας (Εικ. 4Β). Η θεραπεία συνδυασμού έδειξε μια συνεργική επίδραση στην κατάργηση ικανότητας κλωνισμού σε HNC-ΚΕΠ. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας σισπλατίνη επί HNC-ΚΕΠ μπορεί να βελτιωθεί με τη θεραπεία ALA-PDT.

(Α) ικανότητα Εισβολή και (Β) σχηματισμού αποικίας ικανότητα σε HNC-ΚΕΠ εξετάσθηκε μετά τη θεραπεία είτε με ALA-PDT ή σισπλατίνη χημειοθεραπεία ή και τα δύο. *, P & lt? 0,05 ALA-PDT έναντι του ελέγχου? #, P & lt? 0,05 ALA-PDT + σισπλατίνη έναντι μόνο ALA-PDT

Η

Συζήτηση

Τα ΚΕΠ θεωρείται ότι είναι υπεύθυνος για την έναρξη, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των όγκων [23. ]. Είναι σημαντικό ότι, η ύπαρξη ΚΕΠ θα μπορούσε να εξηγήσει υποτροπές του καρκίνου, ακόμη και μετά από κλινική θεραπεία είτε με ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο [24]. Ως εκ τούτου, ψάχνοντας το μυθιστόρημα θεραπευτική στρατηγική στόχευση ΚΕΠ ελπίζουμε να μας δώσει νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Στην παρούσα έκθεση, πρώτον έδειξε ALA-PDT παρέχεται ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα σε HNC-ΚΕΠ με αναστολή των ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, όπως η υπογραφή βλαστική ικανότητα, την ικανότητα της μετανάστευσης, και χημειοαντίσταση. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει τον κρίσιμο ρόλο της θεραπείας ALA-PDT βασίζεται στη στόχευση ΕΘΕΓ που προέρχονται CSC-όπως κύτταρα και στον αποκλεισμό της ΕΘΕΓ-ΚΕΠ με τη μεσολάβηση του όγκου έναρξης δραστηριότητας.

μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι μια διαδικασία κρίσιμη για την κατάλληλη εμβρυϊκή ανάπτυξη, και είναι επίσης εκ νέου ασχολούνται σε ενήλικες κατά την διάρκεια ογκογένεσης [25]. EMT είναι ευρέως αποδεκτή ως μία από τις ιδιότητες ΚΕΠ, [26] και σηματοδότηση Oct4 /Nanog έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της ΕΜΤ και μετάσταση [27]. Τον καρκίνο του στόματος επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά οι οποίες διευκολύνουν τη μετανάστευση και την εισβολή μέσω της διαδικασίας ΕΜΤ [28]. Είναι γνωστό ότι η EMT μπορούν να προκαλέσουν τα κύτταρα με βλαστοκυττάρων, και ο καρκίνος έναρξη βλαστικών κυττάρων ιδιότητες που έχουν υποστεί επομένως EMT είναι πιο κινητικά και μετάσταση . [26]. Δεδομένου ότι έχουμε βρει ότι η δράση του ALA-PDT στην ικανότητα εισβολής στην ΕΘΕΓ-ΚΕΠ, διερεύνηση κατά πόσον η ALA-PDT μεσολάβηση ΚΕΠ και τις δυνατότητες εισβολής ανάλογα με EMT μονοπάτι θα διερευνηθεί στο μέλλον.

Η χημειοθεραπεία είναι η τρέχουσα πλατφόρμα για τη θεραπεία ασθενών με μετάσταση HNC [29]? Ωστόσο, το χημειοθεραπευτικό αποτέλεσμα είναι περιορισμένη, και τις παρενέργειές της παρεμβαίνουν σε μεγάλο βαθμό με την ποιότητα ζωής των ασθενών. ΚΕΠ είναι κλινικά χαρακτηρίζεται από την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [29]. Η παρουσία των ΚΕΠ έχει ως αποτέλεσμα την χαμηλή αποτελεσματικότητα των θεραπειών κατά του καρκίνου και την αποτυχία της εξάλειψης των όγκων και τελικά οδηγεί σε επανεμφάνιση του όγκου και την μετάσταση [30]. Η HNC-ΚΕΠ ήταν πολύ ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία [18] και η χημειοαντίσταση αυτών των κυττάρων αναστάλθηκε σημαντικά όταν αυτοί υπέστησαν αγωγή με ALA-PDT. Είναι αξιοσημείωτο ότι η θεραπεία ALA-PDT οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης MDR σε HNC προερχόμενα ΚΕΠ μετά chemotreatment. Οι λεπτομερείς μηχανισμοί του κανονιστικού δικτύου μεταξύ της θεραπείας ALA-PDT για γονιδίων ανθεκτικών στα φάρμακα απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη κατέδειξε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της ALA-PDT σχετικά με τις ιδιότητες των βλαστικών όπως και χημειοαντίσταση στην ΕΘΕΓ . Αξίζει να σημειωθεί, εδώ είναι μεγάλη ανάγκη να διαλευκάνουν τις υποκείμενων μηχανισμών της ALA-PDT με τη μεσολάβηση της πορείας ΕΘΕΓ-ΚΕΠ και να αξιολογήσει περαιτέρω τις θεραπευτικές δυνατότητες της θεραπείας ALA-PDT κλινικά.